CN103404537A

CN103404537A - 一种桂枝提取物的制备方法及其制备的桂枝提取物和用途

Info

Publication number: CN103404537A
Application number: CN2013103718033A
Authority: CN
Inventors: 陈金印; 万春鹏; 周梦娇
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-23
Also published as: CN103404537B

Abstract

本发明提供了一种桂枝提取物的制备方法，包括超声波辅助乙醇提取桂枝。所述制备方法还可以包括乙酸乙酯萃取和硅胶柱纯化。本发明还提供所述制备方法得到桂枝提取物，以及该桂枝提取物在制备抑制柑橘采后病原菌的药物组合物中的用途。桂枝提取物对柑橘采后病原菌具有较强的抑制作用，用于柑橘保鲜后无化学残留，对人体无健康危害，对环境无污染，不易产生抗药性。

Description

一种桂枝提取物的制备方法及其制备的桂枝提取物和用途

技术领域

本发明属于水果病害防治和保鲜领域，具体涉及一种具有抑制柑橘采后病原菌作用的桂枝提取物及其制备方法和用途。

背景技术

柑橘是世界第一大水果，目前我国柑橘的种植面积和产量均居世界第一位，在我国农业经济中占有非常重要的地位。

柑橘果实组织细嫩多汁并且富含糖分，在采摘、包装、贮藏、运输和销售等各个环节中都容易发生机械损伤，果皮损伤后易受多种病原菌的侵袭而产生采后病害。这些病害易造成果实腐烂变质，腐烂率一般为10%~30%，严重时可达40%~50%以上，造成巨大的经济损失。柑橘采后发生的病害种类高达20余种，主要有意大利青霉(Penicillium italicum)引起的青霉病和指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病，柑橘采后90%左右的腐烂由这两种病害引起。其它的病害还包括黑腐病、酸腐病、褐腐病、褐色帝腐病、炭疽病和焦腐病等。

目前对柑橘采后病害的防治基本以化学药剂为主，但其连续使用容易造成抗药性，另外，化学杀菌剂会造成药剂残留、环境污染，使用安全性日益得到人们的关注。因此，从植物中寻找防治柑橘采后病害的活性物质以开发新型的植物源柑橘保鲜剂成为目前研究领域的一个热点。而且，植物源药剂有着高效、低毒、低残留，使用安全，对环境无污染等优点，另外。植物源药剂是通过多成分，多靶点发挥抑菌作用，因此不易产生抗药性。因此，需要从天然植物中寻找、开发生物活性高、毒性低、安全、价格低廉的天然植物源防腐剂对柑橘进行保鲜以减少对化学药剂使用的依赖。

桂枝(Cinnamomi Ramulus)为樟科樟属常绿乔木肉桂的干燥嫩枝，为一种常用的中药材。桂枝具有很高的药用价值，主要含有挥发油类，香豆素类、萜类、苯丙素类成分。现代药理研究证明，桂枝有解热降温、镇静、镇痛、抗惊厥、扩血管、抗凝、抑制血小板聚集、抗病原体等作用。例如桂枝挥发油可以抑制炎症介质组织胺和前列腺素E(PGE)的释放，清除过多的自由基( LPO、MDA)，从而保护心肌细胞膜和细胞不受氧化作用的损伤。另外，桂枝在体外能完全抑制凝血酶促进纤维蛋白原变为纤维蛋白的作用，能显著延长牛凝血酶凝聚人体纤维蛋白原时间，从而表明桂枝有显著抗凝血作用。关于桂枝的抗菌活性，仅见韩爱霞等研究桂枝水煎煮提取液对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌的抑菌作用，未见桂枝抑制柑橘采后病原菌的系统研究报道。本发明通过对桂枝抑制柑橘采后病原菌活性成分进行提取和分离，明确桂枝的抑菌活性物质。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种桂枝提取物的制备方法及其制备的桂枝提取物和用途。本发明以天然的中草药植物为原料，制备的桂枝提取物抑菌效果明显而且无化学残留，对人体无健康危害，对环境无污染，预示着很好的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种桂枝提取物的制备方法，包括如下步骤：

所述桂枝中加入桂枝重量8~40倍的重量百分比浓度为80% ~100%的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为40~60℃，提取时间为2~3小时，超声频率为30~40 KHz；过滤，即得。

优选的，本发明所述制备方法还可以包括：

将浓缩或干燥的桂枝醇提物溶解于10倍量的蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，减压、浓缩回收乙酸乙酯后，即得。

更优选的，本发明所述制备方法还可以包括：

将得到的桂枝乙酸乙酯萃取物上硅胶柱分离，体积比99:1至10:1的氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，收集氯仿:甲醇=99:1的洗脱液，减压浓缩、回收溶剂，即得。

在本发明所述制备方法中，优选的，乙醇的重量为所述桂枝重量的10~15倍；更优选为10倍。

优选的，乙醇的重量百分比浓度优选为90%~100%；更优选为95%。

优选的，超声波辅助提取的温度优选为40℃。

还优选的，乙醇提取前，所述桂枝40~50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末进行超声波辅助提取。

作为本发明的一个优选的具体实施方式，一种桂枝提取物的制备方法，包括如下步骤：

I. 将桂枝40~50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；

II. 步骤I得到的粉末中加入所述桂枝重量10~15倍的重量百分比浓度为90%~100% 的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为40℃，提取时间为2~3小时，超声频率为30 ~40KHz；过滤，得到醇提取液；

III. 步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，即得。

本发明的另一个优选具体实施方式，一种桂枝提取物的制备方法，包括如下步骤：

I. 将桂枝40~50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；

III. 步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到桂枝乙醇提取物

IV. 步骤III得到的桂枝乙醇提取物溶解于10倍量的蒸馏水中，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，减压、浓缩回收乙酸乙酯，即得。

本发明的另一个更优选具体实施方式，一种桂枝提取物的制备方法，包括如下步骤：

I. 将桂枝40~50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；

IV. 步骤III得到的桂枝乙醇提取物溶解于10倍量的蒸馏水中，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，减压、浓缩回收乙酸乙酯，得到桂枝乙酸乙酯萃取物；

V. 步骤IV得到的桂枝乙酸乙酯萃取物上于30倍量硅胶柱，体积比99:1至10:1的氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，收集氯仿:甲醇=99:1的洗脱液，减压浓缩、回收溶剂，即得。

本发明的另一个目的，在于提供上述制备方法制备得到的桂枝提取物。

本发明还有一个目的，在于提供桂枝或桂枝提取物在制备用于防治柑橘采后病原菌的药物组合物和/或柑橘采后保鲜剂中的用途；优选的，所述桂枝提取物通过本发明所述制备方法制备得到。

由此，本发明提供一种防治柑橘采后病原菌的药物组合物，包括本发明所述制备方法制备得到的桂枝提取物。

另外，本发明还提供一种柑橘采后保鲜剂，包括本发明所述制备方法制备得到的所述桂枝提取物。

本发明所述的药物组合物或柑橘采后保鲜剂，除所述桂枝提取物外，还可以包括可以接受的辅料，例如选自羧甲基纤维素、壳聚糖等的成膜剂，选自茶皂素、吐温等的助溶剂，选自山梨酸钾、苯甲酸钠等的防腐剂。

本发明所述的柑橘采后保鲜剂，除所述桂枝提取物外，还可以包括可以接受的辅料，例如选自羧甲基纤维素、壳聚糖等成膜剂，选自甘油、蔗糖酯、吐温等的助溶剂，选自柠檬酸、丙酸钙、山梨酸钾或苯甲酸钠等的防腐剂，以及适当的溶剂，如水。

如果没有特殊说明，本发明出现的“桂枝提取物”指的是以适当的溶剂，以本领域可以接受的提取方法得到的含有或者不含有提取溶剂的桂枝的提取物。

超声波具有“空化效应”，“机械振动”以及“热效应”等特性，“空化效应”可瞬间产生几千个大气压力，使提取介质的微小气泡压缩、爆裂、破碎提取原料的细胞壁，加速天然药用成份的溶出，“机械振动”和“热效应”进一步强化了溶出成份的扩散，使药用成份在提取介质中快速达到浓度平衡，可大大缩短提取成本。而且提取温度较低，避免了长时间高温水煎煮对桂枝化学成分的破坏，提高产品质量。

本发明以天然的药用植物为原料，无论是醇提物，还是乙酸乙酯萃取物以及硅胶柱纯化物，都具有一定的抑制意大利青霉和指状青霉的作用，尤其是经过精制纯化的桂枝提取物，抑菌效果更显著。本发明所述含有桂枝提取物的药物组合物和柑橘保鲜剂，无化学残留，对人体无健康危害，对环境无污染，具有很好的应用前景。

附图说明

图1的照片显示的是试验例1中桂枝醇提物对意大利青霉和指状青霉的抑菌效果，箭头指示的是抑菌环的边缘；其中图1A显示了桂枝醇提物对意大利青霉的抑菌环，图1B显示了桂枝醇提物对指状青霉的抑菌环。

图2的照片显示的是试验例1中桂枝乙酸乙酯萃取物对意大利青霉和指状青霉的抑菌效果，箭头指示的是抑菌环的边缘；其中图2A显示了桂枝乙酸乙酯萃取物对意大利青霉的抑菌环，图2B显示了桂枝乙酸乙酯萃取物对指状青霉的抑菌环。

图3的照片显示的是试验例1中桂枝硅胶柱纯化物对意大利青霉和指状青霉菌的抑菌效果；箭头指示的是抑菌环的边缘；其中图3A显示了桂枝硅胶柱纯化物对意大利青霉的抑菌环，图3B显示了桂枝硅胶柱纯化物对指状青霉的抑菌环。

图4的照片显示的是试验例1中桂枝醇提物对意大利青霉和指状青霉菌孢子萌发影响的效果，其中4A显示的是桂枝醇提物对意大利青霉孢子萌发的影响，4A-1是对照组，4A-2是桂枝醇提物组；4B显示的是桂枝醇提物对指状青霉菌孢子萌发的影响，4B-1是对照组，4B-2是桂枝醇提取物组。

具体实施方式

通过下面给出的具体的实例对本发明作进一步说明，但它不能理解为对本发明的限定。

下述实施例所用的药材、试剂、生物材料，如无特殊说明，均来源于商业途径。

实施例1：一种桂枝提取物

通过如下步骤制备：

I. 将5kg桂枝40℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；

II. 步骤I得到的粉末中加入所述桂枝重量10倍的重量百分比浓度为95% 的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为40℃，提取时间为2小时，超声频率为30 KHz；过滤，得到醇提取液；

III. 步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到462g目标产物（桂枝醇提取物）。

实施例2 一种桂枝提取物

通过如下步骤制备：

I. 将5kg桂枝50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；

II. 步骤I得到的粉末中加入所述桂枝重量20倍的重量百分比浓度为90% 的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为50℃，提取时间为2小时，超声频率为30 KHz；过滤，得到醇提取液；

III. 步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到469g目标产物（桂枝醇提取物）。

实施例3 一种桂枝提取物

通过如下步骤制备：

I. 将5kg桂枝50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；

II. 步骤I得到的粉末中加入所述桂枝重量30倍的重量百分比浓度为80% 的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为60℃，提取时间为3小时，超声频率为40 KHz；过滤，得到醇提取液；

III. 步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到475g目标产物（桂枝醇提取物）。

实施例4 一种桂枝提取物

通过如下步骤制备：

I. 将5kg桂枝45℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末；

II. 步骤I得到的粉末中加入所述桂枝重量40倍的重量百分比浓度为100% 的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为40℃，提取时间为2小时，超声频率为30 KHz；过滤，得到醇提取液；

III. 步骤II得到的醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到458g目标产物（桂枝醇提取物）。

实施例5 一种桂枝提取物

通过如下方法制备：

按照实施例1所述方法制备得到的桂枝提取物(桂枝醇提取物)，溶解于10倍量的蒸馏水中，用与蒸馏水等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，减压、浓缩回收乙酸乙酯，得到161g目标产物（桂枝乙酸乙酯萃取物）。

实施例6 一种桂枝提取物

按照实施例5制备得到的桂枝提取物（桂枝乙酸乙酯萃取物）上于30倍量硅胶柱，体积比99:1至10:1的氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，收集氯仿:甲醇=99:1的洗脱液，减压浓缩、回收溶剂，得到16g目标产物（桂枝硅胶柱纯化物）。

实施例7 一种防治柑橘采后病原菌的药物组合物

处方：实施例1制备的桂枝醇提取物80 mg，苯甲酸钠10g，柠檬酸钾20g，冰乙酸1g，余量为蒸馏水，共制成1000ml。

制备方法：按照处方称取各组分，加入蒸馏水中，搅拌，使完全溶解，即得。

实施例8 一种防治柑橘采后病原菌的药物组合物

处方：实施例5制备的桂枝乙酸乙酯萃取物物50 mg，柠檬酸钾40g，冰乙酸1g，吐温-80适量，余量为蒸馏水，共制成1000ml。

实施例9 一种柑橘采后保鲜剂

处方：实施例3制备的桂枝提取物50mg，羧甲基纤维素10g，柠檬酸钾0.6g，蔗糖酯5g，甘油5g, 丙酸钙10g，余量为蒸馏水，共制成1000ml。

制备方法：称取处方量的羧甲基纤维素，加入适量蒸馏水溶胀8h，再加入蒸馏水搅拌配制羧甲基纤维素溶液。然后依次加入柠檬酸、蔗糖酯、甘油、丙酸钙及桂枝提取物，用蒸馏水稀释至1000ml，搅拌均匀，即得。

实施例10 一种柑橘采后保鲜剂

处方：实施例6制备的桂枝提取物10mg，羧甲基纤维素10g，苯甲酸钠0.5g，蔗糖酯5g，甘油5g, 丙酸钙10g，余量为蒸馏水，共制成1000ml。

制备方法：称取处方量的羧甲基纤维素，加入适量蒸馏水溶胀8h，再加入蒸馏水搅拌配制羧甲基纤维素溶液。然后依次加入苯甲酸钠、蔗糖酯、甘油、丙酸钙及桂枝提取物，用蒸馏水稀释至1000ml，搅拌均匀，即得。

试验例1 桂枝提取物对柑橘采后病原菌的抑菌作用

实验材料：

①供试药物：不同方法制备的桂枝提取物

a. 桂枝醇提物溶液，实施例1制备的桂枝提取物，用乙醇配制成浓度为1 g药材/mL的溶液。

b. 桂枝乙酸乙酯萃取物溶液，实施例5制备的桂枝提取物，用乙醇配制成浓度为50 mg/mL的溶液。

c. 桂枝硅胶柱纯化物溶液，实施例6制备的桂枝提取物，用乙醇配制成浓度为50 mg/mL的溶液。

②供试菌株：意大利青霉(Penicillium italicum，ACCC30399)，指状青霉(Penicillium digitatum，ACCC30389)、均来自中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）。

实验方法：

1、琼脂扩散法测定桂枝提取物对供试病原菌的抑制作用

取供试菌接种于试管斜面培养基，30℃培养2-3d，将试管培养基中的供试菌用PDB培养液将孢子洗入三角瓶中，摇匀，玻璃珠打散，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使菌液浓度达10⁶-10⁷ cfu/mL备用。

吸取上述孢子菌悬液5 mL混入冷却至50℃左右PDA培养基，制备带菌培养基。然后放置无菌牛津杯，分别于牛津杯中加入200 μL三种桂枝提取物溶液，置于28 ℃恒温箱中培养48 h，十字交叉法测量抑菌圈的大小。重复测定三次，计算抑菌环直径平均值。

2、二倍稀释法测定桂枝醇提物的最低抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MFC)

将所述桂枝醇提物溶液二倍稀释至1.95 mg桂枝药材/mL ~1000 mg桂枝药材/mL之间的十个浓度梯度，然后吸取10 mL不同浓度的桂枝醇提物溶液于含90 mL未融化的PDA培养基中，摇匀后倒入平板中，制成含药培养基，待培养基凝固后，用平板涂布法将供试孢子菌悬液均匀涂于含药PDA培养基上，每个浓度重复三次。并设置空白对照组（培养基不接种菌）、菌液对照组（培养基接种菌但不含桂枝醇提物）。将试验组和对照组置于28℃的培养箱中培养2 d, 试验组中以无菌生长的培养皿的最低含药浓度为其MIC，将所有无菌生长的培养皿继续培养7 d后观察，以无菌生长的培养皿的最低含药浓度为其MFC。

3、桂枝醇提物对孢子萌发率的影响

取供试菌接种于试管斜面培养基，30℃培养2-3d，将试管培养基中的供试菌用PDB培养液将孢子洗入三角瓶中，摇匀，玻璃珠打散，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使菌液浓度达10⁶-10⁷ cfu/mL。取凹玻片，滴入72 μL的菌孢子悬浮液和8 μL不同浓度梯度的桂枝醇提物溶液（3.125 mg桂枝药材/ml-50 mg桂枝药材 /ml），对照组加入等量95%的乙醇，每个处理重复 3 次。将玻片置于28℃培养箱中，12 h 后镜检，观察孢子萌发情况，在显微镜下统计100~200个孢子，计算孢子萌发率和孢子萌发抑制率。用DPS软件计算毒力回归方程、有效中浓度（EC₅₀）和EC₅₀值的置信限等。

实验结果

1、桂枝提取物对供试病原菌的抑制作用

结果参见图1至3。桂枝醇提物、桂枝乙酸乙酯萃取物和桂枝硅胶柱纯化物对柑橘意大利青霉和指状青霉都具有抑制作用，且抑菌作用顺序增强。具体表现为：桂枝醇提取物在1 g桂枝药材/mL的浓度下对意大利青霉和指状青霉的抑菌圈直径的大小分别为34.57 ± 0.78 mm和31.56 ± 0.66 mm，桂枝乙酸乙酯萃取物在50 mg/mL的浓度下对意大利青霉和指状青霉的抑菌圈直径的大小分别为45.33 ± 0.31 mm和40.53 ± 0.97 mm，桂枝硅胶柱纯化物在10 mg/mL的浓度下对意大利青霉和指状青霉的抑菌圈直径的大小分别为43.17 ± 0.48 mm和41.51 ± 0.96 mm。

上述实验结果表明，本发明对桂枝抑菌活性部位的追踪是成功的，随着精制纯化，得到的提取物的活性成倍提高。

2、桂枝醇提物的MIC和MFC的测定

桂枝醇提物对意大利青霉最低抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MFC)分别为3.125 mg桂枝药材/mL和6.25 mg桂枝药材/mL。对指状青霉的MIC及MFC分别为6.25 mg桂枝药材/mL和12.5 mg桂枝药材/mL。

3、桂枝醇提物对孢子萌发的影响

结果参见图4。

25 mg桂枝药材/mL的桂枝醇提物可以完全抑制意大利青霉的孢子萌发，抑制率为95%左右。桂枝醇提物浓度的对数值与意大利青霉孢子萌发抑制率之间表现为线性关系，线性方程为Y=2.0048X + 3.9504。经计算EC₅₀为3.49 mg/mL。

50 mg桂枝药材/mL的桂枝醇提物可以完全抑制指状青霉的孢子萌发，抑制率为99%左右。桂枝醇提物浓度的对数值与指状青霉孢子萌发抑制率之间表现为线性关系，线性方程为Y=2.1282X + 3.5401。经计算EC₅₀为4.96 mg/mL。

上述实验结果说明桂枝醇提物对柑橘采后病原菌的孢子萌发具有很强的抑制作用，可以有效防治柑橘采后由病原菌引起的各种病害。

桂枝乙酸乙酯萃取物和桂枝硅胶柱纯化物的抑菌作用明显强于桂枝醇提物，对柑橘采后由病原菌引起的各种病害，也有很好的防治效果。

Claims

1.一种桂枝提取物的制备方法，包括如下步骤：

将所述桂枝中加入桂枝重量8~40倍的重量百分比浓度为80% ~100%的乙醇进行超声波辅助提取，提取温度为40~60℃，提取时间为2~3小时，超声频率为30~40 KHz；过滤，即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括：

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于：乙醇的重量为所述桂枝重量的10~15倍，优选为10倍；乙醇的重量百分比浓度为90%~100%，优选为95%。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于：超声波辅助提取的温度为40℃。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法，其特征在于：乙醇提取前，所述桂枝40~50℃烘干，粉碎后过40目筛，取筛下粉末进行超声波辅助提取。

7.权利要求1至6中任一项所述的制备方法制备得到的桂枝提取物。

8.桂枝或桂枝提取物在制备用于防治柑橘采后病原菌的药物组合物和/或柑橘采后保鲜剂中的用途；优选的，所述桂枝提取物通过权利要求1至6中任一项所述的制备方法制备得到。

9.一种防治柑橘采后病原菌的药物组合物，包括权利要求7所述的桂枝提取物。

10.一种柑橘采后保鲜剂，包括权利要求7所述的桂枝提取物。