CN104345153A - 微阵列基底、微阵列、微流体系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了微阵列基底，其包含表面被聚多巴胺修饰的含氟聚合物膜片，其中聚多巴胺用于固定生物分子或细胞。本申请还提供了包含上述微阵列基底的微阵列、用于制备上述微阵列基底的微流体系统以及制备上述微阵列基底和微阵列的方法，其中利用微流体系统将多巴胺溶液分配至含氟聚合物膜片表面，进而在其上形成聚多巴胺微斑点阵列作为例如生化反应的反应部位。

Description

微阵列基底、微阵列、微流体系统及其制备方法
相关申请
本申请要求于2013年7月30日提交的美国临时申请61/859,896的优先权益，该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本申请涉及用于检测、分析或研究感兴趣的分子或微粒，特别是生物材料的微阵列基底、微流体系统以及包含上述基底的微阵列。本申请还涉及用于制备基底和微阵列的方法以及利用包含所述基底的微阵列检测或分析样品中感兴趣的分子的方法。
背景技术
本领域已知，一系列的含氟聚合物包括聚四氟乙烯(PTFE)、氟化乙丙烯(FEP)、过氟烷氧基(perfluoroalkoxy,PFA)等具有卓越的不粘性能，可以用作不粘涂层。PTFE在不粘涂层中常用，通常被称为Teflon。Teflon是杜邦公司(DuPont Company)使用在一系列氟聚合物产品上的注册商标1。已知含氟聚合物几乎对任何物质都没有亲和力。然而，Messersmith小组证实了聚多巴胺对Teflon材料的亲和力2。
微阵列是在固体基底上的多重二维微点阵列，可以利用高通量检测方法分析许多类型的生物材料。微阵列的概念和方法学在1983年由Chang TW3首次引入并在其一系列的专利4-6中进行了说明，例如示例了抗体微阵列(也被称为抗体矩阵)。在90年代初期，Schena和其同事开发了微阵列技术，这对生物分析技术的研发产生了巨大的影响。基于微阵列技术的高通量分析允许快速检测生物分子间的相互作用，因此促进了生命科学的研究以及医疗诊断7。微阵列的类型包括DNA微阵列、蛋白质微阵列、肽微阵列等。
蛋白质和肽阵列是用于临床分析的成熟技术8,9。典型的蛋白质或肽微阵列由基底、功能化反应斑点、固定化的蛋白或肽、靶蛋白和用于检测的标记试剂组成10,11。常用的标记试剂有荧光分子12,13、辣根过氧化物酶(HRP)14、量子点15,16、纳米粒子17等。基于标记试剂，已经开发了诸如荧光显微镜检查12,17、酶联免疫吸附分析(ELISA)或酶联免疫化学发光法14,18等用来检测靶蛋白的信号。
微阵列的基底，也常被称为支持物，是用于产生微阵列的材料。硝酸纤维素膜、纸、各种硅材料和玻璃薄片通常用作微阵列的基底材料11,19。然而，这些基底的大多数会有非特异性蛋白吸附的问题，这种吸附导致了背景信号的增加，限制了检测20。对于硝酸纤维素或玻璃，必须进行多步骤处理以便降低背景信号21,22，这显著增加了制备基底的成本以及基底处理和贮存的复杂性。
如果基底表面没有被充分封闭，蛋白质微阵列的灵敏性和稳定性都会降低。因此，开发了多种不同的表面封闭方法以灭活背景信号，诸如聚乙二醇(PEG),23牛血清白蛋白(BSA)24等等25,26,27。这些方法通常需要长时间才能完成，并且非特异性蛋白吸附仍然能够检测到27。活化以及使基底上的反应斑点官能化的方法包括添加酯、乙醛、环氧、马来酰亚胺、诸如聚L赖氨酸的能够吸附蛋白的涂层聚合物、添加氨基、酰肼等11,28。大多数方法需要昂贵的化学试剂以及严格的调控条件，因此通常需要经过专门训练的人员来操作，并且伴随着过高的成本。
因此，需要开发用于制备微阵列，特别是蛋白质或肽微阵列的新的微阵列基底。
发明内容
第一方面，本申请提供了一种微阵列基底，包含表面被聚多巴胺修饰改性的含氟聚合物膜片。
在一实施方案中，含氟聚合物膜片由选自氟化乙丙烯(FEP),聚四氟乙烯(PTFE)和过氟烷氧基(PFA)的含氟聚合物材料制成，以及优选地，所述含氟聚合物材料为FEP。
在一实施方案中，聚多巴胺在所述含氟聚合物膜片表面上形成微斑点阵列。在一优选的实施方案中，聚多巴胺微斑点作为用于微阵列分析的反应部位，优选作为蛋白质或肽微阵列分析的反应部位。
第二方面，本申请提供了包含本文公开的微阵列基底的微阵列。在一些实施方案中，所述微阵列还包含固定在微阵列基底上的生物分子、细胞和/或微/纳米粒子。在优选的实施方案中，所述生物分子、细胞和/或微/纳米粒子固定在聚多巴胺微斑点上。
本申请一些优选的实施方案提供了蛋白质或肽阵列，其包含本文公开的微阵列基底和固定于聚多巴胺的蛋白质或肽，其中所述蛋白质或肽与聚多巴胺形成共价结合。优选地，所述蛋白或肽结合到所述聚多巴胺微斑点上。
第三方面，本申请提供了用于输送化学或生化试剂的微流体系统，其包含通道层，所述通道层包含溶液可以在其中持续流动的微通道，优选地，所述通道层由选自聚二甲基硅氧烷(PDMS),聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃和硅片的材料制成。在优选的实施方案中，微流体系统由PDMS制成。在一些实施方案中，微流体系统还包含位于上述通道层下方的底层，其包含微孔阵列。
第四方面，本申请提供了用于制备本文公开的微阵列基底的方法，其包括将多巴胺溶液涂敷或分配到含氟聚合物膜片上。在一实施方案中，上述分配包括将微流体系统结合在含氟聚合物片上，并保持多巴胺溶液流经含氟聚合物表面，其中含氟聚合物膜片通过微流体系统的微孔暴露于多巴胺溶液，由此在移走所述微流体系统后，在含氟聚合物膜片表面形成聚多巴胺微斑点阵列。
第五方面，本申请提供了用于制备微阵列的方法，包括将感兴趣的试剂分配至本文公开的微阵列基底上。在一实施方案中，试剂可以选自蛋白、肽、核酸、寡核苷酸、细胞、聚合物、小探针分子和微/纳米粒子。在另一实施方案中，微阵列可以用于检测或分析蛋白、肽、核酸、细胞或微/纳米粒子。
在本申请一些优选的实施方案中，提供了用于制备蛋白质或肽微阵列的方法，包括将蛋白质或肽溶液分配到本文公开的微阵列基底上，并在基底表面用所述蛋白质或肽溶液孵育，其中所述蛋白质或肽与聚多巴胺以共价键结合，以及优选地结合至所述聚多巴胺微斑点上。
在第六方面，本申请提供了利用本文公开的微阵列检测样品中感兴趣物质的方法，其包括将样品分配至所述微阵列，以及检测所述物质与所述微阵列的结合，特别是检测所述物质与微阵列基底上的预分配的试剂的结合。在一些实施方案中，上述结合可以通过与结合活动有关的比色法、荧光、化学发光法、电化学信号、质谱或放射性信号等来检测。
在其他方面，本申请提供了制备微流体系统的方法，例如利用光刻法29或软刻法30。本申请的其他实施方案还涉及利用微阵列或微阵列的基底检测、分析以及研究感兴趣的物质。.
附图简要说明
图1是显示PDMS微流体系统制备过程的示意图。
图2(a)是显示在FEP基底上制作聚多巴胺微斑点阵列的示意图；图2(b)示例了聚多巴胺微斑点阵列的形成；以及图2(c)显示了FEP膜片上的聚多巴胺微斑点的照片。
图3显示了利用微流体系统加载感兴趣的试剂溶液的示意图。
图4(a)是显示在微斑点上液滴形成过程的示意图；图4(b)显示了裸FEP基底(左侧)和在表面上涂敷有聚多巴胺的FEP基底(右侧)与液滴的接触角；图4(c)是显示分配至两种不同类型的聚多巴胺微阵列上的红色染料溶液的亮视野图像，左边的阵列为8×8,200μm直径，右边的阵列为4×4×4,100μm直径，左图中的插图显示标出的高光区域的放大图像。
图5(a)是显示不同染料溶液分配在聚多巴胺微阵列上的亮视野图像；以及图5(b)是显示不同荧光蛋白结合至聚多巴胺微阵列的共聚焦图像，GFP(绿色，上两排)，mCherry(红色，下两排)，比例尺:500μm。
图6(a)显示了在聚多巴胺微斑点上制作和分析微阵列的示意图，以及图6(b)是显示利用含氟聚合物基底上的IgG微阵列检测FITC标记的抗-IgG的荧光图像。
图7显示了聚多巴胺官能团和端巯基或端氨基官能化试剂间反应的示意图。
图8显示了利用红色荧光蛋白mCherry测量在不同基底上的非特异性蛋白吸附的结果。(a)显示了当基底用不同浓度的mCherry孵育时，荧光信号强度的变化；(b)是图(a)中的红色方框区域的放大图像，表明来自FEP或BSA封闭的聚多巴胺的信号是检测不到的。
图9(a)示例了建立IgG微阵列的原理以及用于检测抗-IgG的基于荧光和酶联免疫化学发光分析方法；图9(b)显示了来自不同基底的信号/背景比随时间的变化，使用的抗-IgG浓度为50μg/ml；图9(c)显示了当基底用不同浓度的FITC标记的抗-IgG孵育时，来自不同基底的非特异性蛋白吸附；以及图9(d)显示了来自FEP基底和硝酸纤维素基底的荧光信号强度随时间的变化，使用的FITC标记的抗-IgG浓度为50μg/ml。
图10显示了用于检测HRP标记的抗-IgG的酶联免疫化学发光测定。(a)显示了检测抗-IgG的孵育条件的优化分析，当FEP基底在37℃下孵育时，靶信号强度增加；以及(b)显示了在不同孵育条件下，来自不同基底的非特异性蛋白吸附。
图11(a)是显示肽微阵列制作以及肽微阵列用于抗体检测的示意图；图11(b)显示肽1在聚多巴胺微斑点上的加样浓度的优化分析。插图是具有不同肽1浓度的肽微阵列的共聚焦图像。比例尺：1mm；以及图11(c)是基于sflag肽微阵列检测抗-flag抗体的标准曲线。
定义
如本文所用的，术语“微阵列”指高密度的阵列。微阵列包含特异性支持物以及在支持物上的生物材料，其中所述生物材料形成了适于高通量检测一种或多种测试物质的阵列。微阵列通常包括核酸微阵列、蛋白微阵列、肽微阵列等，其能够用于检测多种感兴趣的分子。
如本文所公开的，本申请的基底包括聚多巴胺、含氟聚合物、以及任选地支持物材料。聚多巴胺被分配在含氟聚合物的表面上。在包含支持物材料的情况下，含氟聚合物被涂敷至支持物材料表面上。支持物材料可以包括但不限于塑料、玻璃薄片或其他惰性材料。
如本文所用的，术语“含氟聚合物”为碳氟基聚合物，具有多个作用力强的碳氟键。含氟聚合物的特征在于对溶剂、酸和碱的高抵抗性。含氟聚合物具有卓越的不粘性以及低摩擦性能。此外，含氟聚合物由于多个碳氟键的存在而具有化学稳定性。含氟聚合物可以作为机械上的热固性材料或热塑性材料。含氟聚合物可以是均聚物或共聚物。
如本文所用的，术语“PTFE”和“聚四氟乙烯”是合成的四氟乙烯含氟聚合物，具有多种应用。PTFE最著名的商标名称是杜邦公司的Teflon。如本文所用的，术语“FEP”是被命名为“氟化乙丙烯”的合成的含氟聚合物。FEP是六氟丙烯和四氟乙烯的共聚物。FEP是由杜邦公司研发的，商标名称为Teflon FEP。
如本文所用的，术语“含氟聚合物芯片”指具有配置在或涂敷至含氟聚合物表面上的聚多巴胺的载体，其中聚多巴胺用于对含氟聚合物表面进行修饰改性。所述芯片能够用于制备对测试物质进行高通量检测的微阵列。如本文所用的，术语“含氟聚合物芯片”和“含氟聚合物基底”在本文中可以交互使用。
本说明书中提及的“一个实施方案”、“一实施方案”、“另一实施方案”、“一些实施方案”或者“所述实施方案”等意味着结合该实施方案描述的特定参照特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。因此，在本说明书多处出现的措辞“一个实施方案”、“一实施方案”、“另一实施方案”、“一些实施方案”并不必然都是指同一实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式在一个或多个实施方案中进行组合。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解，在本发明的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
具体实施方式
本领域熟知含氟聚合物具有不粘性能。到目前为止，这类材料还没有被用作微阵列的基底。在本申请中，发明人首次开发了含氟聚合物芯片或含氟聚合物基底，在微阵列技术领域提供了新的检测技术手段。
第一方面，本申请提供了一种微阵列基底，其包含表面用聚多巴胺修饰的含氟聚合物膜片。
在一些实施方案中，提供了用于分析感兴趣物质的微阵列的基底，包含含氟聚合物膜片和聚多巴胺，其中聚多巴胺被分配在含氟聚合物的表面，并能够在含氟聚合物膜片表面上形成微斑点阵列，以连接用于分析或检测感兴趣的物质的试剂。
在一实施方案中，含氟聚合物膜片由选自氟化乙丙烯(FEP),聚四氟乙烯(PTFE)和过氟烷氧基(PFA)的含氟聚合物材料制成。在优选的实施方案中，含氟聚合物材料为FEP。
在其他实施方案中，聚多巴胺可以通过含有巯基或氨基的官能化试剂来修饰。在一实施方案中，官能化试剂可以选自巯基乙酸、半胱氨酸、巯基乙胺、巯基乙醇和包含巯基的其他试剂，以及对氨基苯酚、氨基水杨酸、氨基苯甲酸、多种氨基酸以及包含氨基的其他试剂。在优选的实施方案中，官能化试剂可以与聚多巴胺共价结合。在一些实施方案中，聚多巴胺允许蛋白、肽、核酸、寡核苷酸、细胞、聚合物、小探针分子或微/纳米粒子的固定。所述核酸优选为DNA或者RNA。
在任选的实施方案中，本文公开的微阵列基底还包含位于含氟聚合物膜片下方的支持材料。在一实施方案中，支持材料可以是玻璃或塑料或者其他惰性材料。
第二方面，本申请提供了包含本文公开的微阵列基底的微阵列。在一些实施方案中，微阵列还包含固定在微阵列基底上的生物分子、细胞和/或微/纳米粒子，优选地，这些物质固定在基底表面的聚多巴胺微斑点上。在一实施方案中，生物分子可以是蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、聚合物或者小探针分子。
在一实施方案中，微阵列包含连接到聚多巴胺微斑点的细胞，由此所述微阵列可以用于组织工程学、干细胞分化或细胞靶向的药物功效测试。
在另一实施方案中，固定在微阵列基底上的微/纳米粒子可以用巯基或氨基修饰，并且可以结合至聚多巴胺微斑点上。因此，包含上述微/纳米粒子的微阵列可以用于表面图案化以及用于进行诸如酶分析的生物分子检测或自组装单分子层研究。
在另一实施方案中，包括DNA或RNA的核酸，或者寡核苷酸在其末端被巯基或氨基修饰，由此可以结合到聚多巴胺微斑点上从而产生相应的微阵列。
在一些优选的实施方案中，提供了蛋白质或肽阵列，其包含本文公开的微阵列基底和固定于聚多巴胺的蛋白质或肽，其中所述蛋白质或肽与聚多巴胺共价结合。优选地，所述蛋白或肽可以通过共价结合和静电吸附直接结合到聚多巴胺上。
本申请的发明人在本文公开的基底上成功地制作了用于蛋白分析的蛋白质或肽微阵列。不需要复杂的表面修饰以激活微斑点或灭活背景区域信号。在一些实施方案中，在本文公开的蛋白质或肽微阵列上，基底背景区的非特异性蛋白吸附明显降低。在其他实施方案中，来自不同批次的微阵列基底及来自同一基底不同区域的靶信号具有良好的重复性，能够保证将微阵列基底用于更为复杂的分析系统的稳定性。
第三方面，本申请提供了用于输送化学或生化试剂的微流体系统，其包含通道层，所述通道层包含溶液可以在其中持续流动的微通道。在一些实施方案中，所述通道层由选自聚二甲基硅氧烷(PDMS),聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃和硅片的材料制成。在优选的实施方案中，微流体系统由PDMS制成。在一些实施方案中，微流体系统还包含位于上述通道层下方的底层，其包含微孔阵列。
在一实施方案中，微流体系统是两层的微流体芯片，其中上层是通道层，下层是具有微孔阵列的膜。该微流体芯片可以通过光刻法或软刻法制作。在一些实施方案中，微流体系统的上下两层的结合是通过热动控制实现的31。在另一实施方案中，可以利用多种材料，诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃和硅片来制作微流体系统的上下两层。
第四方面，本申请提供了用于制备本文公开的微阵列基底的方法，其包括将多巴胺溶液涂敷或分配到含氟聚合物膜片上，诸如氟化乙丙烯(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)和过氟烷氧基(PFA)等含氟聚合物膜片上。
在一实施方案中，上述分配包括将微流体系统结合在含氟聚合物片上，并保持多巴胺溶液流经含氟聚合物表面，其中含氟聚合物膜片通过微流体系统的微孔暴露于多巴胺溶液，由此在移走所述微流体系统后，在含氟聚合物膜片表面形成聚多巴胺微斑点阵列。在一实施方案中，微流体系统中的微孔大小决定微斑点的大小。
第五方面，本申请提供了用于制备微阵列的方法，其包括将感兴趣的试剂分配至本文公开的微阵列基底表面上。在一些实施方案中，试剂可以选自蛋白、肽、核酸、寡核苷酸、细胞和微/纳米粒子，由此微阵列可以用于检测或分析蛋白、肽、核酸、细胞或微/纳米粒子。
在一些实施方案中，用于制备微阵列的方法包括在微阵列基底表面上滚动感兴趣试剂的液滴，其中所述试剂液滴可以被聚多巴胺微斑点捕获，并由此在基底表面形成阵列。在其他实施方案中，用于制备微阵列的方法包括将本文公开的微流体系统置于基底表面上，其中所述试剂被引入微流体系统的通道中并流经所述基底的微斑点。移走微流体系统后，只有基底表面的微斑点被试剂覆盖。
在一些优选的实施方案中，提供了用于制备蛋白质或肽微阵列的方法，包括将蛋白质或肽溶液分配到本文公开的微阵列基底上，并在基底表面孵育所述蛋白或肽溶液一段时间，例如孵育几个小时。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽与聚多巴胺形成共价结合，以及优选地结合至聚多巴胺微斑点上。
本文制备的微阵列基底以及蛋白质或肽微阵列具有以下至少一个优势：1)不需要复杂的表面处理；2)节约成本和时间；3)背景信号低；4)检测灵敏度高；5)靶信号的重复性好等等。
第六方面，本申请提供了利用本文公开的微阵列检测样品中感兴趣物质的方法，其包括将样品分配至所述微阵列，以及检测所述物质与所述微阵列的结合，特别是检测所述物质与微阵列基底上的预分配的试剂的结合。在一些实施方案中，上述结合可以通过与结合活动有关的比色法、荧光、化学发光、电化学信号、质谱或放射性信号等来检测。
在其他方面，本申请提供了制备微流体系统的方法，例如利用光刻法29或软刻法30。微流体加载系统可以用于将聚多巴胺溶液分配至含氟聚合物膜片上，或者用于将含有感兴趣试剂的溶液分配至含氟聚合物基底表面上。下文描述了本申请其他的或更为具体的实施方案。
多层微流体加载装置的制备
制备多层微流体加载装置以在含氟聚合物膜片上形成聚多巴胺微斑点。微流体系统还可以用于将化学或生化试剂递送至本文公开的含氟聚合物基底。术语“微流体加载装置”和“微流体系统”在本文中可以交互使用。
可以利用多种材料诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃和硅片来制备微流体系统。例如，微流体系统由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。PDMS是常用的用于微流体芯片的材料29，已知PDMS是透气和透水的32。作为实例，制备微流体系统的方法包括使用软刻法30。
在一实施方案中，微流体系统包含具有不同图案的两层或者由具有不同图案的两层组成。以PDMS微流体系统为例，上层PDMS层是通道层，通过在硅母版(silicon master)里浇铸PDMS前体诸如液体硅氧烷单体和固化剂的混合物来制作。利用快速原型法制造硅母版29。硅母版起模子的作用，并且含有与微图案(在本文中为微通道)互补的浮雕结构(图1)。下层PDMS层是具有微孔阵列的薄PDMS膜。通过将含有较低百分比的固化剂的薄层PDMS前体旋涂至另一硅母版的表面上制作该薄PDMS膜。另一硅母版含有微柱阵列。在大多数情况下，微柱的直径为约100-500μm，优选为约200μm。微柱的大小决定PDMS膜的微孔大小。
在一些实施方案中，微流体系统的上下两层的结合是通过热动控制实现的31。具体地，通过上层和下层间不同的固化速率来实现两层的结合。以PDMS微流体系统为例，PDMS两层具有不同的化学成分，因此在相同的热处理条件下容易使上层完全固化而下层半固化。将上层从硅母版剥离，与下层对齐，经过另外几小时的热处理后，两层能够完全结合(图1)。
制作含氟聚合物上的聚多巴胺微斑点
在本申请的实施方案中，聚多巴胺用于修饰含氟聚合物(诸如PTFE、FEP和PFA)表面以允许蛋白、肽、核酸、聚合物、小探针分子、细胞或其他感兴趣的实体的固定。在一个实施方案中，为了在含氟聚合物表面上制作薄聚多巴胺层，需要新鲜多巴胺溶液(诸如在碱性溶液中，浓度约1-10g/L)的连续流动。为了在含氟聚合物表面的确定位置上产生连续流动的溶液，在一实施方案中，使用微流体加载系统。在微流体系统的微孔下面，含氟聚合物表面暴露于流动的多巴胺溶液。
在另一实施方案中，含氟聚合物基底诸如PTFE、FEP和PFA基底表面利用超声波法分别通过去污剂、酒精和纯水净化处理。微流体系统与含氟聚合物膜片紧密结合，例如通过钳夹法。
在其他实施方案中，在微流体系统以及在含氟聚合物表面制备聚多巴胺层的过程中使用真空33。例如，由于PDMS的透气性，在预脱气的PDMS中产生真空，整个微通道和微孔都充满多巴胺溶液，里面没有气泡(图2a)。
在多巴胺聚合过程中，微流体系统与含有多巴胺溶液的蓄水装置连接，受蠕动泵的驱动，多巴胺溶液持续流动。几个小时后，在微通道壁和含氟聚合物表面上都形成了薄层聚多巴胺，其中含氟聚合物表面通过微孔暴露于多巴胺溶液。移走微流体系统后，在含氟聚合物上生成了呈现聚多巴胺薄层的微斑点阵列(图2b和图2c)。
在其他实施方案中，本文公开的含氟聚合物膜片可以是在塑料、玻璃薄片或其他惰性材料上的含氟聚合物厚片，或者是含氟聚合物薄层。
试剂在微斑点上的分配
在一些实施方案中，将化学或生化试剂分配到含氟聚合物诸如PTFE、FEP和PFA表面的聚多巴胺微斑点上，以产生用于分析或诊断或者本文公开的其他用途的微阵列。在本文中，我们使用“含氟聚合物芯片”指代在其表面上具有聚多巴胺微斑点的含氟聚合物膜片。
在一实施方案中，可以通过以下方法将少量样品溶液分配至含氟聚合物芯片(诸如PTFE、FEP和PFA芯片)上：在含氟聚合物芯片上滚动样品溶液微滴。倾斜含氟聚合物芯片表面或通过机械力实现液滴的滚动。液体溶液可以被亲水性聚多巴胺微斑点快速捕获，并在含氟聚合物芯片表面上形成微滴阵列(图4)。在一些实施方案中，可以将不同的样品溶液以上述液滴滚动分配的方法引入指定的微斑点上，从而形成多功能化阵列。
在一实施方案中，将少量样品溶液分配至含氟聚合物芯片可以通过在微斑点上方放置包含微通道的微流体系统来实现。在一实施方案中，微粒体系统可以是只含有通道的单层系统。在优选的实施方案中，微流体系统可以与用于分配多巴胺溶液的系统具有相同的结构，即包含微通道层和微孔层。液体样品溶液可以被导入微通道，并流经含氟聚合物芯片上的聚多巴胺微斑点(图3)。移走微流体系统后，仅有微斑点被样品溶液覆盖(图4)。
在其他实施方案中，为了生成蛋白质微阵列，可以将蛋白通过共价结合和静电吸附直接结合到聚多巴胺。具体地，可以通过将蛋白溶液分配至聚多巴胺微斑点上并孵育几个小时形成蛋白质微阵列。在另外的实施方案中，末端被硫醇或胺类修饰的DNA,RNA和寡核苷酸也能够结合在聚多巴胺微斑点上以生成相应的微阵列(图6)34。
微斑点上液滴中的亚微升生化反应
在本申请的实施方案中，生化反应诸如聚合酶链反应(PCR)可以在本文公开的含氟聚合物芯片上完成。可以制作体积为毫微微升(femtoliter)至纳升的液滴的微斑点。将样品溶液快速分配至每一微斑点并形成液滴。在一些实施方案中，由于在氟化油的保护下防止了溶液的蒸发，因此可以在含氟聚合物芯片上并行完成大量反应。例如，在本文公开的含氟聚合物芯片上的液滴阵列可以用于数字PCR35。
改变微斑点的表面性质
在一些实施方案中，可以将多种化学官能团引入到聚多巴胺微斑点上，如图7所示例的。官能化试剂包含巯基或氨基，能够与聚多巴胺共价结合34。已有研究证实含氨基或巯基的生物分子能够成功结合在聚多巴胺上35,36,37。在一些实施方案中，官能化试剂可以选自巯基乙酸、半胱氨酸、巯基乙胺、巯基乙醇和包含巯基的其他试剂，以及对氨基苯酚、氨基水杨酸、氨基苯甲酸、多种氨基酸和包含氨基的其他试剂。
在微斑点上沉积细胞或粒子
在其他实施方案中，可以直接将细胞悬液分配至本文公开的含氟聚合物芯片上的聚多巴胺微斑点上。细胞的沉积允许进行若干研究，诸如组织工程学、干细胞分化、细胞靶向的药物功效测试等方面的研究。通过在微斑点上沉积单个细胞也可以进行单细胞分析。在其他实施方案中，也可以将悬浮在溶液中的微米粒子/纳米粒子分配至微斑点上。形成图案的微米粒子或纳米粒子可以用于诸如生物分子的超敏感检测的应用中。如果粒子已经用反应性硫醇或胺类修饰，则能够结合在微斑点上用于进一步的应用，诸如酶活性测定、自组装单层膜研究等。
与已存在的或之前的产品比较
利用本文公开的含氟聚合物芯片制作蛋白质微阵列至少具备以下一项优点。
利用本文公开的含氟聚合物芯片制作蛋白质微阵列的成本低于现有产品。与玻璃和硝酸纤维素不同，本文公开的含氟聚合物芯片在制作过程中不需要进一步的修饰。
利用本文公开的含氟聚合物芯片制作的微阵列的灵敏性优于现有产品。与表面改性的玻璃和硝酸纤维素相比，本文公开的含氟聚合物具有优越的蛋白排斥和防污表面特性。因此，本文公开的含氟聚合物芯片特别是FEP芯片的背景信号较低，这提高了检测的灵敏性。
上述公开内容总体上描述了本发明，通过下面的实施例进一步示例本发明。描述这些实施例仅为说明本发明，而不是限制本发明的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本发明的范围。除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域技术人员所公知的方法和技术。
实施例
实施例1：PDMS微流体加载装置的制备
PDMS微流体装置由具有不同图案的两PDMS层组成，通过软刻法利用Siloxane184 Silicone Elastomer试剂盒(Dow Corning)来制作。该试剂盒包含PDMS前体和固化剂。
通过在硅母版浇铸PDMS前体，即液体硅氧烷单体(184,Dow Corning)和固化剂(5:1)的混合物制作上面的PDMS层。利用光刻法形成硅母版的图案。硅母版作为模子，包含与微图案(此处指微通道)互补的浮雕结构(图1)。
下方的PDMS层是包含微孔的薄PDMS膜(约20μm厚)。通过在第二硅母版的表面上旋转涂布薄层PDMS前体(硅氧烷单体：固化剂＝20:1)制作PDMS下层。该硅母版包含直径为200μm的微柱阵列。微柱大小决定PDMS膜的微孔大小。在1cm×1cm PDMS膜上可以容易地形成成千上百个微孔。
通过控制上层和下层PDMS层的不同固化率实现两PDMS层的结合。由于两层的不同组成，在80℃热处理30分钟后，上层完全固化，而下层是半固化的。将上层从硅母版剥离，与下层对齐。再进行2-5小时的热处理后，两层完全结合(图1)。制作好的PDMS微流体装置备用。
实施例2：在含氟聚合物膜片上制作聚多巴胺微斑点
本实施例中使用的多巴胺购自Sigma-Aldrich公司，使用的FEP(20μm)购自上海玉乙淞塑料制品有限公司。
制备新鲜的多巴胺溶液(pH8.5,2g/L)。在使用前，利用超声波通过表面活性剂、乙醇和去离子水洗涤1cm×1cm FEP膜片三次。
将实施例1中制备的PDMS微流体系统与FEP膜片通过钳夹法紧密结合，并在真空干燥器中脱气30分钟(图2a)。完成脱气步骤后，将新鲜的多巴胺溶液(pH＝8.5)引入微流体系统。溶液立即充满上面的通道层，然后逐渐充满下层微孔中的空区。脱气的PDMS系统通过吸附微通道和微孔中的空气加速了填充过程。在微孔下面，FEP表面暴露于流动的多巴胺溶液。
整个溶液加载过程在5分钟内完成。溶液加载和排除气泡后，在微流体系统中连续不断地供应新鲜的多巴胺溶液3小时。在这期间，溶液会从透明无色变成深棕色，表明聚多巴胺涂层的形成。从FEP膜片移走微流体芯片后，在FEP膜片上形成代表聚多巴胺薄层的微斑点(每个斑点具有200μm的直径)的阵列(图2)，其具有对应于微流体系统的微孔阵列的几何图形。由此FEP芯片制作完成。
实施例3：在微斑点上分配试剂
将化学或生化试剂分配到FEP基底上的微斑点上以产生用于分析或诊断或本文公开的其他应用的微阵列。
通过将液体溶液直接在基底表面上流动(图4)或借助PDMS微流体系统(图3)分配液体溶液。具体地，可以利用下面两种方法将少量样品溶液分配到FEP芯片上。
在FEP芯片表面上滚动样品溶液的微滴实现试剂的快速分配。液滴的滚动则通过倾斜FEP芯片表面或通过机械力来实现。由于聚多巴胺和FEP亲水性的差异，液体溶液只会被捕获在聚多巴胺微斑点上(图4)。从图4c结果可以看出，液体溶液的量均匀分布在每一微斑点上，这证实了微阵列在快速点样应用时的稳定性和可靠性。
试剂的分配还可以通过在微斑点上方放置实施例1制备的PDMS微流体系统来完成。液体样品溶液被引入微通道并在FEP基底微斑点上方流动。移走PDMS微流体系统后，只有微斑点被样品溶液覆盖(图3)。
不同的样品溶液可以通过借助带有通道的PDMS微流体系统引入到指定的微斑点上以形成多功能化阵列(图5a)。先将微流体系统的通道与微斑点阵列校准对齐，然后将微流体系统与FEP基底固定在一起。使用注射器连接微流体系统，将样品溶液从注射器中导入微流体系统，注入以后再抽出。由于聚多巴胺和FEP亲水性的差异，液体溶液只会被捕获在聚多巴胺微斑点上。从图5a的结果可以看出，液体溶液的量均匀分布在每一微斑点上，这证实了微阵列在快速点样应用时的稳定性和可靠性。
实施例4：利用蛋白质微阵列检测抗-抗体
将人IgG蛋白(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)通过共价结合和静电吸附直接与聚多巴胺微斑点结合。通过将IgG溶液(1mg/ml)分配至实施例2制备的FEP基底上，并孵育过夜，形成蛋白质微阵列。分配FITC标记的兔抗人抗-IgG溶液(50μg/ml，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)以与结合聚多巴胺微斑点的IgG接触。利用实施例3描述的液滴滚动方法，进行IgG和抗-IgG的分配。如图6(b)所示,利用FEP基底上的IgG微阵列检测FITC标记的抗-IgG，结果以荧光图像(绿色)显示。荧光强度利用激光扫描共焦显微镜(Nikon)来检测。
实施例5：基于荧光的蛋白质微阵列分析
为了在基底上形成蛋白质微阵列，将蛋白溶液分配至微斑点上，并在4℃孵育过夜。蛋白质上的氨基和巯基会与聚多巴胺上的醌基或邻苯二酚基团形成共价键，由此使微斑点功能化。绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)(两种蛋白都是在发明人利用常规方法通过质粒提取的，使用浓度为0.5mg/ml)用于检测聚多巴胺斑点上的蛋白结合效率(图5b)。从图5b的结果可知，只有微斑点显示绿色或红色荧光，并且微斑点上的荧光强度几乎没有波动，这表明蛋白在每一微斑点上的均匀分布。来自具有相同样品的不同微斑点的荧光强度是一致的，这证实了实验的可重复性。荧光强度利用激光扫描共焦显微镜(Nikon)来检测。
然后我们制作了基于人IgG的蛋白质微阵列，并使用FITC标记的兔抗人二抗(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)来检测FEP基底上非特异性蛋白吸附(图8和图9)。简言之，利用实施例3描述的液滴滚动方法，将60μg/ml人IgG(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)溶液沉积到微斑点上，在4℃孵育过夜。然后将5mg/ml BSA(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)溶液用于封闭聚多巴胺微斑点1小时。随后将整个FEP基底暴露于第二抗体溶液，并在室温下连续摇动孵育3小时。不同浓度的二抗溶液用于观测微斑点和背景的荧光信号变化(图9c)。将与人IgG没有特异性相互作用的红色荧光蛋白作为阴性对照(图8)。在本实施例中，使用硝酸纤维素膜(购自Whatman公司)与本发明的微阵列基底比较蛋白的吸附。对于硝酸纤维素膜，用BSA封闭过夜以确保材料上的非特异性蛋白吸附降至最小。
对于FITC标记的二抗和mCherry，FEP基底的背景信号与仪器的噪音相似。相比之下，在上述两种情况下，硝酸纤维素膜都出现了非特异性蛋白吸附的问题(图8和图9c)。尽管来自聚多巴胺微斑点和硝酸纤维素膜的靶荧光信号强度都随着二抗浓度的增加而增加(图9c)，但FEP基底显示了更好的信号/背景比。如图9b所示，随时孵育时间的延长，来自FEP基底的信号/背景比显著高于来自硝酸纤维素膜的比值。
实施例6：基于基底的酶联免疫化学发光测定法
与基于荧光的微阵列不同，酶联免疫化学发光测定使用HRP诱发的化学发光以放大信号，并由此增加检出限。人IgG微阵列作为简单模型，并且HRP标记的山羊抗人二抗(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)与H2O2一起使用以诱发来自鲁米诺的化学发光信号(图9a)。在本实施例中使用了ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate试剂盒(Thermo)进行实验。
加样和表面封闭后，将具有蛋白质微阵列的基底用不同浓度的HRP标记的二抗孵育。在室温或37℃下孵育30分钟。此后，将基底用0.02％的吐温缓冲液洗涤。然后将H2O2和鲁米诺溶液加载到基底上。通过GEImagequant LAS 4000检测化学发光信号，曝光时间为2分钟。每一实验在至少三个FEP基底膜片上进行，并且每一基底上有(4×4)×4的阵列。从获得的所有数据中计算结果。
对于所有浓度的二抗溶液，在37℃的孵育条件下检测到比室温更强的信号。特别是对于20ng/ml的二抗溶液，仅在37℃的孵育条件下检测到相对强的信号强度，在室温孵育时检测不到信号(图10a)。从图10a的结果可以看出，在室温下，来自FEP基底的背景信号几乎为0。这一结果表明，在相对较高的温度下，可以得到较高的蛋白-蛋白间相互反应率，并保证较短孵育时间的较低检出限。然后我们测量了硝酸纤维素膜在孵育相同时间后的背景信号(图10b)。结果显示，硝酸纤维素膜在37℃的孵育条件下显示了严重的非特异性蛋白吸附。如果反应在室温下进行，来自硝酸纤维素膜的非特异性蛋白吸附就会大大降低，然而仍然明显高于来自FEP基底的非特异性蛋白吸附。
实施例7：肽微阵列分析
前面已证实了FEP基底的“零”非特异性蛋白吸附性能，接下来我们检测是否FEP基底也适用于肽微阵列分析。我们合成并纯化了序列为KKKKRGD的FITC标记的肽(命名为肽1，图11b)。利用实施例3描述的液滴滚动方法，将肽溶液沉积到聚多巴胺微斑点上，并在4℃孵育过夜。不同浓度的肽1溶液用于检测该肽与基底的结合效率(图11b)。从共聚焦图像可以看出，该肽能够成功地结合到微斑点上。此外，由于该肽富含氨基，当浓度达到200μg/ml时，肽结合接近饱和。
为了进行肽微阵列分析，将肽sflag(序列为KCIVEVIDYKDDDDK)固定在聚多巴胺微斑点上。抗-flag抗体是要检测的靶蛋白。如图11a所示，不同浓度的抗flag抗体(购自Abcam plc)首先与肽微阵列孵育。而后彻底洗涤基底，随之用HRP标记的抗flag二抗(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)孵育。所有的孵育都是在37℃进行30分钟。加载鲁米诺溶液，曝光2分钟后，收集化学发光信号(图11c)。当浓度增加时，信号呈现指数增加。上述抗体的浓度检出限为40 ng/ml。实验中的背景信号几乎为零，而且在相同实验条件下，来自不同批次制作的FEP基底微斑点的靶信号强度都是一致的。这些结果表明，利用FEP肽微阵列进行分析的重复性好、信噪比低。
总之，我们已经成功地制备了基于FEP基底的蛋白质或肽微阵列用于蛋白分析。使用简单的分配方法就可以将样品溶液沉积到聚多巴胺微斑点上。不需要复杂的表面修饰来活化微斑点或灭活背景信号。蛋白质或肽样品能够与聚多巴胺共价结合，并能够结合到聚多巴胺微斑点上。
蛋白质和肽微阵列的实验表明，来自本发明的微阵列基底的背景信号显著降低，例如在实施例6和7中非特异性蛋白吸附甚至接近零。此外，来自不同批次基底的靶信号具有良好的重复性，这保证了微阵列基底用于更为复杂的分析系统时的稳定性。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都代表了本发明所属技术领域的技术人员的技术水平。所有提及的出版物、专利和专利申请都通过引用的方式并入本文，如同每一单独的出版物或专利文献被特别指明并入本文一样。
可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本发明要求保护的范围内。
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Claims (26)

1.微阵列基底，其包含表面用聚多巴胺修饰的含氟聚合物膜片。
2.如权利要求1所述的微阵列基底，其中所述含氟聚合物膜片由选自氟化乙丙烯(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)和过氟烷氧基(PFA)的含氟聚合物材料制成，以及优选地，所述含氟聚合物材料为FEP。
3.如权利要求1或2所述的微阵列基底，其中所述聚多巴胺在所述含氟聚合物膜片表面上形成微斑点阵列。
4.如权利要求3所述的微阵列基底，其中所述微斑点作为用于微阵列分析的反应部位，优选作为蛋白质或肽微阵列分析的反应部位。
5.如前述权利要求任一项所述的微阵列基底，其中所述聚多巴胺通过与含巯基或氨基的官能化试剂接触被官能化。
6.如前述权利要求任一项所述的微阵列基底，其中所述聚多巴胺允许蛋白、肽、核酸、寡核苷酸、细胞、聚合物、小探针分子或微/纳米粒子的固定。
7.如前述权利要求任一项所述的微阵列基底，其中所述微阵列基底还包含位于所述含氟聚合物膜片下方的支持材料，诸如玻璃或塑料。
8.微阵列，其包含前述权利要求中任一项所述的微阵列基底。
9.如权利要求8所述的微阵列，其中生物分子、细胞和/或微/纳米粒子固定在所述微阵列基底上，优选固定在所述聚多巴胺微斑点上。
10.如权利要求9所述的微阵列，其中所述生物分子选自蛋白、肽、核酸、寡核苷酸、聚合物和小分子探针。
11.如权利要求9所述的微阵列，其中将所述细胞连接在所述聚多巴胺上，所述微阵列可以用于组织工程学、干细胞分化或细胞靶向的药物功效测试中。
12.如权利要求9所述的微阵列，其中所述微/纳米粒子用巯基或氨基修饰，并且可以结合至聚多巴胺微斑点上。
13.如权利要求10所述的微阵列，其中所述核酸或寡核苷酸在其末端用巯基或氨基修饰。
14.蛋白质或肽阵列，其包含权利要求1-7中任一项所述的微阵列基底，以及固定于聚多巴胺上的蛋白质或肽，其中所述蛋白质或肽与聚多巴胺以共价键结合，优选结合到所述聚多巴胺微斑点上。
15.用于递送试剂的微流体系统，其包含通道层，所述通道层包含溶液可以在其中持续流动的微通道，优选地，所述通道层由选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃和硅片的材料制成。
16.如权利要求15所述的微流体系统，其中所述微流体系统还包含位于所述通道层下面的底层，其中所述底层含有微孔阵列。
17.制备权利要求1所述的微阵列基底的方法，包括将多巴胺溶液分配到含氟聚合物膜片上。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述分配包括将权利要求16所述的微粒体系统与含氟聚合物膜片结合，并保持多巴胺溶液流经含氟聚合物膜片表面，所述含氟聚合物膜片通过所述微流体系统的微孔暴露于多巴胺溶液。
19.制备权利要求8所述的微阵列的方法，其包括将感兴趣的试剂分配至权利要求1-7中任一项所述的微阵列基底上。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述分配包括在所述基底表面上滚动试剂液滴，其中所述试剂可以被聚多巴胺微斑点捕获，并由此在所述基底表面形成阵列。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述分配包括将权利要求16所述的微流体系统置于所述基底表面上，所述试剂被引入微流体系统的通道中并流经所述基底的微斑点。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述试剂选自蛋白、肽、核酸、寡核苷酸、细胞、聚合物、小探针分子和微/纳米粒子。
23.制备权利要求14所述的蛋白质或肽微阵列的方法，其包括将蛋白质或肽溶液分配到权利要求1-7中任一项所述的微阵列基底上，并孵育所述蛋白质或肽溶液，其中所述蛋白质或肽与聚多巴胺以共价键结合，以及优选地所述蛋白质或肽结合至所述聚多巴胺微斑点上。
24.利用权利要求8-14中任一项所述的微阵列检测样品中感兴趣的物质的方法，其包括将样品分配至微阵列，以及检测样品中所述物质与所述微阵列的结合。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述感兴趣的物质选自蛋白、肽、核酸、寡核苷酸、细胞、药物化合物和微/纳米粒子。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述物质与微阵列的结合通过比色法、荧光、化学发光法、质谱或放射性信号来检测。
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