JP2010243454A - 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、支持基体の所定位置に微小な金属パッドを設け、当該金属パッドに対し、ポリペプチドからなるリンカーを固着させ、当該リンカーにプローブ分子を結合させることに関する。本発明により、プローブ分子を所定位置に固定した核酸分析デバイスを提供できる。核酸分析デバイスを用いた核酸分析において、「dephasing」が起こることがないため読み取塩基長を長くでき、かつ、多種類の被解析DNA断片を一度に解析可能であるため、非常に高いスループットとすることができる。
【選択図】 図1
Description
単分子方式では、テンプレートとなるDNA試料断片が1分子だけ、所定の位置に固定される、あるいは、ランダムに平滑基板上に固定され、基板上に核酸合成酵素と蛍光色素付きヌクレオチドが供給されると基板上で伸長反応が起き、取り込まれたヌクレオチドの蛍光色素の発光を一分子レベルで検出することにより、ヌクレオチドの識別を行う。単分子方式の場合には、「Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109.(非特許文献2)」にあるような逐次反応方式に加えて、「Science 2009, Vol. 323, pp. 133-138.(非特許文献3)
」にあるようなリアルタイム計測方式も提案されている。クラスタ方式の利点は、検出対象のDNAがPCRで増幅された数千から数万分子であることから蛍光検出が容易であることである。一方、弱点は、数千から数万分子の伸長反応を平均値として評価するため、数千から数万分子の伸長反応の速度が不揃いで、伸長反応の進み具合にばらつきが生じると、一度に複数の蛍光色素の発光が検出されてしまい、取り込まれた塩基の同定ができなくなってしまう点にある。この現象は「dephasing」と呼ばれ、伸長する塩基鎖が長くなった時ほど起こりやすくなるため、クラスタ方式の読み取り塩基長が比較的短いことの主原因の一つとなっている。
設けておき、末端にビオチン修飾を施した核酸プローブ分子の溶液を低濃度で基板表面と反応させることにより、ランダムに一分子プローブを固定することが提案されている。
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
te Kinase;Domain 3, Lyase, Ornithine Decarboxylase;Chain A, domain 1, Barwin-like endoglucanases, OB fold (Dihydrolipoamide Acetyltransferase, E2P), Cathepsin
D, subunit A;domain 1, Cyclophilin, Butyryl-CoA Dehydrogenase, subunit A;domain 2, Lipocalin, Ribosomal Protein L14, Green Fluorescent Protein (GFP), Porin,
Maltoporin;Chain A, Catalase HpII, Chain A, domain 1, Telomere-binding Protein Beta Subunit;Chain B, Intramolecular trans-sialidase, domain 3などが例示される
。βバレル構造ユニットは、その目的用途に応じて上述した各種タンパク質などから適宜選択したものを利用して構成することができる。例えば、金結合部位を有するドメインをより小さいサイズにして更なる生産性を向上させる場合は、リポカリン(Lipocalin)などの低分子タンパク質が好ましい。また、金属との結合部位を含むドメインを多量体化し
てより剛直な分子にして配向性を向上させる場合、リポカリンやポーリン(Porin)類に存在する多量体分子を選択することができる。タンパク質の機能的な分類で例示すれば、膜貫通タンパク質を挙げることができる。特に、好適なタンパク質としては外膜タンパク質であるポーリンを挙げることができる。
媒性分子を共存させて金薄膜上に製膜する方法が報告されているが、本実施例のポリペプチドリンカー103には、このOmpFのシステイン変異体を用いることができる。非特許文献5で報告されている金とスルホヒドリル基の結合では、水溶液中での安定性に問題があるため、システイン部にリン酸基を導入し、接着用パッド102にはチタンを用いることが好ましい。例えば、スクシンイミドとマレイミドが繋がれたクロスリンカー試薬(Thermo Scientific社製NHS-PEG8-Maleimide)をアミノプロピルリン酸(Sigma-Aldrich社製)と反応させた後、OmpFのシステイン変異体と反応させることにより、システイン
部にリン酸基を導入する。これをガラス基板上に形成したチタンパッドと反応させることにより、チタンパッド上にのみOmpFを導入できる。チタンとガラスとの固定の選択性はリン酸基によってもたらされる。
ことができ、信号/ノイズを高くすることができる。特に、プローブ分子として核酸合成酵素を用いた場合には、局在プラズモンが作る増強場内に、常に蛍光色素を入れることができ、安定した蛍光増強が得られ好ましい。
この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。
、接着用パッド303を構成する材料、例えば、金,チタン,ニッケル,アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板,サファイア基板を用い、接着用パッド材料として金,アルミ,ニッケルを用いる場合には、前記基板材料と前記接着用パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。
。さらに、大腸菌無細胞タンパク発現系(Roche Applied Science社製 RTS 100 E. coli HY kit)を用いてOmpFを生産できる。一方、プローブ分子を固定するための結合分子104は、OmpFを無細胞発現系で作る際に、ビオチンをC末端あるいはN末端に一緒に発現させることにより作製できる。ビオチン導入試薬(Roche Diagnostic社製RTS AviTag E. coliビオチン化キット)を使うことにより、容易にビオチンを導入することができる。この方法を使うことにより、ポリペプチドリンカー一分子に一つだけビオチンが導入される。
基板上に形成したチタンパッドと反応させることにより、チタンパッド上にのみOmpFを導入できる。最終的には、プローブ分子を一分子のみ、所望の位置に配置したチタンパッド上に導入した核酸分析デバイスを製造することができる。
5nm,出力20mW)508から発振するレーザ光509および510を、レーザ光509のみをλ/4板511によって円偏光し、ダイクロイックミラー512(410nm以下を反射)によって、前記2つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ513によって集光し、その後、プリズム514を介してデバイス505へ臨界角以上で照射する。
この場合、レーザ照射により,デバイス505表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したプローブ分子により捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され,その増強された蛍光の一部は検出窓502を介して出射される。また、検出窓502より出射される蛍光は,対物レンズ515(×60,NA1.35,作動距離0.15mm)により平行光束とされ,光学フィルタ516により背景光及び励起光が遮断され,結像レンズ517により2次元CCDカメラ518上に結像される。
102,202,303,403 接着用パッド
103,203,304,404 ポリペプチドリンカー
104,204,305,405 結合分子
105,205 線状分子
106,206,306,406 線状分子末端の官能基
107,207,307,407 核酸合成酵素
108,208 核酸
209,408 微粒子
302,402 電子線用ポジ型レジスト
409 アビジン
501 カバープレート
502 検出窓
503 注入口
504 排出口
505 デバイス
506 流路
507,508 YAGレーザ光源
509,510 レーザ光
511 λ/4板
512 ダイクロイックミラー
513 レンズ
514 プリズム
515 対物レンズ
516 光学フィルタ
517 結像レンズ
518 2次元CCDカメラ
Claims (9)
- 検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析用デバイスであって、
前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、前記プローブ分子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されている核酸分析デバイス。 - 請求項1記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、一つの前記金属パッドに対して一分子のみ固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。 - 請求項1記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイス。 - 検出対象の核酸を捕捉するプローブ分子を支持基体に固定した核酸分析デバイスであって、
前記支持基体の所定位置に金属パッドが形成されており、
前記プローブ分子が微粒子に固定されており、当該微粒子が、ポリペプチドからなるリンカーを介して前記金属パッドに固定されている核酸分析デバイス。 - 請求項4記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、一つの前記微粒子に対して一分子のみ固定され、当該微粒子が、前記金属パッドに固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。 - 請求項4記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイス。 - 請求項4記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。 - 請求項1から7のいずれか1項に記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記金属パッドが、金,チタン,ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。 - 請求項1から8のいずれか1項に記載の核酸分析デバイスを用いる核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイスにおいて前記ヌクレオチド,前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置。
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