CN106290927A - 强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法 - Google Patents

强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗生素检测技术的改进，具体涉及强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法，属于免疫学领域。强力霉素快速检测试剂盒，包括自下而上排列的支撑体、吸水层3、检测层2、带通孔1的盖板4，保藏号为：CCTCC NO:C201680杂交瘤细胞DC‑C所分泌的、胶体金标记的抗强力霉素单克隆抗体C；A液：含1‑5％分子量为20000的PEG的0.01mol/L磷酸盐缓冲液；B液：含0.01‑0.25％吐温‑20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。该试剂盒具有简便、快速、准确、灵敏的特点,最低检测浓度为2ug/ml，可用于现场对强力霉素药物残留的粗筛检测。

Description

强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法
技术领域
本发明涉及抗生素检测技术的改进，具体涉及强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法，属于免疫学领域。
背景技术
机制与四环素相同，主要是干扰敏感菌的蛋白质合成。它可以特异性地与细菌核糖体30S亚基在A位置结合，从而抑制氨基酰-tRNA在该位置上的联结，阻止肽链的延长；强力霉素还可以改变细菌细胞膜的通透性，使细胞内的核苷酸及其他重要成分漏出，从而抑制细菌DNA的复制。强力霉素对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、大肠杆菌、产气杆菌、志贺菌属、耶尔森菌、单核细胞李斯特菌等有较强抗菌活性，对立克次体、支原体、衣原体、放线菌等也有一定作用。抗菌谱与四环素、土霉素基本相同。体内、外抗菌力均较四环素强。
强力霉素被吸收后广泛分布于各组织和体液，分布容积约为0.7L/kg。因脂溶性较高，强力霉素对组织的穿透力较强，在胸导管淋巴液、腹腔积液、肠组织、眼和前列腺组织中的药物浓度均较高，约为血药浓度的60％～75％，胆汁中的药物浓度可达血药浓度的10～20倍；在乳汁中也能达到较高的药物浓度；强力霉素也可以分布于肝脏、脾脏、骨髓、骨骼、牙本质和牙釉质中。强力霉素在体内蛋白结合率为80％～95％，清除半衰期为12～22h，肾功能减退者半衰期延长不明显。药物主要在肝脏内代谢灭活，通过肾小球滤过随尿液排泄，当肾功能损害时，强力霉素从胃肠道的排泄量增加，成为主要的代谢途径。强力霉素不能经透析清除。
强力霉素目前在水产养殖行业作为一种较为普遍的抗感染药物使用，有着很好地治疗作用，但在实际生产中往往会出现强力霉素过量的情况，导致水产品及养殖水体中存在残留。根据农业部2002年12月发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》明确规定，动物性食品肌肉中残留量为100μg/kg，皮脂中最大残留量为300μg/kg，肝脏中最大残留量为300μg/kg，肾脏中最大残留量为600μg/kg。
发明内容
本发明针对强力霉素残留的现状，以及其对人体的危害，设计发明提供一种能够快速、简便、准确、现场检测强力霉素的快速检测试剂盒及其制备、使用方法。
本发明的技术方案实现如下
强力霉素快速检测试剂盒，其特殊之处在于包括自下而上排列的支撑体5、用于快速吸收检测试剂的吸水层3、由硝酸纤维素膜制成的检测层2、带通孔1的盖板4；保藏号为：CCTCC NO:C201680杂交瘤细胞DC-C所分泌的、胶体金标记的抗强力霉素单克隆抗体C(简称：金标单抗C)；A液：含1-5％PEG20000、0.01-0.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；B液：含0.01-0.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；
所述金标单抗C是由强力霉素(DC)半抗原与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛法偶联合成强力霉素-牛血清白蛋白(DC-BSA)完全抗原，将其作为免疫原而制备的抗强力霉素单克隆抗体，经胶体金标记后而制；
所述的胶体金标记的单克隆抗体C的制备步骤如下：
1、以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为18-20nm；
2、将单克隆抗体C(3g/L抗体蛋白)，按200μl-3ml加入到上述的100ml胶体金溶液中，慢搅混匀；
3、向混合溶液中加入PEG20000，使其终浓度为1-5％，静置过夜；
4、将其离心8000-10000转/分，1-1.5小时，弃上清；
5、取离心沉淀，用含有1-5％PEG20000、0.05-0.25％吐温-20、0.02％叠氮化钠的0.01mol/L磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗C；
所述磷酸盐缓冲液的PH值为7.4，其中含有KCI 0.2g、NaCI 8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、蒸馏水1000ml；
所述步骤2中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混匀30-60min；
所述步骤1中所述胶体金溶液的制备方法为按一定的配比将氯金酸与柠檬酸三钠混合并加热制备成胶体金溶液；
所述步骤2中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混匀30-60min。
强力霉素快速检测试剂盒的使用方法，其特殊之处在于包括以下步骤：
1、取待测溶液5μl，点在盖板4的通孔1中的硝酸纤维素膜上，晾干；
2、在其上加含1-5％PEG20000的0.01mol/L PBS的A液100μl渗入，进行封闭；
3、加入100μl金标单抗C，渗入；
4、加入含0.05-0.25％吐温-20的0.01mol/LPBS的B液100μl渗入；
5、结果显示：硝酸纤维素膜上出现红色斑点为阳性，表示检测到有强力霉素残留；无红色斑点为阴性，表示检测不到强力霉素，或者强力霉素浓度低于2ug/ml。
本发明强力霉素快速检测试剂盒检测原理：
将待测样品滴加到硝酸纤维素膜上晾干固定，加封闭液A液封闭之后滴加金标单抗C，金标单抗C特异性和强力霉素进行结合，加洗液B液清洗之后，洗去未结合的金标抗体，利用胶体金红色颗粒显色原理呈现检测结果，在检测层硝酸纤维素膜上呈现红色斑点，表示有强力霉素残留；无红色斑点，表示无强力霉素或残留量极低。
本发明具有以下优点：
1、本发明的强力霉素快速检测试剂盒，从实际的养殖需要出发，将药物残留的检测搬到的养殖现场，使用时无需专门设施和操作技术，适合普通养殖户养殖现场检测，应用简单。2、具有检测快速、简便、准确、灵敏等特点，并具有较高的稳定性，在5-10min之内便可显示检测结果，一旦检出超标可以将养殖动物多养一段时间，让药物代谢直至残留低于国家标准，可以安全上市，这是最方便的一种解决药残问题的方法，减少了因药物残留对人体的伤害和养殖户因药残超标被退货造成巨大的损失，并改善因药物残留送检麻烦，周期长，收费高等原因造成99％以上养殖户在养殖动物上市前是不送检药残留的情况。3、在整个胶体金标记和试剂盒使用过程中牛血清白蛋白也可起到封闭作用，但为防止非特异性结合，均以适当浓度的、分子量为20000的PEG所代替，因免疫原种含有牛血清白蛋白，因此，用PEG代替牛血清白蛋白可杜绝因牛血清白蛋白而致的交叉反应，进一步保证了试剂盒的特异性。
附图说明
图1：本发明强力霉素快速检测试剂盒的结构示意图；
图2：DC-BSA的紫外特征图谱；
图3：DC的紫外特征图谱；
图4：BSA的紫外特征图谱；
图5：DC-BSA、BSA、DC三组图谱拟合后的紫外特征图谱；
图6：OVA的紫外特征图谱；
图7：DC-OVA的紫外特征图谱；
图8：DC的紫外特征图谱；
图9：DC-OVA，OVA，DC三组图谱拟合后的紫外特征图谱。
杂交瘤细胞株DC－C，其保藏编号为：CCTCC NO：C201680；保藏单位全称及简称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；保藏日期：2016年5月20日。
具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步描述如下：
实施例1
强力霉素完全抗原的制备：称取100mg BSA加入到10mL PBS(pH 7.4)中，称取30mgDC溶于PBS中，在DC溶液缓慢搅拌下逐滴加入BSA溶液，随后缓慢滴加200μL的GA(浓度25％)，加入的同时要不断搅拌，在避光及4℃条件下反应24h，以4000rpm转速离心5min，取上清液装入提前处理好的透析袋中，PBS为透析液透析3d，每8h更换一次透析液，透析完全后，偶联产物分装，-20℃保存。相同的方法制备包被原DC-OVA。合成原理图如下所示：
实施例2
紫外特征图谱
完全抗原DC-BSA的特征吸收峰为260nm，而DC的特征吸收峰为378nm，BSA的特征吸收峰为278nm，完全抗原的紫外特征峰发生了明显的位移，表明偶联成功。扫描结果见附图2-附图5所示。
完全抗原DC-OVA的特征吸收峰为265nm，而DC的特征吸收峰为378nm,OVA的特征吸收峰为280nm，完全抗原的紫外特征峰发生了明显的位移，表明偶联成功。扫描结果如附图6-附图9所示。
实施例3
抗强力霉素的单克隆抗体的制备：本发明的分泌抗强力霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其制备与选择的方法如下：
(1)用戊二醛法合成强力霉素完全抗原，包括免疫原DC-BSA，包被原DC-OVA；
(2)用免疫原DC-BSA免疫Balb/c小白鼠；
(3)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，培养得166株杂交瘤细胞；
(4)用包被原DC-OVA包板间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株；
(5)采用有限稀释法对其中1株阳性最强的杂交瘤细胞进行了克隆；
(6)通过间接ELISA法筛选出效价最高的抗强力霉素的单抗1B7-1F9二次克隆的细胞株制备的抗体，制备金标单抗。见表1
表1：单抗效价
实施例4
本发明的强力霉素单抗C的特异性鉴定：为了确定单克隆抗体是否能够特异性结合强力霉素，就要对所得抗体做特异性检测及交叉实验，确定单抗与其他抗生素是否存在交叉现象。分别配置0.1μg/ml的强力霉素、土霉素、新诺明、盐酸诺氟沙星及氟苯尼考，采用竞争ELISA的检测方法，对各种药物进行交叉实验。以DC-OVA为包被原，纯化后的单抗为第一抗体，加入一抗后立即加入上述几种药物，每孔加100μl，以PBS作为对照，加入二抗及底物缓冲液后，测定各个孔的OD值。结果显示强力霉素单抗C与这四种药物均不存在交叉现象，强力霉素与阳性对照比较，存在差异，说明本实验制备的单抗与强力霉素发生特异性结合，与其他抗生素不能够特异结合。实验结
果参见表2。
表2单抗交叉实验(n＝6)
注：*强力霉素组与阳性相比较，其P值为0.0232＜0.05，说明存在显著差异。
实施例5
胶体金标记的单克隆抗体C的制备步骤如下：
1、胶体金的制备：10-20nm胶体金颗粒制备，将0.01％氯金酸溶液250ml与1％柠檬酸钠6.65ml混合，加热至100摄氏度，制成胶体金溶液，该溶液的pH值：用0.2M碳酸钾调至8.2，备用；
2、金标单抗C的制备：
抗强力霉素单抗浓度为3g/L时，100ml胶体金标记的单抗量为1.5ml，按此比例将抗强力霉素单抗加入到胶体金溶液中，慢搅50min，加入3％PEG20000，4℃过夜；然后将其在4℃下，8000r离心60min，离心沉淀，弃上清，用含有3％PEG20000和0.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(KCL 0.2g,NaCL 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO412H2O 2.9g，蒸馏水1000ml,pH 7.4)悬起，再加叠氮化钠将浓度调至0.02％，即制成金标单抗C。
实施例6
本发明的强力霉素快速检测试剂盒检测的最低残留量为2ug/ml。高于农业部2002年12月发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定的皮脂中最大残留量为300μg/kg，肝脏中最大残留量为300μg/kg，肾脏中最大残留量为600μg/kg，动物性食品肌肉中残留量为100μg/kg，其中肾脏残留检测高出3倍，可以用于池边快速筛选。结果见表3
表3：金标单抗C最佳工作浓度
注：++表示斑点颜色为紫红色，检测结果为强阳性；+表示斑点颜色为红色，检测结果为阳性；—表示斑点为无色，检测结果为阴性。
实施例7
本发明的强力霉素快速检测试剂盒的使用方法，即强力霉素的检测步骤：取待测样品5μl点于硝酸纤维素膜上晾干，加A液(封闭液)100μl渗入，然后加金标单抗C 100μl渗入，加B液(洗液)100μl渗入，5分钟读结果。
阳性结果：检测层硝酸纤维素膜上呈现红色斑点，表示有强力霉素残留；
阴性结果：检测层硝酸纤维素膜上无红色斑点，表示检测不到强力霉素或强力霉素浓度低于2ug/ml。

Claims (7)

1.强力霉素快速检测试剂盒，其特殊之处在于包括自下而上排列的支撑体、用于快速吸收检测试剂的吸水层(3)、由硝酸纤维素膜制成的检测层(2)、带通孔(1)的盖板(4)，保藏号为：CCTCC NO:C201680杂交瘤细胞DC-C所分泌的、胶体金标记的抗强力霉素单克隆抗体C(简称：金标单抗C)；A液：含1-5％分子量为20000的聚乙二醇(PEG20000)的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；B液：含0.01-0.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述强力霉素快速检测试剂盒，其特征在于：所述的金标单抗C：是由小分子半抗原强力霉素(DC)与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛法偶联合成的强力霉素-牛血清白蛋白(DC-BSA)完全抗原，将其作为免疫原而制备的抗强力霉素单克隆抗体，经胶体金标记后而致。
3.根据权利要求1所述强力霉素快速检测试剂盒，其特征在于：所述的金标单抗C，其制备方法如下：
(1)、制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为18-20nm；
(2)、将单克隆抗体C(3g/L抗体蛋白)，按200μl-3ml加入到上述的100ml胶体金溶液中，慢搅混匀；
(3)、向混合溶液中加入PEG20000，使其终浓度为1-5％，静置过夜；
(4)、离心8000-10000转/分，1-1.5小时，弃上清；
(5)、取离心沉淀，用含有0.05-0.25％吐温-20、0.02％叠氮化钠的0.01mol/L磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗C。
4.按照权利要求3所述的强力霉素快速检测试剂盒，其特征在于步骤(1)中所述胶体金溶液的制备方法为按一定的配比将氯金酸与柠檬酸三钠混合并加热制备成胶体金溶液。
5.按照权利要求3所述的强力霉素快速检测试剂盒，其特征在于步骤(2)中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混匀30-60min。
6.强力霉素快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：将待测样品滴加到硝酸纤维素膜上，晾干，然后加A液渗入，加金标单抗C渗入，加B 液渗入，5-10分钟，便可在硝酸纤维素膜上显示检测结果。
7.按照权利要求6所述的强力霉素快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取待测溶液5μl，点在盖板(4)的通孔(1)中的硝酸纤维素膜上，晾干；
(2)在其上加含1-5％PEG20000的0.01mol/LPBS的A液100μl渗入，进行封闭；
(3)加入100μl金标单抗C，渗入；
(4)加入含0.05-0.25％吐温-20的0.01mol/LPBS的B液100μl渗入；
(5)结果显示：硝酸纤维素膜上出现红色斑点为阳性，表示检测到有强力霉素残留，无红色斑点为阴性，表示检测不到强力霉素或者强力霉素浓度低于2ug/ml。
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