KR100332427B1

KR100332427B1 - 색소표식중합항체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100332427B1
Application number: KR1019990017364A
Authority: KR
Inventors: 시게토노부유키; 미야자키진세이; 히라이마히토
Original assignee: 모리시타 요이찌; 마쯔시다덴기산교 가부시키가이샤
Priority date: 1998-05-14
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2002-04-13
Also published as: CN1238218A; KR19990088307A; EP0957361A2; EP0957361A3; JPH11322798A; CN1135113C

Abstract

검출대상물이 저농도이어도, 검출이 가능한 고감도의 색소표식중합항체가 개시되어 있다. 이 중합항체는 다관능성 시약을 통하여 중합한 중합항체 및 이하의 식(1) 또는 식(2)로 나타낸 시아닌계 색소로 이루어지며, 상기 중합항체가 상기 시아닌계 색소로 표식되어 있다.

(단, R₁및 R₂는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알칼리금속,n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)

Description

색소표식중합항체 및 그 제조방법{Dye-labeled and polymerized antibody and method for preparing the same}

본 발명은, 시아닌계 색소로 표식된 중합항체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

항체를 색소로 표식한 색소표식항체는, 시료액 중에 포함되는 항원과 특이적으로 반응하고, 또한 시인성이 있기 때문에, 예컨대 면역학적 항원항체반응을 이용하여, 시료액 중에 포함되는 검체의 검출을 행하는 면역센서에 사용되고, 각종 의료기관에서의 진단에 활용되고 있다.

항체를 표식하는 색소로서는, 높은 몰흡광계수를 갖고, 반응성이 높은 시아닌계 색소가 사용되는 경우가 많다(Bioconjugate Chemistry V0L.4, No.2, pp105-111, 1993).

이러한 시아닌계 색소는, 그 관능기가 항체의 아미노기 또는 카르복실기와 반응하여 공유결합하고, 1분자의 항체에 대하여 20∼50분자의 상기 색소가 결합한다.

이렇게 하여 제작된 시아닌계 색소표식항체는, 일반적으로 시인성이 좋고, 예컨대 면역 크로마토그래피에 도입되어, 임산부의 소변 중에만 존재하는 인간융모성(絨毛性) 성선자극호르몬 등의 미량성분을 검출하는 데 효율적으로 사용하고 있다.

통상, 1분자의 항체는, 항원과 반응하는 부위가 2군데로 적기 때문에 항원과의 반응감도가 높지 않다.

그 때문에, 종래의 색소표식항체를 면역센서 등에 이용한 경우, 그 감도에 한계가 있고, 시료액 중에 포함되는 검출대상물(항원)의 농도가 낮으면, 그 검출이 곤란하였다.

본 발명은, 상기 과제를 감안하여, 검출대상물이 저농도이더라도, 그 검출이 가능한 고감도의 색소표식중합항체 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 그와 같은 색소표식중합항체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 있어서의 면역크로마토센서의 구성을 개략적으로 나타낸 사시도이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1 : 판형상지지체 2 : 제1유리여과지

3 : 표식항체부 4 : 항체고정화부

5 : 항체고정용막 6 : 제2유리여과지

본 발명은, 다관능성 시약을 통해 중합한 중합항체, 및 이하의 식(1) 또는 식(2)로 나타낸 시아닌계 색소로 이루어지며, 상기 중합항체가 상기 색소로 표식된 색소표식중합항체를 제공한다.

(단, R₁및 R₂는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알칼리금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)

중합한 항체는, 항원과 반응하는 부위를 다수 가지는 다가 항체이기 때문에, 통상의 2가 항체에 비해서, 항원과의 결합감도가 뛰어나다.

또한, 중합항체 1분자에 결합하는 색소의 수는, 항체 1분자의 경우보다도 많아지기 때문에, 시인성이 향상한다.

따라서, 본 발명에 의한 색소표식중합항체를, 예컨대 면역 크로마토그래피에 사용하면, 측정대상물(검체)의 농도가 낮은 경우라도, 검체를 고감도로 검출할 수있다. 또한 그 고감도로부터, 본 발명의 색소표식중합항체는 바이오센서에도 적용가능하다.

본 발명에 의한 색소표식중합항체는, 상기 색소의 골격이 상기 시아닌계 색소의 숙신이미딜기 유래의 아실탄소와 상기 중합항체의 아미노기 유래의 질소와의 공유결합에 의해, 상기 중합항체에 결합하고 있는 구성인 것이 바람직하다.

본 발명의 색소표식중합항체에서의 항체의 중합도는, 통상 2∼50의 범위인 것이 좋다.

본 발명은, 중성 또는 약알칼리성의 인산완충액 중에서 다관능성 시약을 사용하여 항체를 중합하는 공정, 및 이 완충액 중에 식(1) 또는 식(2)로 나타낸 시아닌계 색소를 첨가하여 상기 중합된 항체를 표식하는 공정을 포함하는 색소표식중합항체의 제조방법을 제공한다.

이 때의 인산완충액의 pH는 7.0∼8.0의 범위인 것이 바람직하다.

본 발명의 색소표식중합항체에 이용할 수 있는 항체는, 특히 제한되어 있지 않으며, 그 유래나 서브클래스 등에 관계없이 사용할 수 있다. 예컨대 면역글로브린(Ig)으로 하여, 마우스 IgG, 마우스 IgM, 마우스 IgA, 마우스 IgE, 래트 IgG, 래트 IgM, 래트 IgA, 래트 IgE, 토끼 IgG, 토끼 IgM, 토끼 IgA, 토끼 IgE, 염소 IgG, 염소 IgM, 염소 IgE, 염소 IgA, 양 IgG, 양 IgM, 양 IgA, 양 IgE 등을 들 수 있다. 이들 항체는 시판품을 입수하거나, 직접 그 동물로부터 채취하여도 좋다.

다관능성 시약으로는, 항체와 결합가능한 관능기(숙신이미딜기, 피리딜이황화물기 등)를 동일분자 내에 2개 이상 갖는 시약을 들 수 있다. 예컨대 식(3)으로나타낸 디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트), 식(4)로 나타낸 비스(술포숙신이미딜)스벨레이트, 식(5)로 나타낸 숙신이미딜타트레이트, 식(6)으로 나타낸 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트), 식(7)로 나타낸 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티 오)프로피오네이트 등이 있다.

식(1) 또는 식(2)로 나타낸 시아닌계 색소는, 청색계통의 색소로서, 장파장영역에 흡수를 하기 때문에, 불순물의 영향을 쉽게 받지 않는다. 그 때문에 흡광도에 따라 특정물질을 검출하는 센서에 유용하다.

식(1) 또는 식(2)에서, X로 표시되는 할로겐으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 들 수 있다. 또한 M으로 표시되는 금속으로서는, 리듐, 나트륨 및 칼륨 등을 들 수 있다.

이하, 식(1)로 나타낸 시아닌계 색소의 합성경로의 일예를 나타낸다.

우선, 히드라디노벤젠술폰산(8)과 이소프로필메틸케톤을 산성용매에 용해하여 가열함으로써 인도레늄술포네이트(9)를 제작한다. 그리고 인도레늄술포네이트 (9)의 알콜용액에 금속수산화물포화의 알콜용액을 가함으로써, 인도레늄술포네이트의 금속염(10)을 얻는다.

다음에, 상기 금속염(10)의 유기용매용액에 할로겐화 알킬산을 가하고, 가열하여 카르복시알킬 인도레늄술포네이트의 금속염(11)을 얻는다. 상기 포화지방산의 탄소수는, 물에의 용해성을 고려하여 1∼4가 바람직하다.

그리고, 상기 금속염(11)과 테트라메톡시프로판을 염기성 유기용매에 용해하고, 가열함으로써 카르본산 유도체(12)를 제작하고, 마지막으로 카르본산 유도체 (12)의 유기용매용액 중에 히드록시호박산이미드와, 축합제로서 디시클로헥실카르보디이미드를 가하여 교반함으로써, 식(1)로 나타낸 시아닌계 표식색소를 얻는다.

식(2)로 나타낸 시아닌계 색소를 합성하면, 테트라메톡시프로판 대신에 글루타콘알데히드테트라메틸아세탈을 이용한다.

그리고, 식(1), 식(2), 식(11) 및 식(12)로 나타낸 각 화합물에 포함되는 할로겐으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 또한 식(1), 식(2) 및 식(10)∼식(12)로 나타낸 각 화합물에 포함되어 있는 금속으로서는, 예컨대 리튬, 나트륨, 칼륨 등을 들 수 있다.

이하, 다관능성 시약에 의한 항체의 중합반응의 메카니즘을 설명한다.

우선, 식(13)에 나타낸 바와 같이, 항체에 대하여, 다관능성 시약(숙신이미딜기를 2개 이상 갖는 디티오비스(술포숙신이미딜플로피오네이트)를 배합하면, 식 (14)에 나타낸 바와 같이 상기 시약의 하나의 숙신이미딜기의 에스테르결합부분에, 항체의 아미노기가 접근한다.

그리고, 식(15)에 나타낸 바와 같이, 상기 아미노기와 상기 에스테르결합부분이 반응하여, 상기 아미노기로부터 수소원자를 1개 빼앗긴다. 그리고 이 아미노기에서 떨어진 수소원자는, 상기 숙신이미딜기의 숙신이미드와 결합한다. 숙신이미드는 히드록시숙신이미드로 되어 숙신이미딜기에서 떨어지고, 이와 동시에 상기 숙신이미딜기의 나머지 부분과, 상기 수소원자를 1개 빼앗긴 아미노기가 아미드결합을 형성하고, 이 아미드결합에 의해 상기 시약과 상기 항체가 결합한다.

상기 시약의 다른 숙신이미딜기에 있어서도 상기와 같은 반응이 일어나, 식(16)으로 나타낸 바와 같이, 상기 시약과 다른 항체가 아미드결합에 의해 결합한다. 이 반응을 되풀이하는 것에 의해 항체가 중합된다.

또, 숙신이미딜기를 갖는 시아닌계 표식색소와, 아미노기를 갖는 항체의 결합반응의 메카니즘도 상기와 동일하다.

이하, 구체적인 실시예를 들어, 본 발명을 상세하게 설명한다.

(1) 마우스 IgG의 중합

10mg(6.667×10^-5mmol)의 마우스 IgG(이하, IgG로 약칭함)를 1ml의 인산완충액(이하, PBS용액이라 함)에 용해하였다. 이것을 실온에서 교반하면서 디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트)(피어스사 제품;이하, DTSSP라 함)의 PBS용액 0.1ml를 적하하였다. 적하한 DTSSP의 PBS용액 중에는 4.057mg(0.006667mmol, 100등량)의 DTSSP가 포함되어 있었다.

그 후, 35℃에서 30분간 교반한 후, 세파로스겔(상품명:세파덱스 G25M 칼럼)을 사용하여 여과하고, 약 6ml의 다량화 IgG(이하, IgGagg.라 함)의 PBS용액을 얻었다. 얻어진 용액의 농도를 다음과 같이 하여 구하였다.

얻어진 용액을 0.5ml 취하고, 280nm에서의 흡광도를 측정한 결과, 흡광도는 2.43이었다. 관측된 280nm에서의 흡광은 IgG에 연유되기 때문에, 다량화 IgG의 IgG 1분자의 농도 [IgGagg.]는 하기에 나타낸 바와 같이 하여 구할 수 있다. 단 IgG의 280nm에서의 몰흡광계수를 2.099×10⁵로 하였다.

[IgGagg.]=2.43/2.099×10⁵=1.158×10^-5(M)

(2) 중합항체의 색소에 의한 표식

식(1) 또는 식(2)에 나타낸 색소를 0.2ml의 PBS용액에 용해하고(총단백량 400배 등량), 색소용액(이하, SLIC5라 함) 28.2mg을 조제하였다. 단 식(1) 또는 식 (2)에서의 X는 요오드, M은 칼륨, 탄소수 n은 2인 것을 이용하였다.

그리고, SLIC5을 (1)에서 얻어진 IgGagg. 용액(총항체량을 10mg로 함)에 천천히 적하하였다. 그 후 이것을 4℃에서 20시간 정치한 후, 미반응의 색소분자를 제거하기 위하여, PBS에 방부제로서 나트륨아디드를 첨가한 용액 20리터에 대하여 투석(透析)하고, 약 6ml의 SLIC5 표식중합항체인 PBS용액을 얻었다.

얻어진 SLIC5 표식중합체인 IgG 1분자당의 SLIC5의 분자수를 다음과 같이 하여 구하였다.

얻어진 용액의 280nm 및 640nm에서의 흡광도를 측정한 결과, 흡광도는 각각 12.0 및 45.5이었다. 중합항체는 640nm에서 흡수하지 않기 때문에, 관측된 흡광은 결합한 SLIC5에 연유되는 것이다. 따라서 SLIC5의 농도 [SLIC5]은 다음과 같이 구할 수 있다. 단 SLIC5의 640nm에서의 몰흡광계수를 1.01×10⁵으로 하였다.

[SLIC5]=45.5/1.01×10⁵=4.505×10^-4(M)

또한, 관측된 280nm의 흡광은 중합항체의 IgG에 연유한 것이지만, 결합하고 있는 SLIC5가 280nm에서도 흡수하므로, 이 영향을 빼고 중합항체의 IgG분자의 농도 [IgGagg.]를 다음과 같이 구할 수 있다. 단 중합항체에 연유하는 280nm의 흡광도를 Ab_280,IgG로 하고, SLIC5의 280nm에서의 몰흡광계수를 2.11×10⁴, 중합항체의 IgG의 280nm에서의 몰흡광계수를 2.099×10⁵로 하였다.

Ab_280,IgG＝12.0－(4.505×10^-4×2.11×10⁴)＝2.494

[IgGagg.]＝2.494/2.099×10⁵＝1.188×10^-5(M)

따라서, SLIC5 표식중합항체의 IgG 1분자당 결합한 SLC1의 분자수는 다음과 같이 나타내게 된다.

[SLIC5]/[IgGagg.]=4.505×10^-4/1.188×10^-6=37.9(개)

(3) 색소표식중합항체의 평가

(2)에서 얻어진 색소표식중합항체를 면역크로마토센서를 사용하여, 색소표식중합항체의 응집에 의한 발광도(감도)를 640nm에서의 흡광도를 측정함으로써 조사하였다.

도 1은, 면역크로마트센서의 개략구성을 나타낸 사시도이다. 폴리염화비닐등의 플라스틱제의 판형상지지체(1) 위에, 제1유리여과지(2), 니트로셀룰로스제의 항체고정용막(5) 및 제2유리여과지(6)가, 이 순서로 배치되어 있다. 그리고 제1유리여과지(2)의 항체고정용막(5)에 접하는 쪽의 끝단부에는, (2)에서 얻어진 색소표식중합항체를 함침시켜 두고, 이 부분이 표식항체부(3)로 되어 있다. 또한 항체고정용막(5)의 소정 장소에, 색소표식중합항체와 같은 항원과 반응하는 항체가 흡착에 의해 고정화되어, 항체고정화부(4)로 되어 있다.

이러한 구성의 면역크로마트센서를 사용한 흡광도의 측정은, 예컨대 다음과 같이 하여 행해진다.

도 1의 제1유리여과지(2)의 항체고정용막(5)에 접하는 쪽과 반대측의 끝단부에 시료액을 적하하면, 크로마토그래피의 원리에 의해, 시료액은 제1유리여과지(2)로부터 제2유리여과지(6)를 향해 이동한다. 그리고 표식항체부(3)에 있어서, 시료액 중의 항원에 색소표식중합항체가 결합한다. 그리고 이 표식항체와 결합한 항원을 포함하는 시료액은, 항체고정화부(4)로 이동하고, 여기서 상기 항원은 고정화항체와 결합하여 여기에 고정된다. 나머지의 시료액은 항체고정용막(5)을 계속 이동하여 제2유리여과지(6)에 흡수된다.

흡광도는, 항체고정화부(4)에 파장 640nm의 빛(Ll)을 조사하고, 그 반사광 (L2)을 측정함으로써 구하였다.

비교예로서, 항체를 중합하지 않은 이외에는, 상기와 같은 방법에 의해 색소표식항체를 제작하고, 이것을 상기와 같이 하여 면역크로마트센서에 사용하여 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 의한 색소표식중합항체를 사용한 경우에, 그 흡광도는 약 O.8이며, 색소표식항체를 사용한 경우의 흡광도는 약 0.08이었다.

이 결과로부터, 본 발명의 실시예의 색소표식중합항체의 감도는, 비교예 감도의 약 10배라고 말할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명의 색소표식중합항체는, 항원과의 반응부위를 다수 갖고 있으므로, 고감도인 것이다. 따라서 예를들어 본 발명의 색소표식중합항체를 면역 크로마토그래피를 이용한 센서에 도입함으로써, 종래법으로 제작한 표식항체를 사용하였을 때보다도 고감도의 센서를 제작할 수가 있다.

Claims

다관능성 시약을 통하여 중합한 중합항체 및 이하의 식(1) 또는 식(2)로 나타낸 시아닌계 색소로 이루어지며, 상기 중합항체는 상기 시아닌계 색소로 표식되어 있는 색소표식중합항체.

(단, R₁및 R₂는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알칼리금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)
제 1 항에 있어서, 상기 색소의 골격이, 상기 시아닌계 색소의 숙신이미딜기 유래의 아실탄소와 상기 중합항체의 아미노기 유래의 질소와의 공유결합에 의해 상기 중합항체에 결합하고 있는 색소표식중합항체.
중성 또는 약알칼리성의 인산완충액 중에서 다관능성 시약을 사용하여 항체를 중합하는 공정, 및 이 완충액 중에 식(1) 또는 식(2)로 나타낸 시아닌계 색소를 첨가하여 상기 중합된 항체를 표식하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 색소표식중합항체의 제조방법.

(단, R₁및 R₂는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알칼리금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)