CN113142291A - 仙人掌果提取物作为腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂及卵形鲳鲹保鲜剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种仙人掌果提取物作为腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂及卵形鲳鲹保鲜剂的应用。仙人掌果提取物的制备方法以乙醇水溶液为溶解介质，采用超声微波协同萃取法进行提取，过滤并收集滤液，滤液经盐沉、酸溶、萃取后旋转蒸发仪蒸浓缩干燥得终产品。本发明制备的仙人掌果提取物在亚抑菌浓度下具有群体感应抑制活性，起作用的剂量低，能显著抑制腐败希瓦氏菌生物膜的形成、胞外酶蛋白酶活性和群集、泳动性等群体感应特性，从而抑制腐败希瓦氏菌的致腐性，而且不影响腐败希瓦氏菌的生长，不会产生耐药性，可以作为天然来源的群体感应抑制剂使用。

Description

仙人掌果提取物作为腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂及卵形鲳 鲹保鲜剂的应用

技术领域

本发明涉及A23B4/00保存鱼或鱼制品的一般方法技术领域，具体为一种仙人掌果提取物作为腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂及卵形鲳鲹保鲜剂的应用。

背景技术

研究表明，在有氧冷藏条件下，腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是大黄鱼、带鱼、卵形鲳鲹和南美白对虾等多种水产品冷藏过程中优势腐败菌之一。作为腐败菌，希瓦氏菌属广泛存在于低温海产品中，具有较强的嗜冷性和产硫能力，能形成生物被膜使水产品表面发粘，并能把氧化三甲胺还原成三甲胺，产生硫化氢等挥发性气体，导致水产品出现鱼腥恶臭味从而腐败变质。

菌群在生长过程中，会不断产生化学信号分子并且分泌到周围环境中，当信号分子积累到一定阈值时，便可以被细菌感知，从而启动细菌相关腐败基因表达，从而表现出单个细菌无法展现的某些生理功能如生物膜形成、胞外酶合成、群集、泳动等特性，以适应环境的变化，这种细菌“语言”被称为群体感应(Quorum sensing，QS)，也称为细菌的“团队作战”。

腐败菌引起的致腐特性，大都依赖于群体感应系统的调控，通过群体感应抑制剂干扰食品腐败菌的群体感应系统，从而抑制腐败因子的表达，为食品绿色保鲜提供了新方向。

仙人掌原产于美洲，现广泛分布在亚洲、非洲、美洲等热带与亚热带地区，我国主要分布在海南、广东、广西、福建、云南、贵州等地，特别是海南岛及广东雷州半岛一带大量生长，仙人掌果，为仙人掌的果实，又名仙掌子，由果皮、果籽和果肉组成，果肉酸甜可口，果皮有红色、绿色、黄色、紫色等，果浆肉质为红色或紫色，海南岛属热带海洋性气候，阳光充足，盛产绿皮红心仙人掌果，仙人掌果具有活化淤血、祛除湿气、退热清热、生肌、消肿、强健胃脾、止痛凝血等多种功效，为民间广为流传的乡土良药。海南当地，仙人掌果多以鲜食为主，其果皮由于毛刺多，不便食用而长期未被开发利用，仅民间作水果食用。研究表明，仙人掌果实富含含糖、氨基酸、有机酸、维生素、矿物质、多酚类化合物等营养成分。

仙人掌提取液在现有技术中被用于某些保鲜剂的组成部分。如中国专利文献CN109090222A公开了一种了果蔬保鲜剂，其主要成分为梨果仙人掌茎提取液，其保鲜原理是利用了梨果仙人掌提取液对多酚氧化酶活力的抑制作用。中国专利文献CN109169828A公开了一种安全健康的肉类低温冷藏保鲜剂，主要组分包括仙人掌花提取物、壳聚糖、磷酸缓冲液、茶多酚、山梨酸钾、溶菌酶、抑菌蛋白溶液。其中，仙人掌花提取物是一种从仙人掌花托筒和子房中提取的多糖类物质，具有良好的成膜效果和吸湿性。

以仙人掌果提取物作为群体感应抑制剂的研究应用还未见公开报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种仙人掌果提取物作为腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂及卵形鲳鲹保鲜剂的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

仙人掌果提取物作为腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂的应用。

仙人掌果提取物作为卵形鲳鲹保鲜剂的应用。

所述仙人掌果提取物的制备方法为：

(1)原料预处理：将仙人掌果实粉碎，得到仙人掌果粉；

(2)醇溶：将仙人掌果粉与乙醇溶液混合，1g仙人掌果粉配20～30mL乙醇溶液；

(3)超声微波协同萃取：60℃下提取，微波功率为150～300W，微波处理时间1～2min，超声功率350～500w，超声时间20～30min；

(4)过滤：提取完成后过滤得到滤液；

(5)盐沉：调节滤液pH至6.0，然后向滤液中加入铝盐、锌盐进行沉淀，待溶液分层，出现明显沉淀后离心，取下层沉淀物；

(6)酸溶、萃取：在沉淀物中加入盐酸进行溶解，减压抽滤得上清液，利用乙酸乙酯对上清液进行萃取得萃取液；

(7)干燥：萃取液于旋仪蒸发浓缩，再将浓缩物于60～85℃烘箱烘干，得终产品。

本发明还提供了一种腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂，所述感应抑制剂为仙人掌果提取物。

本发明的有益效果是：本发明制备的仙人掌果提取物在亚抑菌浓度下具有群体感应抑制活性，起作用的剂量较低，能显著抑制腐败希瓦氏菌生物膜的形成、胞外酶蛋白酶活性和群集、泳动性等群体感应特性，起到抑制腐败希瓦氏菌的致腐效果，可以作为天然来源的群体感应抑制剂使用。其次，所述的仙人掌果提取物的制备方法具有工艺简便、提取成本低、提取率高的特点。仙人掌果提取液旋仪蒸发后的浓缩物，在干燥时可耐受60℃-85℃的温度，与一般群体感应抑制剂相比，耐热性强，提取过程中对沉淀用体积分数为12％的盐酸转溶，表明提取物具有酸稳定性，且抑菌活性较强。

附图说明

图1为仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌抑制活性；

注：a.甲醇对照，b、c、d分别为：1MIC、2MIC、8MIC仙人掌果提取物。

图2仙人掌果提取物对紫色杆菌CV026的群体感应活性；

图3仙人掌果提取物对紫色杆菌CV026紫色素产量的影响；

图4仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌生物膜形成相对抑制率；

注:不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

图5仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌生物膜形态的影响(光学显微镜100×)；

注：a.阴性对照；b、c、分别为1.0、2.0mg/mL仙人掌果提取物。

图6仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌胞外蛋白酶活力的影响；

注：a.阴性对照；b、c、d、e分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL仙人掌果提取物。

图7仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌胞外蛋白酶活力的抑制圈直径；

图8仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌群集和泳动性的影响；

图9为仙人掌果提取物对冷藏卵形鲳鲹感官品质的影响；

图10为仙人掌果提取物对冷藏卵形鲳鲹菌落总数的影响；

图11为仙人掌果提取物对冷藏卵形鲳鲹挥发性盐基氮指标的影响。

具体实施方式

下面通过以下实施例对本发明作进一步说明，它将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容和范围。

1、实施例中用到主要实验材料

(1)菌株

报告菌株紫色杆菌CV026(Chromobacterium violaceum)购于北京百欧博伟生物技术有限公司；目标菌株：腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)登录号U91555.1，分离自冷藏卵形鲳鲹，保存于海南热带海洋学院实验室；绿皮红心仙人掌果、卵形鲳鲹(体质量600±12g)，购于海南省三亚市胜利路旺豪超市。

(2)培养基

a.LB肉汤培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH7.2-7.4，121℃灭菌30min，固体LB培养基加入琼脂20g/L。

b.脱脂奶琼脂平板：15％的脱脂乳粉用纯水溶解后单独灭菌(108℃，15min)。取10mL脱脂乳与90mL固态营养琼脂培养基混合均匀；

c.群集琼脂培养基：1％蛋白胨、0.5％氯化钠、0.5％琼脂和0.5％葡萄糖，

d.泳动琼脂培养基：1％胰蛋白胨、0.5％氯化钠、0.3％琼脂。

2、仙人掌果提取物的制备

新鲜的仙人掌果实，清洗干净，切成薄片，经40-50℃烘箱干燥后，粉碎过60目筛，自封袋密封保存备用。用时称取100g粉末以1:25(g:mL)料液比加入75％乙醇溶液，60℃下超声微波协同萃取，微波功率为250W，微波处理时间1min，超声功率400w，超声时间25min；提取完成后，用纱布粗滤去残渣，粗滤液再用真空泵抽滤，得到滤液；滤液中加入5g AlCl₃和10g ZnCl₂进行沉淀，待溶液分层，出现明显沉淀后离心(3500r/min，10min)，向沉淀中加入200mL的体积分数为12％的盐酸进行转溶，减压抽滤得上清液，加入乙酸乙酯(2倍体积)进行萃取，萃取液于0.085Mpa，60℃旋仪蒸发浓缩，将浓缩物65℃烘箱烘干，即得仙人掌果提取物。使用时以甲醇溶解，配成25mg/mL的原液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

3、仙人掌果提取物对紫色杆菌CV026和腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度(MIC)测定

实验方法：

采用平板涂布法测定，将紫色杆菌和腐败希瓦氏菌从-80℃冰箱取出后，分别接种于LB肉汤培养基，30℃、160r/min摇床震荡培养，过夜活化两次至OD595nm＝1左右。将仙人掌果提取物母液二倍比稀释成6个浓度，紫色杆菌、腐败希瓦氏菌最小抑菌浓度测定的浓度选择分别是0.263、0.525、1.05、2.1、4.2、8.4mg/mL和0.35、0.7、1.4、2.8、5.6、11.2mg/mL，分别吸取2mL上述仙人掌果提取物溶液加入到无菌平皿内，每皿再倒入18mL已灭菌的LB琼脂培养基，混匀，冷却凝固后，将100μL过夜活化的紫色杆菌CV026和腐败希瓦氏菌菌液分别加入各自的平板中央，涂布均匀，30℃倒置培养24h，观察菌的生长情况，以完全没有菌生长的最低浓度为仙人掌果提取物的最小抑菌浓度(MIC)。

实验结果：

通过观察所选取的浓度梯度范围内，仙人掌果提取物对紫色杆菌CV026和腐败希瓦氏菌的生长影响情况，确定了仙人掌果提取物对紫色杆菌CV026的MIC为2.1mg/mL，对腐败希瓦氏菌MIC为2.8mg/mL。

后续仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌的抑制作用测定，选取亚抑菌浓度进行，具体选择0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL，4个浓度。考察仙人掌果提取物在亚抑菌浓度下，对腐败希瓦氏菌的抑制效果。

实施例1

该实施例针对仙人掌果提取物抑菌活性及群体感应活性进行检测

1、对腐败希瓦氏菌的抑菌活性测定

实验方法：

抑菌活性测定采用牛津杯打孔法。腐败希瓦氏菌于30℃，160r/min摇床振荡培养过夜活化后，以2％比例接种于LB肉汤中，培养至菌体密度OD595 nm约为1左右，吸取菌液100μL，均匀涂布于LB琼脂培养基，采用牛津杯打孔，每孔加入50μL不同浓度(1MIC、2MIC、8MIC)仙人掌果提取物，以甲醇为空白对照。30℃培养静置24h，观察仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌的生长抑制情况。结果见附图1。

实验结果：

图1显示，仙人掌果提取物浓度为2.8mg/mL(1MIC)及对照组，周围均无明显抑菌圈产生，浓度为2MIC时，抑菌效果比较明显，当仙人掌果提取物浓度为22.4mg/mL(8MIC)时具有极其显著的抑菌效果，其孔径周围有明显的透明抑制圈出现，说明较高浓度(8MIC)的仙人掌果提取物抑菌活性较强，且抑菌性具有剂量依赖性。

2、仙人掌果提取物对紫色杆菌CV026群体感应抑制活性测定

原理：报告菌株紫色杆菌(Chnomobacterium violaceum)CV026是野生紫色杆菌C.vio-laceum ATCC 31532的突变体，具有卡那霉素抗性，其本身不产生N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)，也不产生紫色素，但当外源有信号分子AHLs存在时，能感知其存在并产生紫色素；紫色杆菌CV026紫色素的产生受细菌群体感应调控，而群体感应抑制剂会抑制其紫色素的产生。

实验方法：

采用报告平板法测定仙人掌果提取物对报告菌株CV026紫色素产生的影响，具体方法为：将报告菌株紫色杆菌CV026于30℃、160r/min摇床过夜活化2次，按2％的接种量接种于含有20μg/mL卡那霉素的LB肉汤中，培养18h后按2％接种量接种于冷却到40℃左右的LB琼脂培养基中(含有20μg/mL C6－HSL信号分子)，混合均匀，冷却凝固后，采用牛津杯打孔，杯中加入100μL的2.0mg/mL仙人掌果提取物，30℃静置培养24h后观察紫色素的产生情况。

实验结果：

附图2是仙人掌果提取物抑制紫色杆菌群体感应活性的结果图。平板中央添加2mg/ml的仙人掌果提取物后，圆孔周围出现不透明的、淡黄色的群体感应抑制圈，表明亚抑菌浓度的仙人掌果提取物能够抑制紫色杆菌紫色素的产生，具有群体感应抑制活性，对紫色杆菌生长无影响。

3、仙人掌果提取物对紫色杆菌CV026紫色素产量的影响

实验方法：

采用LB肉汤培养基将紫色杆菌CV026过夜活化，以2％比例接种于LB肉汤中，添加20μg/mL的信号分子C6-HSL，加入仙人掌果提取物，使其终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL，30℃、160r/min摇床振荡培养至OD595为1左右，依次取300μL添加信号分子菌液于1.5mL无菌离心管中，加入200μL10％十二烷基硫酸钠，室温下涡旋振荡5s，静置5min，加入500μL饱和正丁醇(正丁醇50mL与蒸馏水10mL)，涡旋振荡8s，10 000r/min离心，5min)，取含有紫色色素上清液200μL加入96孔板中，测定OD595，以LB肉汤培养基为空白对照。同时为确定仙人掌果提取物对报告菌株CV026生长的影响，以不加信号分子的实验组作为对照，其余步骤同上，相同条件下培养，测定紫色杆菌CV026生长情况。

实验结果：

图3显示，亚抑菌浓度仙人掌果提取物各处理组与对照组菌液密度值比较接近，表明仙人掌果提取物对紫色杆菌CV026生长不产生影响(P＞0.05)；紫色杆菌色素产量随着仙人掌果提取物浓度的升高逐渐降低，当仙人掌果提取物浓度为2.0mg/mL时，紫色色素产量仅为对照产量的35.4％(P＜0.05)，抑制率达到64.5％。说明仙人掌果提取物在不影响菌株正常生长条件下，对紫色杆菌群体感应系统具有抑制作用，具有群体感应活性。

实施例2

该实施例针对仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌生物膜形成相对抑制率及形态的影响进行测定。

1、仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌生物膜形成相对抑制率的影响

实验方法：

将过夜活化两次的腐败希瓦氏菌菌液，用LB肉汤培养基以1:100的比例进行稀释。取1mL加入1.5mL的离心管中，添加不同剂量的仙人掌果提取物使其终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL，阴性对照为无菌去离子水，30℃静置培养48h。取出后分别取200μL菌液，采用酶标仪在OD595nm下测定菌液密度，测定完成后，倾去菌液，无菌水漂洗浮游菌3次，无菌风干燥30min，加入0.1％(w/v)的结晶紫150μL，室温染色15min后，用无菌水水冲洗离心管至水清晰，随后加入1mL 95％乙醇溶解，静置10min，于酶标仪OD595nm条件下测定吸光度值，计算生物膜的相对抑制率。

计算公式：生物被膜相对抑制率(％)＝(ODcontrol-ODQSI/ODcontrol)×100％

式中：ODQSI为抑制剂处理组测得的OD595nm值；ODcontrol为阴性对照组测得的OD595nm值。

实验结果:

附图4是仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌生物膜生成相对抑制率的影响结果。腐败希瓦氏菌的生物膜形成抑制率，随着仙人掌果提取物处理浓度的增加逐渐升高，浓度为2.0mg/mL时，抑制率最高达到56.1％。表明亚抑菌浓度下仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌生物膜形成具有明显抑制作用。

2、仙人掌果提取物对生物膜形态的影响检测

实验方法：

将载玻片(25.4mm×76.2mm，厚度1～2mm)顺序于无水乙醇、去离子水中超声30min处理后，烘干灭菌备用。取过夜活化后的腐败希瓦氏菌，按体积比1:100接种于LB肉汤中，吸取10mL菌液加入到无菌培养皿中，再加入仙人掌果提取物使其终质量浓度分别为1.0、2.0mg/mL，同时，以不添加仙人掌果提取物为阴性对照组。将载玻片浸没其中，30℃恒温培养72h后。用镊子取出载玻片，无菌水漂洗3～5次，置于无菌培养皿中，加入适量甲醇固定15min，2％结晶紫染色3min，无菌水冲洗7次，无菌风干燥固定，光学显微镜油镜(100×)观察并拍照记录。

实验结果：

附图5是仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌生物膜形态的影响结果，从图5中可以看出，阴性对照组(a)的生物膜最密集且聚集成块，颜色也最深；处理组随着仙人掌果提取物浓度的增大，生物膜分布逐渐变得分散且稀薄，生物膜的密度、细胞团块的大小逐渐下降，2.0mg/mL的仙人掌果提取物处理组(c)的生物膜分布松散、稀疏，且厚度变薄、颜色变浅。测定结果与生物膜相对抑制率测定结果相吻合。

实施例3

该实施例针对仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌胞外蛋白酶活力的影响进行测定。

实验方法：

首先制作脱脂奶琼脂平板，凝固后用牛津杯打孔。制备含有不同浓度(0.5、1.0、1.5和2.0mg/mL)仙人掌果提取物的过夜活化的腐败希瓦氏菌菌悬液，取200μL菌液加入孔内，30℃静置培养24h，期间观察其水解圈直径。蛋白酶水解酪蛋白后，在菌落周围出现明显的透明圈，透明圈的大小表示蛋白酶水解活性的高低，用游标卡尺量取水解透明圈的直径，按下式计算抑菌圈直径。水解圈直径＝水解透明圈的直径(mm)-牛津杯的外径(mm)。结果见图6、7。

实验结果：附图6、7是仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌胞外蛋白酶活力影响的实验结果图。图6、7显示，阴性对照组水解圈直径最大，达5.75mm；仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌蛋白酶活力具有明显抑制作用，且随着仙人掌果提取物浓度的递增，蛋白酶水解圈逐渐减小，在2.0mg/mL时水解圈直径仅为0.96mm。表明仙人掌果提取物极大地抑制了蛋白酶活力，抑制率最高达83.3％。

实施例4

该实施例针对群集性和泳动性的影响进行测定。

实验方法：

分别在群集、泳动培养基中各加入不同剂量的仙人掌果提取物，使其终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2mg/mL。待平板凝固后，吸取过夜培养的菌液5μL点在平板中央，无菌风吹干，30℃静置培养24h，测定扩散圈直径并计算其面积，根据直径大小判断仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌群集和泳动能力的抑制作用。

实验结果：

附图8是仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌群集性和泳动性的抑制效果图。图8显示，腐败希瓦氏菌以鞭毛的形式向外迁移，阴性对照处理组的菌株群集和泳动能力最强，仙人掌果提取物处理组，随着处理浓度的升高群集、泳动性明显减弱，二者呈负相关。表明腐败希瓦氏菌的运动能力受到群体感应系统调控，群体感应抑制剂仙人掌果提取物干扰了腐败希瓦氏菌鞭毛粘附至接触面的能力，进而抑制其致腐能力。

实施例5

该实施例针对群体感应抑制剂仙人掌果提取物对卵形鲳鲹的保鲜应用进行测试。

所用仙人掌果提取物制备方法同前所述，将其应用于水产品-卵形鲳鲹的保鲜应用，具体研究方法如下：

1、卵形鲳鲹无菌鱼块制备

购买无病变的鲜活卵形鲳鲹，采用冰水混合物致死，清水冲去表面粘液，经“三去”处理后，75％乙醇擦拭鱼体，用无菌剪刀剪取背部肌肉，切块(40±0.5g)，鱼块厚度为1cm左右，制备好的无菌鱼块菌落总数应＜102CFU/g。

2、腐败希瓦氏菌悬液的制备

腐败希瓦氏菌接种于LB液体培养基中，于30℃、160rpm摇床恒温震荡培养，至菌悬液浓度达到108CFU/mL，12 000rpm、离心30min后弃上清，用无菌生理盐水稀释至106CFU/mL，备用。

3、贮藏保鲜实验

在无菌条件下，将无菌卵形鲳鲹鱼块分为2组，每组设3个平行，只浸泡于腐败希瓦氏菌悬液(106CFU/mL)的处理为对照组，另1组浸泡于含有2.0mg/mL仙人掌果提取物的腐败希瓦氏菌悬液中，鱼块与抑制剂体积比为1：2，使鱼块能完全浸没其中；3-5min后取出，捞出沥干3-4min，装入无菌的自封袋中置于0-5℃冰箱中贮藏，每隔2d取出接种的鱼块进行感官评价、TVB-N指标、菌落总数测定。

4、感官评定方法与结果

参考GB/T 18108-2019鲜海水鱼通则，制定冷藏卵形鲳鲹感官评价标准(见表1)，10名经过培训的评定员，每隔2d对卵形鲳鲹鱼块的外观、气味、肌肉弹性和组织形态进行感官评分，以4个项目评分总和的算术平均值作为感官评分结果，6分以下为感官不可接受限。

表1卵形鲳鲹感官评分标准

结果：感官评分结果见图9，由图9可知，两组鱼块的感官分值均随贮藏时间的延长呈现下降的趋势，对照组在4d时感官评分为6分，已达到感官临界值，但仙人掌果提取物组的感官评分明显高于对照组(P＜0.05)。经仙人掌果提取物处理后的卵形鲳鲹鱼肉品质保持较好，8d接近感官临界点，10d时感官评分为5.4分，说明已超过感官腐败临界点，与对照组相比使卵形鲳鲹保质期延长5-6d。

5、菌落总数测定方法与结果

菌落总数(TVC)的变化能够反映蛋白质和氨基酸分解代谢程度，菌落总数参考国标GB 4789.2-2016的方法测定。每隔2天取10g样品搅碎后加入90m L无菌生理盐水，震荡5min，将上清液进行梯度稀释，选择合适倍数吸取1m L，注入PCA平板摇匀，每个梯度重复2次，30℃恒温培养48h后计数。

结果：参照文献Al-Daqal等(Al-Daqal M M,Bazaraa W A.Extension of shelflife of whole and peeled shrimp with organic acid salts and bifidobacteria[J].Journal of Food Protection,1999,62(1):51-56)中规定，水产品可食用的菌落总数上限是6.0lg(cfu/g)，超出即为腐败。由图10可知，两组鱼块菌落总数均随着贮藏时间的延长，呈增加趋势，均在4d超过临界值，但二者之间没有显著差异(P＞0.05)，说明仙人掌果提取物对腐败希瓦氏菌的生长无抑制作用。

6、挥发性盐基氮的测定方法与结果

挥发性盐基氮的测定参考国标GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中第一法中的半微量定氮法进行。每隔2天取20g鱼肉样品，进行挥发性盐基氮含量的测定。参考GB/T 18108-2019标准，样品鲜度TVB-N≤15mg/100g为优级品；TVB-N≥30mg/100g为腐败的开始。

挥发性盐基氮值测定结果见图11，对照组8d时挥发性盐基氮值为30.10mg/100g，已到达腐败终点，而经过仙人掌果提取物处理后的实验组12d时挥发性盐基氮值为31.32mg/100g，保质期可以达到12d，与对照组相比，经群体感应抑制剂处理后的鱼块挥发性盐基氮积累量变少，使腐败期延长了4天。说明仙人掌果提取物处理可以有效延长卵形鲳鲹的保质期。推测仙人掌果提取物干扰了腐败希瓦氏菌的群体感应系统，抑制了蛋白酶对鱼肉的降解作用。

Claims (5)

1.仙人掌果提取物作为腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂的应用。

2.如权利要求1所述的仙人掌果提取物作为腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂的应用，其特征在于，所述仙人掌果提取物的制备方法为：

(1)原料预处理：将仙人掌果实粉碎，得到仙人掌果粉；

(2)醇溶：将仙人掌果粉与乙醇溶液混合，1g仙人掌果粉配20～30mL乙醇溶液；

(3)超声微波协同萃取：60℃下提取，微波功率为150～300W，微波处理时间1～2min，超声功率350～500w，超声时间20～30min；

(4)过滤：提取完成后过滤得到滤液；

(5)盐沉：调节滤液pH至6.0，然后向滤液中加入铝盐、锌盐进行沉淀，待溶液分层，出现明显沉淀后离心，取下层沉淀物；

(6)酸溶、萃取：在沉淀物中加入盐酸进行溶解，减压抽滤得上清液，利用乙酸乙酯对上清液进行萃取得萃取液；

(7)干燥：萃取液于旋仪蒸发浓缩，再将浓缩物于60～85℃烘箱烘干，得终产品。

3.腐败希瓦氏菌群体感应抑制剂，其特征在于：所述感应抑制剂为仙人掌果提取物。

4.仙人掌果提取物作为卵形鲳鲹保鲜剂的应用。

5.如权利要求4所述的仙人掌果提取物作为卵形鲳鲹保鲜剂的应用，其特征在于，所述仙人掌果提取物的制备方法为：

(1)原料预处理：将仙人掌果实粉碎，得到仙人掌果粉；

(2)醇溶：将仙人掌果粉与乙醇溶液混合，1g仙人掌果粉配20～30mL乙醇溶液；

(3)超声微波协同萃取：60℃下提取，微波功率为150～300W，微波处理时间1～2min，超声功率350～500w，超声时间20～30min；

(4)过滤：提取完成后过滤得到滤液；

(5)盐沉：调节滤液pH至6.0，然后向滤液中加入铝盐、锌盐进行沉淀，待溶液分层，出现明显沉淀后离心，取下层沉淀物；

(6)酸溶、萃取：在沉淀物中加入盐酸进行溶解，减压抽滤得上清液，利用乙酸乙酯对上清液进行萃取得萃取液；

(7)干燥：萃取液于旋仪蒸发浓缩，再将浓缩物于60～85℃烘箱烘干，得终产品。

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