CN110904271A

CN110904271A - 一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法

Info

Publication number: CN110904271A
Application number: CN201911184699.0A
Authority: CN
Inventors: 刘紫微
Original assignee: Wuhan Kangmat Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Kangmat Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明专利公开了一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法，该方法包括SEQ ID NO.1‑2所示的引物和SEQ ID NO.3‑4所示的两处氨基酸差异。本公开还为鉴别猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）和猫肠道冠状病毒（FECV）提供了一种新的思路。通过这项检测方案能够实现现有检测技术所无法完成的精准、特异、灵敏的结果判定，显著提高了对猫传染性腹膜炎病毒的检测精准度，为尽早发现和有效防控猫传染性腹膜炎病毒提供了重要的技术支持。

Description

一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法

技术领域

本发明属于发明领域，具体涉及引物诊断猫冠状病毒，然后用两处氨基酸位点的差异鉴别FECV与FIPV，本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术

猫传染性腹膜炎（FIP）是由猫传染性腹膜炎病毒引起的一种进行性、致死性疾病，以腹腔和胸腔大量积水为主要特征，是引起猫科动物死亡的主要传染病之一。

目前国内诊断的方法包括病理学检查、血清学检测和RT-PCR检测等。仅通过临床症状进行诊断的方法，需要依赖典型的临床症状表现及诊断者的经验，而患传染性腹膜炎的猫初期症状不明显，病程进展有较大差异，导致获得的结果容易不准确，往往因误诊而贻误治疗最终导致病猫死亡。

确诊主要是采用RT-PCR的方法并结合临床症状，由于该种病毒高突变，不同患猫的病毒基因常不一致，所以设计的引物需要在很保守的区段，这造成现有的引物多是只能检测到猫冠状病毒，尽管有些引物可针对FIPV，但对这种引物适用的通常只有少数情况。因此我设计的引物是在对FIPV和FECV都很保守的序列，这样可以保证引物适用范围较大，且在这段目的基因间包含两处氨基酸位点可用于鉴别FIPV和FECV。

经查阅相关文献，未见有设计该种引物和这两个氨基酸差异位点用于诊断猫传染性腹膜炎的报告。

发明内容

本发明的目的是提供一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法，这种方法将大大提高确诊的准确度。

为达到以上目的，本公开提供了SEQ ID NO.1-2所示的引物组和SEQ ID NO.3-4所示的氨基酸序列差异。本发明提供的一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法，该方法由以下步骤组成：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)对所述总RNA进行逆转录获得PCR模板；用SEQ ID NO.1-2所示的引物对所述 PCR模板进行PCR扩增；

(3)对所述扩增产物进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；

(4)对所述目的条带胶回收送去测序，获得测序结果；

(5)在SEQ ID NO.3-4所示两处氨基酸序列进行比较，得出是FIPV还是FECV；

通过上述技术方案本公开建立了新的猫传染性腹膜炎病毒的检测方法，能够实现现有检测技术所无法完成的准确、特异、敏感的结果判定，显著提高了对猫传染性腹膜炎的确诊正确率，为尽早发现和有效预防猫传染性腹膜炎病毒提供了重要的技术支持。

附图说明

图1是FIPV与FECV 在SEQ ID NO.3处氨基酸序列的比对。

图2是FIPV与FECV 在SEQ ID NO.4处氨基酸序列的比对。

图3是FIPV与FECV琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M：DL1500； 1-5：5种来自不同患猫的FIPV；N：空白对照；6-7：2种来自不同患猫的FECV；8-9：猫杯状病毒与猫瘟病毒做的阴性对照。

图4用这组引物去与其他病毒做PCR后电泳检测看是否有交叉反应性，其中，M：DL2000；1-3：三种不同来源的猫杯状病毒；4-6：三种不同来源的猫瘟病毒；N：阴性对照。

图5是胶回收送测序后序列在SEQ ID NO.3氨基酸差异处的对比。

图6是胶回收送测序后序列在SEQ ID NO. 4氨基酸差异处的对比。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开公开了四种序列：猫冠状病毒检测用引物组，和鉴别FECV和FIPV的两处氨基酸位点。引物组可以诊断猫冠状病毒，氨基酸差异可以用于鉴别FECV和FIPV。引物组扩增猫冠状病毒后的目的条带约1500bp，这段目的条带包含了这两处氨基酸序列。因此在通过测序后获得基因序列，可在SEQ ID NO.3-4两处氨基酸序列位点作比对。

本发明还提供了一种猫传染性腹膜炎病毒的检测方法，该方法包括如下步骤：

（1）提取待测样本的总RNA；

（2）对所述总RNA进行逆转录获得PCR模板；

（3）以所述的逆转录产物为模板，用引物组SEQ ID NO.1-2对模板扩增；

（4）对扩增产物核酸电泳检测，胶回收测序；

（5）获得序列，比较SEQ ID NO.3-4处的氨基酸位点，得出是FIPV还是FECV.

其中，步骤(1)中采用本领域公知的RNA提取方法，例如RNA提取试剂盒，获得待测样本的总RNA。所述待测样本可以包括但不限于病毒、食品、排泄物、呕吐物、血液、腹腔液、组织和细胞培养物等。在本公开的一种实施方式中，所述待测样本为腹腔液和粪样。

步骤（2）使用通用的逆转录方法获得cDNA。

在本公开的一种实施方式中，所述PCR扩增的体系为：PCR模板5μL，phanta酶1μL，上游引物(SEQ ID NO.1)1μl，下游引物(SEQ ID NO.2)1

μL，dNTP1μl，CE buffer10μl加ddH₂O至50μL体系。其中， PCR扩增中SEQ ID NO.1-2所示的引物的最终使用浓度为0.30pmol/μL。

所述PCR扩增的反应程序为：

a：95℃ 3min； b：95℃ 30s；

c：60℃ 30s； d：72℃ 50s；b-d进行30-35个循环

e：16℃ 10min。

可选的：所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。

以下，结合实际例子进一步详细说明本公开。

以下实例中所使用的SEQ ID NO.1-2所示的引物由武汉擎科生物技术有限公司合成，通过实验室收集的大量病毒氨基酸序列比对后得到的两处SEQ ID NO.3-4位点差异性。SEQ ID NO.1-4如表1所示：

表1

试验结果：

如图1、2，通过比对多种不同株病毒的氨基酸序列得到两处FECV与FIPV有明显差异的氨基酸位点。

上游引物与下游引物在FECV和FIPV的保守区间。

设计完引物组并查找发现了两处氨基酸差异位点后，开始做实际实验：

（1）样品获得：取7个病样，有腹水也有粪样。

（2）cDNA合成：总RNA提取：用病毒检测用RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)对0.25mL 待测样品进行总RNA提取；逆转录：逆转录酶(购自诺唯赞生物科技有限公司)对总RNA进行逆转录，合成获得cDNA模板。

（3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，获得目的条带约1500bp(图5)，反应体系及反应程序如下：PCR模板5μL，phanta酶1μL，上游引物(SEQ ID NO.1)1μl，下游引物(SEQ ID NO.2)1μL，dNTP1μl，CEbuffer10μl加ddH₂O至50μL体系。其中， PCR扩增中，SEQ ID NO.1-2所示的引物的最终使用浓度为0.30pmol/μL。

所述PCR扩增的反应程序为：

a：95℃ 3min； b：95℃ 30s；

c：60℃ 30s； d：72℃ 50s；b-d进行30-35个循环

e：16℃ 10min。

（4）核酸电泳：结果在附图3中，目的基因核酸凝胶电泳后用胶回收试剂盒（购自美国OMEGA公司）回收。其中M：DL1500； 1-5：5种来自不同患猫的FIPV；N：空白对照；6-7：2种来自不同患猫的FECV；8-9：猫杯状病毒与猫瘟病毒做的阴性对照，可见本引物组SEQ IDNO.1-2对FECV和FIPV都能识别到。

（5）测序：回收产物送去擎科生物技术有限公司测序。

（6）序列比对：结果在附图5、6中,在S蛋白第3013个碱基处：FIPV与FECV存在明显不同，会导致这个地方的氨基酸不同，FIPV是丙氨酸而FECV是丝氨酸。在S蛋白第3088个碱基处：FIPV与FECV存在明显不同，会导致这个地方的氨基酸不同，FIPV是谷氨酰胺或者组氨酸而FECV是天冬氨酸。通过序列比对可以看出这7种病料中有2种是带有猫肠道冠状病毒有5种是带有猫传染性腹膜炎病毒。

下面是做一个阴性对照实验：

（1）样品获得：取实验室获得的6种病毒的病料，有猫杯状病毒和猫瘟病毒各三种。

（2）cDNA合成：总RNA提取：用病毒检测用RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)对0.20mL 待测样品进行总RNA提取；逆转录：逆转录酶(购自上海近岸科技有限公司)对总RNA进行逆转录，合成获得cDNA模板。

（3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，获得目的条带约1500bp如图5所示反应体系及反应程序如下：PCR模板5μL，phanta酶2μL，上游引物(SEQ ID NO.1)1μl，下游引物(SEQ ID NO.2)1μL，dNTP1μl，CEbuffer10μl加ddH₂O至50μL体系。其中， PCR扩增中SEQ ID NO.1-2所示的引物的最终使用浓度为0.30pmol/μL。

所述PCR扩增的反应程序为：

a：95℃ 3min； b：95℃ 30s；

c：60℃ 30s； d：72℃ 50s；b-d进行30-35个循环

e：16℃ 10min。

（4）核酸电泳：结果在附图4中，胶回收的试剂盒是购自美国OMEGA公司。其中M：DL1500； 1-3：3种来自不同患猫的猫杯状病毒病料；4-6：3种来自不同患猫的猫瘟病毒病料；N：空白对照（模板用ddH₂O代替），可见本引物组SEQ ID NO.1-2对猫杯状病毒和猫瘟病毒都没有交叉反应性。

Claims

1.一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法，其特征在于：运用新设计的RT-PCR引物组扩增目的基因，之后通过测序比对两处FIPV与FECV不同的氨基酸位点，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述的两处FIPV与FECV不同的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。

2.一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法，该方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)对所述总RNA进行逆转录获得PCR模板；用SEQ ID NO.1-2所示的引物对所述PCR模板进行扩增；

(3)对扩增产物核酸电泳获得FECV或FIPV的目的条带；

(4)将目的条带胶回收测序；

(5)通过比对两个FECV与FIPV的氨基酸差异处的序列，得到结果。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中PCR扩增的反应程序为：

a：95℃ 3min； b：95℃ 30s；

c：60℃ 30s； d：72℃ 50s；b-d进行30-35个循环

e：16℃ 10min。

4.根据权利要求2中所述的检测方法，其中，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳

根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于引物组的核苷酸序列SEQ ID NO.1-2，可检测FECV与FIPV。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于两处FIPV与FECV不同的氨基酸序列SEQID NO.3-4，可鉴别FECV与FIPV。

6.一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法，其特征在于，该方法包括权利要求1所述的引物组SEQ ID NO.1-2。

7.一种诊断猫传染性腹膜炎的新方法，其特征在于，该方法包括权利要求1所述的两处氨基酸差异SEQ ID NO.3-4。