CN1737539A - 一种快速微量检测组织活性氧的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速微量检测组织活性氧的方法，在96孔板中加入190微升匀浆上清液、10微升1毫摩尔/升的DCFH－DA溶液，置于酶标仪中，37℃保温，30分钟后于激发波长为485纳米、发射波长538纳米检测荧光强度。该方法反应直接在96孔板中进行，可同时测定多个样品，提高了检测效率，缩短了检测周期。并采用微量加样法，所需样品及试剂消耗减少。
Description
技术领域：
本发明涉及一种快速微量检测组织活性氧的方法。
技术背景：
2，7-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)可被酯酶水解为DCFH，DCFH可被细胞或组织中的活性氧氧化为有荧光的DCF，通过对DCF的测定，可以计算细胞或组织中的总活性氧水平。在使用该方法中通常用荧光分光光度计检测荧光强度，局限性是一次可检测样品数量少、所需样品体积大、实验周期长容易造成荧光猝灭。本发明采用微量加样及快速检测法，在96孔板中完成反应及检测过程，一次可对45个样品同时测定，实现了对动物组织活性氧的高通量、快速、微量的检测。
技术方案：
下面以小鼠肝脏活性氧测定为例对本发明的技术方案进行说明：
1)称取约0.05克组织，按1∶20(质量/体积)比例加入冰冷的100毫摩尔/升磷酸缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆。
2)1000g，4℃离心10分钟取上清。
3)在96孔板中加入190微升匀浆上清液、10微升1毫摩尔/升的DCFH-DA溶液(DCFH-DA终浓度为50微摩尔/升)，用移液器吹打，使之充分混匀。
4)置于酶标仪中，37℃保温，30分钟后于激发波长为485纳米、发射波长538纳米检测荧光强度。
5)另取50微升上清匀浆液，稀释30倍，取100微升进行蛋白定量。
6)结果以荧光强度/毫克蛋白表示。
特征：
可同时测定多个样品，提高了检测效率；
反应直接在96孔板中进行，缩短了检测周期；
采用微量加样法，所需样品及试剂消耗减少。
Claims (3)
1、一种快速微量检测组织活性氧的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行(以小鼠肝脏活性氧测定为例)：
A、称取约0.05克组织，按1∶20(质量/体积)比例加入冰冷的100毫摩尔/升磷酸缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆。
B、1000g，4℃离心10分钟取上清。
C、在96孔板中加入190微升匀浆上清液、10微升1毫摩尔/升的DCFH-DA溶液(DCFH-DA终浓度为50微摩尔/升)，用移液器吹打，使之充分混匀。
D、置于酶标仪中，37℃保温，30分钟后于激发波长为485纳米、发射波长538纳米检测荧光强度。
E、另取50微升上清匀浆液，稀释30倍，取100微升进行蛋白定量。
F、结果以荧光强度/毫克蛋白表示。
2、根据权利要求1所述的快速微量检测组织活性氧的方法，其特征在于反应直接在96孔板中完成，一次可对45个样品同时测定。
3、根据权利要求1所述的快速微量检测组织活性氧的方法，其特征在于反应中样品需要量为190微升，DCFH-DA溶液需要量为10微升。
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| CN106092991A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-11-09 | 南京大学 | 一种利用dapi荧光染料对活细胞内活性氧含量的检测方法 |
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