CN114034662B - 基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置及其制备方法与应用，该生物检测装置是基于金纳米孔阵列的高阶模式的强度在一定范围内表现出对外界折射率的线性相关性设计得到的。该检测装置配备了高清摄像头的智能手机与便携式LED光源来对样品进行检测，不需要依赖于光谱仪及连续光源，仅通过记录纳米孔阵列的传输光实现对生物分子的有效检测，有效提升了该检测装置的便携性，拓宽了测试场景，降低了其使用成本。

Description

基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置及其制备方 法与应用

技术领域

本发明属于生物分子检测领域，具体涉及基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置及其制备方法与应用。

背景技术

等离激元传感器是一种利用表面等离激元共振所具备的纳米尺度光操控与近场增强效应的传感器，其相对于传统传感器而言，在实时、无标记、高通量以及高精度等方面都具有较大的优势，而基于金纳米孔洞阵列的传感器则是等离激元传感器中相对研究较少的一种。

金纳米孔洞阵列是基于科学家对异常光学透射现象的研究而发现的。在相关技术中，金纳米孔洞阵列的制备方法主要有电子束光刻，聚焦离子束刻蚀以及胶体自组装法。但在实际应用中，电子束光刻法和聚焦离子束刻蚀法的经济成本与时间成本都很高，无法应用于大面积阵列的生产。而通过胶体自组装法获得的金纳米孔洞阵列则存在传感效率低的缺陷，因此，难以开展有效的应用。而且，对于基于金纳米孔洞阵列的传感器而言，光纤光谱仪与连续光源是测试其传感性能的必要设备，但碍于其成本及设备的特殊性，其使用范围局限于实验室研究，无法满足日常生活使用的便携需求，从而给基于金纳米孔洞阵列的传感器在实际检测中的应用带来了更多的挑战。

因此，开发一种能够基于现有生产条件制备得到可实际应用的便携式金纳米孔洞阵列传感器仅对于生物分子的高精度快速现场检测具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置，该装置能够利用金纳米孔阵列的高阶模式的强度在一定范围内表现出对外界折射率的线性相关性，并通过使用配备了高清摄像头的智能手机与便携式LED光源来对样品进行检测，不再依赖于光谱仪及连续光源，通过记录纳米孔阵列的传输光实现对生物分子的有效检测，有效提升了该检测装置的便携性，拓宽了测试场景，降低了其使用成本。

本发明的第一个方面，提供一种金纳米孔阵列芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)将基材在氨水、过氧化氢和水的混合溶液中加热处理13～17min，得到芯片基板；制备聚苯乙烯(PS)微球、乙醇和水的混合溶液，得到聚苯乙烯微球分散液；

(2)将聚苯乙烯微球分散液滴加至芯片基板表面，使其在芯片基板表面上形成聚苯乙烯微球阵列层；

(3)对聚苯乙烯微球阵列层进行刻蚀，在刻蚀后的聚苯乙烯微球阵列层上进行金沉积，即得金纳米孔阵列芯片。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中的氨水、过氧化氢和水的混合体积比为1:(0.5～1.5):(4～6)。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(1)中的氨水、过氧化氢和水的混合体积比为1:1:5。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中的加热温度为80±5℃。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(1)中的加热温度为80℃。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中的聚苯乙烯微球、乙醇和水的混合体积比为1:(4～5):(4～5)。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中的聚苯乙烯微球、乙醇和水的混合体积比为1:5:5。

在本发明的一些优选实施方式中，所述乙醇与水的体积比为1:1。

在本发明的一些优选实施方式中，所述聚苯乙烯微球直径约为520nm。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中还包括对聚苯乙烯微球、乙醇和水的混合液进行超声处理，超声时间2min，以使其充分混匀。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述基材的材料包括硅酸盐玻璃和石英玻璃、氧化铝玻璃、氧化铟锡导电玻璃中的至少一种。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中在刻蚀后的聚苯乙烯微球阵列层上先进行铬沉积，再进行金沉积。

在本发明的一些优选实施方式中，所述金的沉积厚度为70±2nm。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述金的沉积厚度为70nm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述铬的沉积厚度为3±1nm。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述铬的沉积厚度为3nm。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述金纳米孔阵列芯片的制备方法制备得到的金纳米孔阵列芯片。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述金纳米孔阵列芯片中的金纳米孔阵列的周期为520±5nm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述金纳米孔阵列芯片中的金纳米孔阵列的周期为520nm。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述金纳米孔阵列芯片中的金纳米孔阵列的孔径为440±4nm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述金纳米孔阵列芯片中的金纳米孔阵列的孔径为440nm。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述金纳米孔阵列芯片中的金纳米孔阵列的厚度为70±1nm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述金纳米孔阵列芯片中的金纳米孔阵列的厚度为70nm。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测产品包括生物传感器和光学侦测装置中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述检测产品为生物传感器。

传统设计中的金纳米孔洞阵列主要依靠透射率极高的位置(共振峰)或利用纳米孔阵列的偶极等基本模式作为传感方式，但本发明中的基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置则是利用金纳米孔洞阵列的尺寸设计得到高阶耦合模式的金纳米孔洞阵列，这种高阶模式在光谱上产生了具有更高灵敏度的波谷，能够更有效地提升传感性能。而且，基于其结构的特殊性，在本发明中该生物传感器可以利用胶体自组装法制备得到，克服了传统方法中胶体自组装法所带来的传感效率低的缺陷，极大的降低了制备成本。

本发明的第三个方面，提供一套生物检测系统，该生物检测系统包括：光源装置、本发明第二个方面所述的金纳米孔阵列芯片、微流控装置和成像装置。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述光源装置为能够散发光源的装置。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述金纳米孔阵列芯片嵌入所述微流控装置的液体流动通道中。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述成像装置具有光信号采集模块和成像模块。

在本发明的一些优选实施方式中，所述光信号采集模块为摄像头。

在本发明的一些优选实施方式中，所述成像模块包括互补金属氧化物半导体和电荷耦合器件中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述光源的波长为中心波长638nm，波长范围为580nm～680nm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述成像装置包括智能手机、照相机、摄像机、显微镜镜头和摄像头中的至少一种。

本发明中的生物检测系统是基于金纳米孔阵列的高阶模式的强度在一定范围内表现出对外界折射率的线性相关性设计得到的。本发明通过配合使用配备了高清摄像头的智能手机与便携式LED光源来即可对样品进行检测，不再依赖于光谱仪及连续光源，通过记录纳米孔阵列的传输光实现对生物分子的有效检测，有效提升了该检测装置的便携性，拓宽了测试场景，降低了其使用成本。

本发明的第四个方面，提供一种生物分子定量检测方法，包括如下步骤：

将待检测物注入本发明第三个方面所述的生物检测系统的微流控装置内，打开光源装置，使光源透过待检测物照射在生物检测系统的金纳米孔阵列芯片上，利用成像装置比较待检测物检测前后的R通道数值的变化，定量待检测分子浓度。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述定量标准为：以标准浓度数值进行初始标定获得标准曲线，根据标准曲线和R通道数值计算待检测物浓度。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述生物分子包括氨基酸和蛋白质。

在本发明中，所述可检测的生物分子的要求为：可均匀分散于某种溶剂中。

在本发明的一些优选实施方式中，所述生物分子为可与金膜产生紧密连结的生物分子。

本发明的有益效果是：

1.本发明中的生物检测系统是基于金纳米孔阵列的高阶模式的强度在一定范围内表现出对外界折射率的线性相关性设计得到的，其通过配合使用配备了高清摄像头的智能手机与便携式LED光源来即可对样品进行检测，不依赖于光谱仪及连续光源，通过记录纳米孔阵列的传输光实现对生物分子的有效检测，有效提升了检测装置的便携性，拓宽了测试场景，降低了其使用成本。

2.本发明中的金纳米孔洞阵列尺寸是基于高阶耦合模式的要求设计得到的，其在光谱上产生了具有更高灵敏度的波谷，能够更有效地提升传感性能，而其基于该结构的特殊性，使该生物传感器可以利用胶体自组装法制备得到，克服了传统方法中胶体自组装法所带来的传感效率低的缺陷，极大的降低了制备成本。

附图说明

图1为本发明实施例中的金纳米孔阵列检测芯片的制备原理图；

图2为本发明实施例中的金纳米孔阵列检测芯片的电镜观测图；

图3为不同孔径的金纳米孔阵列检测芯片的近场分布图；

图4为本发明实施例中的基于不同孔径的金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置对于NaCl溶液的折光率变化曲线(a为280nm孔径，b为350nm孔径，c为440nm孔径)，以及对应的实际测量(Exp)与理论模拟(Sim)的波长折光率关系图(d对应a，e对应b，f对应c)；

图5为本发明实施例中的基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置对于NaCl溶液的相对强度差异折光率关系标准曲线图(a)，以及图中对应三个点值的光谱图(b～d)；

图6为本发明实施例中的基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置对于不同浓度的BSA的折光率变化曲线(a)，以及对应的倾斜波长偏移图(b)；

图7为本发明实施例中的基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置对于不同浓度的BSA的相对强度差异折光率关系图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

一种基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置

本发明实施例中的基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置主要由如下装置组成：光源装置、微流控装置、基于金纳米孔阵列的检测芯片以及成像装置。

(1)光源装置：

在本发明实施例中，光源装置为能够散发光源的装置，其光源为波长范围为580nm-680nm的LED光源。在该波长范围内，LED光源光谱范围能够完全涵盖金纳米孔阵列中的，金纳米孔的高阶模式在不同折射率溶液中的变化范围，从而可以充分利用折射率变化对高阶共振模式光谱的影响来实现提高传感性能的目的。

在本发明实施例中，使用的LED光源为便携性LED光源，中心波长为638nm，可以使用电池驱动，输入电压为5V。

(2)基于金纳米孔阵列的检测芯片：

本发明实施例中的基于金纳米孔阵列的检测芯片的制备方法为：

(a)基板的前处理：

将基材放置于氨水、过氧化氢和去离子水的混合溶液(氨水、过氧化氢和去离子水的混合体积比为1:1:5)中，在80℃的条件下浸泡15分钟，用氮气充分吹干，得到芯片基板。

其中，基材的可选材料包括硅酸盐玻璃、石英玻璃、氧化铝玻璃或氧化铟锡(ITO)导电玻璃等平整透明的材料。

(b)聚苯乙烯微球分散液的制备：

取200mL浓度为10wt％的聚苯乙烯微球溶液(聚苯乙烯微球直径为520nm，购自Polyscience)，在相对离心力(RCF)为1500g的条件下离心10分钟。在离心后得到的固化物中分别加入乙醇和去离子水(乙醇与水的体积比(v/v)为1:1，聚苯乙烯微球、乙醇和水的混合体积比为1:(4～5):(4～5))，分别超声处理2分钟，使其充分混合，得到聚苯乙烯微球分散液。

(c)金纳米孔阵列检测芯片的制备：

倾斜步骤(a)处理后的芯片基板，将步骤(b)制备得到的聚苯乙烯微球分散液滴加在倾斜的芯片基板上，基于空气和水的界面张力，滴加的聚苯乙烯微球分散液会在空气和水之间形成紧密排布的聚苯乙烯微球阵列。用注射泵吸出水，使聚苯乙烯微球阵列降落至芯片基板表面，得到带有聚苯乙烯微球阵列层的芯片基板。

对聚苯乙烯微球阵列层在气压为376mT、氧气流量为100sccm、功率为100W的条件下沿衬底法线方向刻蚀60s，缩小聚苯乙烯微球的直径。然后利用电子束镀膜仪，沿着衬底法线方向以0.1nm/s的沉积速度，分别依次沉积3nm的金属铬和70nm的金属金，得到金纳米孔阵列检测芯片。

将得到的金纳米孔阵列检测芯片在乙醇溶液中超声2分钟，去除聚苯乙烯微球，然后用氮气吹干。

金纳米孔阵列检测芯片的制备原理图如图1所示。

对最终制得的金纳米孔阵列检测芯片进行电镜观测和近场分布分析，结果如图2和3所示。

可以发现，上述实施例中制得的金纳米孔阵列检测芯片上整齐排布有若干的金纳米孔(图2)，形成金纳米孔阵列，其金纳米孔阵列的周期为520nm，孔径大小为440nm，厚度为70nm。通过数值计算近场分布图(图3)，可以判断上述实施例中制备得到的直径440nm的金纳米孔阵列可支持由瑞利异常模式杂化引起的高阶模式，有效提升阵列的传感性能。

(3)微流控装置：

本发明实施例中的基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置可以使用本领域中的任意微流控装置(仅要求待检测位置所对应的仓室的材质有较高的透明度)作为检测样品的承载容器。

将步骤(2)中的金纳米孔阵列检测芯片嵌入微流控装置的液体流动通道中，使光源装置发射出的光源先经过微流控装置中的液体后，再射入金纳米孔阵列检测芯片中，或者光先经过芯片再经过待测液体，以实现检测目的。

(4)成像装置：

成像装置主要为能够采集金纳米孔阵列在不同折射率环境下成像的R通道值变化的仪器或设备。其作用是成像及输出可分离出通道数据的照片。

其中，在本发明实施例中，该成像装置为智能手机(信号采集由智能手机的摄像头进行收集，成像则在智能手机的互补金属氧化物半导体(CMOS)上进行)。在检测时，要求该智能手机使用相机专业模式进行拍摄，参数设置为：白平衡5600、快门时间1/1000s、ISO100。

纳米孔直径大小为280nm的金纳米孔阵列

方法同上述实施例，区别在于：聚苯乙烯微球阵列层的刻蚀条件为气压为376mT、氧气流量为100sccm、功率为100W的条件下沿衬底法线方向刻蚀85s。

纳米孔直径大小为350nm的金纳米孔阵列

方法同上述实施例，区别在于：聚苯乙烯微球阵列层的刻蚀条件为气压为376mT、氧气流量为100sccm、功率为100W的条件下沿衬底法线方向刻蚀80s。

金纳米孔阵列检测芯片的检测性能测试

为了验证上述实施例中制备得到的金纳米孔阵列检测芯片的实际检测灵敏度，发明人分别使用不同浓度的氯化钠溶液作为检测对象，检测不同尺寸的金纳米孔阵列(纳米孔直径大小为280nm、350nm和440nm，制备方法同上述实施例)的传感灵敏度。检测方法同上述实施例。

测试结果如图4所示。

如图4所示，纳米孔直径大小为280nm的金纳米孔阵列的检测灵敏度为353nm/RIU，纳米孔直径为350nm的金纳米孔阵列的检测灵敏度为396nm/RIU，纳米孔直径为440nm的金纳米孔阵列的检测灵敏度为407nm/RIU。通过上述检测结果，可以发现，小孔径(不支持高阶模式)的纳米孔阵列检测精度相对较低，而大孔径(支持高阶模式)的纳米孔阵列则拥有更高的传感灵敏度。

因此，选择孔径约为440nm的金纳米孔阵列对于传感器灵敏度的提升具有极为重要的意义。

基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置的使用方法

本发明实施例中的基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置的使用方法如上述实施例所述，具体为：将金纳米孔阵列检测芯片嵌入微流控装置的液体流动通道中、向微流控装置内注入待检测样品，同时打开光源装置，使其光源能够透过微流控装置中的液体充分照射在金纳米孔阵列检测芯片上(或者光先经过芯片再经过待测液体亦可)，并最终由智能手机摄像头收集。通过提取分析微流控系统中流过的不同类型和/或浓度液体时智能手机CMOS中的R通道数值变化情况，实现生物样品的定量检测。

该方法主要是基于微流控系统中流过的不同类型和/或浓度液体时，会使浸入其中的金纳米孔洞阵列表面的折射率发生变化，从而使通过该阵列的透射光的强度发生相应的变化，而该变化可以通过CMOS成像中的R通道值所体现出来，因此，通过比较待测物检测前后的R通道数值的变化情况，既可以有效的实现待测物的定量分析。

基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置的实际应用

为了充分验证上述实施例中的基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置的实际检测效果，发明人分别使用不同浓度的氯化钠溶液以及牛血清蛋白作为试验对象对其检测灵敏度进行测试，具体测试步骤如下：

(1)以不同浓度的氯化钠溶液作为试验对象：

检测步骤如下：

将不同浓度的NaCl溶于去离子水中制备NaCl溶液，用折射率计测定其折光率为1.3416～1.3786。用光纤光谱仪(海洋光学)测量金纳米孔阵列的透射光谱(采用宽带卤素灯作为光源)。

将上述实施例中制备得到的金纳米孔阵列检测芯片放置进一个标准微流控通道中，以LED作为光源，采用上述高兼容便携式生物检测装置的使用方法进行定量检测。利用智能手机摄像头采集照片，拍摄模式选择手动模式，成像参数设置为白平衡5600，快门时间1/1000s，国际标准组织(ISO)光感条例100。用智能手机对不同浓度的NaCl溶液各拍摄5张照片。提取照片的R通道值，在MATLAB中对5张照片的R通道值取平均值。

检测结果如图5所示。

其中，可以发现，不同浓度NaCl溶液的实验所得数据要显著高于常规计算模拟所得数据，说明基于金纳米孔阵列的高兼容便携式生物检测装置的检测灵敏度要显著优于理论计算。根据光纤光谱仪检测结果，上述实施例中制备得到的大尺寸金纳米孔阵列(440nm)对应的检测灵敏度可达到407nm/RIU。

进一步根据折射率与金纳米孔阵列的高阶模式的相对强度差异构建标准曲线，得到标准曲线方程：

y＝-137x+182；

其中，x表示折射率；y表示相对强度差异。

抽选折射率为1.3333、1.3505和1.3786时的三个点进行验证，发现其实际检测值为理论值的137％/RIU，在统计学上的合理误差范围内，说明上述实施例中的方法具有较高的检测灵敏度。

(2)以不同浓度的牛血清蛋白作为试验对象：

检测方法同上述步骤(1)中的氯化钠溶液。

检测结果如图6、7所示。

利用金纳米孔阵列检测芯片，基于光谱仪以及智能手机的检测装置均可以检测到浓度为10^-8M的牛血清蛋白溶液。说明上述实施例中所设计的高兼容便携生物检测装置其检测能力与常规光谱仪测试方法可相互比拟。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种生物分子的定量检测方法，其特征在于，采用一种生物检测系统进行检测，

所述生物检测系统包括：

光源装置，所述光源装置为能够散发光源的装置；

金纳米孔阵列芯片和微流控装置，所述金纳米孔阵列芯片嵌入所述微流控装置的液体流动通道中；和

成像装置，所述成像装置具有光信号采集模块和成像模块；

所述成像模块包括互补金属氧化物半导体和电荷耦合器件中的至少一种；

所述金纳米孔阵列芯片中的金纳米孔阵列支持由瑞利异常模式杂化引起的高价模式，其孔径为440nm，周期为520nm，厚度为70nm，采用如下方法进行制备：

(1)将基材在氨水、过氧化氢和水的混合溶液中加热处理15min，得到芯片基板；制备聚苯乙烯微球、乙醇和水的混合溶液，得到聚苯乙烯微球分散液；

(2)将聚苯乙烯微球分散液滴加至芯片基板表面，使其在芯片基板表面上形成聚苯乙烯微球阵列层；

(3)对聚苯乙烯微球阵列层进行刻蚀，在刻蚀后的聚苯乙烯微球阵列层上进行金沉积，即得金纳米孔阵列芯片；

步骤(1)中，所述氨水、过氧化氢和水的混合体积比为1:1:5；所述聚苯乙烯微球、乙醇和水的混合体积比为1:(4～5):(4～5)；

步骤(3)中所述金的沉积厚度为70nm；

所述定量检测方法包括如下步骤：

将待检测物注入所述的生物检测系统的微流控装置内，打开光源装置，使光源透过待检测物照射在生物检测系统的金纳米孔阵列芯片上，利用成像装置检测待检测物检测的R通道数值变化，定量待检测分子的浓度；

其中，所述定量的标准为：以标准浓度数值进行初始标定获得标准曲线，根据标准曲线和R通道数值计算待检测物浓度。

2.根据权利要求1所述的生物分子的定量检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述加热处理的温度为80℃。

3.根据权利要求1所述的生物分子的定量检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述基材的材料包括硅酸盐玻璃、石英玻璃、氧化铝玻璃、氧化铟锡导电玻璃中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的生物分子的定量检测方法，其特征在于，步骤（3）中在刻蚀后的聚苯乙烯微球阵列层上先进行铬沉积，再进行金沉积；

所述铬的沉积厚度为3nm。

5.根据权利要求1所述的生物分子的定量检测方法，其特征在于，所述光源的波长范围为580nm-680nm；所述成像装置包括智能手机、照相机、摄像机、显微镜镜头和摄像头中的至少一种。