CN111838295A - 一种基于群体感应抑制剂桂枝提取物的虹鳟鱼保鲜方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水产品保鲜技术领域，具体涉及一种利用桂枝提取物的虹鳟鱼保鲜方法。本方法的具体步骤包括鱼片预处理、桂枝提取物的制备、复合保鲜剂的制备、鱼片浸泡沥干、包装贮藏等步骤。其中在复合保鲜剂的制备中，所述保鲜剂按重量比1％‑3％桂枝提取物，0.3％‑0.5％抗坏血酸，0.3％‑0.5％水溶性壳聚糖，0.05％‑0.15％植酸，1％‑3％食盐，其余为水的比例复配成水溶液。本发明所述的虹鳟鱼保鲜方法简单易行，在抑制特定腐败菌的群体感应现象的同时，进而有效抑制虹鳟鱼贮藏过程中微生物的生长繁殖，并延缓鱼肉氧化速度，最大程度延长虹鳟鱼的保鲜时长。
Description
技术领域
本发明涉及水产品保鲜技术领域，具体涉及一种虹鳟鱼保鲜方法。
背景技术
虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)是一种鲑科、太平洋鲑属冷水性鱼类，原产于北美洲北部和太平洋西岸，目前在我国的养殖已经十分广泛，2015年我国虹鳟鱼养殖产量达27355t。虹鳟鱼是一种名贵的鲑科鱼类，也是少有的高级鱼类之一，现已成为淡水养殖行业的新品种之一。虹鳟鱼肉质鲜嫩，味美，无腥，无小骨刺，蛋白质和脂肪含量高，胆固醇几乎等于零。虹鳟鱼鱼皮和鱼肉中含有丰富的蛋白质，这些蛋白质有一部分是人体必需的成分，人体食用后，可以起到美容、健骨的作用。虹鳟鱼中还有丰富的矿物质，其中的铁元素为最多，而铁元素与人体造血息息相关，对保持人体内脏器官的正常活动具有重要的作用。虹鳟鱼腐败变质的原因包括脂肪的氧化作用、酶的分解作用以及微生物引起的腐败作用，其中最主要的因素是微生物的腐败作用。由于虹鳟鱼中的蛋白质、脂肪含量较高，并且其本身带有的或贮运过程中污染的微生物，在适宜条件下生长繁殖，分解鱼体蛋白质、氨基酸、脂肪等成分产生有异臭味和毒性的物质，致使虹鳟鱼腐败变质。水产品腐败过程中种群数量占优势且有致腐作用的特定腐败菌称为优势腐败菌。虹鳟鱼贮藏过程中的优势腐败菌为假单胞菌、希瓦氏菌、气单胞菌等。且这些菌属对大部分水产品均有致腐作用。
桂枝属樟目，樟科中等大乔木，中医上具有发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气的功效。常用于风寒感冒，脘腹冷痛，血寒经闭，关节痹痛，痰饮，水肿，心悸等。但桂枝提取物用于群体感应信号的抑制剂还未见报道。本专利将桂枝提取物加入到虹鳟鱼的保鲜应用中，用于抑制特定腐败菌的的群体感应信号，进而防止虹鳟鱼腐烂变质，延长腐败期。
目前针对虹鳟鱼保鲜技术的研究较少，目前常见的保鲜方法有低温保藏及气调保藏的方法。但保鲜效果及效率均有一定局限性。有报道显示，虹鳟鱼在4℃冷藏9天，挥发性盐基氮含量达到20.72mg/100g，超过相应的标准，达到腐败期终点。0℃冰藏保鲜方法保藏虹鳟鱼，虽然在一定程度上可以延长虹鳟鱼的腐败期到12天左右，但这种保鲜方式会对鱼肉品质造成难以挽回的破坏。常见的气调保鲜方式包括真空保藏和充入稳定气体两种方式，但需要投入高额设备费用，其应用也有一定的局限性。因此开发出一种制备方法简单的保鲜剂，既操作方便、能够保证产品质量，又能显著延长虹鳟鱼保鲜期是一项亟需解决的课题，具有十分重要的意义和应用价值。基于以上问题，本发明基于桂枝提取物，与其它具有保鲜作用的物质复配制成保鲜复合剂，解决了目前虹鳟鱼保鲜方式单一、保鲜效果较差的问题，通过抑制特定腐败菌的群体感应信号分子，进而抑制虹鳟鱼等水产品贮藏过程中微生物的生长繁殖，来保持虹鳟鱼的鲜活品质，在冷藏条件下可延长虹鳟鱼的贮藏时间达到4～6天。本发明方法具有保鲜效果显著、对人体安全无毒以及制备方法简单、操作方便等优点。
发明内容
本发明的目的在于开发一种利用桂枝提取物作为群体感应信号抑制剂，与其他组分进行复配，用作虹鳟鱼贮藏的保鲜方法。经过验证，桂枝提取物可以有效抑制群体感应信号分子，进而调控特定腐败菌的致腐能力；这种方法可以有效抑制虹鳟鱼贮藏过程中微生物的生长繁殖，减少腐败产物的生成，减缓鱼肉品质的下降速度，从而延长虹鳟鱼的贮藏时间。
本发明主要的工艺流程如下：
①预处理：将鲜活虹鳟鱼去头去骨去内脏，切片后清洗干净并沥干水分；
②桂枝提取物的制备：将桂枝粉末与95％乙醇按照固液比1:8(体积比)进行浸泡，超声辅助浸泡2小时后过滤，得到桂枝提取物。
③复配溶菌酶保鲜剂：将桂枝提取物、抗坏血酸、水溶性壳聚糖、植酸及食盐按一定比例混合复配成水溶液，制成保鲜剂；
④鱼片处理：将虹鳟鱼片在上述保鲜剂中浸泡10分钟，捞出悬挂沥干2-4分钟；
⑤包装贮藏：将鱼片包装后，0℃-4℃冷藏保存。
具体操作步骤为：
①选取鲜活无病变的虹鳟鱼，加冰猝死后，将头、骨及内脏去除干净，切成100g左右均匀的鱼片。将鱼片清洗干净，在室温下沥干水分；
②桂枝提取物的制备：将桂枝粉末与95％乙醇按照固液比1:8(体积比)进行浸泡，超声辅助浸泡2小时后过滤，得到桂枝提取物。
③保鲜剂的制备：按重量比0.05％-0.1％桂枝提取物，0.3％-0.5％抗坏血酸，0.3-0.5％水溶性壳聚糖，0.05％-0.15％植酸，1％-3％食盐，其余为水的比例复配成水溶液，并利用超声、搅拌15分钟使其充分溶解混合；
④将处理好的虹鳟鱼鱼片在保鲜剂中浸泡10分钟，保鲜剂与鱼片体积比为1：1，使保鲜剂完全浸没鱼片；
⑤将浸泡好的鱼片在室温下悬挂沥干，沥干时间2-4分钟；
⑥用包装袋包装沥干的鱼片；
⑦将包装鱼片放置0℃-4℃条件下进行贮藏。
作为优选，步骤②所述桂枝提取物的制备采用95％乙醇浸泡提取；
作为优选，步骤③所述混合方式为超声混合15分钟或磁力搅拌15分钟；
作为优选，步骤④所述浸泡方式为完全浸没，时间为10分钟。
本发明有如下有益效果：(1)桂枝提取物可以有效抑制特定腐败菌的群体感应信号分子，进而减弱特定腐败菌的致腐作用。(2)抗坏血酸作为抗氧化剂，可以抑制鱼肉组织的氧化进程，保证虹鳟鱼鱼肉品质；(3)水溶性壳聚糖作为稳定剂可以在虹鳟鱼鱼肉表面形成一层保护膜，可以隔绝氧气及微生物作用；(4)植酸和食盐的加入可以调节鱼肉组织的pH值及水分活度，进一步抑制微生物的生理生化活动。综上，本发明提供的虹鳟鱼保鲜方法简单易行，在抑制群体感应信号分子的前提下，可以有效抑制虹鳟鱼贮藏过程中微生物的生长繁殖，减少腐败产物的生成，减缓缓鱼肉品质下降速率。
附图说明
图1为虹鳟鱼保鲜方法工艺流程图；
图2为经保鲜处理后虹鳟鱼与未经过保鲜剂处理的对照组贮藏期间的菌落总数；
图3为经保鲜处理后虹鳟鱼与未经过保鲜剂处理的对照组贮藏期间的挥发性盐基氮；
图4为经保鲜处理后虹鳟鱼与未经过保鲜剂处理的对照组贮藏期间的感官分值。
具体实施方式
本发明用到的实验材料及试剂如下：
1.实验材料
(1)菌株:紫色杆菌CV026,实验室保存。
(2)试剂：虹鳟鱼、食盐均从超市购买；桂枝购自江西省樟树市华丰药业公司，将桂枝于60℃真空干燥箱烘干后粉碎，过40目筛，制备桂枝粉末；抗坏血酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水溶性壳聚糖购于上海源叶生物科技有限公司；植酸购于北京索莱宝科技有限公司；信号分子C6-HSL购自Cayman化学公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
对于上述试剂，本领域技术人员可以根据实际情况对市场上出售的产品进行选择，不限于本说明书实施例的具体记载。
2.培养基
LB培养基组成：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH 7.0。
为了更好的理解本发明，以如下具体实施方式为例，详细说明本发明实施方式。
实施例1：桂枝提取物对群体感应信号的抑制作用
虹鳟鱼腐败末期的优势腐败菌包括气单胞菌属、假单胞菌属及希瓦氏菌属等。实验室前期经过检测发现一株分离自虹鳟鱼腐败期的气单胞菌可以产生一种AHLs类群体感应信号—C6-HSL。
紫色杆菌CV026为AHLs类信号分子的报告菌株，其本身不能合成AHLs类信号分子，但可以感知环境中的信号分子调控相关基因产生紫色素，因此可利用紫色杆菌CV026检测桂枝提取物对群体感应信号是否存在抑制作用。
紫色杆菌CV026用LB固体平板活化，挑取单菌落接种于含有20μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基的试管中，30℃200rpm震荡培养16-18h后备用。将LB固体培养基融化并冷却至40℃，加入卡那霉素(20μg/mL)、活化后培养的报告菌株紫色杆菌CV026菌液(每20mL的LB固体培养基加入100μL菌液)、信号分子C6-HSL(加入后终浓度为10μmoL/L)，制备固体平板。在平板中间分别加入10μL桂枝提取物作为实验组，或者等体积的95％乙醇作为对照组，30℃培养12h观察平板现象。若桂枝提取物对群体感应信号C6-HSL有抑制作用，将使平板的紫色变浅，产生不透明的生长圈，记录生长圈直径。如表1所示，实验组有明显的不透明生长圈，说明桂枝提取物对AHLs类群体感应信号C6-HSL有明显的抑制作用。
表1生长圈直径
| 编号 | 实验组(mm) | 对照组(mm) |
| 1 | 15.2 | 0 |
| 2 | 16.2 | 0 |
| 3 | 15.8 | 0 |
实施例2：桂枝提取物对特定腐败菌蛋白酶产生的影响
从虹鳟鱼贮藏过程中分离的优势腐败菌—气单胞菌可以分泌蛋白酶，水解牛奶平板中的蛋白质，使牛奶平板出现透明圈。群体感应信号在一定程度上会促进气单胞菌的蛋白酶的分泌，使透明圈直径增大。
制作脱脂牛奶琼脂平板：将20％的脱脂牛奶115℃灭菌15min后与等体积的融化后的LB固体培养基混合后倾倒平板，无菌风吹干制成牛奶平板。
气单胞菌用平板活化，挑取单菌落接种于装有LB培养基的试管中，30℃150rpm培养过夜。按照OD＝0.1接种到装有30mL的LB培养基的三角瓶中，分别添加等体积的桂枝提取物、95％乙醇和信号分子C6-HSL(终浓度为0.2μg/mL),作为实验组、空白对照组及正对照组，30℃培养24h。取1mL培养液8000g离心10min后取上清液，将10μL上清液滴在牛奶平板上，30℃培养24h后观察透明圈直径，检验桂枝提取物对蛋白酶活性的影响。如表2所示，实验组的透明圈直径明显小于空白对照组，结果表明桂枝提取物对气单胞菌的蛋白酶分泌有抑制作用。
表2牛奶平板透明圈直径
| 编号 | 实验组(mm) | 正对照组(mm) | 空白对照组(mm) |
| 1 | 10.1 | 21.6 | 18.3 |
| 2 | 10.3 | 21.8 | 18.8 |
| 3 | 9.8 | 21.2 | 18.2 |
实施例3
一种基于群体感应抑制剂桂枝提取物的虹鳟鱼保鲜方法，具体实施方法如下：
鱼片预处理：选取鲜活无病变的虹鳟鱼，加冰猝死后，将头、骨及内脏去除干净，切成100g左右均匀的鱼片。将鱼片清洗干净，在室温下沥干水分；
桂枝提取物的制备：将桂枝粉末与95％乙醇按照固液比1:8(体积比)进行浸泡，超声浸泡2小时后过滤得到滤液，为桂枝提取物。
复合保鲜剂的制备：按0.8％桂枝提取物，0.4％抗坏血酸，0.4％水溶性壳聚糖，0.1％植酸，2％食盐，其余为水的比例复配成水溶液，磁力搅拌15min使其充分混合均匀；
处理好的虹鳟鱼鱼片在保鲜剂中浸泡10分钟，鱼片与保鲜剂体积比为1：1，使保鲜剂完全浸没鱼片；
将浸泡好的鱼片在室温下悬挂沥干，沥干时间3分钟；
用包装袋包装沥干的鱼片；
将包装鱼片放置4℃条件下进行贮藏。
实施例4
一种基于群体感应抑制剂桂枝提取物的虹鳟鱼保鲜方法中菌落总数测定方法，具体实施方法如下：
鱼片预处理：选取鲜活无病变的虹鳟鱼，加冰猝死后，将头、骨及内脏去除干净，切成100g左右均匀的鱼片。将鱼片清洗干净，在室温下沥干水分。将处理好的鱼片分为两组，一组利用实施例3中制备的复配保鲜剂进行处理后包装贮藏；另一组不经保鲜处理，直接包装贮藏，作为对照组。将包装鱼片放置4℃条件下贮藏，在贮藏的第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天分别取样，对菌落总数进行测定。菌落总数的测定参考国标GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中方法。每隔3天取10g样品搅碎后加入90mL无菌生理盐水，震荡5min，取上清液梯度稀释，选择合适倍数吸取1mL，倾注PCA平板摇匀，每个梯度2个重复，30℃培养48h后计数。
参考国际微生物规格委员会规定的食品微生物最高安全限值(≤107cfu·g-1)由图2可知，对照组的腐败期为6天，而经过保鲜剂处理后的实验组腐败期可达到12天，与对照组相比，经保鲜剂处理后的鱼片的菌落总数增长更慢，腐败期延长了6天。说明复配保鲜剂处理可以有效延长虹鳟鱼鱼片的贮藏时间。
实施例5
基于群体感应抑制剂桂枝提取物的虹鳟鱼保鲜方法中挥发性盐基氮测定方法，具体实施方法如下：
鱼片预处理：选取鲜活无病变的虹鳟鱼，加冰猝死后，将头、骨及内脏去除干净，切成100g左右均匀的鱼片。将鱼片清洗干净，在室温下沥干水分。将处理好的鱼片分为两组，一组利用实施例3中制备的复配保鲜剂进行处理后包装贮藏；另一组作为对照组，直接包装贮藏。将包装鱼片放置4℃条件下贮藏，在贮藏的第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天分别取样，对挥发性盐基氮进行测定。挥发性盐基氮含量的测定参考国标GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中第一法。每隔3天取20g样品，搅碎后准确加入100mL蒸馏水，震荡后使样品分散均匀，浸渍30min后过滤取滤液。利用半微量定氮装置进行蒸馏，以盐酸标准滴定溶液滴定。
参考GB 2733-2015食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品相关规定(≤20mg/100g)，由图3可知，对照组的腐败期为9天，而经过保鲜剂处理后的实验组的腐败期可以达到13天，与对照组相比，经保鲜剂处理后的鱼片挥发性盐基氮积累量更少，使腐败期延长了4天。说明复配保鲜剂处理可以有效延长虹鳟鱼鱼片的腐败期。
实施例6
基于群体感应抑制剂桂枝提取物的虹鳟鱼保鲜方法中感官评定测定方法，具体实施方法如下：
鱼片预处理：选取鲜活无病变的虹鳟鱼，加冰猝死后，将头、骨及内脏去除干净，切成100g左右均匀的鱼片。将鱼片清洗干净，在室温下沥干水分。将处理好的鱼片分为两组，一组利用实施例3中制备的复配保鲜剂进行处理后包装贮藏；另一组作为对照组，直接包装贮藏。将包装鱼片放置4℃条件下贮藏，在贮藏的第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天分别取样，对鱼片的品质按照如下感官评定表进行感官评定。由图4可知，与对照组相比，经保鲜剂处理后的鱼片品质保持较好，说明复配保鲜剂处理可以延长虹鳟鱼鱼片的腐败期。
表3感官评定表
Claims (8)
1.一种群体感应抑制剂桂枝提取物的应用方法，其特征在于：
所述桂枝提取物为桂枝通过有机溶剂乙醇浸提进行制备，应用于水产保鲜方面。
2.一种群体感应抑制剂桂枝提取物在水产品保鲜方面的应用，其特征在于：
所述水产品保鲜应用为虹鳟鱼的低温保鲜贮藏应用中。
3.一种基于群体感应抑制剂桂枝提取物的虹鳟鱼保鲜方法，其特征在于如下步骤：
①预处理：将鲜活虹鳟鱼去头去骨去内脏，切片后清洗干净并沥干水分；
②桂枝提取物的提取：利用有机溶剂乙醇提取桂枝提取物；
③复配保鲜剂：将桂枝提取物、抗坏血酸、水溶性壳聚糖、植酸及食盐按一定比例混合复配成水溶液，制成保鲜剂；
④鱼片处理：将虹鳟鱼片在上述保鲜剂中浸泡10分钟，捞出悬挂沥干2-4分钟；
⑤包装贮藏：将鱼片包装后，0℃-4℃冷藏保存。
4.根据权利要求3所述虹鳟鱼保鲜方法，其特征在于：
所述方法步骤①预处理中沥干方式为悬挂沥干，所述沥干时间为2-4分钟。
5.根据权利要求3所述虹鳟鱼保鲜方法，其特征在于：
所述方法步骤②中桂枝提取物的提取方法为：桂枝粉末用95％乙醇超声辅助浸提2小时，过滤后得到桂枝提取物。
6.根据权利要求3所述虹鳟鱼保鲜方法，其特征在于：
所述的方法步骤③中复配保鲜剂的重量比为：0.3％-0.5％抗坏血酸，0.3-0.5％水溶性壳聚糖，0.05％-0.15％植酸，1％-3％食盐，其余为水的比例进行复配。保鲜剂复配方法为超声溶解或磁力搅拌15分钟，使保鲜剂各组分充分混合溶解。
7.根据权利要求3所述的虹鳟鱼保鲜方法，其特征在于：
所述的方法步骤④鱼片处理中，鱼片在保鲜剂中的浸泡方式为完全浸没鱼片，浸泡时间为10分钟；鱼片沥干方式为悬挂沥干，沥干时间为2-4分钟，虹鳟鱼鱼片与复配保鲜剂体积比为1：1。
8.根据权利要求1所述的虹鳟鱼保鲜方法，其特征在于：
所述步骤⑤包装贮藏中的包装方式为保鲜袋包装，贮藏温度为0℃-4℃。
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