JPWO2011142307A1 - 核酸分析デバイス、その製造法及び核酸分析装置 - Google Patents

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Abstract

本発明は、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを予め固定した微粒子を、基板上に形成された金などの金属製の接着用パッドパターンに結合させる方法において、基板表面に接着用パッドと同等の厚みを有する微粒子吸着防止膜を形成することと、接着用パッドに対する微粒子の大きさを変えることにより、核酸試料断片が一分子だけ付いた微粒子を一個ずつグリッド状に固定する方法に関する。本発明により、多種類の核酸断片試料を高密度にかつ規則正しく整列させて基板上に固定できるため、高スループットに核酸試料を分析できる。例えば、１ミクロン間隔で微粒子を固定すれば、１０６核酸断片／ｍｍ２という高密度が容易に達成できる。

Description

本発明は、核酸分析デバイス、その製造方法及びそれを用いた核酸分析装置に関する。
核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されている。現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ試料断片を数多く固定して、並列に数多くの断片の配列情報を決定する方式が提案されている。この方式を用いたＤＮＡシーケンサを超並列シーケンサと呼ぶ。超並列シーケンサでは、蛍光標識した塩基を基質としたＤＮＡ伸長反応を、基板上の数十万〜数百万箇所で並列して行う。反応した塩基の蛍光を検出し、ＤＮＡの塩基配列を決定する。また、超並列シーケンサはクラスタ方式と単分子方式分類される。以下、それぞれの方式について説明する。
はじめにクラスタ方式について説明する。クラスタ方式はＤＮＡを増幅したＤＮＡの束であるクラスタを対象に解析する。例えば、非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行い、ＤＮＡのコピーを増幅する。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出す。
また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばらまいて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション反応）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
次に単分子方式について説明する。単分子方式は、非増幅で標識核酸をプローブにハイブリダイゼーションさせ、１塩基ずつ蛍光色素付きヌクレオチドで伸長させながら塩基配列を同定する。この方法は非特許文献３で報告されている。例えば、非特許文献３では、多数の穴を形成したプレートを予め用意しておき、その上に核酸合成酵素を配置させる方法を用い、蛍光色素付きヌクレオチドを取り込ませて伸長させながら蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
Ｎａｔｕｒｅ ２００５，Ｖｏｌ．４３７，ｐｐ．３７６−３８０ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１０５１−１０６３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９，Ｖｏｌ．３２３．ｐｐ．１３３−１３８ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．０４４０１７−０４４０２１． Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．２００６，Ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．１９６３５−１９６４０
超並列シーケンサにおいて、クラスタ方式はＤＮＡを増幅したＤＮＡの束であるクラスタを対象に解析するが、単分子方式はＤＮＡを増幅せず直接解析する。増幅工程が不要な単分子方式は、工程とランニングコストを省くことができる。また、クラスタ方式では、増幅された複数ＤＮＡの間でシーケンス反応のタイミングがずれる現象（ｄｅｐｈａｓｉｎｇ）により解読できる塩基長が制限される。しかし、単分子方式でｄｅｐｈａｓｉｎｇは原理的に生じないため、解読できる塩基長を格段に伸ばせる可能性が示されているが、そのためには数十万個の核酸試料断片を基板上に１分子ずつ又はグループ毎に固定する技術が必要である。このとき、できるだけ規則正しく、平滑な基板上に核酸試料を整列させて固定することが望まれる。なぜなら、核酸試料を担持させた微粒子を平滑支持基板上にばらまいてランダムに固定させる方法は容易であるが、蛍光測定で配列を読み取る段になると、ＣＣＤカメラで検出したランダムに存在する微粒子画像から数値データを取得する際に、データ処理に膨大な時間がかかってしまうためである。
したがって、本発明の目的は、上記の課題を解決することである。
本発明は、基板と、その基板上に形成された複数の接着用パッドと、
該接着用パッド以外の前記基板面を被覆する薄膜層と、
それぞれの前記接着用パッドに接着された１つの微粒子と、
前記微粒子に固定された１種類のプローブ用分子を備え、
前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記薄膜層は前記基板表面に対する前記微粒子の非特異的な吸着を抑制するものであることを特徴とする核酸分析デバイスを提供するものである。
また、本発明は、基板面に金属薄膜を形成し、
該金属薄膜を選択的にエッチングして複数の接着用パッドを形成し、
それぞれの接着用パッドに、接着用パッドに吸着する線状分子膜を導入し、
該線状分子膜に、微粒子を導入して、各接着用パッドに化学結合を介して接着し、
該微粒子にプローブ分子を化学結合を介して固定する、
ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法を提供するものである。
更に本発明は、基板面に金属薄膜を形成し、
該金属薄膜に吸着する線状分子膜を導入し、
該金属薄膜及び線状分子膜を選択的にエッチングして複数のダミー接着用パッドを形成し、
該ダミー接着用パッドを除去して前記線状分子膜を露出させて、金属薄膜と前記線状分子膜を有する複数の接着用パッドを形成し、
露出した線状分子膜に、微粒子を化学結合を介して接着し、
該微粒子にプローブ分子を、化学結合を介して固定する、
ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法を提供するものである。ここでダミー接着用パッドとは、実際の接着用パッドと同形のもので、金属薄膜のパターニングの際に、微粒子と金属薄膜を結合する線状分子膜の上に形成されるエッチングマスクに相当する。なお、このエッチングマスク（ダミー接着用パッド）の上には、前記微粒子の非特異的な吸着を抑制する薄膜が形成されるが、微粒子を接着用パッドに接合する前にエッチング膜とともに除去される。
更にまた、本発明は、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段を備え、上記核酸用デバイスが、その基板上に形成された複数の接着用パッドと、
該接着用パッド以外の前記基板面を被覆する薄膜層と、
それぞれの前記接着用パッドに接着された１つの微粒子と、
前記微粒子に固定された１種類のプローブ用分子を備え、
前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記薄膜層は前記基板表面に対する前記微粒子の非特異的な吸着を抑制するものである核酸分析装置を提供するものである。
本発明によれば、核酸分析デバイスの多数の接着用パッドに固定する微粒子を確実に所望の配列に配置することができ、その結果、高精度で、ノイズを低減した核酸分析が可能となる。
本発明の実施例による核酸分析デバイスの構成の一例を説明するための斜視図。 図１に示した核酸分析デバイスの１実施例の一部の構成を示す断面図。 図１に示した核酸分析デバイスの他の実施例の一部の構成を示す断面図。 基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係の一例を説明する概略断面図。 基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係の他の例を説明する概略断面図。 基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係の更に他の例を説明する概略断面図。 本発明の実施例による基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係の一例を説明する概略断面図。 本発明の他の実施例による基板に形成した接着用パッドの寸法と接着用パッド上のビーズの直径との関係を説明する概略断面図。 核酸分析デバイスの製造法を説明するためのフロー図。 核酸分析デバイスの他の製造法を説明するためのフロー図。 本発明による核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の構成例を説明するための図。
本発明者が核酸試料断片を基板上に１分子ずつ、高密度に且つ規則正しく整列させて固定する技術について鋭意検討した結果、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを予め固定した微粒子を、基板上に形成された金などの複数、特に多数の金属製の接着用パッドパターンに１対１で特異的に反応させることで、核酸試料断片を１個ずつ固定できる方法を見出した。ここで１対１とは、プローブ用分子は微粒子１個につき、１つ又は複数であっても１種類の分子であるので、１対１であると言う意味である。
本発明によれば、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、
前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、基板表面に前記微粒子の非特異的な吸着を防止する効果を有する薄膜層を有し、前記接着用パッドの一部分が前記薄膜層から露出し、前記一部分以外の前記接着用パッドは前記薄膜層に埋もれた構成をとることを特徴とする核酸分析デバイスが提供される。前記接着用パッドは基板上に規則的に配列されていることが好ましい。１つの微粒子に複数のプローブ分子が固定されていてもよい。
より具体的に説明すると、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを予め固定した微粒子を、基板上に形成された金などの金属製の接着用パッドパターンに結合させる際に、基板表面に微粒子の非特異的吸着防止効果を有する有機ポリマーからなる薄膜を形成することと、有機ポリマーからなる薄膜が接着用パッドと同等の厚みを有することと、微粒子に対する接着用パッドの大きさを変えることにより、核酸試料断片を一分子捕捉した微粒子が接着用パッドに１対１で固定される割合を著しく向上させることが可能となる。
本発明の他の実施態様によれば、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、基板表面に前記微粒子の非特異的な吸着を防止する効果を有する薄膜層を有し、前記接着用パッドの一部分が前記薄膜層から露出し、前記一部分以外の前記接着用パッドは前記薄膜層に埋もれた構成をとることを特徴とする核酸分析デバイスが提供される。
上記核酸分析用デバイスにおいて、前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が１分子又は複数分子が固定されていることができる。複数のプローブ分子が固定される場合、それらの分子は同一（１種類）である。
また前記プローブ分子は、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイスである。前記微粒子が半導体、金属、無機ポリマーや有機ポリマーから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイスである。前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることが望ましい。前記接着用パッドの見かけ上の直径が前記微粒子の見かけ上の直径の１倍以下であることが好ましい。
数千〜数十万の多数の前記接着用パッドは基板上に規則的に配列されていることが好ましい。また、１つの微粒子に複数のプローブ分子を固定することができる。この態様によれば、１つの微粒子に１つのプローブ分子を固定するよりも、プローブ数の管理が簡便となり、核酸分析デバイスの製造が容易である。前記接着用パッドの見かけ上の直径が前記微粒子の見かけ上に直径の１倍以下であることが好ましい。
以下、本発明を具体的な実施例により説明する。以下の実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、基板上の微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、微粒子と検出用パッドとが化学結合を介して結合したデバイスを開示する。
さらに、本実施例では、分子プローブを１分子有する微粒子だけを選別して取得する手段と、その微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であることを開示する。
更に、本実施例では基板上の前記微粒子の固定位置に接着用のパッドを備え、微粒子と接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、接着用パッドの直径が微粒子の直径と同等あるいはそれ以下の大きさであり、基板表面に有機物ポリマーを材料とする薄膜層を有し、前記接着用パッドの一部分が前記薄膜層から露出し、前記接着用パッドの前記一部分以外は前記薄膜層に埋もれた構成をとることを特徴とする核酸分析デバイスであることを開示する。
さらに、本実施例では、微粒子１個に対して、１分子又は複数の分子プローブが固定されていることを開示する。１つの微粒子に対して複数のプローブ分子が固定されるとき、それらの分子は全て同一種である必要がある。異なったプローブ分子が存在すれば得られる異なった信号が混在し、解析に支障をきたすことになる。
さらに、本実施例では微粒子が半導体、金属、無機ポリマーまたは有機ポリマーから選ばれる材料からなることを開示する。これらは真球形状でもよいし、非真球形状でもよい。
さらに、本実施例では接着用パッドが、金、チタン、ニッケル、またはアルミから選ばれる材料からなることを開示する。接着用パッドは薄いほどよく、その厚さが一定限度を超えると、複数の微粒子が接着用パッドに付着する可能性が有る。またその平面形状は円形、正方形、矩形、楕円形など任意である。
本発明において、プローブ分子を固定する微細粒子は真球又は真球に近いものが多いが、全て真球であるとは限らず、不定形又は多角形のものがある。また上記微粒子を接着する接着用パッドは真円形状でなくともよい。そのため本明細書では、微細粒子（球体）については見かけの平均直径、接着用パッド（膜）については見かけの平均直径で表す。たとえば、微粒子が長径Ｄ１と短径Ｄ２を持つ場合、その見かけの平均直径Ｄは、（Ｄ１＋Ｄ２）／２となる。Ｄ１＝Ｄ２のときはＤ＝Ｄ１又はＤ２であり、同様に、接着用パッドの平面図が長方形、楕円或いはその他の形状で、長辺Ｌ１＋短辺Ｌ２を持つ場合、接着用パッドの見かけの平均直径Ｌは、［（Ｌ１ ２＋Ｌ２ ２）］１／２となる。正方形のときは、Ｌ＝√（２・Ｌ１）又は√（２・Ｌ２）となる。ただし、接着用パッドが真円形又はそれに近似する形状のときは、Ｌ＝Ｌ１又はＬ２である。
微粒子の大きさ（見かけの平均直径）は、１ｎｍ〜２００ｎｍ、特に５〜１００ｎｍがよい。また接着用パッドの大きさ（見かけの平均直径）は微粒子の直径の２倍以下がよく、１倍以下が特に好ましい。また接着用パッドの厚さは、１ｎｍ〜１００ｎｍ、特に３〜５０ｎｍが好ましいが本発明では特に制限されない。なお、本明細書では、単に微粒子及び接着用パッドの直径と記載するが、これらを上記のように真球又は真円形でないものも含む意味で使用する。
接着用パッドの直径Ｌは、微細粒子の直径の２倍以下が好ましく、特に１倍以下が好ましい。接着用パッドが非円形又は楕円である場合、その長径は微細粒子の見かけの直径の２倍以下であることが望ましい。
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
本実施例のデバイスの構成を、図１、２を用いて説明する。平滑支持基板１０１の上に厚さ１０ｎｍ、直径４０ｎｍの寸法を持つ接着用パッド１０２が規則正しく、例えば図１に示すように格子状に形成されている。これにより接着用パッド間の距離が一様に保たれる。部分的に接着用パッドが接近しすぎると、信号にノイズがはいりこむ可能性が有る。
接着用パッド１０２と微粒子１０３は、線状分子１０５を介して化学結合により結ばれている。線状分子１０５の末端の官能基１０６と、接着用パッド１０２とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基１０６は、平滑支持基板１０１との相互作用が弱く、接着用パッド１０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑支持基板としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができる。
また、接着用パッド１０２は、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基１０６には、平滑支持基板１０１と接着用パッド１０２との組合せを考えて選択しなければならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。線状分子１０５は、微粒子１０３と接着用パッド１０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。
線状分子１０５の末端の官能基１０７は、微粒子１０３との接着性をもたらす。平滑支持基板には非特異的吸着防止用の薄膜１０８が形成されている。薄膜１０８は接着用パッド１０２の厚みと同程度の厚みを有しており接着用パッド１０２の側面部を完全に覆っていることが好ましい。薄膜１０８は微粒子１０３の非特異的吸着を防止する有機ポリマーを材料としていることが好ましい。例えば、有機ポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、３−グリシドキシプロピルメトキシシラン（ＧＯＰＳ）などを用いることができる。
微粒子１０３としては、金属微粒子や半導体微粒子、無機ポリマー微粒子、有機ポリマー微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ〜１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度のＣｄＳｅ等の化合物半導体が市販されており、活用することができる。
微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金、銀、白金、アルミニウム等の直径が１００ｎｍ程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光を増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌ．１８，ｐｐ ０４４０１７−０４４０２１．（非特許文献４）に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定することができ、信号／ノイズを高くすることができる。特に、プローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いた場合には、局在プラズモンが作る増強場内に常に蛍光色素を入れることができ、安定した蛍光増強が得られ好ましい。
半導体微粒子を用いた場合には、半導体微粒子を外部光源の光で励起しておき、取り込まれたヌクレオチドに付随する蛍光色素にその励起エネルギーを移動させることにより、個々の蛍光色素の蛍光を観察することもできる。この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。例えば、直径が１５〜２０ｎｍであるＱｄｏｔ（Ｒ）ストレプトアビジン標識（インビトロジェン社製）を利用することができる。
無機ポリマー微粒子及び有機ポリマー微粒子は、密度、粒径、電荷密度などの粒子の物性を変えたものや、官能基やスペーサーなどの化学的性質、ストレプトアビジンをはじめとする生体分子などの標識が付加されたものも市販されている。
無機ポリマー微粒子を用いる場合、市販の微粒子を用いることができる。また、無機ポリマー微粒子として、直径３０〜５００ｎｍのシリカ製の微粒子が市販されている。例えば、シリカ微粒子である直径が３０〜５００ｎｍであるＳｉｃａｓｔａｒ（Ｒ）アミノ基標識（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）や、直径が１００〜５００ｎｍであるＳｉｃａｓｔａｒ（Ｒ）ストレプトアビジン標識（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）を用いることができる。
また、有機ポリマー微粒子として、直径１５〜５００ｎｍのラテックス製の微粒子が市販されている。例えば、ラテックス微粒子である直径が１５〜５００ｎｍであるＭｉｃｒｏｍｅｒ（Ｒ）アミノ基標識（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）や、直径が１００〜２００ｎｍであるＭｉｃｒｏｍｅｒ（Ｒ）ストレプトアビジン標識（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）を用いることができる。無機ポリマー及び有機ポリマーのアミノ基標識微粒子は、金または白金微粒子と同様に、ビオチン−スクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することができる。核酸捕捉プローブ２１０としてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、容易に微粒子上に固定できる。
核酸捕捉プローブ２１０として核酸合成酵素を用いる場合には、予め、ＲＴＳ ＡｖｉＴａｇ Ｅ．ｃｏｌｉビオチン化キット（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて発現系を組み、核酸合成酵素を作ることにより、容易に、核酸合成酵素を微粒子上に固定できる。官能基１０７として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基，アミノ基等が好ましい。半導体微粒子や無機ポリマー微粒子、有機ポリマー微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基１０７としてビオチンを用いることができる。
核酸を捕捉するプローブ分子１０４には、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子の一本鎖を用いることができる。核酸分子の末端を官能基１０７と同様に予め修飾しておき、微粒子１０３と反応させておく。また、核酸を捕捉するプローブ分子１０４として核酸結合タンパク質や核酸合成酵素を用いることもできる。発現タンパク質にアビジンタグを導入する試薬が市販されており、このような試薬を用いて核酸結合タンパク質や核酸合成酵素を合成することにより、例えば、市販のビオチンで表面が修飾された半導体微粒子表面に容易に核酸結合タンパク質や核酸合成酵素を固定できる。核酸を捕捉するプローブ分子１０４として核酸分子の一本鎖を用いた場合には、特定の相補配列を有する核酸試料分子を捕捉することができる。図２では１つのプローブ分子１０４が１つの微粒子１０３に固定されているが、図３に示すように複数のプローブ分子を１つの微粒子に固定してもよい。ただし、プローブ分子は同一種である必要がある。
捕捉後に、核酸合成酵素やヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸張反応を起こすこともできる。また、核酸結合タンパク質を用いた場合にも特定の配列を持っている核酸を捕捉することができる。そして、プローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いた場合には、非特定の核酸試料分子を捕捉できる。この場合も、ヌクレオチドを供給することにより基板上で核酸伸長反応を起こすことができる。
１つの微粒子１０３に固定するプローブ分子１０４は、１分子であることが最も好ましいが、図３に示すように、１つの微粒子に複数のプローブ分子を固定してもよい。
プローブ分子が短い核酸試料断片である場合、微粒子を結合させた後に、１つのプローブ分子が結合した微粒子だけを選択的に取得することができる。例えば、微粒子の数をプローブ分子の数よりも１０倍多くして反応させると、約９０％の微粒子にはプローブ分子が捕捉されず、約９％の微粒子にはプローブ分子が一分子補足されていた。この結果は、ポアソン分布を仮定した場合の予測結果とよく一致している。したがって、プローブ分子を捕捉した微粒子のみを捕捉すれば、捕集した微粒子のうち９０％以上はプローブ分子を一分子のみ捕捉した微粒子となる。この状態で、分子量による分離や磁気微粒子による捕集、電荷の差を用いた電気泳動分離などを利用してプローブ分子が一分子結合した微粒子をさらに高い純度で取得することができる。
接着用パッド１０２を平滑支持基板１０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると５００ｎｍ以上が好ましい。
本実施例の核酸分析デバイスから核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度や簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、核酸分析デバイスに対して核酸試料を供給し、プローブ分子１０４に核酸試料を捕捉させる。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドを供給し、プローブ分子１０４がＤＮＡプローブである場合には、核酸合成酵素を供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、ヌクレオチドの一種類を供給，未反応ヌクレオチドの洗浄，蛍光観察，違う種類のヌクレオチドの供給、以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後に蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いることにより、連続的な反応を起こし、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
一方、４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定して核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
接着用パッド２０２に１個の微粒子２０１が固定される理由について図４Ａ，４Ｂを用いて説明する。接着用パッド２０２上に微粒子２０１を固定させる際、一つの接着用パッド２０２に複数個の微粒子２０１が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の違う核酸断片の情報が重なり合ってしまい、正確な核酸分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着用パッド２０２には、１個の微粒子２０１を固定させねばならない。図４Ａの場合、接着用パッドの直径Ｌが大きく、その面積が大きいと、微粒子が２個捕捉される可能性が有る。また、接着用パッドの厚さが大きいと、接着用パッドの直径Ｌ１は小さいが、接着用パッドに微粒子が吸着して図４Ｂのように２つの微粒子が捕捉される可能性が有る。
そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着用パッド２０２の直径Ｌが微粒子２０１の直径Ｄに比べて小さい、すなわち直径２Ｄ／直径Ｌ≧１という条件が成り立ち、かつ接着用パッド以外の部分が非特異的吸着を抑制する皮膜により覆われているときは、１つの接着用パッド２０２に１個の微粒子２０１を固定できることを見出した。微粒子同士は反発して互いに退け合うが、接着用パッドの見かけ上の直径が微粒子の２倍を超えると、上記非特異的吸着を抑制する皮膜を組み合わせても、１つの接着用パッドに複数の微粒子が捕捉されることが懸念される。図４Ｃは、接着用パッドの見かけ上の直径Ｌ２が微粒子の見かけ上の直径Ｄよりも小さいが、その厚さｔ１が大きいと、図４Ｂに示すように側面に微粒子が捕捉される可能性がある。
これに対し、接着用パッド１０２の径Ｌに比べて同等以上の大きさの径Ｄの微粒子２０１が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子２０１に覆い隠されてしまい、別の微粒子２０１と反応できなくなってしまうものと説明される。
したがって、接着用パッドはできる限り薄い(ｔ２)ほうが好ましい。これは、接着用パッドに厚みがあると側面部の面積が増え、接着用パッド２０２の直径が微粒子２０１の直径以下の場合でも、１つの接着用パッド２０２に複数の微粒子２０１が固定される可能性が高まるためである。
ただし、接着用パッド２０２に厚みがあったとしても、図５、６に示すように、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの生体分子の吸着を抑制する有機ポリマー２０４で側面部を覆うことで、１つの接着用パッド２０２に複数の微粒子２０１が固定するのを防ぐことができる。この場合、接着用パッドの厚さが微粒子の固定数に影響を与えることはなくなる。したがって、本発明によれば、接着用パッドの形成にあたりその厚さの制御が容易になり、また製造歩留まりも向上することになる。
以下、核酸分析デバイスにシランカップリング剤を用いて接着用パッド２０２の側面をＰＥＧで覆う方法について説明する。この方法はＰＥＧとシランカップリング剤を重合させたＰＥＧシラン剤を使用する。ＰＥＧシラン剤として２−メトキシポリエチレンオキシプロピルトリメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）を用いることができる。核酸分析デバイスに接着用パッド２０２の厚みと同等の厚さにＰＥＧシラン膜を作製する。単層のＰＥＧシラン膜は約１ｎｍであるため、多層のＰＥＧシラン膜を製造して接着用パッド２０２の厚みにする。製造方法としてはＰＥＧシラン剤を溶媒に溶解し、トリエチルアミンなどの触媒を加える。この混合液に核酸分析デバイスを６０℃で１時間浸漬する。
核酸分析デバイスを混合液から取り出した後、電気炉を用いて１３０℃で１時間ベークする。分光エリプソメーターで基板上のシラン膜の膜厚を測定する。測定の結果、膜厚１４ｎｍのシラン膜を確認した。ＰＥＧシラン剤の濃度、ベーク温度、時間などの反応条件を変えることで、１〜１４ｎｍに膜厚を調整できることも確認した。実際に厚み１０ｎｍの接着用パッド２０２を有する核酸分析デバイスに対して１０ｎｍの厚みを持つＰＥＧシラン膜を成膜した結果、接着用パッド２０２の側面をＰＥＧシラン膜で覆うことができた。これは走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による核酸分析デバイス断面観察により確認した。
接着用パッドの材質によっては、ＰＥＧシラン膜が接着用パッドの上面も覆ってしまう可能性がある。その場合、ＰＥＧシラン膜処理前に接着用パッド２０２をシラノール吸着阻害分子などで覆うことでＰＥＧシラン剤が接着用パッドの上面に結合するのを防ぐことができる。例えば、平滑支持基板３０１の材料である石英ガラスで接着用パッド２０２が酸化チタンの場合、シラノール吸着阻害分子としてポリビニルリン酸（ＰＶＰＡ）を使用することで、酸化チタンのみ覆うことができる。ポリビニルリン酸（ＰＶＰＡ）は酸化チタンには吸着するが、石英ガラスには吸着しない。
また、シラノール吸着阻害分子を使用しなくてもＰＥＧシラン膜の吸着力の違いで接着用パッド上のシラン膜だけを取り除くことができる。平滑支持基板３０１の材料である石英ガラスやサファイアと比べて、金属や金属酸化物上に作製されたＰＥＧシラン膜は吸着力が弱いため超音波や界面活性剤を用いた洗浄工程によって接着用パッド上のみ取り除くことができる。実際にＰＥＧシラン膜の厚みが接着用パッド２０２の厚みと同等となるように作製し、接着用パッド２０２をシラノール吸着阻害分子で事前に覆う、あるいはＰＥＧシラン膜を形成してから洗浄によって除去することで、接着用パッド２０２の側面部のみを完全に覆うことができることを確認した。さらに接着用パッド２０２の側面部のみをＰＥＧシラン膜で完全に覆った核酸分析デバイスにアビジンで表面を修飾された微粒子２０１を反応させた。その結果、接着用パッド２０２の上面部には微粒子２０１が固定されるが、接着用パッド２０２の側面に微粒子２０１が固定されないことを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により確認した。
以上のように非特異的吸着防止有機ポリマー２０４は核酸分析デバイス上に容易に作製することができる。これにより高い非特異的吸着防止効果を示し大幅なノイズの低減が示された。同時に微粒子２０１が接着用パッド２０２に１対１で固定する割合を著しく向上させることができた。以上の改善により核酸分析デバイスのスループットを著しく向上させることができる。
核酸分析デバイスの製造方法の例を、図７と図８を用いて説明する。
図７において、平滑支持基板３０１上に接着用パッド３０５を構成する材料、例えば、金、チタン、ニッケル、アルミニウムをスパッタリングで製膜する（ｂ）。これを金属の薄膜３０２とする。平滑支持基板３０１としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着用パッド３０５の材料として金，アルミニウム，ニッケルを用いる場合には、基板材料と接着用パッド３０５材料との間に接着を補強するためにチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。
この金属の薄膜３０２の上にレジストでパターン３０３を形成する（ｃ）。次にレジストパターン以外の金属の薄膜３０２をエッチングにより除去する（ｄ）。さらにレジスト３０３を剥離すると接着用パッド３０５が完成する。次に、平滑支持基板３０１には吸着せず、接着用パッド３０５には吸着する線状分子３０４を反応させる（ｅ）。接着用パッド３０５が金，チタン，アルミ，ニッケルの場合には、線状分子３０４末端の官能基としては、各々、スルホヒドニル基，リン酸基，チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子の官能基には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子を平滑支持基板３０１と反応させた後、接着用パッド３０５を形成した以外の平滑支持基板３０１表面に薄膜３０６を作製する（ｆ）。
次に、線状分子３０４に微粒子１０３を、化学結合を介して接着し、更に微粒子の表面に１つ又は複数のプローブ分子を固定する（ｇ）。
薄膜３０６は微粒子１０３の非特異的吸着を防止する有機ポリマーを材料とする。非特異的吸着を防止する有機ポリマーの種類は微粒子１０３の表面状態に合わせて適宜選択する。微粒子１０３の表面状態が負の電荷を有している場合は、反発するように負に帯電している有機ポリマーを選択する。微粒子１０３の表面が親水性ならば、有機ポリマーは疎水性のものを選択し、微粒子１０３の表面が疎水性ならば、有機ポリマーは親水性のものを選択する。例えば、親水性のアビジンが修飾された微粒子１０３に対して非特異的吸着防止用有機ポリマー３０６としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、３−グリシドキシプロピルメトキシシラン（ＧＯＰＳ）などを用いることができる。
核酸分析デバイスの製造法の他の例を図８で説明する。この方法を用いることで、接着用パッド４０６と平滑支持基板４０１に選択性を持たない線状分子４０３でも接着用パッド４０６上のみに線状分子を残すことができる。
線状分子４０３は図８（ｂ）に示すように、製膜した金属の薄膜４０２のエッチングの前に反応させることもできる。その場合、線状分子４０３を反応させてからレジスト４０４でパターンを形成する（ｃ）。レジスト４０４で保護された部分以外はエッチングにより、線状分子４０３ごと除去される（ｄ）。その後、レジスト４０４及び平滑支持基板４０１上に、非特異的吸着防止用有機ポリマー４０５の薄膜を形成する（ｅ）。
次いで、レジスト４０４を剥離することでレジスト４０４及びその上に形成された非特異的吸着防止用有機ポリマー４０６を除くと、パターン化された線状分子４０３が結合した接着用パッドが形成される（ｆ）。更に線状分子４０３に微粒子１０３を、化学結合を介して接着し、更に微粒子の表面に１つ又は複数のプローブ分子を固定する（ｇ）。
微粒子表面には、予めアビジンを修飾しておくことが好ましい。金または白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン−スクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金または白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン−スクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させる。これにより、金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。
核酸捕捉プローブを固定した微粒子を平滑支持基板４０１と反応させることにより、本実施例の核酸分析デバイスを製造することができる。
本実施例では、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図９を参照しながら説明する。本実施例の核酸分析装置は、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート５０１と検出窓５０２と溶液交換用口である注入口５０３と排出口５０４から構成される反応チャンバに前記のデバイス５０５を設置する。なお、カバープレート５０１と検出窓５０２の材質として、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を使用する。
また、検出窓５０２の厚さは０．１７ｍｍとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０８から発振するレーザ光５０９および５１０を、レーザ光５０９のみをλ／４板５１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー５１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ５１３によって集光し、その後、プリズム５１４を介してデバイス５０５へ臨界角以上で照射する。
以下、微粒子として直径５０ｎｍ程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。
この場合、レーザ照射により、デバイス５０５表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したＤＮＡプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓５０２を介して出射される。また、検出窓５０２より出射される蛍光は、対物レンズ５１５（×６０，ＮＡ１．３５，作動距離０．１５ｍｍ）により平行光束とされ、光学フィルタ５１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ５１７により２次元ＣＣＤカメラ５１８上に結像される。
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、非特許文献５に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。
微粒子として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてＱｄｏｔ（Ｒ）５６５（インビトロジェン社製）を用いると、ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）３０７で十分に励起できる。この励起エネルギーは５３２ｎｍの光では励起されないアレクサ６３３（インビトロジェン社製）へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、ＤＮＡプローブに捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するので、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。
材質が無機ポリマーや有機ポリマーの微粒子は、外部光源の光を照射しても励起しない。そのため、励起エネルギーの移動による蛍光色素の発光は起こらず、未反応のヌクレオチドも発光し、ノイズとなる可能性がある。しかし、核酸合成酵素に半導体微粒子などのエネルギー移動をもたらす微粒子を結合することで、取り込まれたヌクレオチドだけを発光させることができる。あるいは、核酸合成酵素に金、銀、白金、アルミニウム等を結合させれば、取り込まれたヌクレオチドの蛍光を増強させることができる。あるいは、微粒子を固定する金属パッドの材料に金、銀、白金、アルミニウム等を用いれば、金属パッド周囲の蛍光が増強されるため、信号／ノイズを高くすることができる。
上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることにより、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善を図ることができる。
本発明により、多種類の核酸断片を、微粒子を介して、高密度に且つ規則正しく整列させて基板に固定でき、核酸分析デバイスの製造工程のステップを増やすことなく、簡易的な基板処理だけで、核酸試料断片を高い率で一分子だけ固定することができ、かつ微粒子の非特異的吸着の抑制によるノイズ低減を実現できるため、低ランニングコストかつ高スループットに核酸試料を分析できる。
１０１，２０３，３０１，４０１…平滑支持基板、１０２，２０２，３０５…接着用パッド、１０３，２０１…微粒子、１０４…プローブ分子、１０５…線状分子、１０６，１０７，２０５，２０６，３０４，４０３…線状分子末端の官能基、１０８，２０４，３０６，４０５…非特異的吸着防止用有機ポリマー、３０２，４０２…金属の薄膜、３０３，４０４…レジスト、５０１…カバープレート、５０２…検出窓、５０３…注入口、５０４…排出口、５０５…核酸分析デバイス、５０６…流路、５０７，５０８…ＹＡＧレーザ光源、５０９，５１０…レーザ光、５１１…λ／４板、５１２…ダイクロイックミラー、５１３…レンズ、５１４…プリズム、５１５…対物レンズ、５１６…光学フィルタ、５１７…結像レンズ、５１８…２次元ＣＣＤカメラ。

Claims (18)

  1. 基板と、
    その基板上に形成された複数の接着用パッドと、
    該接着用パッド以外の前記基板面を被覆する薄膜層と、
    それぞれの前記接着用パッドに接着された１つの微粒子と、
    前記微粒子に固定された１種類のプローブ用分子を備え、
    前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記薄膜層は前記基板表面に対する前記微粒子の非特異的な吸着を抑制するものであることを特徴とする核酸分析デバイス。
  2. 請求項１記載の核酸分析用デバイスにおいて、前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が１分子固定されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
  3. 請求項１記載の核酸分析用デバイスにおいて、前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析デバイス。
  4. 請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、前記微粒子が半導体、金属、無機ポリマーや有機ポリマーから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
  5. 請求項１記載の核酸分析用デバイスにおいて、
    前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
  6. 基板面に金属薄膜を形成し、
    該金属薄膜を選択的にエッチングして複数の接着用パッドを形成し、
    それぞれの接着用パッドに、接着用パッドに吸着する線状分子を導入し、
    該線状分子に、微粒子を、化学結合を介して接着し、
    該微粒子にプローブ分子を、化学結合を介して固定する、
    ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法。
  7. 前記接着用パッドは基板上に規則的に配列されていることを特徴とする請求項６記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  8. １つの微粒子に複数のプローブ分子が固定されていることを特徴とする請求項６記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  9. 前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径の２倍以下であることを特徴とする請求項６記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  10. 基板面に金属薄膜を形成し、
    該金属薄膜に吸着する線状分子膜を導入し、
    複数のダミー接着用パッドを形成して該金属薄膜及び金属薄膜を選択的にエッチングし、該ダミー接着用パッドを除去して前記線状分子膜を露出させて、金属薄膜と前記線状分子膜を有する複数の接着用パッドを形成し、
    露出した線状分子に微粒子を、化学結合を介して接着し、
    該微粒子にプローブ分子を、化学結合を介して固定する、
    ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法。
  11. 前記接着用パッドは基板上に規則的に配列されていることを特徴とする請求項１０記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  12. １つの微粒子に複数のプローブ分子が固定されていることを特徴とする請求項１０記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  13. 前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径の２倍以下であることを特徴とする請求項１０記載の核酸分析デバイスの製造方法。
  14. 検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
    前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
    前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
    前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段を備え、
    前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、前記基板上の前記微粒子の固定位置に複数の接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッド以外の部分が線状分子膜により
    被覆されていることを特徴とする核酸分析装置。
  15. 請求項１４記載の核酸分析装置において、前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とする核酸分析装置。
  16. 請求項１４記載の核酸分析装置において、前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析装置。
  17. 請求項１４記載の核酸分析装置において、前記微粒子が、半導体、金属、無機ポリマーや有機ポリマーから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析装置。
  18. 請求項１４記載の核酸分析装置において、前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析装置。
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