CN114835804A - 一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因重组及抗体制备技术领域，具体公开了一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物及其制备方法和应用，该组合物是将猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体与Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体按相同效价下以(1‑2)：(1‑2)：(1‑2)的质量比混合获得，比单独一种抗体、两种抗体混合，以及三种抗体按照其他比例混合治疗猫传染性腹膜炎效果要好。既可以中和无临床症状表现的猫肠道冠状病毒感染从而达到预防猫传染性腹膜炎病毒感染，也可以中和有临床症状的猫传染性腹膜炎Ⅰ型和Ⅱ型的感染，从而达到治疗猫传染性腹膜炎的效果，特别是对Ⅰ型和Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒的交叉感染的治疗有较好的效果。
Description
技术领域
本发明属于基因重组及抗体制备技术领域，尤其涉及一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物及其制备方法和应用。
背景技术
卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk，IgY)是通过免疫产卵动物在其生产的蛋黄中提取的相应抗体，可用于相应疾病的预防和治疗。IgY的性质与哺乳动物的IgG相似，且IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。
原核表达技术是指将外源目的蛋白的基因通过克隆技术构建表达载体并导入原核表达细胞如大肠埃希菌并表达的技术。Rosetta-gami2系列细胞能进行正确修饰和折叠而形成有生物活性的蛋白质同时兼备了真核表达的优点，且原核生长繁殖速度快，生产成本低廉，从而适合大规模生产。
猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是一种由猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)感染引起的传染病，猫传染性腹膜炎目前很难医治，常用手段是使用441进行治疗，而用抗体治疗效果很差。在检验方面目前唯一权威性的FIP诊断方法是病理学检测，但由于样本获得的不易性导致临床开展较为不便。临床上常采用免疫组化(IHC)、间接荧光抗体检测(IFA)和逆转录PCR(RT-PCR)做为替代检测手段。其中RT-PCR检测时间短操作简单，配合特定的引物可以作为实验室检测FIPV的常规手段，并且配合测序可以做到型别的区分。而荧光定量PCR(qPCR)是PCR的一种定量手段，可以更精确地检测FIPV的病毒含量，这为本发明的效果检验提供了实验手段。
FIPV由猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus,FECV)突变而来。FIPV和FECV是猫冠状病毒(Feline coronavirus,FCoV)的两个生物型，但他们所产生的疾病大不相同。FIPV在临床上会导致猫患有传染性腹膜炎，是一种慢性型的、进行性的、致死性的疾病。而FECV通过粪-口途径传播，主要感染肠上皮细胞，在临床上一般不引起疾病。FIPV在临床上分为两种血清型：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型在欧洲占大多数，而Ⅱ型在北美及日本占主导地位。但由于近年来我国宠物市场的繁荣，各种猫类的进口繁殖，从而导致FIPVⅠ型和Ⅱ型均在我国普遍流行，且常能检测出两种型别存在交叉混合感染的现象。Ⅰ型主要由FECV在巨噬细胞中产生突变，突变位置在S基因，而Ⅱ型主要是由Ⅰ型和犬冠状病毒(Canine Coronavirus，CCoV)重组产生，其重组部分主要发生在S基因部分。由于两者突变的产生和混合、交叉感染的情况导致猫传染性腹膜炎疫苗的研发困难重重，至今尚无有效疫苗，且该病尚无特效药物，因此，本发明提供了一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物及其制备方法和应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物及其制备方法和应用。
本发明的具体技术方案包括：
本发明提供了一种猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体在制备猫传染性腹膜炎治疗药物中的应用，所述猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体为通过重组猫肠道冠状病毒S蛋白免疫卵生动物后，再从卵生动物生产的蛋黄中提取获得。
作为本发明的进一步优化方案，所述重组猫肠道冠状病毒S蛋白是以猫肠道冠状病毒毒株的S蛋白为参考，根据其基因序列，经宿主菌密码子优化后获得编码基因序列而获得的重组蛋白，编码该蛋白的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物，所述猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物是将上述任一所述的猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体与Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体按相同效价下以(1-2)：(1-2)：(1-2)的质量比混合获得。
作为本发明的进一步优化方案，所述Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体是分别将重组Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白和重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白分别免疫卵生动物后，从卵生动物生产的蛋黄中提取得到的。
作为本发明的进一步优化方案，所述猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物是将权利要求1所述的猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体与Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体按相同效价下以2：1：1的质量比混合获得。
本发明还提供了一种如上述任一所述的猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别制备重组猫肠道冠状病毒S蛋白、Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白，备用；
(2)将重组猫肠道冠状病毒S蛋白、Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白分别对卵生动物进行免疫，至卵生动物血清抗体效价达到1：32以上时收集卵生动物的蛋；
(3)将收集到的蛋的蛋黄液分别进行纯化获得猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体、Ⅰ、Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体；
(4)将猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体与Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体按相同效价下以(1-2)：(1-2)：(1-2)的质量比混合获得所述猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物。
作为本发明的进一步优化方案，所述重组猫肠道冠状病毒S蛋白、重组Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白的制备步骤如下：
(1)分别取编码猫肠道冠状病毒毒株S蛋白、Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白的基因序列，并做大肠杆菌密码子优化，获得目的蛋白的核酸序列；
(2)对目的蛋白的核酸序列进行人工合成，连接到原核表达质粒pET32a中，获得含有目的基因的pET32a质粒，将含有目的基因的pET32a质粒用热击法导入到Rosetta-gami2表达菌中，涂布于氨苄抗性的LB琼脂平板上，挑取阳性菌落，分别获得rFECV-S工程菌、rFIPVⅠ-S工程菌以及rFIPVⅡ-S工程菌；
(3)分别取rFECV-S工程菌、rFIPVⅠ-S工程菌以及rFIPVⅡ-S工程菌进行发酵培养和纯化，即得重组猫肠道冠状病毒S蛋白、重组Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白。
作为本发明的进一步优化方案，所述卵生动物为鸡。
本发明还提供了一种如上述任一所述的猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物在制备猫传染性腹膜炎治疗药物中的应用。
综上所述，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体三者按相同效价下以2：1：1的质量比例混合，比单独一种抗体、两种抗体混合，以及三种抗体按照1：1：1、1：2：1、1：1：2混合治疗猫传染性腹膜炎效果要好。既可以中和无临床症状表现的猫肠道冠状病毒感染从而达到预防猫传染性腹膜炎病毒感染，也可以中和有临床症状的猫传染性腹膜炎Ⅰ型和Ⅱ型的感染，从而达到治疗猫传染性腹膜炎的效果。特别是对Ⅰ型和Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒的交叉感染的治疗有较好的效果；
(2)本发明提供了卵黄抗体组合物可用于制备针对治疗猫传染性腹膜炎的卵黄抗体制品，解决了猫传染性腹膜炎抗体应用的高成本问题，可用于猫传染性腹膜炎的针对性治疗和保健。
附图说明
图1为rFECV-S、rFIPVⅠ-S、rFIPVⅡ-S蛋白wb验证图；图中，泳道M：Thermofisher蛋白Marker 26619、泳道1：空菌对照、泳道2：rFECV-S蛋白、泳道3：rFIPVⅠ-S蛋白、泳道4：rFIPVⅡ-S蛋白；
图2为rFECV-S、rFIPVⅠ-S、rFIPVⅡ-S蛋白免疫蛋鸡的琼脂双扩散图；1：2-1：64表示血清稀释2-64倍。中间孔Ag(抗原)分别为纯化的rFECV-S、rFIPVⅠ-S、rFIPVⅡ-S蛋白。图中2-1为rFECV-S抗体效价琼扩测试结果、2-2为rFIPVⅠ-S抗体效价琼扩测试结果、2-3为rFIPVⅡ-S抗体效价琼扩测试结果；
图3为治疗及预防结束后取肛拭子采用qPCR检测FECV、FIPVⅠ型及FIPVⅡ型三种病毒拷贝数结果图；图中3-1为FECV各组检测结果，3-2为FIPVⅠ型各组检测结果，3-3为FIPVⅡ型各组检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。
一、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
二、方法
1、重组猫肠道冠状病毒S蛋白的制备及rFECV-S蛋白卵黄抗体的制备
(1)重组猫肠道冠状病毒S蛋白的基因序列的获取：
参考GENBANK登录号X80799.1，取编码猫肠道冠状病毒毒株S蛋白的基因序列，并做大肠杆菌密码子优化，获得如SEQ ID NO.1所示的目的基因序列。将目的基因序列送华大基因合成获得含有目的基因的pET32a质粒，测序合格备用。
(2)工程菌构建
将pET32a质粒用热击法导入Rosetta-gami2表达菌，涂布于含有氨苄的LB琼脂平板上，37℃过夜培养，挑取氨苄LB琼脂平板上长出的阳性菌落保种并送华大基因测序鉴定目的基因，测序结果与目的基因一致，表示表达菌构建成功，记为rFECV-S工程菌。
(3)发酵表达
取rFECV-S工程菌于摇床37℃，250r/min，在含有氨苄的LB培养基中放大培养，测OD值在1.0时，加入54μg/ml的IPTG，32℃诱导表达过夜，于4℃、7500r/min离心30min收集菌体。-20℃与室温反复冻融菌体3次，并冰浴超声裂解菌体，功率：400W，工作8S，间隔2S，超声30min，于4℃、14000r/min离心15min弃上清取沉淀，得到粗制蛋白。
(4)粗制品纯化
粗制蛋白溶解于100mL洗涤缓冲液(2M尿素、50mMTris-HCl、1mMEDTA、0.5％TritonX-100，调整pH到8.0)中，于磁力搅拌器上洗涤2h，12000r/min离心15min，弃上清液，取沉淀，重复洗涤两次。
将洗涤后的沉淀逐步捣碎用45mL溶解液(100mMNaCL、50mMTris-HCl、1mMEDTA、7M盐酸胍、0.1％β-巯基乙醇，调整pH到8.0)充分溶解于磁力搅拌器上过夜，然后经4℃、12000r/min离心15min，取上清即为包涵体溶解产物。
将包涵体溶解产物缓慢加入到4倍体积的复性缓冲液(2.5M尿素、50mMTris-HCl、100mM NaCL、0.1％β-巯基乙醇，调整pH到8.0)中，4℃静置过夜，再置20倍体积透析液(50mMTris-HCl、100mM NaCL，调整pH到8.0)中4℃透析8h，12000r/min离心15min收上清，即为纯化的目的蛋白，记为rFECV-S。
(5)重组rFECV-S蛋白验证
由于猫肠道冠状病毒无相关多抗和单抗，本实施例使用表达载体上的标签蛋白结合蛋白大小作为验证手段。使用Abcam公司Anti-6X His tag单抗(货号ab18184)为一抗，Abcam公司HRP标记的山羊抗小鼠IgG H&L(货号ab6789)为二抗，进行Wb验证，在177kDa处有明显的阳性条带，如图1中泳道2所示。表明重组蛋白rFECV-S表达成功。
(5)rFECV-S蛋白卵黄抗体的制备
选取4月龄健康蛋鸡进行免疫。rFECV-S使用PBS稀释到1mg/mL，弗氏完全佐剂1：1乳化，以肌肉多点注射的方式进行首次免疫，每只鸡注射总量为2mL；14天后以相同方式进行加强免疫；第21天使用弗氏不完全佐剂1：1乳化，以肌肉多点注射的方式进行加强免疫。第28天翅静脉采血，琼脂双扩散法测定血清抗体效价，效价≥1:32时(如图2-1所示)开始收集鸡蛋，若不足，按上述方法补充免疫直到效价满足要求。
挑选完整未破损的鸡蛋，挑选完整未破损的鸡蛋清洗后，消毒风干后，蛋黄蛋清分离，收集蛋黄液，用1：9倍的蒸馏水稀释卵黄，调节pH至5.4，搅拌15min，置4℃过夜自然沉淀，以10000rpm，4℃离心30min去除脂类，收集上清液。加入等体积PBS稀释，再按体积1：1加入饱和硫酸铵，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。再用PBS溶解沉淀，离心去除不溶物，取上清液加入100m饱和硫酸铵至33％饱和度，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。如此重复3次，可获较纯的rFECV-S IgY，20倍体积PBS透析过夜，经0.22μm无菌过滤获得rFECV-S的IgY(以下简称为rFECV-S卵黄抗体)。
2、重组Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及卵黄抗体的制备
(1)重组Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白的基因序列的获取
参考Genbank登录号AAB47503.1取编码Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白的氨基酸序列，根据其氨基酸序列，反向翻译获得基因序列，并做大肠杆菌密码子优化，获得如SEQ IDNO.2所示的目的基因序列。将目的基因序列送华大基因合成获得含有目的基因的pET32a质粒，测序合格备用。
(2)工程菌构建
将pET32a质粒用热击法导入Rosetta-gami2表达菌，涂布于含有氨苄的LB琼脂平板上，37℃过夜培养，挑取氨苄LB琼脂平板上长出的阳性菌落保种并送华大基因测序鉴定目的基因，测序结果与目的基因一致，表示表达菌构建成功，记为rFIPVⅠ-S工程菌。
(3)发酵表达
取rFIPVⅠ-S工程菌于摇床37℃，250r/min，在含有氨苄的LB培养基中放大培养，测OD值在1.0时，加入54μg/ml的IPTG，37℃诱导表达过夜，于4℃、7500r/min离心30min收集菌体。-20℃与室温反复冻融菌体3次，并冰浴超声裂解菌体，功率：400W，工作8S，间隔2S，超声30min，于4℃、14000r/min离心15min弃上清取沉淀，得到粗制蛋白。
(4)粗制品纯化
粗制蛋白溶解于100mL洗涤缓冲液(2M尿素、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.5％TritonX-100，调整pH到8.0)中，于磁力搅拌器上洗涤2h，12000r/min离心15min，弃上清液，取沉淀，重复洗涤两次。
将洗涤后的沉淀逐步捣碎用45mL溶解液(100mM NaCL、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、7M盐酸胍、0.1％β-巯基乙醇，调整pH到8.0)充分溶解于磁力搅拌器上过夜，然后经4℃、12000r/min离心15min，取上清即为包涵体溶解产物。
将包涵体溶解产物缓慢加入到4倍体积的复性缓冲液(2.5M尿素、50mM Tris-HCl、100mM NaCL、0.1％β-巯基乙醇，调整pH到8.0)中，4℃静置过夜，再置20倍体积透析液(50mMTris-HCl、100mM NaCL，调整pH到8.0)中4℃透析8h，12000r/min离心15min收上清，即为纯化的目的蛋白，记为rFIPVⅠ-S。
(5)重组rFIPVⅠ-S蛋白验证
由于猫传染性腹膜炎病毒无相关商品化多抗和单抗，故本实施例使用表达载体上的标签蛋白结合蛋白大小作为验证手段。使用Abcam公司Anti-6X His tag单抗(货号ab18184)为一抗，Abcam公司HRP标记的山羊抗小鼠IgG H&L(货号ab6789)为二抗，进行Wb验证，在180kDa处有明显的阳性条带，如图1泳道3所示。表明重组蛋白rFIPVⅠ-S表达成功。
(6)rFIPVⅠ-S蛋白卵黄抗体的制备
选取4月龄健康蛋鸡进行免疫。rFIPVⅠ-S使用PBS稀释到1mg/mL，弗氏完全佐剂1：1乳化，以肌肉多点注射的方式进行首次免疫，每只鸡注射总量为2mL；14天后以相同方式进行加强免疫；第21天使用弗氏不完全佐剂1：1乳化，以肌肉多点注射的方式进行加强免疫。第28天翅静脉采血，琼脂双扩散法测定血清抗体效价，效价≥1:32时(如图2-2所示)开始收集鸡蛋，若不足，按上述方法补充免疫直到效价满足要求。
挑选完整未破损的鸡蛋，挑选完整未破损的鸡蛋清洗后，消毒风干后，蛋黄蛋清分离，收集蛋黄液，用1：9倍的蒸馏水稀释卵黄，调节pH至5.4，搅拌15min，置4℃过夜自然沉淀，以10000rpm，4℃离心30min去除脂类，收集上清液。加入等体积PBS稀释，再按体积1：1加入饱和硫酸铵，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。再用PBS溶解沉淀，离心去除不溶物，取上清液加入100m饱和硫酸铵至33％饱和度，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。如此重复3次，可获较纯的IgY，20倍体积PBS透析过夜，经0.22μm无菌过滤获得rFIPVⅠ-S的IgY液体制剂(以下简称为rFECV-S卵黄抗体)，以此为基础可根据需要做其他剂型。
3、重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及卵黄抗体的制备
(1)重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白的基因序列的获取
参考Genbank登录号AAY32596.1取编码Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白的氨基酸序列，根据其氨基酸序列，反向翻译获得基因序列，并做大肠杆菌密码子优化，获得如SEQID NO.3所示的目的基因序列。将目的基因序列送华大基因合成获得含有目的基因的pET32a质粒，测序合格备用。
(2)工程菌构建
将pET32a质粒用热击法导入Rosetta-gami2表达菌，涂布于含有氨苄的LB琼脂平板上，37℃过夜培养，挑取氨苄LB琼脂平板上长出的阳性菌落保种并送华大基因测序鉴定目的基因，测序结果与目的基因一致，表示表达菌构建成功，记为rFIPVⅡ-S工程菌。
(3)发酵表达
取rFIPVⅡ-S工程菌于摇床37℃，250r/min，在含有氨苄的LB培养基中放大培养，测OD值在1.0时，加入54μg/ml的IPTG，32℃诱导表达过夜，于4℃、7500r/min离心30min收集菌体。﹣20℃与室温反复冻融菌体3次，并冰浴超声裂解菌体，功率：400W，工作8S，间隔2S，超声30min，于4℃、14000r/min离心15min弃沉淀取上清，得到粗制蛋白。
(4)粗制品纯化
使用AKTATM explorer蛋白纯化仪做亲和层析精纯蛋白：将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，用Elution buffer(50mM Tris-HCL 40mM还原性谷胱甘肽，pH8.0)梯度洗脱，收集rFIPVⅡ-S峰；过脱盐柱，用缓冲液(50mM Tris-HCL，pH6.5)置换，备用。
分别用Loading buffer(50mM Tris-HCL，pH6.5)平衡好柱体，上样后用Elutionbuffer(50mM Tris-HCL 1M NaCL，pH6.5)梯度洗脱，收集rFIPVⅡ-S峰。过分子筛层析柱，Elution buffer(50mM Na2HPO4 0.15M NaCL pH7.0)收集rFIPVⅡ-S峰；20倍柱体积PBS透析过夜，0.22μm无菌过滤处理，处理后样品即为纯化的目的蛋白，记为rFIPVⅡ-S。
(5)重组rFIPVⅡ-S蛋白验证
由于猫传染性腹膜炎病毒无相关商品化多抗和单抗，故本实施例使用表达载体上的标签蛋白结合蛋白大小作为验证手段。使用Abcam公司Anti-6X His tag单抗(货号ab18184)为一抗，Abcam公司HRP标记的山羊抗小鼠IgG H&L(货号ab6789)为二抗，进行Wb验证，在176kDa处有明显的阳性条带，如图1泳道4所示。表明重组蛋白rFIPVⅡ-S表达成功。
(6)rFIPVⅡ-S蛋白卵黄抗体的制备
选取4月龄健康蛋鸡进行免疫。rFIPVⅡ-S使用PBS稀释到1mg/mL，弗氏完全佐剂1：1乳化，以肌肉多点注射的方式进行首次免疫，每只鸡注射总量为2mL；14天后以相同方式进行加强免疫；第21天使用弗氏不完全佐剂1：1乳化，以肌肉多点注射的方式进行加强免疫。第28天翅静脉采血，琼脂双扩散法测定血清抗体效价，效价≥1:32时(如图2-3所示)开始收集鸡蛋，若不足，按上述方法补充免疫直到效价满足要求。
挑选完整未破损的鸡蛋，挑选完整未破损的鸡蛋清洗后，消毒风干后，蛋黄蛋清分离，收集蛋黄液，用1：9倍的蒸馏水稀释卵黄，调节pH至5.4，搅拌15min，置4℃过夜自然沉淀，以10000rpm，4℃离心30min去除脂类，收集上清液。加入等体积PBS稀释，再按体积1：1加入饱和硫酸铵，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。再用PBS溶解沉淀，离心去除不溶物，取上清液加入100m饱和硫酸铵至33％饱和度，4℃静置2h，10000rpm离心15min，弃上清。如此重复3次，可获较纯的IgY，20倍体积PBS透析过夜，经0.22μm无菌过滤获得rFIPVⅡ-S的IgY液体制剂(以下简称为rFIPVⅡ-S卵黄抗体)，以此为基础可根据需要做其他剂型。
3、猫传染性腹膜炎卵黄抗体的应用
于安徽农业大学动物医院选取1岁±1月的单纯FECV感染患猫33例，1岁±1月的单纯Ⅰ型FIPV感染患猫33例，1岁±1月的单纯Ⅱ型FIPV感染患猫33例，1岁±1月的Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染患猫33例，1岁±1月的健康猫66只。按如下方式分组，以每小组3只进行实验：
A-1组：FECV感染，使用rFECV-S卵黄抗体治疗；
A-2组：FECV感染，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体治疗；
A-3组：FECV感染，使用rFIPVⅡ-S卵黄抗体治疗；
A-4组：FECV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
A-5组：FECV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
A-6组：FECV感染，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
A-7组：FECV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：1质量比联合治疗；
A-8组：FECV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下2：1：1质量比联合治疗；
A-9组：FECV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：2：1质量比联合治疗；
A-10组：FECV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：2质量比联合治疗；
A-11组：FECV感染，不做治疗；
B-1组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体治疗；
B-2组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体治疗；
B-3组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFIPVⅡ-S卵黄抗体治疗；
B-4组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
B-5组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
B-6组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
B-7组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：1质量比联合治疗；
B-8组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下2：1：1质量比联合治疗；
B-9组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：2：1质量比联合治疗；
B-10组：Ⅰ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：2质量比联合治疗；
B-11组：Ⅰ型FIPV感染，不做治疗；
C-1组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体治疗；
C-2组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体治疗；
C-3组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFIPVⅡ-S卵黄抗体治疗；
C-4组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
C-5组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
C-6组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
C-7组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：1质量比联合治疗；
C-8组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下2：1：1质量比联合治疗；
C-9组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：2：1质量比联合治疗；
C-10组：Ⅱ型FIPV感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：2质量比联合治疗；
C-11组：Ⅱ型FIPV感染，不做治疗；
D-1组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFECV-S卵黄抗体治疗；
D-2组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体治疗；
D-3组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFIPVⅡ-S卵黄抗体治疗；
D-4组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
D-5组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
D-6组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合治疗；
D-7组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：1质量比联合治疗；
D-8组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下2：1：1质量比联合治疗；
D-9组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：2：1质量比联合治疗；
D-10组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：2质量比联合治疗；
D-11组：Ⅰ型和Ⅱ型FIPV混合感染，不做治疗；
E-1组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-2组：健康猫，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-3组：健康猫，使用rFIPVⅡ-S卵黄抗体预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-4组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-5组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-6组：健康猫，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-7组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-8组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下2：1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-9组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：2：1质量比联合预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-10组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：2质量比联合预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
E-11组：健康猫，不做预防，后使用FIPVⅠ型病毒攻毒；
F-1组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-2组：健康猫，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-3组：健康猫，使用rFIPVⅡ-S卵黄抗体预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-4组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-5组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-6组：健康猫，使用rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-7组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-8组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下2：1：1质量比联合预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-9组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：2：1质量比联合预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-10组：健康猫，使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下1：1：2质量比联合预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒；
F-11组：健康猫，不做预防，后使用FIPVⅡ型病毒攻毒。
按照上述6种分组方式，分别在6间隔离的病房中由6位饲养人员分别饲养，避免交叉污染。
其中，治疗方式为注射2mg每公斤体重，第1、3、5天注射一次，后每周注射一次，连续注射4周。预防方法为饮水5mg/只，连续饮水一周，后每周饮水一次，连续饮水4周。在治疗后采用qPCR方法取肛拭子检测其病毒含量，在预防后进行攻毒，攻毒3日后采用qPCR方法取肛拭子检测其病毒含量。qPCR检测引物分别如下：FECV检测引物为自行设计，Ⅰ型和Ⅱ型FIPV检测引物参考Addie D D，Schaap I A T，Nicolson L，et al.Persistence andtransmission of natural type I feline coronavirus infection[J].J GenVirol.2003，84(10)：2735-2744.引物序列如表1所示：
表1.qPCR检测引物
检测仪器使用ROCHE LightCycler 480，微量定量仪使用五义科技有限公司OneDropTM超微量分光光度计。检测试剂使用ROCHE SYBR Green Master货号4913914001。提取试剂使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0货号9766。反转录试剂使用TaKaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit。货号6110A。胶回收试剂盒使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0货号9762。质粒提取试剂盒使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0货号9760。肛拭子自备。
检测过程如下：
首先，标准品构建：三对引物分别扩增出相应的条带，然后做胶回收，再连接到18T载体，并导入到DH5α克隆菌中，分别涂布于氨苄抗性LB琼脂平板上，过夜培养分别挑取阳性克隆。并分别发酵100ml左右的阳性菌，分别提取质粒，分别使用ONEDROP微量定量仪测定其质粒浓度，并换算成拷贝数。
其次，样品测试：肛拭子内加0.5mL pH7.4 PBS挤捏充分润湿肛拭子，在距棉签端顶端2cm处记号笔做标记。猫固定后，肛拭子进入标记处，顺时针贴肠壁旋转5圈，使用套管内剩余PBS充分挤捏。各取200μL使用TaKaRa 9766提取核酸，使用TaKaRa 6110A进行反转录，后使用ROCHE 4913914001进行qPCR测试，同步设置5个浓度标准品对照，并设置空白对照。
其中，qPCR反应条件如下：94℃30sec，(94℃5sec，60℃10sec)×40cycles，95℃5sec，60℃1min，95℃acquisition，50℃30sec。
最后，数据分析：病毒拷贝数越低效果越好。实验结果如图3和表2所示：
表2.qPCR检测数据
结果表明：在单种或混合病毒感染情况下使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下按2：1：1质量比进行联合治疗效果都较好，尤其是在混合感染目前尚无特效药物的情况下的联合治疗效果；使用rFECV-S卵黄抗体、rFIPVⅠ-S卵黄抗体、rFIPVⅡ-S卵黄抗体相同效价下2：1：1质量比联合预防较其他组也有较好的效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽中起生物科技有限公司
<120> 一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物及其制备方法和应用
<141> 2022-05-19
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4377
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 1
ggatccatga ttgtgctggt gacctgtatc ctgctgctgt gcagctatca cactgtgtcc 60
tccacctcta acaacgattg tcgtcaagtt aacgttaccc agctggccgg taacgaaaac 120
ctgatccgtg atttcctgtt ccagagcttt aaagaggaag gtattgtagt ggttggtggc 180
tattacccga ctgaagtttg gtacaattgc tctcgcaccg ccaccaccac tgcgtatgaa 240
tacttcaaca acattcacgc tttctacttt gatatggagg caatggagaa ctctaccggc 300
aacgctcgtg gcaaacctct gctgttccac gtacacggcg aaccagtgag catcattatc 360
tacatttccg cttatggcga cgacgtgcag cagcgcccgc tgctggaaca tggtctgctg 420
tgcatcacta agaaccgtaa catcgattac aacacgttca cctctaacca atgggattcc 480
atctgcacgg gcaacgaccg taaaattcca ttttccgtga tcccgcgtga caacggcacc 540
aagatctatg gcctggaatg gaacgatgag ttcgttactg catatatctc cggccgcagc 600
tataactgga acatcaacaa caactggttc aataacgtta ctctgctgta ttcccgttcc 660
agcacggcta cttggcatca ctccgctgcg tatgtatacc agggtgtatc taacttcact 720
tattacaaac tgaacaacac caacggtctg aaaacctatg aattctgcga agactacgag 780
tactgtaccg gctacgcgac caacgtgttc gcgccgaccg tgggtggcta tattccggac 840
ggcttctctt ttaacaactg gttcctgctg accaactcct ctacctttgt ctccggtcgc 900
tttgttacta atcagccgct gctggtcaat tgtctgtggc cggttccgtc cttcggtgtt 960
gctgcccagg aattctgctt cgaaggtgca caattctctc agtgctctgg tgtttccctg 1020
aacaacaccg ttgatgtcat ccgttttaac ctgaacttca ctgccgatgt acagagcggt 1080
atgggcgcta ccgtgttctc tctgaacacc acgggtggcg taattctgga aatctcctgc 1140
tacaacgaca ccgtttccga aagctctttt tactcttatg gtgagattcc gttcggcatt 1200
accgacggtc cgcgctattg ctacgttctg tacaacggta ccgctctgaa atacctgggt 1260
acgctgccgc catctgtaaa ggaaattgcg atctccaaat ggggccactt ctatatcaac 1320
ggctacaatt tcttctccac cttcccgatt gattgcattt ctttcaacct gaccactggt 1380
gactctggcg cgttctggac tattgcatac actagctaca ccgaagcgct ggttcaggtt 1440
gagaacaccg ctatcaaaaa ggttacctac tgcaactctc acatcaacaa cattaaatgc 1500
agccagctga ctgccaacct gaacaacggc ttctacccgg tggcatcttc tgaagtgggc 1560
ctggttaaca agtccgtggt tctgctgccg atttttttcg ctcatactgc gattaacatt 1620
actattgacc tgggtatgaa acgttctggt tatggtcaac cgatcgcgtc caccctgtct 1680
aatatcaccc tgccaatgca ggataacaac accgacgtat actgcatccg ttctaaccag 1740
ttctccgttt atgtgcactc tatctgcaaa agcagcctgt gggataacat ctttaaccaa 1800
gaatgcaccg atgtactgga cgcaaccgcg gtgatcaaaa ctggcacctg cccgttcagc 1860
ttcgataagc tgaacaacta tctgactttc aacaaatttt gcctgtctct gtctccggtt 1920
ggtgctaact gcaaattcga cgtagccgct cgcacccgta ccaacgaaca ggtcgtacgc 1980
tctctgtacg taatctacga agagggcgac aacattgttg gtgtgccgtc tgacaacagc 2040
ggcctgcatg atctgtctgt tctgcacctg gattcttgta ccgaatacaa catctacggt 2100
cgcactggtg tgggcattat ccgtcagacg aactctactc tgctgagcgg tctgtattac 2160
acgtctctga gcggcgatct gctgggcttt aaaaacgtgt ccgatggtgt aatctacagc 2220
gtaactccgt gtgacgtgtc tgctcaggca gcggttatcg atggcgccat cgtcggtgct 2280
atgacgtcta ttaactctga actgctgggc ctgaaacatt ggaccactac cccgaacttc 2340
tactactact ctatttacaa ctacacgaac gaacgtactc gtggtaccgc catcgactcc 2400
aatgacgtcg actgcgaacc gatcatcacc tattctaaca tcggtgtttg caaaaacggt 2460
gccctggtct tcatcaacgt cactcactcc gacggcgatg ttcagccaat ctctacgggc 2520
accgttacta tcccaaccaa tttcaccatc agcgtgcagg tggagtacct gcaggtgtac 2580
accactccgg tatccatcga ttgcgcacgc tacgtctgta atggcaaccc gcgttgcaac 2640
aaactgctga ctcaatatgt atccgcctgt cagaccatcg aacaggctct ggcgatgggc 2700
gctcgcctgg agaacatgga agttgattct atgctgttcg tttctgaaaa cgcgctgaaa 2760
ctggcgagcg tggaagcatt caactccacc gaaaatctgg acccgatcta caaggagtgg 2820
ccgaacatcg gtggttcttg gctgggcggt ctgaaagaca ttctgccgtc tcacaattct 2880
aaacgtaaat atcgttccgc aattgaagac ctgctgttcg acaaagccgt gactagcggc 2940
ctgggtacgg tggacgagga ctacaaacgt tgtaccggcg gttacgatat cgcggacctg 3000
gtatgcgctc agtactacaa cggcatcatg gtactgccgg gcgtcgctaa cgacgacaaa 3060
atgaccatgt acactgcttc cctggcaggt ggtatcactc tgggcgccct gggcggtggc 3120
gcggtcgcga tcccgtttgc ggttgctgtg caggcacgcc tgaattacgt agccctgcag 3180
accgacgttc tgaacaaaaa ccagcaaatc ctggctaacg cgttcaacca ggctatcggt 3240
aacattaccc aggctttcgg taaagttaac gatgcgatcc accagacctc caaaggcctg 3300
gctacggttg ctaaagcact ggcgaaagtc caggacgtag tgaacaccca gggtcaagcc 3360
ctgtcccacc tgaccgtaca gctgcagaac aacttccagg caatcagctc cagcatctcc 3420
gacatttaca accgtctgga cgaactgagc gctgacgcac aggtcgatcg cctgatcacc 3480
ggccgtctga ccgctctgaa cgctttcgtt tcccagaccc tgacccgcca agcagaggtt 3540
cgcgcatctc gtcagctggc taaagacaaa gtcaacgaat gtgttcgtag ccagtcccag 3600
cgtttcggct tttgcggcaa tggcacccac ctgttctccc tggccaacgc tgcgccgaac 3660
ggtatgattt ttttccatac ggtactgctg ccgactgcat acgaaacggt gaccgcatgg 3720
ccgggcatct gtgcttccga cggcgatcgt acgttcggtc tggttgttaa agacgtccag 3780
ctgactctgt tccgtaacct ggacgataaa ttttacctga ccccgcgcac catgtaccag 3840
ccgcgtgccg ctaccagctc tgactttgtc cagatcgaag gttgcgacgt tctgttcgtt 3900
aacgcgaccg ttattgatct gccgagcatt atccctgact acattgacat caaccagacc 3960
gtacaggaca ttctggaaaa ctaccgtccg aactggaccg ttccggaact gaccctggac 4020
attttcaatg cgacctacct gaacctgacc ggtgaaatcg atgacctgga atttcgttct 4080
gagaaactgc acaataccac cgtcgaactg gctattctga tcgataacat caacaacacc 4140
ctggtgaacc tggaatggct gaaccgtatt gaaacttacg ttaagtggcc gtggtacgtt 4200
tggctgctga tcggtctggt ggtgatcttc tgcatcccgc tgctgctgtt ctgttgctgc 4260
agcaccggct gctgtggctg tatcggttgc ctgggtagct gctgtcatag catgtgttcc 4320
cgtcgccagt ttgagaatta cgaaccaatt gaaaaagtgc acgtacacta aaagctt 4377
<210> 2
<211> 4407
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 2
ggatccatga ttgttctgat cttcgcactg ctgagcaccg ctcgttctga agatgcaccg 60
catggtgtga ccctgcctca gtttaacact tcctctaaca accagaagtt tgaactgaac 120
ttctacaact ttctgcaaac ttgggatatc ccgccgaaca ctgaaaccat tctgggtggc 180
tacctgccgt actgtggtga tggcccgaac tgtggttggt acaacttcgt gtactcccaa 240
aacgtgggtc agaacggccg ccactcctat attaacacca aaaatctgaa catcccgaac 300
gttcacggtg tttacttcga cgtgcgtgaa cacaacagcg acggcctgtg ggatgctcgt 360
gaccgtgtag gtctgctgat tgcgatctac ggcacctctt attactctct gctgatggtg 420
ctgcaggaca aggttgaaga aaaccagccg cacgtagcag tgaaaatctg ccactggaaa 480
ccgggtaaca tctcctctta ccaccagttc tccgtgaacc tggaagatgg cggtcagtgc 540
gttttcaacc agcgtttcga cactgtcctg actgccaacg atttttatgg tttccagtgg 600
actgatactt acgtcgacat ctatctgggc ggcactatca ctaaagtttg ggttaacaat 660
gattggtctt ccgttgaagc gtctatttct tatcactgga accagatcaa ctacggttac 720
tatatccagt tcgtaaatcg taccacttat tacacctata acaatactgg cggctccaac 780
tatacccacc tgcagctggc ggaatgtcat tccgaatact gcgcgggtta cgccaagaac 840
gtcttcgttc caatcgatgg taaaattccg gaaagcttct ccttttctaa ctggttcctg 900
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<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
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Claims (9)
1.一种猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体在制备猫传染性腹膜炎治疗药物中的应用，其特征在于，所述猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体为通过重组猫肠道冠状病毒S蛋白免疫卵生动物后，再从卵生动物生产的蛋黄中提取获得。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组猫肠道冠状病毒S蛋白是以猫肠道冠状病毒毒株的S蛋白为参考，根据其基因序列，经宿主菌密码子优化后获得编码基因序列而获得的重组蛋白，编码该蛋白的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物，其特征在于，所述猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物是将权利要求1-2任一所述的猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体与Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体按相同效价下以(1-2)：(1-2)：(1-2)的质量比混合获得。
4.根据权利要求3所述的一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物，其特征在于，所述Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体是分别将重组Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白和重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白分别免疫卵生动物后，从卵生动物生产的蛋黄中提取得到的。
5.根据权利要求3所述的一种猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物，其特征在于，所述猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物是将权利要求1-2任一所述的猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体与Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体按相同效价下以2：1：1的质量比混合获得。
6.一种如权利要求3-5任一所述的猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别制备重组猫肠道冠状病毒S蛋白、Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白，备用；
(2)将重组猫肠道冠状病毒S蛋白、Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白分别对卵生动物进行免疫，至卵生动物血清抗体效价达到1：32以上时收集卵生动物的蛋；
(3)将收集到的蛋的蛋黄液分别进行纯化获得猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体、Ⅰ、Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体；
(4)将猫肠道冠状病毒S蛋白卵黄抗体与Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白卵黄抗体按相同效价下以(1-2)：(1-2)：(1-2)的质量比混合获得所述猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物。
7.根据权利要求6所述的猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物的制备方法，其特征在于，所述重组猫肠道冠状病毒S蛋白、重组Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白的制备步骤如下：
(1)分别取编码猫肠道冠状病毒毒株S蛋白、Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白的基因序列，并做大肠杆菌密码子优化，获得目的蛋白的核酸序列；
(2)对目的蛋白的核酸序列进行人工合成，连接到原核表达质粒pET32a中，获得含有目的基因的pET32a质粒，将含有目的基因的pET32a质粒用热击法导入到Rosetta-gami2表达菌中，涂布于氨苄抗性的LB琼脂平板上，挑取阳性菌落，分别获得rFECV-S工程菌、rFIPVⅠ-S工程菌以及rFIPVⅡ-S工程菌；
(3)分别取rFECV-S工程菌、rFIPVⅠ-S工程菌以及rFIPVⅡ-S工程菌进行发酵培养和纯化，即得重组猫肠道冠状病毒S蛋白、重组Ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白及重组Ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒S蛋白。
8.根据权利要求6所述的猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物的制备方法，其特征在于，所述卵生动物为鸡。
9.一种如权利要求3-5任一所述的猫传染性腹膜炎卵黄抗体组合物在制备猫传染性腹膜炎治疗药物中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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