KR20100096622A

KR20100096622A - 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법

Info

Publication number: KR20100096622A
Application number: KR1020090015591A
Authority: KR
Inventors: 신용범; 김민곤; 안준형
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2010-09-02

Abstract

본 발명은 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기판-나노구조체-1차 특이 수용체-생체분자-2차 특이 수용체-효소 순으로 결합되어 있는 센서에 기질을 반응시켜, 효소와 기질의 반응산물이 나노구조체 표면부근에 침전되어 나노구조체 표면부근의 굴절률이 증가됨으로써, 생체분자를 고감도로 분석할 수 있는 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법은 금속 나노구조체 표면에 미리 고정화된 특이적 수용체와 시료분자의 결합 만으로 변화된 LSPR 시그날을 관측하는 것에 비해, 동일한 농도의 시료분자의 검출에 있어서 더 큰 시그날 변화를 기대할 수 있고, 수백배 이상의 감도 향상을 꾀할 수 있어서 낮은 농도의 시료를 정성 및 정량분석하는 것이 가능하다.

금속 나노구조체, 국소 표면플라즈몬, 굴절률 측정, 효소침전, 흡광도

Description

국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법{Method for Measuring Biomolecules Using Localized Surface Plasmon Resonance}

본 발명은 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기판-나노구조체-1차 특이 수용체-생체분자-2차 특이 수용체-효소 순으로 결합된 센서에 기질을 반응시켜, 효소와 기질의 반응산물이 나노구조체 표면부근에 침전되어 나노구조체 표면부근의 굴절률이 증가됨으로써, 생체분자를 고감도로 분석할 수 있는 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법에 관한 것이다.

표면 플라즈몬(Surface Plasmon)이란 도체 표면, 이를테면 금속 박막의 표면을 따라 전파하는 자유전자의 양자화된 진동을 의미한다. 이와 같은 표면 플라즈몬은 프리즘과 같은 유전매체(dielectric medium)를 지나 유전매체의 임계각 이상의 각도로 금속 박막에 입사하는 입사광에 의해 여기되어 공명을 일으키는데, 이를 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR)이라 하며, 이때 발생하는 표면 플라즈몬은 금속박막을 따라 수㎛를 전파하는 특성을 지니고 있어, 표면플라즈몬-폴라리톤(surface plasmon polariton; SPP) 이라고 부르기도 한다.

단색 입사광을 사용할 때, 공명이 일어나는 입사광의 입사각(공명각) 및 공명이 일어나는 파장(공명파장)은 금속 박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 매우 민감하다. SPR 센서는 이러한 성질을 이용하여 금속 박막에 근접한 물질 즉, 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량·정성 분석 및 박막인 시료의 두께를 측정하는 데에 이용되어 왔다.

한편, 금속 박막이 아닌 금속으로 이루어진 나노입자(particle 또는 dot), 나노막대(rod) 및 나노구멍(hole) 등의 수nm~수백nm 크기의 금속 나노구조체는 외부에서 입사되는 특정한 주파수(파장)의 빛에 의하여 나노구조체 전도대(conduction band)에 있는 전자들의 집단적 진동(collective oscillation)이 유발되어 전기 쌍극자 특성을 띠게 된다. 그 결과, 해당 주파수 영역의 빛을 강하게 산란 및 흡수를 하게 되는데, 이를 국소표면플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR)이라 한다. LSPR에 의한 산란과 흡수는 SPP와는 달리 프리즘 또는 회절격자 없이 단순 투과분광학적 방법에 의하여 흡광도(extinction) 측정이 가능하다. 금속 나노구조체의 외부 입사광에 대한 흡광도 특성, 즉 흡광세기, 흡광스펙트럼의 선폭, 흡광중심 파장 등은 금속의 종류, 금속 나노구조체의 크기 및 형상에 매우 강한 의존성을 보인다. 뿐만 아니라, SPP와 유사하게, 그들의 흡광특성은 금속 나노구조체의 외부환경, 즉 금속나노구조체 표면 주위 매질의 복소 유전율에 민감하게 반응하는데, 이 성질을 이용하여 생체분자 및 화학성분을 검출하 는 바이오/화학 센서에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다.

그러나 SPP를 기반하는 바이오/화학센서와는 달리 LSPR 기반 바이오/화학센서의 감도는 현저히 낮아 SPP 기반센서의 1/10∼1/100 정도에 불과하다. 그 이유는 표면플라즈몬공명에 의해 발생되는 전자기장(electromagnetic field)이 미치는 범위가 SPP의 약 1/10 정도에 불과하기 때문이다. 즉, SPP의 경우, 금속박막 표면에서 측정하고자 하는 매질 방향으로의 플라즈몬 전자기장 침투깊이가 파장에 따라 약 200∼300nm에 이르는 반면, LSPR의 경우 금속나노구조체 표면에서 매질 방향으로의 전자기장 침투깊이가 약 20∼30nm에 불과하다. 더욱이, 바이오/화학센서에는 측정시료 분자를 선택적으로 포획하기 위해 미리 금속표면에 시료분자에 대한 특이적 수용체(receptor)를 고정화시키는 것이 필수적인데, 만일 고정되는 수용체 가 항체와 같이 크기가 큰 거대분자 (∼13nm)일 경우, 감도저하는 더욱 극심해져 실제 응용에서 사용하는데에는 많은 제약이 뒤따른다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 미국공개특허 US 2008-0213814는 금속 나노입자를 기판에 랜덤하게 고정한 후, LSPR을 위하여 효소학적 방법을 사용하였으나, 이 경우, 금속이 랜덤하게 고정되었기 때문에 재현성에 문제가 있고, 실제 바이오칩 적용 실험시 생체분자 고정화 단계에서 기판에 미리 고정된 금속입자가 떨어지는 문제가 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 나노임프린트 리쏘 그라피 등의 패터닝 방법을 이용하여 다수의 나노 구조체를 기판 에 일정한 간격으로 정렬시키는 단계, 상기 나노 구조체에 1차 특이 수용체를 고정시키는 단계, 상기 1차 특이 수용체에 대상시료를 반응시키는 단계, 상기 대상시료와 효소가 결합되어 있는 2차 특이 수용체를 반응시키는 단계 및 상기 효소에 기질(substrate)을 가하는 단계 등을 거치면, 금속나노입자 표면에 효소에 의한 기질의 반응산물이 치밀하게 침전되어 금속 나노구조체 표면부근의 굴절률을 대폭 증대시킴으로써, 결과적으로 국소표면 플라즈몬공명을 이용하여 생체분자에 대한 정량·정성 분석을 고감도로 수행할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고감도의 분석능을 가지는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 기판에 다수의 나노 구조체를 일정한 간격으로 정렬시키는 단계; (b) 상기 나노 구조체 표면에 1차 특이 수용체를 고정화시키는 단계; (c) 상기 1차 특이 수용체와 선택적으로 결합하는 측정 대상시료를 도입하여 반응시키는 단계; (d) 상기 1차 특이 수용체와 결합되어 있는 측정 대상시료와 선택적으로 결합하면서, 효소가 결합되어 있는 2차 특이 수용체를 도입하여 반응시키는 단계; 및 (e) 상기 효소에 대하여 특이적으로 반응하는 기질을 도입시키는 단계를 포함하는 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법에 있어서, 상기 효소와 상기 기질의 반응산물이 상기 나노 구조체 표면에 침전·흡착되어 나노 구조체 표면 부근의 굴절률 증대를 증폭시킴으로써, 상기 나노 구조체의 국소표면 플라즈몬공명 변화를 증대시키는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법을 제공한다.

본 발명에 따른 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법은 금속 나노구조체 표면에 미리 고정화된 특이적 수용체와 시료분자의 결합만으로 변화된 LSPR 시그날을 측정하는 것에 비해, 동일한 농도의 시료분자의 검출에 있어서 더 큰 시그날 변화를 기대할 수 있고, 수백배 이상의 감도 향상을 꾀할 수 있어서 낮은 농도의 시료를 정성 및 정량분석하는 것이 가능하다. 또한, 나노 구조체를 일정 간격으로 기판에 정렬시키고, 안정적으로 고정시키기 때문에, 재현성이 우수하고, 1차 특이 수용체의 고정화시 나노 구조체가 떨어지지 않아, 보다 효율적으로 생체분자에 대한 정량·정성 분석을 실시할 수 있다.

본 발명에서는 나노임프린트 리쏘 그라피 등의 패터닝 방법을 이용하여 다수의 나노 구조체를 기판에 일정한 간격으로 정렬시키는 단계, 상기 나노 구조체에 1 차 특이 수용체를 고정시키는 단계, 상기 1차 특이 수용체에 대상시료를 반응시키는 단계, 상기 대상시료와 효소가 결합되어 있는 2차 특이 수용체를 반응시키는 단계 및 상기 효소에 기질(substrate)을 가하는 단계를 거치면, 금속나노입자 표면에 효소에 의한 기질의 반응산물이 치밀하게 침전되어 금속 나노구조체 표면부근의 굴절률을 대폭 증대시킴으로써, 결과적으로 국소표면 플라즈몬공명을 이용하여 생체분자에 대한 정량·정성 분석을 고감도로 수행할 수 있을 것으로 예측하였다.

이를 확인하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는, 유리기판에 다수의 금 나노구조체를 나노임프린트 리쏘그라피법(NIL)으로 정렬되게 고정시킨 후, 나노 구조체상에 anti-human IL5를 고정시키고, 재조합 human IL5를 반응시킨 다음, 다시 biotinylated anti-human IL5와 streptavidin-alkaline phosphatase를 반응시켰다. 그런 후, 재조합 human IL5와 결합되어 있는 anti-human IL5에 결합된 효소인 alkaline phosphatase와 특이적으로 반응하는 기질인 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine(BCIP)와 nitro blue tetrazolium(NBT) 혼합액을 반응시켜, 침전반응을 유도하였다. 각 단계별로 LSPR 시그날을 측정한 결과, human IL5의 농도가 낮은 경우, human IL5 자체에 대한 LSPR 시그날 변화를 측정할 수 없었지만, 효소반응에 의한 침전 단계에서는 LSPR 시그날 변화가 급격히 증폭되어, 측정감도가 향상되었음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 기판에 다수의 나노 구조체를 일정한 간격으로 정렬시키는 단계; (b) 상기 나노 구조체 표면에 1차 특이 수용체를 고정 화시키는 단계; (c) 상기 1차 특이 수용체와 선택적으로 결합하는 측정 대상시료를 도입하여 반응시키는 단계; (d) 상기 1차 특이 수용체와 결합되어 있는 측정 대상시료와 선택적으로 결합하면서, 효소가 결합되어 있는 2차 특이 수용체를 도입하여 반응시키는 단계; 및 (e) 상기 효소에 대하여 특이적으로 반응하는 기질을 도입시키는 단계를 포함하는 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법에 있어서, 상기 효소와 상기 기질의 반응산물이 상기 나노 구조체 표면에 침전·흡착되어 나노 구조체 표면 부근의 굴절률 증대를 증폭시킴으로써, 상기 나노 구조체의 국소표면 플라즈몬공명 변화를 증대시키는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 기판은 유리, 플라스틱, 금속, 실리콘, 석영, 알루미나, 산화물 결정 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 플라스틱은 PMMA, PC, COC 등을 예시할 수 있고, 금속은 니켈, 알루미늄, 철, 구리 등을 예시할 수 있으며, 산화물 결정은 SiO₂, TiO₂, Ta₂O₅, Al₂O₂ 등을 예시할 수 있다. 상기 기판은 투명한 것이 바람직하며, 두께는 50㎛∼5㎜인 것이 바람직하다. 상기 기판의 두께가 50㎛ 미만인 경우에는 강도가 약해 핸들링하기 어려운 문제가 있고, 5㎜를 초과할 경우 측정을 위해 분광기 및 기타 장치에 장착하는데 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 나노 구조체의 형태는 크게 제한되지는 않지만, 원기둥, 사각기둥, 삼각기둥, 오각기둥, 육각기둥, 팔각기둥, 구, 반구, 구의 일부분, 타원구, 반타원구, 타원구의 일부분, 사각뿔, 사각뿔대, 삼각뿔, 삼각뿔대, 원 뿔, 원뿔대, 링, 금속나노필름 상의 구멍(hole) 등을 예시할 수 있다. 상기 금속나노필름 상의 구멍(hole)은 기판 전체에 금속 박막이 5~수백nm로 코팅되어 있는 상태에서 5~500nm의 지름으로 구멍이 형성되어 있는 것으로서, 이와 같은 나노홀이 규칙적으로 2차원적 배열을 이루는 것을 나노홀 어레이라도 한다. 다른 나노 구조체는 기판에 원기둥의 나노구조체가 닷 형태로 배열되어 있는것을 의미한다.

상기 구조체의 형태와 크기에 따라서 플라즈몬 밴드 파장 영역이 달라지며 이에 따라 측정감도 또한 달라질 수 있다. 일반적으로 파장이 길어질 수록 측정감도가 높아지나 현실적으로 측정시스템의 사양에 맞게 조절해야 한다.

본 발명에 있어서, 상기 나노 구조체의 재질은 금, 은, 동, 알루미늄, 백금 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 금속성 재질 또는 실리콘, 게르마늄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 반도체 재질인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 금속성 재질, 더욱 바람직하게는 은, 금, 동, 알루미늄 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 나노 구조체의 높이는 1∼500nm이며, 직경 또는 사방 길이가 5∼500nm인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 나노 구조체의 높이, 직경 또는 사방의 길이가 상기 범위를 벗어난 경우 LSPR 현상을 관측하는데 문제가 있다.

상기 다수의 나노 구조체는 미리 미세 구조의 금속 모형(master)을 만들고, 이를 도장을 찍듯이 PMMA와 같은 중합체(polymer)에 압력을 가하여 나노 구조체를 만드는 나노임프린트 리쏘그라피법(Nano Imprint Lithography; NIL), 전자빔 리쏘 그라피(Electron Beam Lithography; EBL), 집속이온빔(FIB), 소프트 리쏘그라피법(SL), 블록공중합 고분자의 자기조립 등의 방법에 의하여 상기 기판에 일정한 간격으로 정렬될 수 있다. 상기 다수의 나노 구조체들이 정렬된 간격은 특별히 제한되지 않으나, 근접한 다른 나노구조체의 플라즈몬 공명 특성에 영향을 주지 않을 정도로 나노구조체의 지름의 0.7~1.5배인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 1차 특이 수용체는 측정 하고자 하는 대상시료와 특이적으로 결합할 수 있는 것으로서, DNA, 단백질, 펩타이드, 앱타머 등을 예시할 수 있다.

상기 1차 특이 수용체는 상기 나노 구조체 표면에 직접 고정화되거나, 중간 가교 역할을 하는 링커(linker)를 통하여 고정화될 수 있다. 상기 링커로는 MUA(11-mercaptoundecanoic acid), MUOH(11-mercaptoundecanol) 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 측정 대상시료는 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 각종 암질환 표지자, 심혈관질환 표지자, 각종 싸이토카인 류, 환경유해 저분자 물질 등의 생체분자를 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2차 특이 수용체는 상기 1차 특이 수용체에 선택적으로 결합되어 있는 측정 대상시료와 결합할 수 있는 것을 특징으로 하며, DNA, PNA, 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, 앱타머, 아미노산 등을 예시할 수 있다.

상기 2차 특이 수용체는 상기 측정 대상시료와 결합하는 부분 외의 다른 부분에 상기 효소와 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 효소는 상기 2차 특이 수용체 또는 상기 2차 특이 수용체의 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는데, 상기 효소에는 상기 2차 특이 수용체의 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 링커분자가 미리 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 링커분자는 DNA, PNA, 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, 앱타머, 및 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. LSPR의 경우 SPP(surface plasmon polariton:금속박막에서 발생하는 전파성 표면플라즈몬)과 달리, 플라즈몬 전자기장이 금속나노구조체 표면으로부터 20~30nm 밖에 미치지 못하므로 가능한 크기가 작은 바이오리셉터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 상기 기질은 상기 2차 특이 수용체와 결합되어 있는 효소와 특이적으로 반응하는 것으로서, 상기 기질은 단일 또는 2가지 이상의 기질 혼합물을 사용할 수 있다.

상기 효소와 상기 기질이 반응하여 생성된 반응산물은 상기 나노 구조체 표면에 침전·흡착되어 나노 구조체 표면 부근의 굴절률 증대를 증폭시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법은 상기 나노 구조체의 국소표면 플라즈몬공명 특성 변화를 측정함에 있어서 전통적인 투과분광방식, 반사분광방식, 프리즘 또는 광도파로를 이용하는 감쇄전반사방식(attenuated total reflection; ATR) 등의 원격장(far-field) 분광기법 및 NSOM(near-field scanning optical microscope) 등을 이용하는 근접장 분광기법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: LSPR을 이용한 human interleukin 5 (hIL5)의 측정

LSPR을 이용하여 인체의 면역체계에서 중요한 역할을 하는 사이토카인 중 하나인 human interleukin 5 (hIL5)를 측정하는 방법은 다음과 같다.

실시예 1-1: 금(Au) 나노입자 어레이 제작

나노임프린트 리쏘그라피법(NIL)으로 유리 투명기판상에 200nm 직경과 20nm의 두께를 갖는 나노닷 형태의 금(Au) 나노입자를 정렬(고정)시킨 나노입자 어레이를 제조하고, 제조된 금 나노입자 어레이를 전자현미경을 이용하여 확인하였다(도 1 참조).

실시예 1-2: 링커가 결합된 금 나노입자 어레이

피란하 용액(piranha solution, H₂SO₄:H₂O₂=3:1)에 상기 실시예 1-1에서 제조된 금 나노입자 어레이를 65℃에서 15분간 담지시켜, 표면에 흡착된 오염물질을 제 거시키고, DW로 5회 세척하였다. 10mM의 11-머캅토운데카노익산(11-mercaptoundecanoic acid; MUA)을 녹인 에탄올 용액에 상기 세척된 금 나노입자 어레이를 12시간 담지시켜, 금 나노입자 표면에 MUA를 결합시켰다. 상기 금 나노입자 표면에 결합된 MUA의 COOH기를 활성화시키기 위하여 증류수에 0.1M의 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC) 및 0.025M n-hydrosuccinimide(NHS)를 녹인 용액에 15분간 담지시켰다.

실시예 1-3: 금 나노입자와 1차 특이 수용체의 결합

실시예 1-2에서 제조된 링커(MUA)가 결합된 금 나노입자 어레이를 0.1㎎/㎖의 anti-human IL5를 함유하는 1X PBS(pH 7.4) 용액에 담지시킨 후, 1시간동안 반응시켜 anti-human IL5(항체)를 고정화시켰다. 다음으로, 미결합 NHS를 블록킹(blocking)하기 위하여, 1M ethanolamine-HCl(pH 8.5) 용액에 금 나노입자 어레이를 담지시켜, 15분간 반응시키고, 1% bovine serum albumin(BSA)를 함유하는 1X PBS(pH 7.4)에서 1시간 반응시켜서 비특이적 결합을 최소화시켰다.

실시예 1-4: 1차 특이 수용체와 대상 측정시료의 결합

각각의 40pM, 400pM, 4nM, 40nM의 재조합 human-IL5(in 1㎎/㎖ BSA; PBS)(즉 1㎎/㎖의 BSA를 함유한 PBS 용액에 40pM, 400pM, 4nM, 40nM의 재조합 human-IL5가 포함되어 있음)을 실시예 1-3에서 제조된 anti-human IL5(항체)가 고정화된 금 나노입자 어레이의 항체 표면에 도포시키고, 1시간동안 반응시켰다.

실시예 1-5: 대상 측정시료와 효소가 결합되어 있는 2차 특이 수용체의 결합

실시예 1-4의 anti-human IL5에 재조합 human-IL5가 결합되어 있는 금 나노입자 어레이에 1㎍/㎖ biotinylated anti-human IL5(리간드를 포함하는 2차특이 수용체)와 1㎍/㎖ streptavidin-alkaline phosphatase(in 1㎎/㎖ BSA; PBS)의 혼합액을 도포하고, 30분간 반응시켰다.

실시예 1-6: 효소와 기질의 반응

실시예 1-5에서 시료인 재조합 human-IL5와 결합되어 있는 anti-human IL5(2차 특이 수용체)에 결합된 효소인 alkaline phosphatase와 특이적으로 반응하는 기질인 0.1M 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine(BCIP)와 1㎎/㎖ nitro blue tetrazolium (NBT)(in 0.1M tris-HNO₃, pH9.8) 혼합액을 30분간 반응시켜, 침전반응을 유도하였다.

실시예 1-7: LSPR 측정

상기 실시예 1-2 내지 실시예 1-6 각 단계마다 발생하는 LSPR 시그날을 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 실시예 1-2의 MUA만 고정화된 금나노입자 어레이의 LSPR 밴드 피크는 695.1nm이고, 여기에 anti-human IL5(항체)가 결합(실시예 1-3)되었을 때 702.6nm로 적색천이 되었다. 여기에 측정시료인 hIL5 (40nM)을 반 응(실시예 1-4)시킨 경우 0.4nm 적색천이되고, 여기에 2차 항체-효소(alkaline phosphatase) 복합체를 결합(실시예 1-5)시킨 결과, 0.6nm 변화되었음을 확인하였다. 이들 변화는 상기 MUA 표면에 항체를 고정화했을 때의 적색천이 7.5nm와 비교하면 매우 미미한 파장 변화임을 알 수 있는데, 이는 금나노입자 상에서 발생하는 국소 표면플라즈몬의 전자기장 침투깊이가 짧아, 분자크기가 큰 항체를 수용체로 사용했을 때 검출시료인 hIL5 분자가 그 전자기장에 노출되는 비율이 상대적으로 낮아 감도가 낮아지는 것으로 사료된다.

반면 본 발명에 따라, 이미 결합된 효소에 특이적으로 반응하여 침전되는 기질인 NBT-BCIP 혼합물을 가하면(실시예 1-6) 금나노입자 상에 효소반응에 의한 침전이 발생되는데, 침전물은 항체, 항원 및 효소 등의 생체분자에 비해 원자번호가 큰 고밀도 성분의 치밀한 화합물로서 금나노입자 표면 주위의 굴절률을 대폭 증대시켜주는 역할을 한다. 그 결과, 기질의 침전반응이 종료된 후의 LSPR 밴드 피크는 10.5nm 가량 적색천이된 714.1nm에 위치함을 확인하였다.

도 4는 40pM, 400pM, 4nM 농도의 hIL5에 대한 LSPR 시그날을 상기와 동일하게 단계별로 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 검출 대상시료인 hIL5 자체만의 LSPR 시그날 변화로는 40nM 미만의 농도에서 측정이 불가하지만, 2차항체-효소 복합체를 부가적으로 결합한 후 기질인 NBT-BCIP를 적용할 경우, 40pM, 400pM, 4nM, 40nM 일 때 각각 0.7nm, 2.2nm, 7.5nm, 10.5nm의 LSPR 시그날 변화를 보여, 결과적으로 항원인 hIL5 만의 시그날 변화를 이용한 측정감도 대비 1000배 까지 향상되는 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유리 기판 상에 나노임프린트 리쏘그라피법(NIL)으로 제조된 200nm 직경과 20nm의 두께를 갖는 금(Au) 나노입자 어레이의 전자현미경 사진이다(a:저배율의 전자현미경 사진 ,b:고배율의 전자현미경 사진).

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법을 단계별로 나타낸 모식도이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 40nM 농도의 human interleukin 5 (hIL5)를 측정하기 위하여, 각 단계별로 이루어진 생체분자의 결합에 따른 LSPR 스펙트럼 측정결과를 나타낸 도면이다.

도 4는 상기 본 발명의 일 실시예에 따라 40pM, 400pM, 4nM, 40nM의 농도를 가지는 각각의 hIL5를 측정하기 위하여, 각 단계별로 이루어진 생체분자의 결합에 따른 플라즈몬 밴드의 이동을 나타낸 도면이다.

Claims

(a) 기판에 다수의 나노 구조체를 일정한 간격으로 정렬시키는 단계;

(b) 상기 나노 구조체 표면에 1차 특이 수용체를 고정화시키는 단계;

(c) 상기 1차 특이 수용체와 선택적으로 결합하는 측정 대상시료를 도입하여 반응시키는 단계;

(d) 상기 1차 특이 수용체와 결합되어 있는 측정 대상시료와 선택적으로 결합하면서, 효소가 결합되어 있는 2차 특이 수용체를 도입하여 반응시키는 단계; 및

(e) 상기 효소에 대하여 특이적으로 반응하는 기질을 도입시키는 단계를 포함하는 국소표면 플라즈몬공명을 이용한 생체분자의 측정방법에 있어서,

상기 효소와 상기 기질의 반응산물이 상기 나노 구조체 표면에 침전·흡착되어 나노 구조체 표면 부근의 굴절률 증대를 증폭시킴으로써, 상기 나노 구조체의 국소표면 플라즈몬공명 변화를 증대시키는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 플라스틱, 금속, 실리콘, 석영, 알루미나, 산화물 결정 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되며, 두께가 50㎛∼5㎜인 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 나노 구조체의 형태는 원기둥, 사각기둥, 삼각기둥, 오각기둥, 육각기둥, 팔각기둥, 구, 반구, 구의 일부분, 타원구, 반타원구, 타원구의 일부분, 사각뿔, 사각뿔대, 삼각뿔, 삼각뿔대, 원뿔, 원뿔대, 링, 금속나노필름 상의 구멍(hole)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 나노 구조체는 금, 은, 동, 알루미늄, 백금 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 금속성 재질 또는 실리콘, 게르마늄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 반도체 재질인 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 나노 구조체의 높이는 1∼500nm이며, 직경 또는 사방 길이가 5∼500nm인 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 1차 특이 수용체는 DNA, 단백질, 펩타이드 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 1차 특이 수용체는 상기 나노 구조체 표면에 직접 고정화되거나, 중간 가교 역할을 하는 링커를 통하여 고정화되는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 2차 특이 수용체는 DNA, PNA, 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, 앱타머, 및 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 2차 특이 수용체는 상기 측정 대상시료와 결합하는 부분 외의 다른 부분에 상기 효소와 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제9항에 있어서, 상기 효소는 상기 2차 특이 수용체의 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 링커분자가 미리 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제10항에 있어서, 상기 링커분자는 DNA, PNA, 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, 앱타머, 및 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.
제1항에 있어서, 상기 기질은 단일 또는 2가지 이상의 기질 혼합물인 것을 특징으로 하는 국소표면 플라즈몬공명(LSPR)을 이용한 생체분자의 측정방법.