KR101082766B1 - 절임용 키토산 분말, 이를 이용한 절임물, 및 이를 이용하여 제조한 김치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 절임용 키토산 분말, 이를 이용한 절임물, 및 이를 이용하여 제조한 김치에 관한 것으로, 상기 절임용 키토산 분말은 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암활성이 우수한 수용성/불용성 키토산을 선별하여 탈아세틸화도와 점도에 따라 규격화한 것을 특징으로 한다. 상기 규격화된 키토산 분말을 이용하여 제조한 키토산 함유 김치는 키토산 자체의 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암활성보다 더 우수하며, 저장안정성 및 조직감이 우수하다.
Description
본 발명은 절임용 키토산 분말, 이를 이용한 절임물, 및 이를 이용하여 제조한 김치에 관한 것이다.
키토산은 게, 가재, 갑오징어 및 새우의 껍데기에 들어 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻은 물질로, (+)전하를 갖는 동물성 식이섬유이다. 키토산의 구조는 탈아세틸화도에 따라 N-아세틸-글루코사민(키틴의 단분자)과 글루코사민(키토산의 단분자)의 공중합체로 이루어져 있다. 키토산은 노폐해진 세포를 활성화시켜 노화를 억제하고, 면역력을 강화시켜 질병을 예방하며, 생체의 자연적인 치유 능력을 활성화하는 기능과 함께 생체 리듬을 조절해준다고 알려져 있으나, 그 메커니즘은 아직 완전히 규명되지 못하고 있다. 키토산의 효능으로는 항암작용, 항균작용, 면역강화 작용, 간기능 강화, 콜레스테롤 억제, 장내 유효군 증가, 유해균 억제, 혈압 조절 효과, 중금속 및 유해성분 흡착 배출, 혈당치 억제, 세포의 활성화 등이 알려져 있다. 그러나 키토산의 여러 가지 생리활성에도 불구하고 그 분자량이 매우 크고 우 리 몸에 이를 분해하는 효소가 존재하지 않아서 그 응용폭이 제한되고 그대로 섭취시에는 대부분 흡수되지 않고 체외로 배출되는 문제점이 있다.
일반적으로 갑각류인 대게/홍게류는 경상북도 청정해역에서 생산되는 대표적 특산물로 전국 생산량의 30%를 점유하고 있다. 키틴 및 키토산은 생산 기준 년산 1천억톤에 달하는 자원으로서 식물이 생산하는 셀룰로오스에 필적하는 양이다. 따라서, 종래에는 키토산을 주로 응집제로서 폐수처리나 토양 개량제로서 농업분야에 이용되어 왔으나, 근래에 이르러 생리적 합성 세재, 의약품, 화장품 및 식품 등에 응용되면서 그 적용범위가 확대되고 있다. 그러나, 고분자 키토산의 경우, 중성 pH 조건에서는 물에 불용성이고, 저농도 유기산용액에는 가용성이나 떫은맛과 쓴맛이 강하므로 식품에 적용하기에는 다소 어려움이 있었다. 또한, 키토산 제품 수입은 년간 10%씩 꾸준히 매년 늘어나고 있으나, 국내생산은 2003년 이후 퇴조하고 있는 실정이다.
한편, 김치는 우리 민족 고유의 전통 발효식품으로 각종 무기질과 비타민의 공급원이며, 섭취 후에는 장내의 유효 세균의 증식을 도와주는 건강식품으로 널리 알려져 있다. 김치는 무, 배추 및 오이 등을 소금에 절여서 고추·마늘·파·생강·젓갈 등의 양념을 버무린 후 젖산 생성에 의해 숙성되어 저온에서 발효된 제품으로, 한국인의 식탁에서 빼놓을 수 없는 반찬이다. 김치를 담그는 것은 채소를 오래 저장하기 위한 수단으로, 종래에는 김치를 오래도록 저장하기 위해 땅속에 김장독을 묻어 김치의 보존기간을 연장하여 왔다. 그러나, 최근 들어 주거환경의 변화로 김장독을 땅속에 묻지 못하는 경우가 많이 발생하며, 또한 김치를 땅속에 저장한다 하더라도 장기간 경과하면 숙성된 김치의 특유한 냄새가 나게 된다. 따라서 김치의 고유한 맛을 유지하면서 오랜 기간 보존하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구 중의 하나로 최근에 김치의 천연첨가제로서 키토산을 첨가하는 방법이 알려져 있다. 키토산은 약산에 용해되고, 분자 내 (+)전하를 가지고 있으며, 특히 항균성이 높은 것으로 알려져 있어 천연 보존제로서 일반식품에 많이 사용되고 있다.
키토산을 이용하여 김치의 보존성을 향상시키기 위한 선행기술을 살펴보면, 대한민국 특허출원 제 10-1999-23848호 및 제 10-1999-23849호 "산패 지연 개량김치의 제조방법", 제 10-1998-20451호 "보존성이 연장되는 김치의 제조방법", 대한민국 특허출원 제 10-1999-25417호 "키토산 및 광물질을 함유한 김치의 제조방법", 제 10-2003-26731호 "키토산 함유 황토수성 추출액제를 사용한 김치의 제조방법", 제 10-2001-42866호 "신선초를 주재료로 한 김치 제조방법" 등이 있다. 또한, 김치 양념 속에 키토산을 적용한 기술로, 대한민국 특허출원 제 10-1994-34463호 "즉석 김치 속 천연양념 조성물 및 그 제조방법", 대한민국 특허출원 제 10-1997-24877호 "키틴 키토산 김치" 등이 있고, 제조한 김치 자체에 키토산을 적용한 기술로 대한민국 특허출원 제 10-1997-81996호 "김치의 숙성 지연 방법", 대한민국 특허출원 제 10-1996-33362호 "산패 지연 김치 제조법", 대한민국 특허출원 제 10-1997-66558호 "김치 신선도 유지방법" 등이 있다.
상기한 바와 같이 김치의 보존성을 향상시키기 위한 연구와, 김치 양념 속 및 김치 자체에 키토산을 적용한 기술 등이 다양하게 개발되고 있지만, 최적의 조 건을 사용하기 위해 키토산을 규격화하여 이를 김치에 적용한 기술에 대한 연구 및 개발은 아직까지 전무한 상태이다.
따라서, 규격화된 키토산을 이용하여 특정식품에 대한 맞춤형 키토산이 생산되면, 식품 보존 기간을 향상시켜 식품 폐기물을 감소시키고, 식중독 등을 예방하여 국민건강에 이바지할 수 있으며, 키토산을 첨가한 기능성 김치를 생산하여 거대한 김치시장에서 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명자들은 여러 가지 생리활성을 갖는 키토산을 규격화하여 이를 김치에 적용하는 연구를 하던 중, 탈아세틸화도 및 점도의 차이에 따른 키토산을 규격화하였으며, 규격화된 키토산을 이용하여 제조한 김치가 키토산 자체의 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암활성보다 더 우수하고, 저장안정성 및 조직감이 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 탈아세틸화도 및 점도의 차이에 따라 규격화된 절임용 키토산 분말, 이를 이용한 절임물, 및 이를 이용하여 제조한 김치를 제공하고자 한다.
본 발명은 50 내지 90%의 탈아세틸화도 및 1 내지 10 cP의 점도를 갖는 수용성 키토산, 60 내지 100%의 탈아세틸화도 및 8 내지 80 cP의 점도를 갖는 불용성 키토산, 및 이의 식품학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 하나 이상의 조합인 항균, 항산화, 항돌연변이 및 항암 활성이 우수한 절임용 키토산 분말을 제공한다.
상기 수용성 키토산 또는 불용성 키토산은 식품학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 식품학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산이 바람직하고, 유기산으로는 아세트산, 시트르산 및 젖산 등이 바람직하다.
상기 절임용 키토산 분말은 탈아세틸화도와 점도가 다른 수용성 키토산 12종류(S-1 ~ S12)와 불용성 키토산 11종류(NS-1 ~ NS11)에 대해 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암 활성이 우수한 수용성/불용성 키토산을 선별하여 탈아세틸화도와 점도에 따라 규격화한 것을 특징으로 한다. 상기 키토산 중 수용성 키토산 5종류(S-2, S-9, S-10, S-11, S-12)와 불용성 키토산 6종류(NS-2, NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11)에서 식품군별 공시균주에 대한 항균활성이 우수하게 나타나며, S-7, S-10 및 NS-8에서 항산화 활성 및 항돌연변이 효과가 우수하게 나타나고, S-10 및 NS-8에서 항암효과가 우수하게 나타난다. 따라서, 본 발명에 따른 키토산은 50 내지 90%의 탈아세틸화도 및 1 내지 10 cP의 점도를 갖는 수용성 키토산, 및 60 내지 100%의 탈아세틸화도 및 8 내지 80 cP의 점도를 갖는 불용성 키토산을 선별하여 탈아세틸화도와 점도에 따라 규격화한다. 이 중 90%의 탈아세틸화도 및 3cP의 점도를 갖는 수용성 키토산(S-10)과, 95%의 탈아세틸화도 및 22cP의 점도를 갖는 불용성 키토산(NS-8)이 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암활성을 가장 우수하게 나타낸다.
또한, 본 발명은 탈아세틸화도 및 점도의 차이에 따라 규격화된 절임용 키토산 분말을 포함하는 절임 용액을 제공한다.
상기 절임 용액은 키토산 분말을 절임 용액 총 중량에 대해 0.2 내지 1.0 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 만일 키토산 분말이 0.2 중량% 미만이면 키토산 분말의 함량이 너무 적어 절임물의 저장성 및 조직감을 개선하기 어렵고, 1.0 중량% 를 초과하면 절임물의 저장성 및 조직감이 더 이상 향상되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 절임 용액에 채소류를 절여 제조한 절임물을 제공한다. 상기 절임물은 채소류 뿐만 아니라 과일, 육류 및 어패류 등을 절임 용액에 절인 물질을 총칭하며, 채소류로는 배추, 열무, 무우, 오이, 양파, 마늘, 고추 등을 포함한다. 상기 절임물은 절임물 총 중량에 대해 0.05 내지 0.25 중량%의 키토산이 함침된 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 절임물을 이용하여 제조한 김치를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 절임용 키토산 분말을 김치 총 중량에 대해 0.01 내지 1.5 중량%를 포함하는 김치를 제공한다.
본 발명에 따른 키토산 분말을 포함하는 김치는 표준화 김치 레시피를 이용하여 제조할 수 있다.
표준화 방법으로 제조된 키토산 함유 김치는 키토산 자체의 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암활성보다 더 우수하게 나타나고, 키토산이 김치의 발효를 천천히 이루어지게 하여 적숙기에 도달하는 기간을 길게 함으로써, 저장안정성이 우수하다. 또한, 키토산 함유 김치는 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 젖산균의 성장속도를 억제시켜 저장성 및 보존성이 우수하다. 또한, 식물성 셀룰로오스는 음(-)전하의 식이섬유인데 키토산은 양(+)전하의 식이섬유이므로, 키토산이 절임물에 적당량 함침 혼입되면 양성 식이섬유가 되어 김치의 식물성 셀룰로오스의 구조가 치밀해지므로 김치의 조직감을 개선시키며, 식이섬유 자체의 기능성을 보완해준다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1
: 키토산의 제조
1-1. 키토산의 제조
대한민국 동해에서 얻은 홍게 게각을 건조시킨 후 5% NaOH 수용액에 넣고, 100℃에서 5시간 동안 추출하여 탈단백된 게각을 얻었다. 상기 탈단백된 게각을 5% HCl 수용액에 넣고, 상온에서 5시간 동안 추출하여 탈칼슘화시켜 키틴을 얻었다. 그 다음 반응조에 45% NaOH 수용액을 채우고, 여기에 상기에서 얻은 키틴을 침적시킨 후 온도(80℃, 90℃, 100℃, 110℃)와 시간(5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50시간)을 변화시키면서 탈아세틸화 반응을 통해 키토산을 제조하였다. 상기 제조된 키토산의 탈아세틸화도와 점도를 측정하여 표 1에 나타내었다. 탈아세틸화도는 콜로이드 적정법(pvsk titration method)을 이용하여 측정하였으며, 점도는 키토산을 아세트산에 녹여 0.5%의 키토산 함유 아세트산 용액을 만들고, 20℃ 항온조에서 2시간 보관한 후 항온 하에서 측정하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 45% NaOH 수용액의 온도와 시간에 따라 키토산의 탈아세틸화도와 점도가 달라지게 되는데 높은 온도에서 오랜 시간 반응시키면 탈아세틸화도는 높아지나 점도가 낮아지게 되고, 반응시간을 짧게 하면 점도는 올라가나 탈아세틸화도가 낮아졌다. 또한, 낮은 온도에서 반응시키면 탈아세틸화가 되는 시간이 오래 걸리지만 점도는 천천히 떨어지는 것을 알 수 있었다. 따라서, 키토산의 규격은 탈아세틸화도와 점도로 표시하기로 한다.
1-2. 규격화된 키토산의 제조
상기 1-1에서 제조한 키토산을 규격화하기 위하여, 탈아세틸화도와 점도가 다른 수용성 키토산 12종류(S-1 ~ S-12)와 불용성 키토산 11종류(NS-1 ~ NS-11)를 준비하였으며, 하기 표 2에 나타내었다. 모든 키토산은 플라스틱 용기에 넣어 실온에서 보관하면서 사용하였으며, 수용성/불용성 키토산의 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암 활성을 하기 실험예 1~4의 방법으로 측정하였다. 상기 23종의 수용성/불용성 키토산 중 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암 활성이 우수한 키토산을 선별하여 규격화하였다.
| 키토산 종류 | 탈아세틸화도(DA, %) | 점도(cP) | |
| 수용성 키토산 | S-1 | 50 | 1 |
| S-2 | 50 | 3 | |
| S-3 | 50 | 5 | |
| S-4 | 50 | 10 | |
| S-5 | 70 | 1 | |
| S-6 | 70 | 3 | |
| S-7 | 70 | 5 | |
| S-8 | 70 | 10 | |
| S-9 | 90 | 1 | |
| S-10 | 90 | 3 | |
| S-11 | 90 | 5 | |
| S-12 | 90 | 10 | |
| 불용성 키토산 | NS-1 | 53 | 8 |
| NS-2 | 60 | 45 | |
| NS-3 | 56 | 70 | |
| NS-4 | 58 | 100 | |
| NS-5 | 77 | 55 | |
| NS-6 | 74 | 65 | |
| NS-7 | 76 | 150 | |
| NS-8 | 95 | 22 | |
| NS-9 | 100 | 8 | |
| NS-10 | 90 | 60 | |
| NS-11 | 96 | 80 | |
수용성/불용성 키토산의 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암 활성을 측정한 결과, 수용성 키토산 5종류(S-2, S-9, S-10, S-11, S-12)와 불용성 키토산 6종류(NS-2, NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11)에서 식품군별 공시균주에 대한 항균활성이 우수하게 나타났으며, S-7, S-10 및 NS-8에서 항산화 활성 및 항돌연변이 효과가 우수하게 나타났고, S-10 및 NS-8에서 항암효과가 우수하게 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 키토산은 50 내지 90%의 탈아세틸화도 및 1 내지 10 cP의 점도를 갖는 수용성 키토산, 및 60 내지 100%의 탈아세틸화도 및 8 내지 80 cP의 점도를 갖는 불용성 키토산을 선별하여 탈아세틸화도와 점도에 따라 규격화하였다.
실시예
2
: 키토산 함유 김치의 제조
2-1. 키토산 재료
수용성/불용성 키토산 중 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암 활성이 가장 우수한 수용성 키토산 S-10(탈아세틸화도 90%, 점도 3cP)과 불용성 키토산 NS-8(탈아세틸화도 95%, 점도 22cP)을 4℃에서 보관하면서 사용하였다.
2-2. 김치 재료
배추는 부산 부전시장, 젓갈은 청정멸치액젓((주)대상), 고춧가루는 영양농협 청결고춧가루 가공공장에서 구입하여 사용하였다. 무, 파, 마늘, 생강은 부산 부전시장에서 구입하였다. 설탕은 백설탕, 소금은 천일염((주)고센)을 사용하였다.
2-3. 김치의 제조
김치는 절인 배추 100 중량부에 대해 고춧가루 3.5 중량부, 마늘 1.4 중량부, 생강 0.6 중량부, 젓갈 2.2 중량부, 파 2.0 중량부, 무 13.0 중량부, 설탕 1.0 중량부의 비율로 혼합하여 표준화 김치의 레시피를 이용하여 제조하였다.
즉, 천일염으로 10% 절임 용액을 제조한 후, 여기에 배추를 넣고 10시간 동안 염절임 하였다. 절인 배추를 수돗물로 3회 씻고 3시간 동안 물기를 뺐다. 수용성 키토산(S-10) 분말과 불용성 키토산(NS-8) 분말을 절인 배추 무게 100 중량부에 대해 1 중량부, 0.5 중량부를 부재료로 사용하여 양념에 섞어 버무렸다. 무와 파는 채 썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어서 버무린 다음 멸치액젓과 마늘 및 생강을 고루 섞은 후 염도는 각각의 소금으로 조절하여 김치를 제조하였다.
실시예
3
: 키토산 함유 절임 용액에 절인 배추를 사용한 김치의 제조
불용성 키토산 NS-8을 아세트산에 녹여 2%의 키토산 용액을 제조하였다. 상기 키토산 용액을 사용하여 키토산 함량이 절임 용액 총 중량에 대해 0.05, 0.15, 0.3, 0.5%가 되게 첨가한 물에 천일염을 가하여 10% 절임 용액을 제조하였다. 상기 키토산 함유 절임 용액에 배추를 넣고 10시간 동안 염절임 하였다. 절인 배추를 수돗물로 3회 씻고 3시간 동안 물기를 뺀 후, 무와 파는 채 썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어서 버무린 다음 멸치액젓과 마늘 및 생강을 고루 섞은 후 염도는 각각의 소금으로 조절하여 김치를 제조하였다.
실시예
4
: 소금에 절인 배추를 키토산 함유
헹굼액에
헹군 후 사용한 김치의 제조
불용성 키토산 NS-8을 아세트산에 녹여 2%의 키토산 용액을 제조하였다. 상기 키토산 용액을 사용하여 키토산 함량이 헹굼액 총 중량에 대해 0.1, 0.2, 0.3, 0.5%가 되게 물을 첨가하여 키토산 함유 헹굼액을 제조하였다. 천일염으로 10% 절임 용액을 제조한 후, 여기에 배추를 넣고 10시간 동안 염절임 하였다. 절인 배추를 수돗물로 2회 씻고 최종 헹굼과정에서 상기 키토산 함유 헹굼액에 3분 동안 헹군 다음 3시간 동안 물기를 뺀 후, 무와 파는 채 썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어서 버무린 다음 멸치액젓과 마늘 및 생강을 고루 섞은 후 염도는 각각의 소금으로 조절하여 김치를 제조하였다.
실시예
5
: 키토산 함유 양념을 사용한 김치의 제조
천일염으로 10% 절임 용액을 제조한 후, 여기에 배추를 넣고 10시간 동안 염절임 하였다. 절인 배추를 수돗물로 3회 씻고 3시간 동안 물기를 뺐다. 수용성 키토산(S-10) 분말과 불용성 키토산(NS-8) 분말을 1:1의 무게비율로 섞은 후, 절인 배추 무게 100 중량부에 대해 0.1, 0.25, 0.5, 1.5 중량부의 키토산을 부재료로 사용하여 양념에 섞어 버무렸다. 무와 파는 채 썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어서 버무린 다음 멸치액젓과 마늘 및 생강을 고루 섞은 후 염도는 각각의 소금으로 조절하여 김치를 제조하였다.
실험예
1
: 항균활성 측정
수용성/불용성 키토산의 항균활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1-1. 균주 및 배지
항균활성 검색을 위한 병원성 미생물 및 부패 미생물로는 9종의 그램 음성균과 6종의 그램 양성균을 사용하였으며, 하기 표 3에 나타내었다. Listeria monocytogenes ATCC 19115, Staphylococcus aureus ATCC 29737, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus ATCC 21366, Aeromonas hydrophila subsp . hydrophila ATCC 7966, Pseudomonas fluorecens ATCC 21541, Proteus vulgaris ATCC 6059, Erwinia carotovora subsp . carotovora ATCC 15390, Lactobacillus curvatus ATCC 25601, Lactobacillus plantrarum ATCC 8014, Serratia marcescens ATCC 990, Escherichia coli ATCC 8739, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802, Vibrio vulnificus ATCC 27562는 한국 미생물 보존센터에서, Salmonella typhimurium ATCC 13311은 유전자 은행에서 분양받아 사용하였다.
배양 배지로는 트립틱 대두 배양액(TSB, Difco, USA)과 브레인 하트 주입액 (Brain Hart Infusion)(BHI, Difco, USA), MRS 배양액(Difco, USA)을 사용하였으며, 키토산의 항균활성을 검색하기 위한 배지로는 뮐러 힌톤 배양액(Muller Hinton broth)(MHB, Merck, Germany)을 사용하였다.
| 균주 | 비고(부패 관련) | |
| 그램 음성균 |
Aeromonas hydrophila subsp . hydrophila ATCC 7966 | 어패류 |
| Pseudomonas fluorecens ATCC 21541 | 육류, 채소류, 어패류 | |
| Proteus vulgaris ATCC 6059 | 육류, 어패류 | |
| Erwinia carotovora subsp . carotovora ATCC 15390 | 채소류 | |
| Serratia marcescens ATCC 990 | 육류, 채소류, 곡류 | |
| Escherichia coli ATCC 8739 | 식중독균 | |
| Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 | 어패류, 식중독균 | |
| Vibrio vulnificus ATCC 27562 | 어패류 | |
| Salmonella typhimurium ATCC 13311 | 육류, 채소류, 식중독균 | |
| 그램 양성균 |
Listeria monocytogenes ATCC 19115 | 육류, 채소류, 식중독균 |
| Staphylococcus aureus ATCC 29737 | 식중독균 | |
| Bacillus subtilis ATCC 6633 | 곡류 | |
| Bacillus cereus ATCC 21366 | 곡류, 식중독균 | |
| Lactobacillus curvatus ATCC 25601 | 채소류 | |
| Lactobacillus plantarum ATCC 8014 | 채소류 | |
1-2. 키토산 종류에 따른 항균활성
본 실험에 사용하기 위해 수용성 키토산은 증류수에, 불용성 키토산은 1% (v/v) 아세트산에 완전히 녹여서 1%(w/v) 농도로 키토산 저장 용액을 제조하였다.
키토산의 항균활성 검색은 페이퍼 디스크 방법(paper disc method)으로 공시균주에 대한 생육저지환(clear zone) 형성 유무를 조사하여 측정하였으며, 사용배지는 MHA에 최종농도가 0.1% 되도록 키토산 저장 용액을 첨가하여 제조하였다. 이때, 불용성 키토산 중 NS-1, NS-3 및 NS-4 키토산은 녹지 않아서 향후 실험에 사용하지 않았다. 본 실험에 사용한 키토산 첨가 배지의 pH는 모두 1N HCl과 1N NaOH를 사용하여 pH 5.9로 보정하였다.
공시균주에 대한 0.1% 수용성 키토산의 항균활성은 표 4에 나타내었고, 공시균주에 대한 0.1% 불용성 키토산의 항균활성은 표 5에 나타내었다.
표 4에 나타난 바와 같이, 0.1% 수용성 키토산의 항균활성은 균주에 따라 다양하게 나타났는데, S-12가 15종의 공시균주 중 13종의 균주에 대해 항균활성을 나타내어 15종의 키토산 중 항균 스펙트럼이 가장 넓었으며, S-10과 S-11도 9종의 균주에 항균활성을 나타내었다. S-2와 S-9가 8균주에 대해 항균활성을 나타내었고, S-3 및 S-4가 7균주에 대해, S-1 및 S-7이 6균주에 대해, S-8이 5균주에 대해, S-5 및 S-6이 4균주에 대해 항균활성을 나타내어 키토산의 종류에 따라 그 항균활성의 정도가 다양하게 나타났다. Proteus vulgaris는 모든 수용성 키토산에 의해서 성장이 억제되었으며, Aeromonas hydrophila, Salmonella typhimurium, Erwinia carotovora도 대부분의 수용성 키토산에 대해서 성장이 억제되었다. Bacillus cereus도 S-8을 제외한 모든 키토산에서 성장이 억제되었다.
또한 표 5에 나타난 바와 같이, 0.1% 불용성 키토산은 모든 공시균주에 대해서 항균활성을 나타내었다. 또한, 동일 농도에서 키토산의 항균활성은 수용성 키토산 보다 불용성 키토산이 월등히 높게 나타났다.
1-3. 병원성 미생물 및 부패 미생물에 대한 키토산의 성장억제 활성
수용성 키토산 중 항균활성이 높게 나타난 S-2, S-9, S-10, S-11, S-12와, 불용성 키토산 중 항균활성이 높게 나타난 NS-2, NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11을 선별하여 공시균주 15종에 대한 성장억제 활성을 조사하였다.
선별된 키토산의 항균력을 조사하기 위하여 1%(w/v) 키토산 저장 용액을 MHB에 첨가하여 최종농도가 수용성 키토산은 0.1%, 불용성 키토산은 0.1%와 0.05%가 되도록 조절한 후 사용하였다. 병원성 미생물은 TSB에서, 유산균은 MRS 배양액에서 각각 2회 계대배양 시킨 공시균주를 키토산 첨가 배지에 0.05㎖씩 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 진탕배양한 후 펩톤수를 이용하여 적정 희석하여 생균수(log No. CFU/㎖)를 측정하였다. 유산균은 MRS agar, Erwinia carotovora subsp . carotovora는 BHI agar, 그 외 부패 미생물과 병원성 미생물은 TSA를 이용하여 주입평판법 (pour plate method)으로 생균수를 측정하였다.
공시균주에 대한 0.1% 수용성 키토산의 성장억제 활성은 표 6에 나타내었고, 공시균주에 대한 0.1% 불용성 키토산의 성장억제 활성은 표 7에 나타내었으며, 공시균주에 대한 0.05% 불용성 키토산의 성장억제 활성은 표 8에 나타내었다.
표 6에 나타난 바와 같이, A. hydrophila는 S-11과 S-12 키토산 첨가구에서 성장이 관찰되지 않았으며, 기타 3종의 키토산은 대조구에 비해 약 4-5 로그 사이클 정도 성장이 억제되었다. 선별된 키토산은 E. carotovora에 강한 항균활성을 나타내었는데 특히, S-2, S-10 및 S-11에서 성장이 관찰되지 않았으며, S-9 및 S-12에서는 약 101 CFU/㎖을 나타내어 대조구에 비해 약 7 로그 사이클 정도 억제되었다. P. fluorecens, V. parahaemolyticus 및 V. vulnificus는 대조구에서 108 CFU/㎖의 균수를 나타내었고, 선별된 키토산에서는 107 CFU/㎖의 균수를 나타내어 대조구에 비해 약 1 로그 사이클 정도 낮은 균수를 나타내어 키토산에 의한 생육억제효과는 매우 낮게 나타났다. B. subtilis는 S-9를 제외한 나머지 키토산에서 균의 성장이 관찰되지 않았으며, S-9에서도 101 CFU/㎖ 이하의 균수를 나타내었다. 또한 B. cereus도 S-9, S-10, S-12에서 101 CFU/㎖ 이하의 균수를 나타내었고, S-2 및 S-11에서는 균성장이 관찰되지 않았다. 유산균주인 L. curvatus는 선별된 키토산 모두에서 성장이 관찰되지 않았으며, L plantarum은 S-11을 제외한 모든 키토산에서 성장이 관찰되지 않아 선별된 키토산의 유산균주에 대해 강한 성장억제 활성을 나타내었다. L. monocytogenes 및 S. aureus의 경우 S-12에서 균성장이 관찰되지 않았으며, 나머지 키토산에서는 107-108 CFU/㎖를 나타내어 대조구와 유사한 균성장을 나타내었으며, 6종의 그램 양성균 중 키토산에 대한 성장억제율이 가장 낮게 나타났다. 상기한 바와 같이, 수용성 키토산의 항균활성은 그램 음성균보다 그램 양성균에 대해서 높게 나타났으며, 수용성 키토산 중 S-12 키토산이 공시균주에 대해서 넓은 항균활성을 나타내었다.
또한 표 7에 나타난 바와 같이, A. hydrophila의 경우 대조구는 108 CFU/㎖를 나타내었고, NS-11은 105 CFU/㎖, NS-2는 104 CFU/㎖를 나타내어 대조구에 비해서 4-5 로그 사이클 정도 성장이 억제되었으며, 나머지 키토산에서도 약 102-103 CFU/㎖의 균수를 나타내어 5-6 로그 사이클 정도의 균성장이 억제되었다. P. vulgaris와 E. carotovora는 배양 24시간 후에 NS-10에서 102 CFU/㎖의 균성장을 나타내었고, NS-10 키토산을 제외한 나머지 키토산에서는 균성장이 관찰되지 않았다. V. vulificus는 NS-5에서 102 CFU/㎖의 균성장을 나타내었고 다른 키토산에서는 균성장이 관찰되지 않았다. L. monocytogenes, S. aureus , P. fluorecens, S. marcescens, E. coli, V. parahaemolyticus, B. subtilis, B. cereus, L. curvatus 및 L. plantarum은 배양 24시간째 모든 키토산에서 균성장이 관찰되지 않았다. 상기한 바와 같이, 불용성 키토산은 그램 양성균과 그램 음성균 모두에서 강한 항균활성을 나타내었으며, 그램 양성균에 대해서 항균활성이 더 높게 나타났다.
A. hydrophila의 경우 수용성 키토산인 S-11, S-12에서 균 성장이 관찰되지 않아 불용성 키토산보다 뛰어난 항균활성을 나타내었으나, 본 실험 결과 전반적으로 동일 농도에서 불용성 키토산이 수용성 키토산에 비해 항균 스펙트럼이 넓었으며, 균 성장 억제도 높게 나타났다.
불용성 키토산의 경우, 0.1% 농도에서 항균활성은 강하게 나타났으나, 키토산 종류에 따른 항균활성 차이가 관찰되지 않았으며, 공시 균주 모두가 6종의 키토산에 대해 성장이 억제되어, 키토산에 따른 미생물의 선별적 항균활성 차이가 관찰되지 않았다.
또한 표 8에 나타난 바와 같이, S. typhymurium의 경우 NS-2, NS-5, NS-8에서 배양 24시간째 108 CFU/㎖로 대조구와 유사한 균수를 나타내었고, NS-11에서는 105 CFU/㎖의 균성장을 나타내었으며, 나머지 키토산에서는 균성장이 관찰되지 않았다. S. marcescens는 배양 24시간째 모든 키토산에서 101-102 CFU/㎖의 균수를 나타내어 대조구에 비해 약 6-7 로그 사이클 정도 성장이 억제되었으나, 키토산 종류에 따른 성장억제도의 차이는 관찰되지 않았다. A. hydrophila도 S. marcescens와 마찬가지로 키토산 종류에 따른 성장 억제도의 차이는 관찰되지 않았으나, 대조구에 비해 약 4 로그 사이클 정도의 균수가 감소하여, 키토산의 종류에 상관없이 성장억제도가 높게 나타났다. 그램 양성균 중에서 L. moncytogenes와 S. aureus는 N-2에서, B. cereus에서는 N-9와 N-10의 키토산에서 101 CFU/㎖ 이하의 균성장을 나타내었을 뿐 다른 키토산에서는 균성장이 관찰되지 않았다. L. curvatus는 101 CFU/㎖ 이하 또는 101 CFU/㎖ 정도의 균성장을 나타내었고, L. plantarum은 NS-11을 제외한 나머지 키토산에서 101-103 CFU/㎖의 균성장을 나타내어, 대조구에 비해서 균성장이 뚜렷히 억제되었으나, 유산균주의 경우 다른 그램 양성균에 비해 키토산의 성장억제 효과는 다소 낮은 경향을 나타내었다. 공시균주에 대한 0.5% 불용성 키토산의 성장억제 효과는 NS-11이 가장 높았으며, 다음은 NS-9가 다소 낮은 효과를 나타내었다. 불용성 키토산의 공시균주에 대한 성장억제 효과는 그램 음성균보다 그램 양성균에서 높게 나타났으며, 그램 양성균에서는 키토산 종류에 따른 성장억제 효과의 차이가 없었으나, 그램 음성균의 경우에는 키토산의 탈아세틸화도가 높을수록 성장억제효과가 높게 나타났다.
1-4. 병원성 미생물 및 부패 미생물에 대한 최소성장저해 농도( Minimum inhibitor concentration ; MIC)
수용성 키토산 중 항균활성이 높게 나타난 S-2, S-9, S-10, S-11, S-12와, 불용성 키토산 중 항균활성이 높게 나타난 NS-2, NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11을 선별하여 공시균주 15종에 대한 최소성장저해 농도를 측정하였다.
수용성 키토산과 불용성 키토산의 공시균주에 대한 최소성장저해 농도를 측정하기 위하여 한천 확산법(agar diffusion method)을 이용하였으며, 공시 균주 각각의 생장 적온에서 72시간 배양한 후, 최소성장저해 농도를 측정하였다.
수용성 키토산의 MIC 측정 결과는 표 9에 나타내었고, 불용성 키토산의 MIC 측정 결과는 표 10에 나타내었다. 또한, 식품군별 고항균 활성도 키토산 규격군은 표 11에 나타내었다.
| 균주 | 부패 관련 식품 | 항균활성이 우수한 키토산 | |
| 그램 음성균 |
Aeromonas hydrophila subsp . hydrophila ATCC 7966 | 어패류 | S-11, S-12, NS-8 |
| Pseudomonas fluorecens ATCC 21541 | 육류, 채소류, 어패류 | NS-8, NS-9, NS-11 | |
| Proteus vulgaris ATCC 6059 | 육류, 어패류 | NS-11 | |
| Erwinia carotovora subsp . carotovora ATCC 15390 | 채소류 | S-11, NS-8, NS-9 | |
| Serratia marcescens ATCC 990 | 육류, 채소류, 곡류 | NS-9 | |
| Escherichia coli ATCC 8739 | 식중독균 | NS-2, NS-9, NS-10 | |
| Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 | 어패류, 식중독균 | NS-8, NS-11 | |
| Vibrio vulnificus ATCC 27562 | 어패류 | NS-8, NS-10, NS-11 | |
| Salmonella typhimurium ATCC 13311 | 육류, 채소류, 식중독균 | NS-8, NS-10 | |
| 그램 양성균 |
Listeria monocytogenes ATCC 19115 | 육류, 채소류, 식중독균 | NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11 |
| Staphylococcus aureus ATCC 29737 | 식중독균 | NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11 | |
| Bacillus subtilis ATCC 6633 | 곡류 | NS-2, NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11 | |
| Bacillus cereus ATCC 21366 | 곡류, 식중독균 | NS-2, NS-5, NS-8, NS-11 | |
| Lactobacillus curvatus ATCC 25601 | 채소류 | S-2, S-11, NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11 | |
| Lactobacillus plantarum ATCC 8014 | 채소류 | S-2, S-9, S-11, NS-5, NS-9, NS-10, NS-11 | |
표 9에 나타난 바와 같이, 공시균주에 대한 수용성 키토산의 MIC 범위는 0.05-0.8%, >0.8%를 나타내었는데, 유산균주의 경우 다른 시험균주에 비해 낮은 MIC를 나타내었다. L. curvatus의 경우 S-2와 S-11에서 0.05%의 MIC를 나타내었고, 나머지 키토산에서는 0.08%의 MIC를 나타내었다. L. plantarum은 S-10에서 0.1%로 가장 높은 MIC를 나타내었으며, S-12가 0.08%, S-2, S-9 및 S-11이 0.05%의 MIC를 나타내었다. B. cereus 및 B. subtilis의 MIC는 0.1-0.3%로, 키토산의 종류에 따라 MIC는 다르게 나타났으나 B. subtilis의 MIC가 B. cereus의 MIC 보다 다소 낮게 나타났다. E. carotovora의 경우 S-11과 S-12의 MIC는 0.08%로 다른 키토산에 비해 매우 낮은 MIC를 나타내었으며, E. carotovora는 그램 음성균 중에서 가장 낮은 MIC를 나타내었다.
또한, 표 10에 나타난 바와 같이, 공시균주에 대한 불용성 키토산의 MIC 범위는 A. hydrophila에서 NS-2, NS-5, P. vulgaris에서 NS-2, E. coli에서 NS-5, Sal. typhimurium에서 NS-2, NS-5, NS-9, NS-11는 >0.1%의 MIC를 나타내었고, 나머지 키토산의 MIC 범위는 0.03-0.1%로 수용성 키토산에 비해 매우 낮은 MIC 값을 나타내었다. 그램 양성균의 MIC 범위는 0.03-0.08%로, 공시균주에 대한 불용성 키토산의 MIC가 대부분 0.05%를 나타내었다. 반면에 그램 음성균의 MIC 범위는 0.05-1% 또는 >1%로 그램 양성균에 비해 넓은 MIC 값을 나타내었으며, 그램 음성균에 대한 불용성 키토산의 MIC는 대부분 0.08%를 나타내어, 불용성 키토산의 MIC도 그램 양성균이 그램 음성균보다 낮게 나타났다.
또한 표 11에 나타난 바와 같이, 수용성 키토산 5종류(S-2, S-9, S-10, S-11, S-12)와 불용성 키토산 6종류(NS-2, NS-5, NS-8, NS-9, NS-10, NS-11)는 식품군별 공시균주에 대하여 우수한 항균활성을 나타내므로, 식품 보존 기간을 향상시켜 어패류, 육류, 채소류에 기인한 부패 및 식중독 예방에 효과적이다.
상기 결과에 의하면, 공시균주에 대한 키토산의 항균활성은 수용성 키토산의 경우 탈아세틸화도가 60% 이상, 불용성 키토산의 경우 탈아세틸화도가 89% 이상일 때, 매우 우수한 항균활성을 나타내었다. 또한, 선별된 키토산의 공시균주에 대한 성장억제 활성 및 최소성장저해 농도가 수용성 키토산 보다 불용성 키토산에서 높았으며, 그램 음성균보다는 그램 양성균에 대해서 효과가 더 높게 나타났다.
실험예
2
: 항산화 활성 측정
수용성/불용성 키토산의 항산화 활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
2-1.
DPPH
(1,1-
디페닐
-2-
피크릴
히드라질) 소거 효과
수용성/불용성 키토산의 DPPH에 대한 전자공여능(electron donating ability)을 Blois 등에 의한 방법에 따라 측정하였다. 메탄올로 희석한 수용성/불용성 키토산(1 mg/㎖, 0.5 mg/㎖) 100㎕를 96 웰 플레이트에 넣은 후 60㎛ DPPH 시액 100㎕를 가하고 실온에서 30분간 정치 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 자유 라디칼에 대한 수용성 키토산의 항산화 효과는 도 1에 나타내었으며, DPPH 자유 라디칼에 대한 불용성 키토산의 항산화 효과는 도 2에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 수용성 키토산 S-9와 S-10은 1 mg/㎖의 농도에서 각각 79%와 74%의 라디칼 소거능을 나타내었고, 저농도인 0.5 mg/㎖의 농도에서도 각각 77%와 72%의 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이들 두 샘플간의 항산화 활성이 농도에 따라 크게 차이가 나지 않는다는 것을 알 수 있다. 하지만 S-4의 샘플은 1 mg/㎖의 농도에서는 83%의 활성을 나타내었지만 0.5 mg/㎖의 농도에서는 48%의 활성을 나타내었다. 이러한 결과에 의해 수용성 키토산이 농도에 따라 항산화 활성의 변화에 영향을 많이 받는다는 것을 알 수 있다. 반면에 불용성 키토산은 농도에 크게 영향을 받지 않고 40~50%대의 항산화 활성을 나타내었다.
2-2. 셀룰러 시스템에서 항산화 실험
1) 세포 종류 및 시약
LLC-PK1(porcine renal epithelial cell)은 ATCC(Solon, Ohio, USA)에서, 배양을 위한 DMEM(Dulbecco's modified Eagal medium)과 FBS(fetal bovine serum)는 Invitogen CO.(Grand Island, NY)에서 구입하여 사용하였다. 산화적 스트레스를 유도하기 위해 사용한 SNP는 Wako(Tokyo, Japan)사 제품을, SIN-1(3-morpholinosydnonimine), AAPH[2,2'-Azobis (2-aminopropane) dihydrochloride], 피로갈롤(pyrogallol), MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide]는 Sigma Chemical Co.(USA)사 제품을 사용하였다.
2) 세포 배양
LLC-PK1 세포는 100 units/㎖의 페니실린-스트렙토마이신(penicilin-streptomycin)과 5%의 FBS가 함유된 DMEM을 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포는 일주일에 2~3회 재급여하고 배양 6~7일경 인산염 완충 용액 (phosphate buffered saline; PBS)으로 1차 세척한 후 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후, 집적된 세포를 배지에 넣고 피펫으로 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 계대 배양시 각각의 통과 횟수(passage number)를 기록하여 통과 횟수가 10회 이상일 때는 새로운 세포를 배양하여 실험하였다.
3) 세포 생존
세포가 집합(confluence) 상태가 되면 96-웰 플레이트에 웰당 1×104 cells/㎖로 식재하여 2시간 배양한 후, 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 퍼옥실 라디칼(LOO-), ONOO-, NO, O2 -의 공여자인 AAPH(10 mM), SIN-1(1 mM), SNP(1.2 mM) 및 피로갈롤(1.2 mM)을 첨가하여 24시간 배양하였다. 산화적 스트레스를 유발한 후, S-10 및 NS-8을 농도별(50, 100, 500, 1000㎍/㎖)로 처리하여 24시간 배양한 뒤 1 mg/㎖의 MTT 용액을 각 웰에 주입하여 37℃에서 4시간 동안 재배양한 후 생성된 포르마잔 결정을 디메틸 술폭사이드(DMSO)에 녹여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다 (Mosmann, 1983).
AAPH를 처리한 LLC-PK1 세포에 대한 수용성 키토산(S-10)과 불용성 키토산 (NS-8)의 항산화 활성을 농도별로 나타낸 결과는 표 12에 나타내었고, SIN-1을 처리한 LLC-PK1 세포에 대한 수용성 키토산(S-10)과 불용성 키토산(NS-8)의 항산화 활성을 농도별로 나타낸 결과는 표 13에 나타내었다.
| 농도(㎍/㎖) | 세포 생존율(%) | |
| 정상구 | - | 100±0.4 |
| AAPH-처리된 대조구 | - | 23.6±1.0 |
| S-10 | 50 | 27.4±1.8 |
| 100 | 46.0±2.2 | |
| 500 | 63.0±2.8 | |
| 1000 | 67.1±1.5 | |
| NS-8 | 50 | 25.1±2.8 |
| 100 | 31.0±1.5 | |
| 500 | 49.8±1.8 | |
| 1000 | 52.1±1.5 |
| 농도(㎍/㎖) | 세포 생존율(%) | |
| 정상구 | - | 100±0.8 |
| SIN-1-처리된 대조구 | - | 20.4±1.5 |
| S-10 | 50 | 39.1±1.8 |
| 100 | 52.8±0.2 | |
| 500 | 68.0±1.8 | |
| 1000 | 72.9±2.5 | |
| NS-8 | 50 | 30.9±1.6 |
| 100 | 44.8±1.4 | |
| 500 | 50.1±0.8 | |
| 1000 | 64.2±1.1 |
표 12에 나타난 바와 같이, AAPH를 처리한 LLC-PK1 세포에 대한 스크리닝 과정을 통하여 선택된 PBS에 녹인 수용성 키토산(S-10)과 1% 아세트산에 녹인 불용성 키토산(NS-8)의 항산화 활성을 농도별로 살펴본 결과, AAPH만을 처리한 대조구의 세포 생존율은 23.6% 이었으나 S-10과 NS-8을 각각 농도별로 처리한 후의 세포 생존율은 농도 의존적으로 상승하였으며, 수용성 키토산의 경우 1000 ㎍/㎖에서 67.1%의 세포 생존율을 나타내었고, 대조구와 비교할 때 증가하였다. 따라서 수용성/불용성 키토산은 AAPH에 의한 LLC-PK1 세포의 산화적 스트레스에 대하여 우수한 개선 효과를 나타내었으며, 특히 수용성 키토산이 불용성 키토산보다 더 우수한 항산화 활성을 나타내었다.
또한 표 13에 나타난 바와 같이, SIN-1만을 처리한 대조구는 산화적 스트레스에 의한 세포 손상으로 세포 생존율이 20.4%로 감소한 반면, S-10 및 NS-8 키토산을 농도별로 처리한 후의 세포 생존율은 농도 의존적으로 증가하여 1000 ㎍/㎖ 처리 시 각각 72.9%와 64.2%로 나타났다. 이는 ONOO-에 대한 직접적인 소거능을 통해 산화적 스트레스에 개선 효과를 나타낸 것으로 사료된다.
실험예
3
:
항돌연변이
효과 측정
수용성/불용성 키토산 및 키토산 함유 김치의 항돌연변이 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1-1. 시약 및 균주
D-비오틴, L-히스티딘·HCl(모노하이드레이트), D-글루코오스-6-포스페이트 (모노나트륨 염)와 NADP(나트륨 염)는 Sigma Chemical Co.(USA)에서 구입하였으며, 박토 영양 배양액(탈수된)과 비텍 아가(Bitek agar)는 Difco Laboratories (USA)로부터 구입하였다. 또한 돌연변이 유발원으로는 직접돌연변이원인 MNNG(4-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 Aldrich Chemical Co.(USA)로부터 구입하여 멸균 증류수에 녹여 실험에 사용하였고, 간접돌연변이원인 AFB1(아플라톡신 B1)을 Sigma Chemical Co.(St. Lous, MO, USA)에서 구입하여 DMSO에 녹여서 사용하였다.
실험에 사용한 균주는 Salmonella typhimurium TA100으로 미국 캘리포니아 대학의 Ames, B.N. 박사로부터 제공받아 사용하였다. 그리고 이들 균주는 실험 직전에 히스티딘 요구성, 딥러프(deep rough)(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이, R-인자 등의 유전형질을 확인하여 사용하였다.
김치 시료는 상기 실시예 2에서 제조한 키토산 함유 김치의 초기 김치와 적숙기 김치(pH 4.3)를 녹즙기(NUC, 한국)로 착즙하여 제조한 즙액 시료와 메탄올 추출물의 두 종류를 사용하여 실험하였다. 즙액 시료는 즙액으로 모은 뒤 4℃, 9000rpm에서 15분간 원심분리하여 채취한 상등액을 milipore filter(0.20㎛)로 여과 제균한 후 시료로 사용하였다. 메탄올 추출물은 초기 및 pH 4.3의 적숙기까지 발효시킨 각각의 키토산 김치를 채취하여 동결건조한 후 시료를 마쇄하여 분말로 조제하고 분말시료에 20배(w/v)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 2회 반복하여 여과한 후 회전식 진공 농축기로 농축하여 얻었다. 추출물은 DMSO에 희석하여 실험에 사용하였다.
1-2.
직접돌연변이원(MNNG)에
대한
항돌연변이
효과
0.5㎖의 인산 완충액(직접 돌연변이원)에 하룻밤 배양한 균주(1~2×109 cells/㎖) 0.1㎖, 희석 시료 50㎕와 돌연변이 유발물질 50㎕를 얼음욕조에 담긴 캡 튜브(cap tube)에 첨가하여 가볍게 볼텍싱하고, 37℃에서 30분 동안 예비 배양하였다. 여기에 45℃의 탑 아가(히스티딘/비오틴 용액) 2㎖를 예비 배양한 각 튜브에 붓고 3초간 볼텍싱하여 최소평판배지(minimal glucose agar plate)에 도말하고 37℃에서 48시간 배양한 후 복귀 돌연변이체(revertant) 숫자를 계수하였다. 돌연변이 억제율(inhibition rate)은 수학식 1에 의해 계산하였다.
Salmonella typhimurium TA100에서 직접돌연변이원인 MNNG(0.4㎍/plate)에 의해 유발된 돌연변이에 대한 수용성 키토산 및 불용성 키토산의 항돌연변이 효과는 각각 표 14 및 표 15에 나타내었으며, 키토산 함유 김치의 메탄올 추출물의 항돌연변이 효과는 표 16 및 도 3에 나타내었다.
※ a : 돌연변이원에 의해 유도된 복귀돌연변이수,
b : 시료를 처리하였을 때의 복귀돌연변이 수,
c : 돌연변이원과 시료가 없을 경우의 자연복귀돌연변이의 수.
| 복귀돌연변이수/플레이트 | 복귀돌연변이수/플레이트 | |||
| 1.25㎎/plate | 억제율(%) | 2.5㎎/plate | 억제율(%) | |
| 대조구(MNNG) | 1178±33 | - | 1178±33 | - |
| MNNG + S-1 | 989±14 | 17 | 659±42 | 46 |
| MNNG + S-2 | 886±14 | 26 | 730±42 | 40 |
| MNNG + S-3 | 906±80 | 24 | 827±28 | 31 |
| MNNG + S-4 | 968±28 | 19 | 750±34 | 38 |
| MNNG + S-5 | 759±49 | 37 | 623±21 | 49 |
| MNNG + S-6 | 669±28 | 45 | 605±42 | 51 |
| MNNG + S-7 | 558±28 | 52 | 555±28 | 55 |
| MNNG + S-8 | 912±17 | 24 | 867±42 | 27 |
| MNNG + S-9 | 755±55 | 37 | 707±47 | 42 |
| MNNG + S-10 | 1024±20 | 14 | 560±28 | 55 |
| MNNG + S-11 | 1057±70 | 11 | 710±14 | 41 |
| MNNG + S-12 | 744±30 | 38 | 611±16 | 50 |
※ 플레이트당 자연복귀돌연변이의 수 : 47±9
| 복귀돌연변이수/플레이트 | 복귀돌연변이수/플레이트 | |||
| 1.25㎎/plate | 억제율(%) | 2.5㎎/plate | 억제율(%) | |
| 대조구(MNNG) | 1178±33 | - | 1178±33 | - |
| MNNG + NS-1 | 873±41 | 27 | 556±20 | 55 |
| MNNG + NS-2 | 764±30 | 37 | 665±70 | 45 |
| MNNG + NS-3 | 829±35 | 31 | 635±28 | 48 |
| MNNG + NS-4 | 1004±60 | 15 | 714±42 | 41 |
| MNNG + NS-5 | 586±22 | 52 | 552±20 | 55 |
| MNNG + NS-6 | 926±28 | 22 | 756±28 | 37 |
| MNNG + NS-7 | 806±28 | 33 | 604±31 | 51 |
| MNNG + NS-8 | 414±59 | 68 | 383±50 | 70 |
| MNNG + NS-9 | 733±42 | 39 | 645±28 | 47 |
| MNNG + NS-10 | 623±33 | 49 | 593±47 | 52 |
| MNNG + NS-11 | 859±28 | 28 | 707±10 | 42 |
※ 플레이트당 자연복귀돌연변이의 수 : 47±9
| 복귀돌연변이수/플레이트 | 복귀돌연변이수/플레이트 | ||||
| 1.25㎎/plate | 억제율(%) | 2.5㎎/plate | 억제율(%) | ||
| 대조구(MNNG) | 1031±102 | - | 1031±102 | - | |
| MNNG + 표준화 김치 | 629±57 | 41 | 458±49 | 58 | |
| MNNG + | 1% S-10 함유 김치 | 468±85 | 57 | 272±129 | 77 |
| 1% NS-8 함유 김치 | 402±30 | 64 | 275±11 | 77 | |
| MNNG + |
0.5% S-10 함유 김치 | 527±57 | 51 | 353±32 | 69 |
| 0.5% NS-8 함유 김치 | 575±15 | 46 | 426±76 | 61 | |
※ 플레이트당 자연복귀돌연변이의 수 : 44±6
표 14 및 표 15에 나타난 바와 같이, 수용성 키토산은 1.25 ㎎/plate의 낮은 농도보다 2.5 ㎎/plate의 높은 농도에서 항돌연변이 효과가 높게 나타났다. 수용성 키토산을 2.5 ㎎/plate 농도로 처리하였을 때 S-7는 55%의 항돌연변이 효과를 보인 반면, S-10은 첨가 농도에 따라 농도 의존적으로 더 높은 항돌연변이 효과를 나타내었다. 수용성 키토산 중에서는 S-7과 S-10의 항돌연변이 효과가 55%로 가장 높았고, 불용성 키토산 중에서는 NS-8이 억제율 70%로 항돌연변이 효과가 가장 높게 나타났다. 대부분의 수용성/불용성 키토산은 농도가 증가함에 따라 항돌연변이 효과도 유의적으로 증가하였다. 또한, 수용성/불용성 키토산은 탈아세틸화가 클수록, 점도가 작아질수록 항돌연변이 효과가 증가되었다. 이 실험은 23가지의 키토산을 스크리닝하는 중요한 근거자료를 제공해주고 있다.
또한 표 16 및 도 3에 나타난 바와 같이, 불용성 키토산 NS-8을 1% 첨가한 김치를 1.25 ㎎/plate 농도로 처리하였을 때 64%의 항돌연변이 효과를 나타내었으며, 이는 표준화 김치의 항돌연변이 효과(41%)보다 높았다. 또한 키토산 함유 김치를 2.5 ㎎/plate의 농도로 처리하였을 때 수용성 키토산 S-10을 1% 첨가한 김치와 불용성 키토산 NS-8을 1% 첨가한 김치는 77%의 항돌연변이 효과를 나타내어 가장 높았다. 이 또한 표준화 김치의 항돌연변이 효과(58%)보다 높았다. 따라서, 수용성/불용성 키토산 첨가 김치는 표준화 김치보다 항돌연변이 효과가 높은 것을 알 수 있다. 또한, 수용성 키토산 S-10을 첨가한 김치에 비하여 불용성 키토산 NS-8을 첨가한 김치가 항돌연변이 효과가 높았고, 0.5%의 키토산을 첨가한 김치보다 1%의 키토산을 첨가한 김치가 항돌연변이 효과가 높게 나타났다.
1-3.
간접돌연변이원(MNNG)에
대한
항돌연변이
효과
간접 돌연변이원을 활성화시키기 위하여, 마론(Maron)과 에임스(Ames)의 방법에 따라 간의 마이크로솜 효소 혼합물(microsomal enzyme mixture)인 S9 혼합물을 조제하였다. 약 200g의 웅성 스프라구-돌리 랫트의 간 효소 유발을 위하여 폴리클로리네이트 비페닐(PCB) 혼합물인 아로클로르(Aroclor) 1254를 옥수수유 1㎖당 200㎎의 농도로 희석하여 1회 복강주사하고(500 ㎎/㎏) 5일 후에 간을 적출하였다. 4℃ 무균 상태에서 적출한 간을 0.15M KCl로 수회 세척하고 간 무게의 3배량의 0.15M KCl 용액을 가하여 균질화기(Potter-Elvehiem apparatus, USA)에서 균질화 하였다. 이것을 9,000 xg에서 10분간 원심분리하여 상등액인 S9 분획을 얻었으며, 크리오관(cryo tube)에 1~2㎖씩 분주하여 드라이 아이스에서 급속동결한 후 -180℃ 액체질소탱크에 보관하면서 실험에 사용하였다. 상기 S9 분획(10%)을 MgCl-KCl 염 (2%), 1M 글루코오스-6-포스페이트(0.5%), 1M NADP(4%), 0.2M 인산염 완충액(pH 7.4) 및 멸균수와 혼합하여 S9 혼합물을 조제하였다.
상기 1-2에서 인산 완충액(직접 돌연변이원) 대신 S9 혼합물(간접 돌연변이원)을 사용한 것을 제외하고는 상기 1-2의 방법과 동일하게 하여 실험하였다.
Salmonella typhimurium TA100에서 간접돌연변이원인 AFB1(0.5㎍/plate)에 의해 유발된 돌연변이에 대한 키토산 함유 김치의 메탄올 추출물의 항돌연변이 효과는 표 17 및 도 4에 나타내었다.
| 복귀돌연변이수/플레이트 | 복귀돌연변이수/플레이트 | ||||
| 1.25㎎/plate | 억제율(%) | 2.5㎎/plate | 억제율(%) | ||
| 대조구(AFB1) | 787±67 | - | 787±67 | - | |
| AFB1 + 표준화 김치 | 403±52 | 53 | 232±45 | 77 | |
| AFB1 + | 1% S-10 함유 김치 | 330±28 | 63 | 160±30 | 87 |
| 1% NS-8 함유 김치 | 305±28 | 59 | 125±35 | 78 | |
| AFB1 + | 0.5% S-10 함유 김치 | 365±105 | 67 | 225±38 | 92 |
| 0.5% NS-8 함유 김치 | 381±27 | 56 | 164±23 | 86 | |
※ 플레이트당 자연복귀돌연변이의 수 : 66±15
표 17 및 도 4에 나타난 바와 같이, 1.25 ㎎/plate의 낮은 농도에서 불용성 키토산 NS-8을 0.5% 첨가한 김치가 억제율 67%로 항돌연변이 효과가 가장 높게 나타났으며, 수용성 키토산 S-10을 1% 첨가한 김치는 63%의 억제율을 나타내었다. 이는 표준화 김치의 항돌연변이 효과(53%)보다도 높았다. 키토산 첨가 김치를 2.5 ㎎/plate 농도로 처리하였을 때 수용성 키토산 S-10을 0.5% 첨가한 김치는 92%의 억제율로 항돌연변이 효과가 매우 크게 나타났으며, 수용성 키토산 S-10을 1% 첨가한 김치는 87%의 억제율을 나타내었다. 이는 표준화 김치의 항돌연변이 효과(77%)보다 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 수용성/불용성 키토산을 첨가한 김치는 간접돌연변이원인 AFB1에 대한 항돌연변이 효과에서도 MNNG에서 보인 항돌연변이 효과와 유사한 경향을 나타내었다.
실험예
4
: 항암 활성 측정
수용성/불용성 키토산 및 키토산 함유 김치의 항암 활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
4-1. 세포배양
세포배양을 위해 RPMI 1640, FBS, 0.05% 트립신-0.02% EDTA 및 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신은 GIBCO사(USA)로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양은 5% CO2 배양기(Forma, model MCO96, Japan)를 사용하여 실험하였다. AGS 인체 위암세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell), HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon adenocarcinoma cell)는 한국세포주은행(서울의대)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다.
AGS 인체 위암세포 및 HT-29 인체 결장암세포는 100 units/㎖의 페니실린-스트렙토마이신과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 재급여하고 6~7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포를 배지에 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75㎖ 세포배양 플라스크에 10㎖씩 일정 수 분할하여 주입하고 계속 6~7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대배양시 각각의 통과 횟수를 기록하였고, 통과 횟수가 10회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체 질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.
4-2.
MTT
assay
상기 배양된 암세포를 96 웰 플레이트에 웰당 1×104 cells/㎖가 되도록 180㎕씩 분주하고 시료를 농도별로 20㎕씩 첨가한 다음, 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 여기에, 인산생리식염수에 5㎎/㎖의 농도로 제조한 MTT (Sigma, USA) 용액 20㎕를 첨가하고 동일한 배양조건에서 4시간 동안 더 배양하였다. 10분 동안 2000rpm에서 원심분리한 후 상층액을 버리고, DMSO 150㎕를 가한 다음 30분 동안 플레이트를 흔들어 주었다. 이때 생성된 포르마잔 결정을 DMSO에 녹여 ELISA 판독기로 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성율(%)은 수학식 2로 계산하였다.
수용성 키토산의 AGS 인체위암세포에 대한 성장억제 효과는 표 18에 나타내었고, 수용성 키토산의 HT-29 인체 결장암세포에 대한 성장억제 효과는 표 19에 나타내었으며, 불용성 키토산의 HT-29 인체 결장암세포에 대한 성장억제 효과는 표 20에 나타내었다. 또한, 키토산 함유 김치의 메탄올 추출물의 AGS 인체위암세포에 대한 성장억제 효과는 표 21에 나타내었으며, 키토산 함유 김치의 메탄올 추출물의 HT-29 인체 결장암세포에 대한 성장억제 효과는 표 22에 나타내었다.
| OD540(㎎/㎖) | OD540(㎎/㎖) | |||
| 2㎎/㎖ | 억제율(%) | 5㎎/㎖ | 억제율(%) | |
| 대조구 | 0.531±0.004 | - | 0.531±0.004 | - |
| S-1 | 0.484±0.012 | 9 | 0.466±0.015 | 12 |
| S-2 | 0.480±0.006 | 9 | 0.384±0.017 | 28 |
| S-3 | 0.484±0.013 | 9 | 0.421±0.016 | 21 |
| S-4 | 0.495±0.012 | 7 | 0.411±0.013 | 23 |
| S-5 | 0.461±0.008 | 13 | 0.332±0.031 | 37 |
| S-6 | 0.460±0.011 | 13 | 0.370±0.047 | 30 |
| S-7 | 0.453±0.020 | 15 | 0.413±0.013 | 22 |
| S-8 | 0.457±0.011 | 14 | 0.353±0.026 | 33 |
| S-9 | 0.489±0.006 | 8 | 0.460±0.079 | 13 |
| S-10 | 0.491±0.035 | 8 | 0.064±0.004 | 88 |
| S-11 | 0.488±0.007 | 8 | 0.445±0.021 | 16 |
| S-12 | 0.494±0.008 | 7 | 0.426±0.032 | 20 |
| OD540(㎎/㎖) | OD540(㎎/㎖) | |||
| 1㎎/㎖ | 억제율(%) | 5㎎/㎖ | 억제율(%) | |
| 대조구 | 0.519±0.007 | - | 0.525±0.006 | - |
| S-1 | 0.506±0.002 | 3 | 0.505±0.001 | 4 |
| S-2 | 0.488±0.007 | 6 | 0.413±0.028 | 21 |
| S-3 | 0.480±0.020 | 7 | 0.351±0.019 | 33 |
| S-4 | 0.492±0.015 | 5 | 0.390±0.011 | 26 |
| S-5 | 0.439±0.006 | 15 | 0.388±0.005 | 26 |
| S-6 | 0.420±0.009 | 19 | 0.366±0.005 | 30 |
| S-7 | 0.416±0.008 | 20 | 0.298±0.009 | 43 |
| S-8 | 0.417±0.028 | 20 | 0.293±0.028 | 44 |
| S-9 | 0.476±0.003 | 8 | 0.469±0.004 | 11 |
| S-10 | 0.498±0.013 | 4 | 0.332±0.006 | 37 |
| S-11 | 0.499±0.003 | 4 | 0.489±0.002 | 7 |
| S-12 | 0.492±0.005 | 5 | 0.476±0.011 | 9 |
| OD540(㎎/㎖) | ||
| 1㎎/㎖ | 억제율(%) | |
| 대조구 | 0.461±0.009 | - |
| NS-2 | 0.459±0.003 | 0.4 |
| NS-5 | 0.460±0.023 | 0.1 |
| NS-6 | 0.379±0.014 | 18 |
| NS-7 | 0.457±0.009 | 1 |
| NS-8 | 0.078±0.001 | 83 |
| NS-9 | 0.081±0.002 | 83 |
| NS-10 | 0.382±0.040 | 17 |
| NS-11 | 0.412±0.018 | 11 |
| OD540(㎍/㎖) | OD540(㎍/㎖) | |||
| 100㎍/㎖ | 억제율(%) | 200㎍/㎖ | 억제율(%) | |
| 표준화 김치 | 0.397±0.023 | 24 | 0.326±0.040 | 38 |
| 1% S-10 함유 김치 | 0.375±0.046 | 29 | 0.178±0.026 | 66 |
| 1% NS-10 함유 김치 | 0.303±0.042 | 42 | 0.058±0.002 | 89 |
| 0.5% S-10 함유 김치 | 0.330±0.032 | 37 | 0.221±0.018 | 58 |
| 0.5% NS-10 함유 김치 | 0.391±0.036 | 25 | 0.264±0.012 | 50 |
| OD540(㎍/㎖) | OD540(㎍/㎖) | |||
| 100㎍/㎖ | 억제율(%) | 200㎍/㎖ | 억제율(%) | |
| 표준화 김치 | 0.395±0.019 | 21 | 0.341±0.008 | 32 |
| 1% S-10 함유 김치 | 0.349±0.012 | 30 | 0.246±0.024 | 47 |
| 1% NS-10 함유 김치 | 0.388±0.018 | 22 | 0.187±0.017 | 63 |
| 0.5% S-10 함유 김치 | 0.426±0.012 | 15 | 0.288±0.022 | 42 |
| 0.5% NS-10 함유 김치 | 0.390±0.015 | 22 | 0.279±0.021 | 44 |
표 18에 나타난 바와 같이, 수용성/불용성 키토산의 AGS 인체위암세포에 대한 항암효과는 5㎎/㎖의 높은 농도에서 S-10이 가장 높은 항암효과를 보였고 농도가 증가함에 따라 항암효과도 8~88%로 가파르게 증가하였다.
또한 표 19 및 표 20에 나타난 바와 같이, HT-29 인체 결장암세포에서도 AGS 인체 위암 세포와 비슷한 경향을 보여, 1㎎/㎖의 낮은 농도의 키토산에서보다 5㎎/㎖의 높은 농도의 키토산에서 항암효과가 높게 나타났다. 수용성 키토산인 S-7, S-8은 43~44%의 가장 높은 항암효과를 나타내었으며, 불용성 키토산인 NS-8과 NS-9는 83%의 매우 높은 항암활성을 나타내었다.
또한 표 21에 나타난 바와 같이, 키토산 함유 김치의 메탄올 추출물의 AGS 인체위암세포에 대한 암세포 성장 억제 효과는 높은 농도(200 ㎍/㎖)에서 1% S-10 함유 김치와 1% NS-8 함유 김치의 경우 각각 66%와 89%로 표준화 김치(38%)보다 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 또한 표 22에 나타난 바와 같이, 키토산 함유 김치의 메탄올 추출물의 HT-29 인체 결장암세포에 대한 암세포 성장 억제 효과는 높은 농도(200 ㎍/㎖)에서 1% S-10 함유 김치와 1% NS-8 함유 김치의 경우 각각 47%와 63%로 표준화 김치(32%)보다 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 상기한 바와 같이, 불용성 키토산을 첨가한 김치가 수용성 키토산을 첨가한 김치보다 항암효과가 더 우수하게 나타남을 알 수 있다.
실험예
5
: 키토산 함유 김치의 저장안정성 검증
본 발명에 따른 키토산 함유 김치의 저장안정성을 확인하기 위하여, 김치를 4~15℃에서 발효시키면서 5일마다 발효특성을 관찰하였다.
5-1. 김치 발효 중
pH
및 산도의 변화 측정
시료는 상기 실시예 2 내지 5에서 제조한 키토산 함유 김치를 녹즙기(NUC, 한국)로 착즙하여 이용하였다. pH는 pH 미터(Corning 220, USA)로 실온에서 측정하였다. 산도는 시료 20㎖를 증류수로 20배 희석한 후, 여기에서 10㎖를 취하여 AOAC방법으로 측정하였다. 이때 0.1% 페놀프탈레인을 지시약으로 1㎖ 첨가하고 0.1N NaOH로 적정하여 분홍색을 띄는 점을 종말점으로 하였다. 적정값은 수학식 3을 이용하여 락트산으로 환산하고 함량 %로 나타내었다.
15℃에서 발효된 수용성/불용성 키토산 함유 김치(실시예 2)의 pH 및 산도의 변화는 표 23에 나타내었으며, 4℃에서 발효된 키토산 함유 절임 용액에 절인 배추를 사용하여 제조한 김치(실시예 3)의 pH 및 산도의 변화는 표 24에 나타내었으며, 4℃에서 발효된 소금에 절인 배추를 키토산 함유 헹굼액에 헹군 후 제조한 김치(실시예 4)의 pH 및 산도의 변화는 표 25에 나타내었고, 4℃에서 발효된 키토산 함유 양념을 사용하여 제조한 김치(실시예 5)의 pH 및 산도의 변화는 표 26에 나타내었다.
| 발효기간 | 대조구 (표준화 김치) |
키토산 함유 김치 | |||||
| S-10 | NS-8 | ||||||
| 1% | 0.5% | 1% | 0.5% | ||||
| pH | 1 | 5.50 | 6.11 | 5.88 | 6.34 | 6.22 | |
| 3 | 4.29 | 4.99 | 4.52 | 4.32 | 4.14 | ||
| 5 | 3.85 | 4.08 | 3.96 | 3.99 | 3.89 | ||
| 7 | 3.71 | 3.91 | 3.81 | 3.84 | 3.73 | ||
| 산도(%) | 1 | 0.30 | 0.38 | 0.31 | 0.18 | 0.18 | |
| 3 | 0.84 | 0.91 | 0.82 | 0.81 | 0.87 | ||
| 5 | 1.08 | 1.38 | 1.30 | 1.11 | 1.09 | ||
| 7 | 1.05 | 1.14 | 1.22 | 1.06 | 1.03 | ||
| 발효기간 | 대조구 (표준화 김치) |
키토산 함유 절임 용액에 절인 배추를 사용하여 제조한 김치 | ||||
| 0.05% | 0.15% | 0.3% | 0.5% | |||
| pH | 0 | 5.49 | 5.41 | 5.19 | 5.11 | 4.81 |
| 5 | 5.77 | 5.95 | 5.61 | 5.39 | 5.17 | |
| 10 | 4.30 | 5.27 | 5.42 | 5.14 | 4.71 | |
| 15 | 4.13 | 4.31 | 4.30 | 4.44 | 4.80 | |
| 20 | 4.01 | 4.15 | 4.14 | 4.21 | 4.75 | |
| 25 | 4.00 | 4.12 | 4.10 | 4.24 | 4.89 | |
| 30 | 4.02 | 4.09 | 4.10 | 4.10 | 4.60 | |
| 35 | 3.96 | 4.09 | 4.10 | 4.16 | 4.37 | |
| 산도(%) | 0 | 0.287 | 0.301 | 0.306 | 0.319 | 0.396 |
| 5 | 0.216 | 0.235 | 0.259 | 0.279 | 0.316 | |
| 10 | 0.720 | 0.351 | 0.348 | 0.356 | 0.347 | |
| 15 | 0.965 | 0.776 | 0.735 | 0.562 | 0.383 | |
| 20 | 1.004 | 0.779 | 0.745 | 0.594 | 0.402 | |
| 25 | 1.046 | 0.883 | 0.829 | 0.677 | 0.386 | |
| 30 | 1.057 | 0.956 | 0.897 | 0.744 | 0.468 | |
| 35 | 1.198 | 1.134 | 1.067 | 0.902 | 0.766 | |
| 발효기간 | 대조구 (표준화 김치) |
소금에 절인 배추를 키토산 함유 헹굼액에 헹군 후 제조한 김치 | ||||
| 0.1% | 0.2% | 0.3% | 0.5% | |||
| pH | 0 | 5.49 | 5.36 | 5.35 | 5.26 | 5.14 |
| 5 | 5.77 | 5.80 | 6.03 | 5.67 | 5.58 | |
| 10 | 4.30 | 4.93 | 5.25 | 4.82 | 5.23 | |
| 15 | 4.13 | 4.26 | 4.25 | 4.21 | 4.46 | |
| 20 | 4.01 | 4.11 | 4.05 | 4.08 | 4.15 | |
| 25 | 4.00 | 4.12 | 4.07 | 4.13 | 4.16 | |
| 30 | 4.02 | 4.13 | 4.05 | 4.08 | 4.10 | |
| 35 | 3.96 | 4.11 | 4.06 | 4.17 | 4.11 | |
| 산도(%) | 0 | 0.287 | 0.288 | 0.294 | 0.301 | 0.401 |
| 5 | 0.216 | 0.243 | 0.223 | 0.225 | 0.267 | |
| 10 | 0.720 | 0.402 | 0.365 | 0.461 | 0.417 | |
| 15 | 1.035 | 0.978 | 0.906 | 0.858 | 0.722 | |
| 20 | 1.004 | 0.857 | 0.783 | 0.780 | 0.724 | |
| 25 | 1.046 | 1.015 | 0.981 | 0.891 | 0.884 | |
| 30 | 1.057 | 0.925 | 0.906 | 0.897 | 0.815 | |
| 35 | 1.198 | 0.861 | 1.235 | 1.156 | 1.118 | |
| 발효기간 | 대조구 (표준화 김치) |
키토산 함유 양념을 사용하여 제조한 김치 | ||||
| 0.1% | 0.25% | 0.5% | 1.5% | |||
| pH | 0 | 5.49 | 5.36 | 5.65 | 5.31 | 5.42 |
| 5 | 5.77 | 6.00 | 6.22 | 6.08 | 6.07 | |
| 10 | 4.30 | 5.55 | 4.86 | 4.34 | 5.69 | |
| 15 | 4.13 | 4.33 | 4.22 | 4.11 | 4.24 | |
| 20 | 4.01 | 4.14 | 4.10 | 3.97 | 4.10 | |
| 25 | 4.00 | 4.18 | 4.04 | 4.05 | 4.11 | |
| 30 | 4.02 | 4.09 | 3.99 | 4.02 | 4.06 | |
| 35 | 3.96 | 4.10 | 4.06 | 4.07 | 4.09 | |
| 산도(%) | 0 | 0.287 | 0.298 | 0.261 | 0.278 | 0.262 |
| 5 | 0.216 | 0.360 | 0.317 | 0.305 | 0.301 | |
| 10 | 0.720 | 0.362 | 0.487 | 0.538 | 0.332 | |
| 15 | 1.035 | 0.723 | 0.730 | 0.854 | 0.837 | |
| 20 | 1.004 | 0.758 | 0.864 | 0.697 | 0.864 | |
| 25 | 1.046 | 0.861 | 0.833 | 0.810 | 0.750 | |
| 30 | 1.057 | 0.816 | 0.887 | 0.735 | 0.752 | |
| 35 | 1.198 | 1.152 | 0.855 | 0.805 | 1.267 | |
표 23에 나타난 바와 같이, 김치를 담근 직후의 pH 변화를 보면 불용성 키토산을 첨가한 김치가 현저하게 높은 pH를 유지하였다. 발효가 진행됨에 따라 표준화 김치의 발효 속도보다 키토산을 첨가한 김치의 발효 속도가 늦었으며, 7일째의 pH를 보면 1% S-10을 첨가한 김치가 3.91인데 반해 표준화 김치의 pH는 3.71로 낮았으며, 농도가 낮을수록 pH가 낮았고, 0.5% NS-8을 첨가한 김치의 pH는 3.73으로 표준화 김치와 거의 유사하였다. 4일째인 적숙기를 지나면서 키토산을 첨가한 김치는 더욱 빨리 발효가 진행되었으며 발효 7일째가 되면 pH는 비슷한 값을 나타내었다. 또한, 산도의 변화에서도 처음에는 불용성 키토산 함유 김치의 산도가 수용성 키토산 함유 김치의 산도보다 현저히 낮았으나, 발효가 진행됨에 따라 산도 변화는 비슷하게 나타났다. 상기한 바와 같이, 발효의 초반부에 키토산의 첨가로 인하여 김치의 발효 속도가 늦어지게 되는데, 이는 키토산이 초기 발효를 억제하는 효과가 있는 것으로 생각된다.
또한 표 24에 나타난 바와 같이, 배추를 절이는 소금물에 키토산 농도가 0.05%, 0.15%, 0.3%, 0.5%로 증가함에 따라 pH의 감소가 천천히 이루어졌다. 0.3%의 키토산 함유 절임 용액에 절인 배추를 사용하여 제조한 김치의 경우, 발효 15~25일째 동안 pH 4.2~4.4, 산도 0.6~0.7%를 유지하였으며, 0.5%의 키토산 함유 절임 용액에 절인 배추를 사용하여 제조한 김치의 경우 35일 이후에야 비로소 적숙기에 도달하였고, 35일째가 되어도 pH가 4.0 이하로 감소하지 않았다. 이는 표준화 김치의 발효양상과 비교할 때 저장성이 증가되어 가식기간이 길어지게 됨을 알 수 있다. 반면, 0.05% 및 0.15%의 키토산 함유 절임 용액에 절인 배추를 사용하여 제조한 김치의 경우는 표준화 김치와 비슷한 시기에 적숙기에 도달하였다.
또한 표 25에 나타난 바와 같이, 소금에 절인 배추를 키토산 함유 헹굼액에 헹군 후 제조한 김치도 15일에 적숙기에 도달한 것으로 보아, 표준화 김치보다 저장성이 증가됨을 알 수 있다. 그러나, 키토산 첨가 농도 간에는 차이를 보이지 않았다.
또한 표 26에 나타난 바와 같이, 수용성/불용성 키토산 함유(0.1, 0.25, 1.5%) 양념을 사용하여 제조한 김치는 15일에 적숙기로 도달하였으며, 0.5%의 수용성/불용성 키토산을 함유한 양념을 사용하여 제조한 김치는 표준화 김치와 같이 10일째 적숙기(pH 4.34)에 도달한 것을 확인하였다. 산도도 pH와 유사한 경향을 나타내었으며, 수용성/불용성 키토산 함유 양념을 사용하여 제조한 김치가 표준화 김치보다 저장성이 증가됨을 알 수 있다. 그러나, 키토산 첨가 농도 간에는 차이를 보이지 않았다.
상기 pH와 산도의 변화를 관찰한 결과, 키토산 함유 절임 용액에 절여진 배추를 이용하여 제조한 김치가 소금에 절인 배추를 키토산 함유 헹굼액에 헹군 후 제조한 김치와 수용성/불용성 키토산 함유 양념을 사용하여 제조한 김치에 비해 저장성 및 보존성이 가장 우수하게 나타났다.
상기한 바와 같이, 키토산 함유 김치는 키토산이 김치의 발효를 천천히 이루어지게 하여 그 저장성 및 보존성을 증가시키는 역할을 함으로써, 표준화 김치에 비해 적숙기에 도달하는 기간이 길어 발효가 천천히 일어나게 되며, 이로써 저장안정성이 우수하여짐을 알 수 있다.
5-2. 김치 발효 중 젖산균 수의 측정
상기 실시예 2 내지 5에서 제조한 키토산 함유 김치가 김치 젖산균인 Leuconostoc sp.와 Lactobacillus sp.의 성장에 미치는 영향을 관찰하였다.
김치는 발효 초기에 Leuconostoc sp. 젖산균이 생성되면서 김치의 맛과 풍미를 좋게 할 뿐만 아니라 잡균인 호기성 세균의 번식을 억제시켜 시원한 맛을 띠지만 발효가 진행됨에 따라 신맛을 내는 Lactobacillus sp. 젖산균이 증가하게 되어 pH는 감소하고, 산도는 증가하게 된다.
김치 발효 중 젖산균 수는 평판계수법(plate count technique)을 이용하여 측정하였다. 김치 발효숙성 중 미생물 균수의 변화는 혼합액 1㎖를 멸균한 증류수로 단계적으로 101~107까지 희석하여 각 희석액 중 0.1㎖씩을 미리 가열 융해하여 43~45℃로 냉각한 MRS 배지 10㎖에 넣고 혼합한 후 페트리 접시에 평판을 만들고 37℃ 배양기에서 48시간 배양하여 나타난 콜로니 수를 세어 젖산균 수로 측정하였다. 배지는 젖산균 분리에 주로 쓰이는 MRS 아가 배지를 사용하였다. MRS 아가 배지 조성은 표 27에 나타내었다. Lactobacillus 배지는 Lactobacillus 선택 배지 (LBS 배지)에 Pediococcus의 생육을 억제하기 위하여 아세트산와 아세트산 나트륨을 첨가한 개질 LBS 아가 배지(m-LBS 배지, 표 28)를 사용하여 30℃에서 3일간 평판배양 하였다. Leuconostoc 선택 배지로 페닐에틸 알콜과 수크로오스를 첨가한 페닐에틸 알콜 수크로오스 아가 배지(PES 배지, 표 29)를 사용하여 20℃에서 3일간 평판배양 하였다.
키토산 함유 김치(실시예 2)의 15℃에서 발효 동안 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 수의 변화는 도 5에 나타내었고, 키토산 함유 절임 용액에 절인 배추를 사용하여 제조한 김치(실시예 3)의 4℃에서 발효 동안 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 수의 변화는 도 6에 나타내었으며, 소금에 절인 배추를 키토산 함유 헹굼액에 헹군 후 제조한 김치(실시예 4)의 4℃에서 발효 동안 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 수의 변화는 도 7에 나타내었고, 키토산 함유 양념을 사용하여 제조한 김치(실시예 5)의 4℃에서 발효 동안 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 수의 변화는 도 8에 나타내었다.
| MRS 아가 배지 | |
| 성분 | 양(g/L) |
| 펩톤 | 10 |
| 미트 추출물 | 8 |
| 효모 추출물 | 4 |
| D-(+)-글루코오스 | 20 |
| 디칼륨 수소 인산염 | 2 |
| 트윈 80 | 1 |
| 디암모늄 수소 인산염 | 2 |
| 아세트산나트륨 | 5 |
| 황산마그네슘 | 0.2 |
| 황산망간 | 0.04 |
| Lactobacillus sp.용 m-LRS 배지 조성 | |
| 성분 | 양(%) |
| 펩톤 | 1.0 |
| 비프 추출물 | 1.0 |
| 효모 추출물 | 0.5 |
| 글루코오스 | 2.0 |
| 트윈 80 | 0.1 |
| K2HPO4 | 0.2 |
| 아세트산나트륨 | 0.5 |
| 구연산암모늄 | 0.2 |
| MgSO4·7H2O | 0.02 |
| 아세트산 | 2.5 ㎎/L |
| 아세트산나트륨 | 35 g/L |
| Leuconostoc sp.용 PES 배지 조성 | |
| 성분 | 양(g) |
| 트립티카제 | 5.0 |
| 효모 추출물 | 0.5 |
| 수크로오스 | 20.0 |
| (NH4)2SO4·7H2O | 2.0 |
| MgSO4·7H2O | 0.244 |
| K2HPO4 | 1.0 |
| 아가 | 15.0 |
| 페닐에틸 알콜 | 2.5 |
| 물 | 1000㎖ |
| pH | 9.8 |
도 5 내지 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 키토산 함유 김치는 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 젖산균의 성장속도를 억제시켜 저장성 및 보존성이 우수함을 알 수 있다.
실험예
6
: 키토산 함유 김치의 조직감 측정
본 발명에 따른 키토산 함유 김치의 저장기간 중 조직감을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
3주 및 4주 발효된 상기 실시예 3에서 제조한 김치(0.3% 및 0.5% 키토산 함유 절임 용액 사용)를 10㎠씩 잘라 시편으로 준비하였으며, 이 시편의 절단 강도를 측정하여 조직감을 판단하였다. 결과는 표 30에 나타내었다.
| 절단 강도(g/㎠) | |||
| 3주 발효 | 4주 발효 | ||
| 표준화 김치 | 151.65 | 141.75 | |
| 키토산 함유 절임 용액 | 0.3% NS-8 | 222.60 | 209.45 |
| 0.5% NS-8 | 215.45 | 183.80 | |
표 30에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 키토산 함유 김치는 표준화 김치보다 조직감이 매우 우수함을 알 수 있다.
실험예
7
: 키토산 함유 절임 용액을 이용하여 절여진 절임 배추 및 이를 이용하여 제조한 김치의 키토산 함량 측정
본 발명에 따른 키토산 함유 절임 용액을 이용하여 절여진 절임 배추 및 이를 이용하여 제조한 김치의 키토산 함량을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 3에서 0.3% 및 0.5% 키토산 함유 절임 용액에 절여진 절임 배추 및 상기 절임 배추를 이용하여 제조한 김치의 키토산 함량을 측정하였다. 결과는 표 31에 나타내었다.
| 키토산 함량(%) | |||
| 절임 배추 | 절임 배추 김치 | ||
| 키토산 함유 절임 용액 | 0.3% NS-8 | 0.064 | 0.06 |
| 0.5% NS-8 | 0.11 | 0.085 | |
표 31에 나타난 바와 같이, 키토산 함유 절임 용액으로 절여진 절임 배추 및 이를 이용하여 제조한 김치는 절임 농도에 따라 키토산이 절임 배추에 함침되고, 이로 인해 김치의 조직감을 개선시키며, 식이섬유 자체의 기능성을 보완해준다. 즉, 식물성 셀룰로오스는 음(-)전하의 식이섬유인데 키토산은 양(+)전하의 식이섬유이므로, 키토산이 절임물에 적당량 함침 혼입되면 양성 식이섬유가 되어 김치의 식물성 셀룰로오스의 구조가 치밀해지므로 김치의 조직감을 개선시키며, 식이섬유 자체의 기능성을 보완해주는 것으로 생각된다.
본 발명에 따른 절임용 키토산 분말은 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암활성이 우수한 수용성/불용성 키토산을 선별하여 탈아세틸화도와 점도에 따라 규격화함으로써, 이를 이용하여 제조한 키토산 함유 김치는 키토산 자체의 항균활성, 항산화 활성, 항돌연변이 효과 및 항암활성보다 더 우수하게 나타난다. 또한, 본 발명의 키토산 함유 김치는 키토산이 김치의 발효를 천천히 이루어지게 하여 적숙기에 도달하는 기간을 길게 함으로써 저장안정성이 우수하고, Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 젖산균의 성장속도를 억제시켜 저장성 및 보존성이 우수하며, 키토산이 절임물에 적당량 함침 혼입되면 양성 식이섬유가 되어 김치의 식물성 셀룰로오스의 구조가 치밀해지므로 김치의 조직감을 개선시키며, 식이섬유 자체의 기능성을 보완해주는 효과가 있다.
도 1은 DPPH 자유 라디칼에 대한 수용성 키토산의 항산화 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 DPPH 자유 라디칼에 대한 불용성 키토산의 항산화 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 Salmonella typhimurium TA100에서 직접돌연변이원인 MNNG(0.4㎍/plate)에 의해 유발된 돌연변이에 대한 키토산 함유 김치의 메탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 Salmonella typhimurium TA100에서 간접돌연변이원인 AFB1(0.5㎍/plate)에 의해 유발된 돌연변이에 대한 키토산 함유 김치의 메탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 키토산 함유 김치(실시예 2)의 15℃에서 발효 동안 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 수의 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 키토산 함유 절임 용액에 절인 배추를 사용하여 제조한 김치(실시예 3)의 4℃에서 발효 동안 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 수의 변화를 나타낸 도이다.
도 7은 소금에 절인 배추를 키토산 함유 헹굼액에 헹군 후 제조한 김치(실시예 4)의 4℃에서 발효 동안 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 수의 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 키토산 함유 양념을 사용하여 제조한 김치(실시예 5)의 4℃에서 발효 동안 Leuconostoc sp. 및 Lactobacillus sp. 수의 변화를 나타낸 도이다.
Claims (8)
- 85 내지 95%의 탈아세틸화도 및 2 내지 4 cP의 점도를 갖는 수용성 키토산, 90 내지 99%의 탈아세틸화도 및 20 내지 30 cP의 점도를 갖는 불용성 키토산, 및 이의 식품학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 하나 이상의 조합인 항균, 항산화, 항돌연변이 및 항암 활성을 모두 갖는 절임용 키토산 분말.
- 제 1항에 있어서, 상기 식품학적으로 허용가능한 염은 염산염, 아세트산염, 시트르산염 및 젖산염으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 절임용 키토산 분말.
- 제 1항의 절임용 키토산 분말을 절임 용액 총 중량에 대해 0.2 내지 1.0 중량% 포함하는 절임 용액.
- 제 3항의 절임 용액에 채소류를 절여 제조한 절임물.
- 제 4항에 있어서, 상기 채소류는 배추, 열무, 무우, 오이, 양파, 마늘 및 고추로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 절임물.
- 제 4항에 있어서, 상기 절임물은 절임물 총 중량에 대해 0.05 내지 0.25 중량%의 키토산이 함침된 것을 특징으로 하는 절임물.
- 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 절임물을 이용하여 제조한 김치.
- 제 1항 또는 제 2항의 절임용 키토산 분말을 김치 총 중량에 대해 0.01 내지 1.5 중량% 포함하는 김치.
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