CN105420229B - 一种提取古代生物骨骼dna的裂解液及方法 - Google Patents

一种提取古代生物骨骼dna的裂解液及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。所述裂解液配方：pH8.5Tris‑HCl，10mM；EDTA，10‑15mM；SDS，1.0‑1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3‑0.5mg/ml。通过将SDS、EDTA和蛋白酶K的组分分别提高，可明显提高新裂解液对骨组织的裂解程度。同时在使用时再利用去蛋白液，DNA漂洗液处理，以及DNA离心柱法可明显减少DNA样品中的杂质成分，有利于提高PCR的扩增效果，从而有助于获取高纯度古代生物骨骼的DNA。

Description

一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法
技术领域
本发明属于生物DNA提取技术领域，具体涉及一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。
背景技术
从古代生物骨骼中提取DNA对于探索古代生物的生命奥秘以及人类文明的发展具有重要意义。骨骼是一种比较特殊的生物检测材料，因为外部有坚硬的保护组织，所以相对于生物体的其他组织脏器器官的降解比较慢。因此，对于高度腐化的样本来说，骨骼是进行DNA检测的有效检测材料之一。由于受周围环境中核酸酶和微生物的作用，古代生物骨骼中的DNA链会发生断裂、缺失甚至降解，不易获得足够的DNA样本。因此，目前尚需寻找一种更有效的DNA提取方法，为最大程度地提取和保存陈旧骨骼中的DNA。
由于骨骼组织异常坚固，提取DNA较其他软组织困难。而现有的一些旧方法存在组织裂解不完全，DNA丢失较多，同时获取的样本含杂质太多，苯酚/氯仿法对人体毒性大，即便脱钙法也存在占用时间太长等缺点。本发明提供了一种新的骨组织DNA提取液，无需脱钙处理和利用苯酚/氯仿，通过提高旧方法裂解液中SDS、EDTA和蛋白酶K的组分，增强裂解液对骨组织的裂解程度，使骨组织裂解更充分。骨骼裂解离心后，再将上清液利用异丙醇、去蛋白液，DNA漂洗液等处理，借助离心柱可更大程度地获取高纯度古代生物骨骼的DNA。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。该裂解液及配套使用的方法能够使得组织裂解完全，获取的样本杂质少，更大程度地获取高纯度古代生物骨骼的DNA，而且使用环境无毒、操作简便，时间短、效率高。
一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液，所述裂解液配方是在去离子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，10-15mM；SDS，1.0-1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3-0.5mg/ml。
所述裂解液优选配方是在去离子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，15mM；SDS，1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.5mg/ml。
利用所述的裂解液提取古代生物骨骼DNA的方法，包括以下步骤：
1)剪取一小块出土的古代人骨骼，将其碾碎，称取0.3-0.4g放入1.5ml的EP管中；
2)加入250-300μl的裂解液，55-57℃孵育12–16h；
3)12000rpm离心10-15min，取200-250μl上清液入新EP管，按照体积比1:1加入250μl异丙醇，轻轻混匀后4℃静置至少10min；
4)轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1-2min，弃收集管内的液体；
5)加入500μl去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
6)加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液，并重复一次操作，本步骤操作前，须预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇；
7)打开盖子，24-26℃至少风干10–15min；
8)加入75℃预热的去离子水30-50μl洗脱DNA；
9)将收集的DNA液加入离心柱内，相同条件下再次洗脱。
所述的方法，优选包括以下步骤：
1)剪取一小块出土的古代人骨骼，将其碾碎，称取0.3g放入1.5ml的EP管中；
2)加入300μl的裂解液，55℃孵育12–16h；
3)12000rpm离心10min，取250μl上清液入新EP管，按照体积比1:1加入250μl异丙醇，轻轻混匀后4℃静置至少10min；
4)轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1min，弃收集管内的液体；
5)加入500μl去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
6)加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液，并重复一次操作，本步骤操作前，须预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇；
7)打开盖子，25℃至少风干10–15min；
8)加入75℃预热的去离子水50μl洗脱DNA；
9)将收集的DNA液加入离心柱内，相同条件下再次洗脱。
DNA的浓度和纯度用生物分光光度计测定，DNA样本的扩增按照常规PCR方法实施，扩增循环为40次。
本发明通过将SDS、EDTA和蛋白酶K的组分分别提高至1.5％、15mM和0.5mg/ml，可明显提高新裂解液对骨组织的裂解程度。骨骼裂解离心后，再将上清液利用异丙醇、去蛋白液，DNA漂洗液等处理，借助离心柱可明显减少DNA样品中的杂质成分，有利于提高PCR的扩增效果，从而有助于获取高纯度古代生物骨骼的DNA。
附图说明
图1为不同裂解液对古代人骨骼裂解效果对比；
A：旧裂解液对骨组织的裂解；B：本发明新裂解液对骨组织的裂解更充分；
图2为本发明方法/旧方法提取的样品扩增人β-actin基因片段效果对比；
A：旧方法；B：本发明方法。
具体实施方式
以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
本发明提供的新裂解液配方：pH8.5Tris-Hcl，10mM；EDTA，15mM；SDS，1.5％；
NaCl，150mM；蛋白酶K，0.5mg/ml。
其余试剂及耗材：异丙醇，DNA离心柱，去蛋白液，DNA漂洗液，无水乙醇等
本发明所实施的步骤：
(操作前，预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇)
1、剪取一小块出土的古代人骨骼，用研磨器将其碾碎，并称取0.3g放入1.5ml的EP管中，剩余粉末可收集，-20℃保存；
2、加入300μl的裂解液，55℃孵育12–16h；
3、12000rpm离心10min，取250μl上清液入新EP管，加入250μl异丙醇(1:1)，轻轻混匀后4℃静置10min；
4、轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1min，弃收集管内的液体；
5、加入500μl去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
6、加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，并重复一次操作；
7、打开盖子，室温风干10–15min；
8、加入75℃预热的去离子水50μl洗脱DNA；
9、将收集的DNA液加入离心柱内，再次洗脱；
10、DNA的浓度和纯度用生物分光光度计测定，DNA样本的扩增按照常规PCR方法实施，扩增循环为40次。
旧裂解液配方：pH8.5Tris-Hcl，10mM；EDTA，5mM；SDS，0.2％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.1mg/ml。
其余试剂：异丙醇。
旧方法操作步骤：
1、剪取一小块出土的古代人骨骼，用研磨器将其碾碎，并称取0.3g放入1.5ml的EP管中，剩余粉末可收集，-20℃保存；
2、加入300μl的裂解液，55℃孵育12–16h；
3、12000rpm离心10min，取250μl上清液入新EP管，加入250μl异丙醇(1:1)，轻轻混匀后4℃静置10min；
4、12000rpm离心1min，弃上清液，用30-50μl去离子水溶解DNA；
5、DNA的浓度和纯度用生物分光光度计测定，DNA样本的扩增按照常规PCR方法实施，扩增循环为40次。
现有的技术相比，本发明方法无需脱钙处理骨组织，步骤相对简单，同时骨组织裂解更完全(图1)，能提取出高浓度和高纯度的DNA样本(表1)。利用PCR技术检测显示，在相同样本浓度(100ng DNA)下，本发明方法分离的样本可更有效地扩增出DNA产物(图2)。
表1本发明方法/旧方法提取古代人骨骼DNA的浓度和纯度对比
本发明裂解液配方的部分探索过程见下表2：每种成分都做了单因素试验，以确定最优的浓度范围。
表2

Claims (3)

1.一种提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)剪取一小块出土的古代人骨骼，将其碾碎，称取0.3-0.4g放入1.5ml的EP管中；
2)加入250-300μl的裂解液，55-57℃孵育12–16h；
3)12000rpm离心10-15min，取200-250μl上清液入新EP管，按照体积比1:1加入250μl异丙醇，轻轻混匀后4℃静置至少10min；
4)轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1-2min，弃收集管内的液体；
5)加入500μl去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
6)加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液，并重复一次操作，本步骤操作前，须预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇；
7)打开盖子，24-26℃至少风干10–15min；
8)加入75℃预热的去离子水30-50μl洗脱DNA；
9)将收集的DNA液加入离心柱内，相同条件下再次洗脱；
所述裂解液配方是在去离子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，10-15mM；SDS，1.0-1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3-0.5mg/ml。
2.根据权利要求1所述的提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，所述裂解液配方是在去离子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，15mM；SDS，1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)剪取一小块出土的古代人骨骼，将其碾碎，称取0.3g放入1.5ml的EP管中；
2)加入300μl的裂解液，55℃孵育12–16h；
3)12000rpm离心10min，取250μl上清液入新EP管，按照体积比1:1加入250μl异丙醇，轻轻混匀后4℃静置至少10min；
4)轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1min，弃收集管内的液体；
5)加入500μl去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
6)加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液，并重复一次操作，本步骤操作前，须预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇；
7)打开盖子，25℃至少风干10–15min；
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