CN101649299B

CN101649299B - 一种消除单核细胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN101649299B
Application number: CN2009100422765A
Authority: CN
Inventors: 蔡俊鹏; 彭宗辉
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2029-08-28
Also published as: CN101649299A

Abstract

本发明公开了一种消除单核细胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其应用。本发明通过分离纯化、紫外诱变得到蛭弧菌BDSM08。BDSM08于电子显微镜下形态观察呈单细胞，弧形，大小为1.8×1.0μm，端生鞭毛，长度为3.2μm。所述蛭弧菌BDSM08以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2-3mm的透明圆形噬菌斑，其最适生长pH值为7.2，最适生长温度28℃，最适盐度0％。应用BDSM08制备的微生物制剂对环境中常见的单增李斯特菌具有很强的杀灭作用。本发明首次将蛭弧菌BDSM08用于防治食品李斯特菌病，对食品上的单增李斯特菌消除效果良好，且具有无毒、对食品无副作用等特点，应用前景良好。

Description

一种消除单核细胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种蛭弧菌，特别涉及一种消除单核细胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其应用。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌LM，是一种人畜共患病的病原菌。它广泛存在于自然界中，在绝大多数食品中如蔬菜、奶及奶制品、生肉、熟肉制品和水产品中都存在。食用污染了单增李斯特菌的食品后，可导致李斯特菌病。李斯特菌病能导致较高的死亡率，是仅次于沙门氏菌感染的致命性食源性疾病。据美国CDC(Center for Disease Control andPrevention)统计，2003年美国李斯特菌病的平均发病率为3.3/100万人。目前国内已有单增李斯特菌引起孕妇发病，导致胎儿死亡的报道。该菌能在2～42℃环境下生存，能在冰箱内较长时间生长并且繁殖，危险性极大，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。WHO(World Health Organization)将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。

对于食品中携带单增李斯特菌的消除，目前的处理方式也仅局限在普通的灭菌方式，如巴氏杀菌，化学方法灭菌等。普通的杀菌方式往往会造成细菌的残留，同时传统灭菌方式处理过的食品往往会破坏其本来具有的色香味，破坏了食品的营养成分。新型的噬菌体灭菌也局限性较大。而蛭弧菌作为一类具有裂解致病菌的特殊细菌，不仅可应用到畜禽从养殖到食用前的全过程，而且不会导致细菌出现抗性，也无噬菌体疗法中宿主过于专一的缺点。在用蛭弧菌处理后的食品通过较短时间的巴氏杀菌既能达到商业无菌状态，在保证食品安全的同时也有效降低了耗能。因此蛭弧菌作为一类致病菌的生物消除剂具有相当大的优势。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种消除单核细胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株。

本发明的另一目的在于提供所述蛭弧菌菌株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种消除单核细胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株，名称为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDSM08，于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 209171。

对所述蛭弧菌BDSM08进行负染后于电子显微镜下形态观察(见图1)：BDSM08呈单细胞，弧形，大小为1.8×1.0μm，端生鞭毛，长度为3.2μm；所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDSM08以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2-3mm的透明圆形噬菌斑，其最适生长pH值为7.2，最适生长温度28℃，最适盐度0％；

所述蛭弧菌BDSM08由蛭弧菌BDS01进行紫外诱变而得；

所述蛭弧菌BDS01自泥样中分离得到，于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209169；对其进行负染后于电子显微镜下形态观察：蛭弧菌BDS01呈单细胞，弧形，大小为0.9×0.25μm，端生鞭毛，长度为4μm；将其以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1-2mm的透明圆形噬菌斑；

所述紫外诱变依据申请号“2008100220488.3”，名称为“紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用”的国家发明专利申请中的方法进行；

蛭弧菌BDSM08的16S-ITS rDNA序列如下(如序列表SEQ ID No.1所示)： CAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGGGTAGCAATACCTAGTGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTGGATAATCTGCCTTAGAGTGGGGGATAACTAGTC G AAAGATTAGCTAATACCGCATAAGACCACAAGAGCTGCGGCTCAAGGGGTCAAAGGTTTTTCGCTCTAAGATGAGTCCGCGTAAGATTAGCTAGTTGG TG AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCTTTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAG CAG TAGGGAATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTCGCAGGGGAATAAC ACAA TGAATGTACCCTGTAAGAAAGGATCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGAGGGATCCTAGCGTTGTTCGGAATCATTGGGCGTAAA GCGGG TGTAGGTGGCTTTGTAAGTCAGGTGTGAAAGCCTAGGGCTCAACCCTAGAAGTGCATTTGATACTGCGAAGCTTGAGTGCTAGAGAGGTTACTA GAATTG TTGGTGTAGTGGTGAAATACGTAGATATCAACAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGGTAACTGGCTAGACACTGACACTCAGACCCGAAAGCGT GGGGATC AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTTGTTGTTGGAGGTATTGACCCCTTCAGTGWCGAAGCTAACGCGT TAAGTATC CCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAA CGCGAAGAA CCTTACCTAGGCTTGACATGTACTGGAAGATTGGCAGAAATGTCGTCGCCCGCAAGGGTCGGTACACAGGTGCTGCACGGCTGTCGTCAG CTCGTGTCGT AAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGCATTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGATGGACTGCCGGTGTT AAACCGGAGGA AGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGCCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGTCACAGAGCGAAGCTAAGCCGC GAGGTAGAGCAA ATCGCTTAAAAGCTATCTAAGTTCAGATTGATCTCTGCAACTCGAGATCATGAAGTTGGAATCGCTAGTGATCGCGGATCAGAATGC CGCGGTGAATACG TTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAAAGTCGGCTGTACCAGAAGTCGCTGCGCTAACCGTAAGGAGGCAGGCGC CCAAGGTATGATCG ATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGATTATCCGGTCAATCT TCACTAAGACTTGTT CTTAGTAAGTTAAAATGACCCAATCTTAGGTCAGCTTACTCTTCCCGAGTAAGTGAGTCCCAAAAATCTATCTAGCTGTTTAGT TTTGAGAGAGTGAAGC CTAACGGGCCTGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCACACGCTTGATAAGCGTGGGGTCGGAAGTTCGAGTCTTCCCAGGCCTACCAA GTTCTACTGACGGTTGA ATGCGGTGTAAGTTAGTGTTTTACGTGAACAAGTTTTTGTTCTTTGACAATTGAATAGATTGATTTAGTTGATTTTTAGCGA

一种微生物制剂，含有所述的蛭弧菌BDSM08；

所述微生物制剂的制备方法，包含以下步骤：将蛭弧菌的浓度用DNB(dilutenutrient broth)培养基、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液调整为至少10²pfu/mL，得到所述的微生物制剂；

所述的微生物制剂应用于消除单核细胞增生李斯特菌；

所述微生物制剂应用于消除食品中的单核细胞增生李斯特菌；

所述微生物制剂应用于消除食品中的单核细胞增生李斯特菌，是以喷洒、擦涂、浸渍或者加入的方法处理携带有单核细胞增生李斯特菌的食用前的食品；部分产品需配合简单的巴氏杀菌，就能达到很好的消除效果；

所述微生物制剂应用于消除食用前果蔬或水产品携带的单核细胞增生李斯特菌，所述微生物制剂中的蛭弧菌最佳浓度范围为10⁴～10¹²pfu/mL。

所述微生物制剂应用于消除蛋类、肉类和鲜牛奶及奶制品所携带的单核细胞增生李斯特菌，所述微生物制剂中的蛭弧菌最佳浓度范围均为10²～10¹²pfu/mL。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明蛭弧菌在消除食用前果蔬或水产品致病性弧菌的应用效果显著。以卷心菜、罗非鱼和对虾(又称明虾、大虾)为例，如图2、图3所示，对单增李斯特菌均有较高的消除率。

2、在食用前用蛭弧菌消除果蔬及水产品中单增李斯特菌安全性好

蛭弧菌消除果蔬及水产品中单增李斯特菌的方法是生物的方法，蛭弧菌可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，且其在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，因此对人和动物无毒副作用。不仅可提高消费者生食果蔬和水产品的安全系数，保护消费者的健康，也为果蔬及水产品的绿色加工生产提供保障。

3、本应用方法特别适用于禽蛋及肉类加工过程中，为加工提供优质原材料和加工上的便利，确保禽蛋类加工产品的优质，有效地解决了食品安全问题。

4、用于禽蛋及肉类保藏中致病菌的消除时，以新鲜的鸡蛋、猪肉为例，检测结果如图4和图5所示，对单增李斯特菌的清除率均可达99％以上。可有效地延长在常温或者低温下的保藏时间，防止或延缓禽蛋及肉腐败变质，同时避免使用化学防腐剂，方便、安全且效果好，直接提高了产品品质。

5、本发明用于鲜牛奶及奶制品的前期灭菌，奶制品以奶酪为例，检测结果如图6和图7所示，不仅能够有效的缩短巴氏杀菌的时间，同时可以杀灭奶酪成熟过程感染的致病菌。

附图说明

图1是蛭弧菌BDSM08于电镜下观察的形态图。

图2是微生物制剂消除食用前果蔬携带单增李斯特菌效果图。

图3是微生物制剂消除食用前水产品携单增李斯特菌效果图。

图4是微生物制剂对蛋类携带的单增李斯特菌的消除效果图。

图5是微生物制剂对肉类携带的单增李斯特菌的消除效果图。

图6是微生物制剂对携带单增李斯特菌的鲜牛奶巴氏杀菌效果图。

图7是微生物制剂对携带单增李斯特菌的奶制品的消除效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)通过紫外诱变方法得到蛭弧菌BDSM08

出发菌株为蛭弧菌BDS01，蛭弧菌BDS01自泥样中分离得到，于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209169；对其进行负染后于电子显微镜下形态观察：蛭弧菌BDS01呈单细胞，弧形，大小为0.9×0.25μm，端生鞭毛，长度为4μm；将其以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1-2mm的透明圆形噬菌斑。

将蛭弧菌BDS01依据申请号“2008100220488.3”，名称为“紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用”的国家发明专利申请中的方法，在紫外灯功率15W，辅助红外光源的功率为20W，照射距离为15cm，诱变时间4min的条件下，五次累加诱变后，筛选得到诱变株BDSM08。

对蛭弧菌BDSM08进行负染后于电子显微镜下形态观察(见图1)：BDSM08呈单细胞，弧形，大小为1.8×1.0μm，端生鞭毛，长度为3.2μm；所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDSM08以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2-3mm的透明圆形噬菌斑，其最适生长pH值为7.2，最适生长温度28℃，最适盐度0％。

将蛭弧菌BDSM08于2009年8月7日在位于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 209171。

BDSM08与BDS01裂解单增李斯特菌(购于广东省微生物研究所菌种保藏中心，编号GIM 1.298)的对比实验中，由实验结果检验发现，BDSM08可以裂解单增李斯特菌，出现噬菌斑的时间为48h，斑较亮，边缘清晰，透明斑直径平均值为2.5mm。BDS01经过观察未出现噬菌斑，不能裂解单增李斯特菌，由此可以看出经过诱变的BDSM08菌株与出发菌BDS01相比具有更强的裂解能力，从而为提高食品质量提供有效的安全措施，为食物中毒、鱼类病害防治和食品安全保障提供新的手段。

(2)消除单核细胞增生李斯特菌的微生物制剂的制备

蛭弧菌菌液通过申请号“200710031166.X”的国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行制备：在装有100mL LB(Luria-Bertani)液体培养基的锥形瓶中接种嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物研究所菌种保藏中心，编号GIM 1.172)，250rpm、30℃摇床培养24小时，培养液分别于4℃、5000rpm离心15min，弃上清。将沉淀加入到装有100mL DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)的锥形瓶中，再加入从双层平板上挑取的蛭弧菌BDSM08的噬菌斑，恒温摇床250rpm、30℃培养24h。培养液分别于4℃、6000rpm离心20min，取上清液，再将上清液分别于4℃、16000rpm离心20min，保留沉淀，加入DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)重新悬浮蛭弧菌沉淀物，蛭弧菌BDSM08菌液的浓度为10¹⁴pfu/mL。

用水稀释BDSM08菌液，得到不同的微生物制剂，其中：

微生物制剂A含有的蛭弧菌数为10¹²pfu/mL；

微生物制剂B含有的蛭弧菌数为10¹⁰pfu/mL；

微生物制剂C含有的蛭弧菌数为10⁸pfu/mL；

微生物制剂D含有的蛭弧菌数为10⁶pfu/mL；

微生物制剂E含有的蛭弧菌数为10⁴pfu/mL；

微生物制剂F含有的蛭弧菌数为10²pfu/mL。

(3)将微生物制剂用于消除食用前果蔬携带的单增李斯特菌

①、单增李斯特菌菌液的制备

单增李斯特菌(购于广东省微生物研究所菌种保藏中心，编号GIM 1.298)用营养肉汁培养基摇床培养，160rpm、28℃培养18h，接着，将培养液经4℃、6000rpm离心20min，弃上清液，沉淀菌体用无菌水重新悬浮，使其浓度为10⁹cfu/mL。

②将微生物制剂用于消除食用前果蔬携带的单增李斯特菌

试验所用材料为卷心菜。设置对照组和试验组。各设三个平行样，每个平行样均有卷心菜500克(即样品)。将卷心菜浸渍于步骤(3)①制备的单增李斯特菌菌液中，用无菌水调节终浓度，使其浓度达到1.0×10⁴cfu/mL，30秒后取出沥干。再分别将卷心菜(每500g卷心菜为一个样品)浸渍于浓度为A、B、C、D和E的微生物制剂中，每种试剂均有三个平行样。样品在不同蛭弧菌液浸渍后，30秒后取出沥干，在室温下放置，分别于2小时和4小时检测单增李斯特菌的含量。

单增李斯特菌的具体检测方法是称取卷心菜50g，置于已灭过菌的研钵中，加无菌水10ml，匀浆之后，把液体平均分装到两支50ml的离心管中，研钵再加40ml无菌水冲洗，在把冲洗液平均分装到两支50ml的、已盛有匀浆液的离心管中，2000rpm离心20min除去杂质，然后把两支离心管的上清液转移到一无菌烧杯中，并按10倍稀释法进行系列稀释，最后采用MPN(mostprobable number)方法对细菌进行计数(单位为cfu/kg)。其中单增李斯特菌的检测采用ALOA单增李斯特菌显色培养基，通过观察是否出现带有不透明晕环的蓝绿色菌落来检测单增李斯特菌。

检测结果如图2所示，所有数据均为三个平行样的平均值。由图中可以得到，蛭弧菌浓度越高，微生物制剂消除李斯特菌的能力越强，消除率越高；作用时间越久，消除效果越好。因此，在消除果蔬携带的单增李斯特菌中，BDSM08蛭弧菌液的最佳使用浓度在10⁴～10¹²pfu/mL。

实施例2

(1)将微生物制剂用于消除食用前水产品携带的单增李斯特菌

试验容器为25L的水族箱，分为试验组和对照组，每组设3个平行。试验用水为滤膜过滤的养殖淡水，每个水族箱注入16L过滤水。水族箱在实验前经二氯异腈尿酸钠消毒，水温为26℃。在每个水族箱中加入实施例1步骤(3)①制备单增李斯特菌液，用无菌水调节使其终浓度为1.0×10⁴cfu/mL。然后每个水族箱放罗非鱼和对虾各10只。试验所用罗非鱼约重140～190g，对虾约重15～30g，体长约为8-10cm。对照组为只加实施例1步骤(3)①制备的单增李斯特菌，用无菌水调节终浓度，使其浓度达到1.0×10⁴cfu/mL，且不加蛭弧菌液，试验组加入蛭弧菌BDSM08菌液形成的微生物制剂A、B、C、D和E。样品在不同蛭弧菌液浸渍后，30秒后取出沥干，在室温下放置，分别于2小时和4小时检测单增李斯特菌的含量。

单增李斯特菌的具体检测方法是用经无菌生理盐水湿润的灭菌拭子(棉花签)在水产品表面上均匀的涂抹4次后，置含无菌生理盐水的无菌离心管中振荡、混匀，然后采用MPN方法对细菌进行计数(单位为cfu/kg)。其中单增李斯特菌的检测采用ALOA单增李斯特菌显色培养基，通过观察是否出现带有不透明晕环的蓝绿色菌落来检测单增李斯特菌。

检测结果如图3所示，所有数据均为三个平行样的平均值。图3表明，蛭弧菌BDSM08对单增李斯特菌的消除率可达到99％以上。由图中可以看到时间越长消除率越高，蛭弧菌液浓度越高，消除效果越好。因此，在消除水产品携带的单增李斯特菌中，BDSM08蛭弧菌液的最佳使用浓度在10⁴～10¹²pfu/mL。

实施例3

将微生物制剂用于消除蛋类携带的单增李斯特菌，具体过程如下：

试验所用材料为鸡蛋，试验均设对照和试验组。各设三个平行样，每个平行样有鸡蛋10个，每个鸡蛋约重50g。分别把鸡蛋浸渍于实施例1步骤(3)①制备的浓度为10⁹cfu/mL的单增李斯特菌菌液中，用无菌水调节终浓度，使其浓度达到1.0×10⁴cfu/mL，30秒后取出沥干。然后将每10个鸡蛋分成一个小组，浸渍于实施例1制备的微生物制剂A、B、C、D、E和F中。鸡蛋浸渍30秒后取出沥干，室温下放置，分别在放置时间为2小时和4小时这两个时刻，检测单增李斯特菌的含量。单增李斯特菌的具体检测方法是取经无菌生理盐水湿润的灭菌拭子(棉花签)在蛋表面上均匀的涂抹4次后，置含无菌生理盐水的无菌离心管中振荡、混匀，然后采用MPN方法对细菌进行计数(单位为cfu/kg)。检测所用特异性培养基同实施例1。

检测结果如图4所示，所有数据均为三个平行样的平均值。图4表明，由BDSM08蛭弧菌液形成的微生物制剂对单增李斯特菌的消除率均可达到99％以上。因此，在消除蛋类携带的单增李斯特菌中，BDSM08蛭弧菌液的最佳使用浓度在10²～10¹²pfu/mL。

实施例4

将微生物制剂应用于消除肉类携带的单增李斯特菌，具体过程如下：

分割出每块重量相近的实验样品猪块，每块重约0.25kg。试验设对照组和试验组，每组设三个平行样。将它们浸渍于实施例1步骤(3)①的浓度为10⁹cfu/mL的单增李斯特菌菌液中，用无菌水调节终浓度，使其浓度达到1.0×10⁴cfu/mL，30秒后取出沥干。将试验组浸渍于浓度为A、B、C、D、E和F的微生物制剂中，每种试剂均有三个平行样。样品在不同蛭弧菌液浸渍后，30秒后取出沥干，在室温下放置，分别于2小时和4小时检测单增李斯特菌的含量。单增李斯特菌的具体检测方法是取经无菌生理盐水湿润的灭菌拭子(棉花签)在猪肉表面上均匀的涂抹4次后，置含无菌生理盐水的无菌离心管中振荡、混匀，采用MPN检测法(单位为cfu/kg)。检测所用特异性培养基同实施例1。

检测结果如图5所示，所有数据均为三个平行样的平均值。从图5可以看出，蛭弧菌浓度越高，微生物制剂消除李斯特菌的能力越强，消除率越高。作用时间越久，消除效果越好。比较单增李斯特菌的初始浓度与终浓度，可知单增李斯特菌的残留率均不到1％。因此，在消除肉类携带的单增李斯特菌中，BDSM08蛭弧菌液的最佳使用浓度在10²～10¹²pfu/mL。

关于对肉品质的评价，除了上述从肉的卫生安全方面做出检测外，还包括从持水力、pH、嫩度、肉色以及硬度及湿度几个方面来考查。

持水力按照目前通用的48小时滴水法，将肉制品悬挂在0～4℃悬挂贮存48小时后计算失重率，使用微生物制剂的试验组的猪肉在悬挂48h持水率均较高，失重率平均为2.2％，而对照组的失重率则为11％。由此明显看出对照组猪肉品质的下降。

从肉色来评价，使用微生物制剂的猪肉呈现鲜红色，稍有光泽，而未使用蛭弧菌的猪肉肉色灰白，光泽暗淡，且不断有水外渗。主观评价可以看出感染致病菌的猪肉(对照组)肉色明显的劣于试验组。

从pH值测定来看，感染致病菌的猪肉(对照组)的pH值都接近5，这是肌肉的持水力下降的标志，此时的pH值对猪肉的风味产生较大影响，而使用蛭弧菌的试验组pH值维持在6.5左右，这说明肉的品质保持的比对照组的要好。

嫩度主要是通过嫩度仪来评估的，评估的结果两者之间没有很明显的区别，实验组嫩度略微的优于对照组。

主观评价硬度主要是通过切面是否容易变形来确定的，而评价湿度主要是通过切面液体渗出的多少来确定的，4h时对照组的猪肉切面很容易变形，而且还有水渗出，可以鉴定等级为渗出。试验组的猪肉切面不容易变形，也没有水渗出，可以鉴定等级为潮湿。

从以上肉品质的综合鉴定来看，试验组的猪肉品质明显的优于对照组。这说明蛭弧菌在消除禽蛋肉类携带的常见致病菌方面效果显著，可以推广应用于禽蛋肉类的保藏和加工工业。

实施例5

将微生物制剂应用于消除鲜牛奶及奶制品中携带的单增李斯特菌，具体过程如下：

本实验在新鲜的10L鲜牛奶中加入实施例1步骤(3)①的浓度为10⁹cfu/mL的单增李斯特菌液0.1mL，使菌液终浓度为1.0×10⁴cfu/mL。然后将带有李斯特菌的牛奶分为12份，其中3份为对照系列，另9份为实验系列。实验系列中每3份为1组加入蛭弧菌BDSM08菌液形成的微生物制剂D、E和F。将对照系列和试验系列的牛奶静置2小时，同时采用65℃巴氏杀菌对鲜牛奶进行灭菌。每10分钟用无菌移液管吸取10mL牛奶样品采用MPN方法对细菌进行计数(单位为cfu/mL)。所有数据均为三个平行样的平均值。检测所用特异性培养基同实施例1。

巴氏杀菌效果见图6所示。图中以无菌为细菌0残留量，■为对照系列牛奶随巴氏杀菌时间延长的灭菌率，□为实验系列中添加微生物制F组的牛奶随巴氏杀菌时间延长的灭菌率。所有数据均为三个平行样的平均值。实验结果表明，对照系列100％无菌的巴氏杀菌时间为30min；而实验系列中最低蛭弧菌终浓度组(10²pfu/mL，由于其它试验小组的效果更好，故在此不再赘述)在20min时已达无菌，大大缩短了巴氏杀菌的时间，减少了产品的耗能也更好的保证了产品的风味。

对于奶制品以奶酪为例。本实验将成熟干燥后的奶酪浸入实施例1步骤(3)①浓度为10⁹cfu/mL的单增李斯特菌液，用无菌水调节终浓度至1.0×10⁴cfu/mL。试验设对照组和试验组，每组设三个平行样，每个平行样均有一块成型后等质量的奶酪，30秒后取出沥干。试验组中，在浸泡完单增李斯特菌菌液后的奶酪分别直接浸入实施例1制备的微生物制剂A和F中，30秒后取出沥干，室温下放置，每10分钟用无菌刀切取5克左右奶酪置于含无菌生理盐水的无菌离心管中振荡、混匀，然后采用MPN方法对细菌进行计数(单位为cfu/kg)。检测所用特异性培养基同实施例1。

检测结果如图7所示，所有数据均为三个平行样的平均值。从图7可以看出，蛭弧菌BDSM08对单增李斯特菌的消除率可达到100％。实验结果以添加不同浓度蛭弧菌液的不同时间得到的结果作图，由图中可以看到时间越长消除率越高，在作用时间30分钟时达到消除率100％，蛭弧菌液浓度越高，消除效果越好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

<120>一种消除单核细胞增生李斯特菌的蛭弧菌菌株及其应用

<130>7

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

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<212>DNA

<213>蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)

<220>

<221>misc_feature

<222>(778)..(778)

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agaggatgat cagtcacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300

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ccttcgggtc gtaaagctct gtcgcagggg aataacacaa tgaatgtacc ctgtaagaaa 420

ggatcggcta acttcgtgcc agcagccgcg gtaagacgag ggatcctagc gttgttcgga 480

atcattgggc gtaaagcggg tgtaggtggc tttgtaagtc aggtgtgaaa gcctagggct 540

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caagttctac tgacggttga atgcggtgta agttagtgtt ttacgtgaac aagtttttgt 1740

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Claims

1.一种消除单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的蛭弧菌菌株，其特征在于：所述蛭弧菌菌株为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDSM08，于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209171。

2.一种消除单核细胞增生李斯特菌的微生物制剂，其特征在于：所述微生物制剂含有权利要求1所述的蛭弧菌BDSM08。

3.权利要求2所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：将蛭弧菌用DNB培养基、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液调整菌液浓度至少为10²pfu/mL，得到所述的微生物制剂；

所述DNB培养基的组成为：营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.2～7.6；其中，DNB的中文名称为稀释营养肉汤，英文全称为dilute nutrient broth。

4.权利要求2所述的微生物制剂的应用，其特征在于：所述的微生物制剂用于消除单核细胞增生李斯特菌。

5.根据权利要求4所述所述微生物制剂的应用，其特征在于：所述微生物制剂应用于消除食品中的单核细胞增生李斯特菌。

6.根据权利要求5所述微生物制剂的应用，其特征在于：所述微生物制剂以喷洒、擦涂、浸渍或者加入方式作用于食品。

7.根据权利要求5所述微生物制剂的应用，其特征在于：所述微生物制剂应用于消除果蔬或水产品表面携带的单核细胞增生李斯特菌，所述微生物制剂中蛭弧菌的浓度为10⁴～10¹²pfu/mL。

8.根据权利要求5所述微生物制剂的应用，其特征在于：所述微生物制剂应用于消除蛋类、肉类、鲜奶或奶制品携带的单核细胞增生李斯特菌，所述微生物制剂中蛭弧菌的浓度为10²～10¹²pfu/mL。