CN105527436A - 柠檬黄elisa检测试剂盒 - Google Patents

柠檬黄elisa检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105527436A
CN105527436A CN201510917214.XA CN201510917214A CN105527436A CN 105527436 A CN105527436 A CN 105527436A CN 201510917214 A CN201510917214 A CN 201510917214A CN 105527436 A CN105527436 A CN 105527436A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lemon yellow
plate
protein
elisa
elisa plate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510917214.XA
Other languages
English (en)
Inventor
董颖超
王莹
秦玉昌
牛力斌
李军国
刘薇
柳家鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201510917214.XA priority Critical patent/CN105527436A/zh
Publication of CN105527436A publication Critical patent/CN105527436A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种检测柠檬黄的ELISA试剂盒，包括有柠檬黄ELISA检测试剂和酶标板，其特征是还含有蛋白G。与传统EL1SA检测方法相比，本发明的试剂盒不仅特异性强、灵敏度高、精确性和准确性高、操作简便等优点，还可提高抗体的利用率，节省包被抗体的用量。

Description

柠檬黄ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速检测色素柠檬黄的方法，本发明还涉及一种包被蛋白G的柠檬黄的ELISA检测试剂盒。
背景技术
柠檬黄是应用最广泛的一种人工合成色素，用于食品、药品、化妆品、医疗器具、烟草、饲料、食用包装、玩具等，常需要对上述产品中的柠檬黄进行定量检测，因为如果人体摄入量柠檬黄过大，会产生伤害。
目前，国家标准规定的柠檬黄检测方法是高效液相色谱法、薄层分析法及分光光度计法等理化方法，虽然结果准确，但由于其操作复杂、所需时间较长、检测成本较高的缺点，不能适用于大规模操作。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有高效、灵敏、便于基层推广等优点，而且可以直接采样进行检测，与HPLC、GC-MS检测有较高的一致性，目前已有应用于柠檬黄快速检测的报道，但现有技术的柠檬黄ELISA快速检测方法具有以下缺点：
一是抗体利用率低。现有技术方法是抗体直接与酶标板反应，由于抗体排列不规则，不能够保证与抗原有效相结合(见图1)。而且因为抗体利用率低，用量大，还需要较高纯度，造成检测成本较高；
二是，由于与酶标板反应的抗体随机排列，导致排列不规则，使同一酶标板内和不同酶标板间的各孔间变异大，影响检测结果的准确性。如图1所示。
另外，现有ELISA检测方法是先包被抗原，然后加抗体，再加酶标二抗，然后再加显色剂。步骤较多，操作比较繁琐。
因此，如果能使得抗体Y排列较为整齐，保证抗体Y与抗原有效相结合，将能有效利用抗体。既提高抗体利用率，降低检测成本，又能提高检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种提高抗体利用率，降低检测成本，又能提高检测结果准确性的检测柠檬黄的方法和试剂盒。具体目的是提供一种使抗体Y排列较为整齐，保证抗体Y与抗原有效相结合的ELISA检测方法。
本发明利用了蛋白G的功能。检测时，在酶标孔中先加蛋白G，蛋白G具有跟抗体上Fc部分特异结合的特点，所以将蛋白G偶联到酶标板上后，使抗体的Fab端朝向外侧，从而降低了空间位阻，不对抗原结合区域构成干扰，使抗体Y排列更加的整齐，增加了重组蛋白G与柠檬黄抗体IgG的结合能力，能够保证Y有效的跟抗原相结合，提高抗体的利用率(见图2)。试验表明，在不影响检测性能的条件下，先经蛋白G预处理的ELISA试剂盒柠檬黄抗体的需用量仅为通常制备方法下抗体的需用量的十分之一。
不仅如此，对酶标板先经蛋白G处理再进行抗体包被，还可提高同一酶标板内或不同酶标板中各孔间的均一性，提高检测的准确性。
所述蛋白G(ProteinG)是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，从链球菌A、C和G群很多菌株的细胞壁及培养上清中提取得到。蛋白G能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，并且具有很高的亲和力。
在实际应用中，所用的蛋白G也可以选用基因重组蛋白G，通过克隆蛋白G的基因序列，在大肠杆菌中表达出与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G而获得。蛋白G可以通过市售方式，方便获得。
本发明的实施例1分别采用本专利的方法和传统方法制备了用于柠檬黄检测的ELISA试剂盒，实施例2、3比较了传统的方法和采用本专利的方法检测柠檬黄，由试验结果可以看出可以只用原来的抗体浓度的十分之一，即可达到传统方法的检测效果；
实施例1是采用和未采用蛋白G处理的试验比较，其中：
实验1采用蛋白G处理，抗体用量为100微升，抗体浓度为1：1000000；
实验2未采用蛋白G处理，抗体浓度稀释比为1：100000，为实验1的10倍。抗体用量未变，仍为100微升，
从结果可看出：采用蛋白G处理后，不仅节约了90％的抗体用量，而且每个批次的结果更加均匀，结果更一致。
传统ELISA检测方法的步骤为：空白酶标板——包被抗体——加入标准物质或样品与酶标化合物竞争反应；
本专利的步骤为：空白酶标板——包被一层proteinG——包被抗体——加入标准物质或样品与酶标化合物竞争反应；
本发明与传统方法相比，最大的特点就是：通过这一技术处理，可以节省抗体用量，减小板间板内的差异；同时通过优化抗体浓度以及酶标化合物可增加检测的灵敏度。
本发明建立的EL1SA检测方法的具体步骤如下：
1)制备包被有蛋白G的酶标板
第一步：包被蛋白G
用包被缓冲液将蛋白G稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到空白酶标板的微孔内，37℃孵育2h；
第二步：洗板
取出酶标板甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；
第三步：包被抗体
用10nMpH7.4PBS缓冲液将抗柠檬黄特异性单克隆抗体稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到酶标板的孔内，37℃孵育0.5h；
第四步：洗板
取出酶标板，甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；
第五步，封闭
用1％鱼皮明胶的封闭液，100～200μl/孔，37℃孵育2h；
第六步，干燥
取出酶标板甩掉板内液体，排干，37℃烘干3h；得到包被蛋白G的酶标板；
2)反应
操作步骤如下：在步骤1)制备的酶标板的各微孔中，或加入50μl系列浓度的柠檬黄标准品，或加入50μl待测样品提取液；之后，每孔中再加入50μl酶标记柠檬黄抗原，此时每微孔内含100μl溶液，25℃放置15min～60min；
3)洗板：取出酶标板甩掉板内液体，洗涤酶标板孔，洗1～5次，每次间隔20s，甩掉板内液体并拍干板孔；
4)加底物：加入底物显色液放置10～20min，底物显色液为含0.8mmol/L过氧化氢脲和0.4mmol/L四甲基联苯胺的pH7.9的磷酸缓冲液溶液；
5)终止：加入2mol/LH2SO4，50μl/孔；
6)读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔OD值。
以上所述洗涤酶标板孔，是用PBST洗涤液洗涤酶标板孔，使用洗涤液200～400μl/孔；
所述系列浓度的柠檬黄标准品，浓度为0～4.05ng/ml，用0.01mol/LPBS缓冲液配制；
所述酶标记柠檬黄抗原的浓度是1:5000～25000。
为与传统EL1SA检测方法进行比较，本发明人按如下步骤进行了传统的EL1SA检测：
1)包被ELISA板：
第一步：用10nMpH7.4PBS缓冲液将抗柠檬黄特异性单克隆抗体稀释到0.1～1μl/ml，100μl/孔；包被到ELISA微孔板内，37℃孵育0.5h；
其余步骤与前述相同。
结果表明，与传统EL1SA检测方法相比，本方法不仅特异性强、灵敏度高、精确性和准确性高、操作简便等优点，还可提高抗体的利用率，节省包被抗体的用量。
本发明提供了一种柠檬黄的ELISA检测试剂盒，包括有常规柠檬黄ELISA检测试剂和酶标板，其特征是，还含有蛋白G。
所述常规柠檬黄ELISA检测试剂包括柠檬黄系列标准品、标记辣根过氧化物酶的柠檬黄、样本稀释液、洗涤液、底物液和终止液。
所述样本稀释液为pH为7.4的10mMPBS溶液。
洗涤液为含0.2％Tween20pH为7.4的0.6MPBS溶液。
终止液为含2mol/LH2SO4。
本发明试剂盒使用方法：
1、样本前处理
称取5g经过粉碎的样品，加入25mL样品稀释液(浓缩样本稀释液按1:10稀释)，150r/min振荡20min，过滤(或于4000r/min离心10min)，取滤液或上清液，用样品稀释液按照1:19比例稀释，稀释后的溶液为上样液。整体稀释倍数为100倍。
2、操作步骤
(1)分别在微孔中加入系列浓度的标准品和处理后的上样液50μL/孔，再加入酶标物50μL/孔，25℃放置30min；
(2)弃去液体，甩干。将洗涤液用去离子水按1:60稀释。每孔250μl，洗涤5次，每次20s，甩干；
(3)加底物溶液，每孔100μl，37℃避光显色15分钟；
(4)加终止液，每孔50μl，轻轻摇晃，迅速使用酶标仪在450nm主波长和630nm次波长下测各孔OD值；
(5)结果判定：
以标准品百分吸光率为纵坐标，以柠檬黄标准品浓度(μg/kg)的对数值为横坐标，在半对数绘图纸上绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度。
包被蛋白G的柠檬黄的ELISA检测试剂盒，使用蛋白G预处理酶标板，可快速有效的检测待检样本中柠檬黄残留水平。基于ProteinG和IgG的特殊亲和力，ProteinG与抗体Fc片段结合后，Fab片段伸展在外，更容易抓取抗原。直接用抗体包板，抗体在板上的结合方向是随机的，而ProteinG板上的抗体具有一致方向性。抗体利用率更高，抗体的用量更少，制备得到酶标板板内、板间的差异更小。
附图说明
图1是现有技术方法中抗体直接与酶标板反应的示意图。可看出，由于抗体排列不规则，不能够保证与抗原有效相结合；
图2是将蛋白G偶联到酶标板上后，提高抗体Y与抗原相结合的示意图。可看出，抗体的Fab端朝向外侧，从而降低了空间位阻，不对抗原结合区域构成干扰，使抗体Y排列更加的整齐，增加了重组蛋白G与柠檬黄抗体IgG的结合能力；
图3抗体包被前先经蛋白G处理的酶标板试剂盒的标准曲线图，拟合的方程为y＝1.95185-0.22541ln(x)，相关系数：R＝0.9992。
图4抗体包被前未经蛋白G处理的酶标板试剂盒的标准曲线图，拟合的方程为y＝1.95562-0.22578ln(x)，相关系数：R＝0.9976。
具体实施方式
试验材料和试剂
以下各实验中所用的蛋白G，购自北京华安麦科生物技术有限公司，产品编号为HSS098,纯度95％以上，包装容量为10mg。
抗柠檬黄特异性单克隆抗体、酶标记柠檬黄抗原由本发明人实验室制备或合成；
PBST洗涤液的配制：分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，加0.5ml吐温-20，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存。
PBS缓冲液的配制:分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存。
其他试剂购自北京市化学试剂厂。
实施例1本发明方法和传统方法制备的柠檬黄检测的ELISA试剂盒比较
实验目的：比较本发明方法和传统不经蛋白G处理的柠檬黄检测方法
实验方法和结果：见如下
一、包被前先经蛋白G处理的柠檬黄ELISA检测试剂盒的制备
(一)柠檬黄单克隆抗体的获得
1、免疫脾细胞的获得
1.1免疫动物
选择6周龄，雌性，BALB/C小鼠，将购买的柠檬黄人工免疫原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射，免疫剂量为50μg，进行基础免疫。
免疫前断尾取血，分离血清，保存在-20℃，作为正常对照小鼠的血清。隔4周，进行第二次免疫，抗原剂量同基础免疫，抗原与福氏不完全佐剂混合、乳化，对小鼠进行加强免疫。隔4周，进行第三次免疫，免疫条件同第二次。第三次免疫后第7～10天，断尾取血，分离血清，用ELISA方法检测血清效价。用生理盐水稀释免疫原对高效价小鼠进行连续加强免疫。
1.2饲养细胞的获得
融合前一天，引颈处死小鼠，浸泡于75％酒精1min。将小鼠仰卧在解剖板上，剪开胸部皮肤，纵向拉开皮肤，暴露腹部，用注射器抽取5mL无血清培养液注入腹腔，轻柔腹部1～2min，吸出细胞悬液，移入离心管。用无血清培养液离心洗涤一次(1000rpm，5min)。弃去上清液，加入HAT培养液，均匀悬液，接种于96孔培养板，0.1mL/孔。置37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养备用。
2、细胞融合和杂交瘤的筛选
2.1细胞融合
将50％PEG4000、无血清培养液、HAT筛选培养液置37℃CO2培养箱中预热。收获对数生长期的Sp2/0细胞，用无血清培养液洗涤3次(1000r/min离心10min)，作活细胞计数。无菌条件下分离脾细胞，作活细胞计数。将1×108脾细胞与1×107Sp2/0细胞在50mL尖底离心管中混匀，以1000r/min离心10min，弃去上清液，用食指轻弹管底，使细胞沉淀松散。将含有脾细胞和Sp2/0瘤细胞的50mL尖底离心管放于38℃融合水杯中，用1mL吸管吸取0.7mLPEG4000缓慢加入到细胞混悬液中(在1min内完成)，边加边轻轻地转动试管，使PEG与细胞充分混匀。静置90秒，在2min内加完15mL37℃预热的无血清培养液，以1000r/min离心10min，弃去上清液，加入37℃预温HAT培养液充分混匀。接种于前一天含有BALB/C饲养细胞的96孔培养板中，0.1mL/孔。置37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。
2.2杂交瘤细胞的筛选
融合5天观察有小集落后，用HAT筛选培养液换液，10天后换HT培养液，镜检96孔细胞培养板。观察12天，集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用的ELISA法检测阳性孔。OD450值大于1时，判定为阳性孔。将阳性孔细胞转至24孔含有巨噬细胞的培养板，待集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用的ELISA法检测特异性。检出无交叉阳性株，进行克隆化培养，同时转入培养瓶。
2.3杂交瘤细胞的克隆
采用有限稀释法分别对阳性的杂交瘤细胞株进行了3次克隆，用ELISA法筛选阳性率达到100％的细胞株，且OD450值最高的细胞株。扩大培养，冻存，建立细胞株系。
3、腹水获得
将筛选得到的细胞株生产细胞复苏后，培养于含15％胎牛血清的RPMI1640完全培养液中进行扩增。于两周前给小鼠腹腔注射降植烷(0.5mL/只)。然后将扩增的杂交瘤细胞接种于用降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔内，每只小鼠腹腔内注射0.5mL(约1×106个细胞)。7～11天后小鼠开始产生腹水。采用一次收集的方法收集腹水，平均每只小鼠可获得3～5mL腹水。取小鼠腹水置于离心管中，3000r/min，离心15min，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，分装，-20℃冻存备用。
4、抗体的分离纯化和鉴定
纯化抗体；SDS-PAGE电泳法鉴定抗体纯度，抗体纯度良好；ELISA方法鉴定抗体活性，OD450值大于1，均合格；ELISA方法鉴定抗体特异性，检测单抗只针对该毒素抗原特异，与其它抗原不发生反应，具有较好的特异性；抗体亲和力测定。
5、用于柠檬黄检测的单克隆抗体特异性检测结果
测试1ppm的交叉反应药物，根据半数抑制浓度计算交叉反应率。
交叉反应率＝IC50(柠檬黄)/IC50(交叉药物)×100％
表1用于柠檬黄检测的单克隆抗体交叉反应率
药物名称 IC50(ppb) 交叉反应(％)
柠檬黄 0.5 100
日落黄 ＞1000 ＜0.05
苏丹红 ＞1000 ＜0.05
碱性橙 ＞1000 ＜0.05
罗丹明 ＞1000 ＜0.05
(二)酶标记柠檬黄抗原
将4mgHRP溶于1ml水中，加入0.2ml1M过碘酸钠，制成活化HRP；用0.5MpH10CB将所述活化HRP的pH调至9.5，取2mg柠檬黄-BSA，透析完成。
(三)包被前先经蛋白G处理的柠檬黄的EL1SA检测方法的建立
1、包被ELISA板：
首先用包被缓冲液将蛋白G稀释到0.1～1μl/ml，100μl/孔；包被到ELISA微孔板内，37℃孵育2h；
洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液(PBST)洗涤板孔，200～400μl/孔，洗涤2次；
再用10nMpH7.4PBS缓冲液将抗柠檬黄特异性单克隆抗体稀释到1:1000000，100μl/孔；包被到ELISA微孔板内，37℃孵育0.5h；
2、洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液洗涤板孔，250μl/孔，洗涤2次；
3、封闭：1％鱼皮明胶的封闭液，150μl/孔，37℃孵育2h；
4、干燥：取出酶标板甩掉板内液体，排干，37℃烘干3h；
5、反应时加入待测样品和酶标柠檬黄抗原：每孔加入0.01mol/LPBS稀释液缓冲液配制的标准品0、0.15、0.45、1.35、4.05ng/ml，50μl/孔，再加入1:15000浓度的酶标抗原，50μl/孔，25℃放置15min～60min；
6、洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液(PBST)洗涤板孔，250μl/孔，洗1～5次，每次间隔20s，甩掉板内液体并拍干板孔；
7、底物：加入底物放置10～20min；
8、终止：加入2mol/LH2SO4，50μl/孔；
9、读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔OD值。
(四)抗体包被前先经蛋白G处理的ELISA试剂盒的性能测试
1、建立抗体包被前先经蛋白G处理的ELISA试剂盒标准曲线
表2抗体包被前先经蛋白G处理的ELISA试剂盒标准曲线
序号 浓度ppt Absorbance B/B0(％) calculated Deviation
1 0 1.582 100 - -
2 150 1.300 82.2 150 0.0
3 450 0.941 59.5 449.5 0.1
4 1350 0.473 29.2 1351.7 0.1
5 4050 0.148 9.4 4048.7 0.0
所得的标准曲线见图3。
2、抗体包被前先经蛋白G处理的ELISA试剂盒重复性检测结果
样本加标50ng/ml柠檬黄，11份样品进行提取和检验，结果如下：
表3抗体包被前先经蛋白G处理的ELISA试剂盒重复性
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
45.2 41.5 47.1 44.8 42.4 40.8 44.1 48.3 50.9 52.4 46.8
11次重复测量的均值为45.8ng/ml，方差3.7，变异系数8.1％。
二、包被前未经蛋白G处理的柠檬黄ELISA检测试剂盒的制备
(一)柠檬黄单克隆抗体的获得
该制备步骤同一、(一)。
(二)包被前未经蛋白G处理的柠檬黄ELISA检测试剂盒检测方法的建立
1)用10mMpH7.4PBS缓冲液将抗柠檬黄特异性单克隆抗体稀释到1:100000(为采用蛋白G包被酶标板的抗体量的10倍)，100μl/孔，37℃孵育0.5h；
其余制备步骤同一、(二)。
(三)建立抗体包被前未经蛋白G处理的ELISA试剂盒标准曲线
表4包被前未经蛋白G处理的ELISA试剂盒标准曲线
序号 浓度ppt Absorbance B/B0(％) calculated Deviation
1 0 1.992 100 - -
2 150 1.639 82.3 150 0.0
3 450 1.181 59.3 449.4 0.1
4 1350 0.577 29.0 1352.3 0.2
5 4050 0.196 9.8 4046.9 0.2
所得的标准曲线见图4。
实验结论：由图3、图4可知，这两种方法得到的ELISA试剂盒标准曲线均可以大于99.8％，基本能满足日常检测的要求，经过蛋白G处理的ELISA试剂盒的线性更好。
实施例2抗体包被前是否经蛋白G预处理的试剂盒精密度与准确度试验的比较
1、标准品溶液重复性试验
按照实施例2、3中的方法分别制备不同处理方法的酶标板中，每种处理方法中随机选三个酶标板的10个微孔，测定0.5ng/mL标准品溶液的吸光度值(OD值)，计算变异系数CV，结果见表5、表6。
表5经蛋白G处理ELISA试剂盒标液重复性试验结果
表6未经蛋白G处理ELISA试剂盒标液重复性试验结果
2、样本的可重复性实验
对小麦粉进行添加实验，添加终浓度为50ng/g。分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复10次，分别计算变异系数，结果见表7，表8。
表7经蛋白G处理ELISA试剂盒小麦样品重复性试验结果
表8未经蛋白G处理ELISA试剂盒小麦样品重复性试验结果
实验结论：从重复性结果可以看出，经过蛋白G包被处理的ELISA试剂盒的变异系数均小于5％，添加终浓度为50ng/g水平时，测定的回收率均大于90％；未经蛋白G包被处理的ELISA试剂盒的变异系数均大于9％，添加终浓度为50ng/g水平时，该方法的到的回收率的平均值不到84％。
实施例3抗体包被前是否经蛋白G预处理检测试剂盒的准确度试验
为验证采用两种不同方式得到的试剂盒的准确度，对小麦粉、玉米蛋白粉、禽配合饲料进行添加回收试验，添加终浓度为0ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g，每个浓度做三孔平行，计算其添加回收率。
样品的前处理方法为：称取5g经过粉碎的样品，加入25mL样品稀释液(浓缩样本稀释液按1:10稀释)，150r/min振荡20min，过滤(或于4000r/min离心10min)，取滤液或上清液，用样品稀释液按照1:19比例稀释，稀释后的溶液为上样液。两种不同方法制备的试剂盒的检测结果见表9。
表9两种检测试剂盒检测小麦粉、玉米蛋白粉、禽配合饲料样品的试验结果
根据实验结果，小麦粉、玉米蛋白粉及禽配合饲料的添加回收的检测结果见表3，包被前经蛋白G处理的ELISA检测的平均回收率是60.7-89.5％，变异系数5.2-12.8％；包被前未经蛋白G处理的ELISA检测的平均回收率是58.5-91.2％，变异系数9.4-13.6％。从总体回收率及变异系数上看，柠檬黄抗体在包被酶标板前先经蛋白G处理，ELISA检测结果优于包被前未经蛋白G处理的ELISA检测结果。
实验结论：柠檬黄抗体在包被酶标板前先经蛋白G处理的ELIAS试剂盒检测结果的准确度和精确度均符合实际检测要求，可用于柠檬黄在饲料原料及产品中的快速筛查。
实施例4包被抗体前经蛋白G处理的ELISA稳定性试验
为考察包被抗体前经蛋白G处理的ELISA稳定性，将包被抗体前经蛋白G处理的试剂盒放置于2～8℃，分别取0、2、4、6、8、10、11和12个月的试剂盒，对柠檬黄标准品(0.15ng/mL)的吸光度值、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。结果表明，经过低温下保存试验，柠檬黄标准样品(0.15ng/mL)的吸光度值下降小于8％，且OD不低于1.0；批内变异系数小于8.5％；添加水平在50ng/g时，回收率在78～115％之间；各项指标均符合质量要求，因此，试剂盒可以在2～8℃保存12个月。
实验结论：通过以上实验可以看出：经过蛋白G处理的检测柠檬黄试剂盒在重复性、抗体的利用效率等方面优于未经处理的试剂盒。

Claims (9)

1.一种用酶联免疫吸附法测定柠檬黄的方法，其特征是，在酶标板的微孔中加入抗柠檬黄特异性单克隆抗体之前，在空白酶标板的微孔中先加入蛋白G。
2.权利要求1所述的方法，所述加入蛋白G，是将蛋白G用包被缓冲液稀释至0.1～1μl/ml，每个酶标板微孔加100μl，37℃孵育2h。
3.权利要求2所述的方法，所述包被缓冲液是0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液。
4.权利要求2所述的方法，步骤如下：
1)制备包被有蛋白G的酶标板
第一步：包被蛋白G
用包被缓冲液将蛋白G稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到空白酶标板的微孔内，37℃孵育2h；
第二步：洗板
取出酶标板甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；
第三步：包被抗体
用10nMpH7.4PBS缓冲液将抗柠檬黄特异性单克隆抗体稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到酶标板的孔内，37℃孵育0.5h；
第四步：洗板
取出酶标板，甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；
第五步，封闭
用1％鱼皮明胶的封闭液，100～200μl/孔，37℃孵育2h；
第六步，干燥
取出酶标板甩掉板内液体，排干，37℃烘干3h；得到包被蛋白G的酶标板；
2)反应
操作步骤如下：在步骤1)制备的酶标板的各微孔中，或加入50μl系列浓度的柠檬黄标准品，或加入50μl待测样品提取液；之后，每孔中再加入50μl酶标记柠檬黄抗原，此时每微孔内含100μl溶液，25℃放置15min～60min；
3)洗板：取出酶标板甩掉板内液体，洗涤酶标板孔，洗1～5次，每次间隔20s，甩掉板内液体并拍干板孔；
4)加底物：加入底物显色液放置10～20min，底物显色液为含0.8mmol/L过氧化氢脲和0.4mmol/L四甲基联苯胺的pH7.9的磷酸缓冲液溶液；
5)终止：加入2mol/LH2SO4，50μl/孔；
6)读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔OD值。
5.权利要求4所述的方法，所述洗涤酶标板孔，是用PBST洗涤液洗涤酶标板孔，使用洗涤液200～400μl/孔；
所述PBST洗涤液的配制：分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，加0.5ml吐温-20，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存。
6.权利要求4所述的方法，所述系列浓度的柠檬黄标准品，浓度为0～4.05ng/ml，用0.01mol/LPBS缓冲液配制；
所述PBS缓冲液的配制:分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存；
所述酶标记柠檬黄抗原的浓度是1:5000～25000。
7.一种检测柠檬黄的ELISA试剂盒，包括有柠檬黄ELISA检测试剂和酶标板，其特征是，还含有蛋白G。
8.权利要求7所述的试剂盒，所述柠檬黄ELISA检测试剂包括柠檬黄标准品、经辣根过氧化物酶标记的柠檬黄、样本稀释液、洗涤液、底物液和终止液。
9.权利要求8所述的试剂盒，所述样本稀释液为pH为7.4的10mMPBS缓冲液；洗涤液为含0.2％Tween20pH为7.4的0.6MPBS溶液；终止液为含2mol/LH2SO4。
CN201510917214.XA 2015-12-10 2015-12-10 柠檬黄elisa检测试剂盒 Pending CN105527436A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510917214.XA CN105527436A (zh) 2015-12-10 2015-12-10 柠檬黄elisa检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510917214.XA CN105527436A (zh) 2015-12-10 2015-12-10 柠檬黄elisa检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105527436A true CN105527436A (zh) 2016-04-27

Family

ID=55769788

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510917214.XA Pending CN105527436A (zh) 2015-12-10 2015-12-10 柠檬黄elisa检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105527436A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106370847A (zh) * 2016-08-22 2017-02-01 广州达元食品安全技术有限公司 一种食品中柠檬黄快速检测盒
CN106568966A (zh) * 2016-10-14 2017-04-19 广州安诺食品科学技术有限公司 柠檬黄胶体金检测卡及其制备方法
CN117491650A (zh) * 2023-11-01 2024-02-02 首都医科大学宣武医院 一种外周血Hb-Aβ复合物定量检测试剂盒、检测方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1844926A (zh) * 2006-05-10 2006-10-11 北京望尔生物技术有限公司 检测苏丹红药物的酶联免疫试剂盒及方法
CN102331500A (zh) * 2011-02-01 2012-01-25 天津百鸥瑞达生物科技有限公司 用于检测柠檬黄的方法及酶联免疫试剂盒
CN103558376A (zh) * 2013-10-14 2014-02-05 青岛海佑海洋生物工程有限公司 一种新型多糖生物电极芯片及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1844926A (zh) * 2006-05-10 2006-10-11 北京望尔生物技术有限公司 检测苏丹红药物的酶联免疫试剂盒及方法
CN102331500A (zh) * 2011-02-01 2012-01-25 天津百鸥瑞达生物科技有限公司 用于检测柠檬黄的方法及酶联免疫试剂盒
CN103558376A (zh) * 2013-10-14 2014-02-05 青岛海佑海洋生物工程有限公司 一种新型多糖生物电极芯片及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
邱凯等: "柠檬黄的ELISA检测方法的建立", 《内蒙古民族大学学报(自然科学版)》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106370847A (zh) * 2016-08-22 2017-02-01 广州达元食品安全技术有限公司 一种食品中柠檬黄快速检测盒
CN106568966A (zh) * 2016-10-14 2017-04-19 广州安诺食品科学技术有限公司 柠檬黄胶体金检测卡及其制备方法
CN117491650A (zh) * 2023-11-01 2024-02-02 首都医科大学宣武医院 一种外周血Hb-Aβ复合物定量检测试剂盒、检测方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103558400A (zh) 一种降钙素原乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒
CN1908664B (zh) 多簇抗原及制备方法、宽谱特异性多克隆抗体及其用途
CN103134931B (zh) 一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素a的双抗体夹心法
CN104017070B (zh) 一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法
CN102080066B (zh) 一种检测t-2毒素的方法及其专用试剂盒
CN103575889B (zh) 一种检测万古霉素的试纸条及方法
CN105527436A (zh) 柠檬黄elisa检测试剂盒
CN103439503B (zh) 司帕沙星的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法
CN105699653A (zh) 一种超敏感超顺磁性纳米免疫微球及其检测gp73抗原的方法
CN104849464B (zh) 一种检测阿司匹林疗效的试剂盒及其检测方法
CN107014993A (zh) 一种检测动物源性食品中头孢类抗生素的间接竞争elisa试剂盒及其应用
CN104031886B (zh) 一种免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莫能菌素的方法及其专用单克隆抗体
CN103777015A (zh) 一种检测红霉素的胶体金试纸条及方法
CN102033130A (zh) 酶联免疫检测试剂盒及检测样品中t-2毒素的方法
CN1979169A (zh) 腹泻性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒及其制备和应用
CN105353137A (zh) 一种快速检测色素苏丹红的方法
CN102690788A (zh) 一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体及其制备方法和应用
CN107083370A (zh) 抗树鼩干扰素γ单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用
CN102608310A (zh) 一种沙丁胺醇酶联免疫试剂盒及其使用方法
CN102936584A (zh) 氨基脲衍生物的单克隆抗体及其应用
CN102363634A (zh) 拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法
CN105586317A (zh) 一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用
CN101710124A (zh) 一种检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒
CN103760351B (zh) 一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素d的双抗体夹心法
CN111072775B (zh) 抗MntC蛋白抗体及其应用和包含其的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160427