JPH11322798A

JPH11322798A - 色素標識重合抗体およびその製造方法

Info

Publication number: JPH11322798A
Application number: JP10132426A
Authority: JP
Inventors: Osayuki Shigefuji; 修行重藤; Kimimasa Miyazaki; 仁誠宮崎; Masato Hirai; 真人平井
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1998-05-14
Filing date: 1998-05-14
Publication date: 1999-11-24
Also published as: KR19990088307A; CN1135113C; KR100332427B1; CN1238218A; EP0957361A2; EP0957361A3

Abstract

(57)【要約】【課題】検出対象物が低濃度であっても、その検出が
可能な高感度の色素標識重合抗体を提供することを目的
とする。【解決手段】本発明による色素標識重合抗体は、多官
能性試薬を介して重合した重合抗体が、次式（ただし、
Ｒ₁およびＲ₂は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン、
Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示
す。）で示されるシアニン系色素で標識されたものであ
る。【化１】

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、シアニン系色素で
標識された重合抗体およびその製造方法に関するもので
ある。【０００２】【従来の技術】抗体を色素で標識した色素標識抗体は、
試料液中に含まれる抗原と特異的に反応し、かつ視認性
があるため、例えば、免疫学的抗原抗体反応を利用し
て、試料液中に含まれる検体の検出を行う免疫センサに
使用され、各種医療機関での診断に活用されている。抗
体を標識する色素としては、高いモル吸光係数を有し、
反応性の高いシアニン系色素が使用される場合が多い
（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶ
ＯＬ.４Ｎｏ.２,ｐｐ１０５−１１１,１９９３）。【０００３】このようなシアニン系色素は、その官能基
が抗体のアミノ基またはカルボキシル基と反応して共有
結合し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色
素が結合する。このようにして作製されたシアニン系色
素標識抗体は、一般に視認性がよく、例えば免疫クロマ
トグラフィーに導入されて、妊婦の尿中にのみ存在する
ヒト絨毛性ゴナドトロピン等の微量成分を検出するのに
有効に用いられている。【０００４】【発明が解決しようとする課題】通常、１分子の抗体
は、抗原と反応する部位が２か所と少ないため、抗原と
の反応感度が高くない。そのため、従来の色素標識抗体
を免疫センサ等に利用した場合、その感度に限界があ
り、試料液中に含まれる検出対象物（抗原）の濃度が低
いと、その検出が困難であった。本発明は、上記課題に
鑑み、検出対象物が低濃度であっても、その検出が可能
な高感度の色素標識重合抗体およびその製造方法を提供
することを目的とする。【０００５】【課題を解決するための手段】本発明による色素標識重
合抗体は、多官能性試薬を介して重合した重合抗体が、
式（１）または式（２）で示されるシアニン系色素で標
識されたものである。【０００６】【化３】【０００７】（ただし、Ｒ₁およびＲ₂は水素またはアル
キル基、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、
ｎは１〜４の整数を示す。）【０００８】重合した抗体は、抗原と反応する部位を多
数有する多価抗体であるため、通常の２価の抗体に比べ
て、抗原との結合感度が優れる。また、重合抗体１分子
に結合する色素の数は、抗体１分子の場合よりも多くな
るため、視認性が向上する。したがって、本発明による
色素標識重合抗体を、例えば、免疫クロマトグラフィー
に用いれば、測定対象物（検体）の濃度が低い場合で
も、検体を高感度に検出できる。また、その高感度か
ら、本発明の色素標識重合抗体は、バイオセンサーにも
適用可能である。【０００９】本発明による色素標識重合抗体は、前記シ
アニン系色素のスクシンイミジル基由来のアシル炭素と
前記重合抗体のアミノ基由来の窒素とが共有結合するこ
とにより、前記色素の骨格が重合抗体に結合している構
成であるのが好ましい。本発明の色素標識重合抗体にお
ける抗体の重合度は、通常、２〜５０の範囲であるのが
よい。【００１０】本発明による色素標識重合抗体の製造方法
は、中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中で多官能
性試薬を用いて抗体を重合する工程、およびこの緩衝液
中に式（１）または式（２）で示されるシアニン系色素
を添加して前記重合された抗体を標識する工程を含む。
このときのリン酸緩衝液のｐＨは、７．０〜８．０の範
囲であるのが好ましい。【００１１】本発明の色素標識重合抗体に用いることが
できる抗体は、特に制限されず、その由来やサブクラス
等に関係なく使用できる。例えば、イムノグロブリン
（Ｉｇ）として、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、マウス
ＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、
ラットＩｇＡ、ラットＩｇＥ、ラビットＩｇＧ、ラビッ
トＩｇＭ、ラビットＩｇＡ、ラビットＩｇＥ、ヤギＩｇ
Ｇ、ヤギＩｇＭ、ヤギＩｇＥ、ヤギＩｇＡ、ヒツジＩｇ
Ｇ、ヒツジＩｇＭ、ヒツジＩｇＡ、ヒツジＩｇＥ等が挙
げられる。これらの抗体は、市販品として入手しても、
直接その動物から採取してもよい。【００１２】多官能性試薬には、抗体と結合可能な官能
基（スクシンイミジル基、ピリジルジスルフィド基等）
を同一分子内に２つ以上有する試薬が挙げられる。例え
ば、式（３）で示されるジチオビス（スルホスクシンイ
ミジルプロピオネート）、式（４）で示されるビス（ス
ルホスクシンイミジル）スベレート、式（５）で示され
るジスクシンイミジルタートレート、式（６）で示され
るエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネ
ート）、式（７）で示されるＮ−スクシンイミジル−３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート等がある。【００１３】【化４】【００１４】【化５】【００１５】式（１）または式（２）で示されるシアニ
ン系色素は、青色系統の色素で、長波長領域に吸収を持
つため、不純物の影響を受けにくい。そのため、機械で
確認するセンサー等に有効に利用される。式（１）また
は式（２）において、Ｘで示されるハロゲンとしては、
例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられ
る。また、Ｍで示される金属としては、リチウム、ナト
リウムおよびカリウム等が挙げられる。【００１６】【発明の実施の形態】以下に、式（１）で示されるシア
ニン系色素の合成経路の一例を示す。【００１７】【化６】【００１８】まず、ヒドラジノベンゼンスルホン酸
（８）とイソプロピルメチルケトンとを酸性溶媒に溶解
し加熱することによってインドレニウムスルホネート
（９）を作製する。そして、インドレニウムスルホネー
ト（９）のアルコール溶液に金属水酸化物飽和のアルコ
ール溶液を加えることによって、インドレニウムスルホ
ネートの金属塩（１０）を得る。次に、前記金属塩（１
０）の有機溶媒溶液にハロゲン化アルキル酸を加えて、
加熱してカルボキシアルキルインドレニウムスルホネー
トの金属塩（１１）を得る。ハロゲン化アルキル酸の炭
素数は、水への溶解性を考え、１〜４が好ましい。そし
て、前記金属塩（１１）とテトラメトキシプロパンを塩
基性有機溶媒に溶解し、加熱することによってカルボン
酸誘導体（１２）を作製し、最後に、前記カルボン酸誘
導体（１２）の有機溶媒溶液中に、ヒドロキシコハク酸
イミドと、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミ
ドとを加えて攪拌することにより、式（１）で示される
シアニン系標識色素を得る。式（２）で示されるシアニ
ン系色素を合成するには、テトラメトキシプロパンの代
わりに、グルタコンアルデヒドテトラメチルアセタール
を用いる。【００１９】なお、式（１）、式（２）式（１１）およ
び式（１２）で示される各化合物に含まれるハロゲンと
しては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられ
る。また、式（１）、式（２）、式（１０）〜（１２）
で示される各化合物に含まれる金属としては、例えばリ
チウム、ナトリウム、カリウムなどがあげられる。【００２０】以下に、多官能性試薬による抗体の重合反
応のメカニズムを説明する。【００２１】【化７】【００２２】まず、式（１３）に示すように、抗体に対
し、多官能性試薬（スクシンイミジル基を２つ以上有す
るジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネー
ト））を配合すると、式（１４）に示すように、前記試
薬の一つのスクシンイミジル基のエステル結合部分に、
抗体のアミノ基が接近する。そして、式（１５）に示す
ように、前記アミノ基と前記エステル結合部分とが反応
し、前記アミノ基から水素原子が１個奪われる。そし
て、このアミノ基から脱離した水素原子は、前記スクシ
ンイミジル基のスクシンイミドと結合する。スクシンイ
ミドはヒドロキシスクシンイミドとなってスクシンイミ
ジル基から脱離し、これと同時に、前記スクシンイミジ
ル基の残りの部分と、前記水素原子が一個奪われたアミ
ノ基とがアミド結合を形成し、このアミド結合によって
前記試薬と前記抗体とが結合する。前記試薬の他のスク
シンイミジル基においても前記と同様の反応が起き、式
（１６）に示すように、前記試薬と他の抗体とがアミド
結合により結合する。この反応を繰り返すことにより抗
体が重合される。【００２３】なお、シアニン系色素のスクシンイミジル
基と、抗体のアミノ基の結合反応のメカニズムも上記と
同様である。【００２４】【実施例】以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明を
詳細に説明する。【００２５】（１）マウスＩｇＧの重合１０ｍｇ（６．６６７×１０^-5ｍｍｏｌ）のマウスＩｇ
Ｇ（以下、ＩｇＧと略す。）を１ｍｌのリン酸緩衝液
（以下、ＰＢＳという。）に溶解した。これを室温で撹
拌しながら、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロ
ピオネート）（ピアス社製；以下、ＤＴＳＳＰとい
う。）のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを滴下した。滴下したＤ
ＴＳＳＰのＰＢＳ溶液中には、４．０５７ｍｇ（０．０
０６６６７ｍｍｏｌ、１００等量）のＤＴＳＳＰが含ま
れていた。この後、３５℃で３０分間攪拌した後、セフ
ァロースゲル（ファルマシア社製；セファデックスＧ２
５Ｍカラム）を用いて濾過し約６ｍｌの多量化ＩｇＧ
（以下、ＩｇＧａｇｇ．とする。）のＰＢＳ溶液を得
た。得られた溶液の濃度を、つぎのようにして求めた。【００２６】得られた溶液を０．５ｍｌ取り、２８０ｎ
ｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は２．４３であっ
た。観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するも
のであるので、多量化ＩｇＧのＩｇＧ１分子の濃度［Ｉ
ｇＧａｇｇ．］は、下記に示すようにして求めることが
できる。ただし、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光
係数を２．０９９×１０⁵とした。 [ＩｇＧａｇｇ.]＝２.４３／２.０９９×１０⁵＝１.１
５８×１０^-5（Ｍ）【００２７】（２）重合抗体の色素標識式（１）で示す色素を０．２ｍｌのＰＢＳに溶解し（総
タンパク量の４００倍等量）、色素溶液（以下、ＳＬＩ
Ｃ５とする。）２８．２ｍｇを調製した。ただし、式
（１）におけるＸはヨウ素、Ｍはカリウム、炭素数ｎは
２のものを用いた。そして、ＳＬＩＣ５を、（１）で得
られたＩｇＧａｇｇ．溶液（総抗体量を１０ｍｇとす
る。）にゆっくりと滴下した。その後、これを４℃で２
０時間静置した後、未反応の色素分子を除くため、ＰＢ
Ｓに防腐剤としてナトリウムアジドを添加した溶液２０
リットルに対して透析して、約６ｍｌのＳＬＩＣ５標識
重合抗体のＰＢＳ溶液を得た。【００２８】得られたＳＬＩＣ５標識重合抗体のＩｇＧ
１分子あたりのＳＬＩＣ５の分子数をつぎのようにして
求めた。得られた溶液の２８０ｎｍ及び６４０ｎｍにお
ける吸光度を測定した結果、吸光度はそれぞれ１２．０
および４５．５であった。重合抗体は６４０ｎｍに吸収
を持たないので、観測された吸光は結合したＳＬＩＣ５
に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ５の濃度
［ＳＬＩＣ５］は、次のように求めることができる。た
だし、ＳＬＩＣ５の６４０ｎｍにおけるモル吸光係数を
１．０１×１０⁵とした。［ＳＬＩＣ５]＝４５．５／１．０１×１０⁵＝４．５０
５×１０^-4（Ｍ）【００２９】また、観測された２８０ｎｍの吸光は重合
抗体のＩｇＧに由来するものであるが、結合しているＳ
ＬＩＣ５が２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を
差し引いて重合抗体のＩｇＧ分子の濃度［ＩｇＧａｇ
ｇ．］を次のように求めることができる。ただし、重合
抗体に由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ_280,IgG.と
し、ＳＬＩＣ５の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を
２．１１×１０⁴、重合抗体のＩｇＧの２８０ｎｍにお
けるモル吸光係数を２．０９９×１０⁵とした。Ａｂ_280,IgG＝１２．０−（４．５０５×１０^-4×２．
１１×１０⁴）＝２．４９４［ＩｇＧａｇｇ．］＝２．４９４／２．０９９×１０⁵
＝１．１８８×１０^-5（Ｍ）従って、ＳＬＩＣ５標識重合抗体のＩｇＧ１分子当たり
に結合したＳＬＩＣ５の分子数は、次に示すようにな
る。［ＳＬＩＣ５］／[ＩｇＧａｇｇ．]＝４．５０５×１０
^-4／１．１８８×１０^{-5＝３７．９（個）} ^{【００３０】（３）色素標識重合抗体の評価} ^{（２）で得られた色素標識重合抗体を免疫クロマトセン}
^{サーに用い、色素標識重合抗体の凝集による発光度（感}
^{度）を６４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより}
^{調べた。図１は、免疫クロマトセンサーの概略構成を示}
^{す斜視図である。ポリ塩化ビニル等のプラスチック製の}
^{板状支持体１の上に、第１のガラスろ紙２、ニトロセル}
^{ロース製の抗体固定用膜５および第２のガラスろ紙６が}
^{、この順に配置されている。そして、第１のガラスろ紙}
^{２の抗体固定用膜５に接する側の端部には、（２）で得}
^{られた色素標識重合抗体を含浸させてあり、この部分が}
^{標識抗体部３となっている。また、抗体固定用膜５の所}
^{定の場所に、色素標識重合抗体と同じ抗原と反応する抗}
^{体が吸着により固定化され、抗体固定化部４となってい}
^る。 ^{【００３１】}
^{このような構成の免疫クロマトセンサーを用いての吸光}
^{度の測定は、例えば次のようにして行われる。図１の第}
^{１のガラスろ紙２の抗体固定用膜５に接する側と反対側}
^{の端部に試料液を滴下すると、クロマトグラフィーの原}
^{理により、試料液は、第１のガラスろ紙２から第２のガ}
^{ラスろ紙６へ向かって移動する。そして、標識抗体部３}
^{において、試料液中の抗原に色素標識重合抗体が結合す}
^{る。そして、この標識抗体と結合した抗原を含む試料液}
^{は、抗体固定化部４に移動し、ここで前記抗原は固定化}
^{抗体と結合し、ここに固定される。残りの試料液は抗体}
^{固定用膜５を移動し続け、第２のガラスろ紙６に吸収さ}
^{れる。吸光度は、抗体固定化部４に、波長６４０ｎｍの}
^{光（Ｌ１）を照射し、その反射光Ｌ２を測定することに}
^{よって求めた。} ^{【００３２】比較例として、抗体を重合しなかった以外}
^{は、前記と同様の方法により、色素標識抗体を作製し、}
^{これを上記と同様にして免疫クロマトセンサーに用い、}
^{吸光度を測定した。} ^{【００３３】その結果、本発明による色素標識重合抗体}
^{を用いた場合は、その吸光度は約０．８であり、色素標}
^{識抗体を用いた場合の吸光度は約０．０８であった。こ}
^{の結果から、本発明の実施例の色素標識重合抗体の感度}
^{は、比較例の感度の約１０倍であるといえる。} ^{【００３４】} ^{【発明の効果】以上のように、本発明の色素標識重合抗}
^{体は、抗原との反応部位を多数有しているため、高感度}
^{のものである。したがって、例えば、本発明の色素標識}
^{重合抗体を免疫クロマトグラフィーを利用したセンサに}
^{導入することによって、従来法で作製した標識抗体を用}
^{いたときよりも高感度のセンサを作製することができる}
^。

^{【図面の簡単な説明】} ^【図１】
^{本発明の一実施例における免疫クロマトセンサーの構成}
^{の概略を示す斜視図である。} ^{【符号の説明】} ^{１板状支持体} ^{２第１のガラスろ紙} ^{３標識抗体部} ^{４抗体固定化部} ^{５抗体固定用膜} ^{６第２のガラスろ紙} ^{Ｌ１照射光} ^{Ｌ２反射光}

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多官能性試薬を介して重合した重合抗体
が、式（１）または式（２）で示されるシアニン系色素
で標識された色素標識重合抗体。【化１】（ただし、Ｒ₁およびＲ₂は水素またはアルキル基、Ｘは
ハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の
整数を示す。）
【請求項２】前記シアニン系色素のスクシンイミジル
基由来のアシル炭素と前記重合抗体のアミノ基由来の窒
素との共有結合により前記色素の骨格が重合抗体に結合
している請求項１記載の色素標識重合抗体。
【請求項３】中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液
中で多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程、および
この緩衝液中に式（１）または式（２）で示されるシア
ニン系色素を添加して前記重合された抗体を標識する工
程を含むことを特徴とする色素標識重合抗体の製造方
法。【化２】（ただし、Ｒ₁およびＲ₂は水素またはアルキル基、Ｘは
ハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の
整数を示す。）