BR112012017837B1

BR112012017837B1 - método para determinar se o vírus da peritonite infecciosa felina (fipv) está presente em uma amostra e uso

Info

Publication number: BR112012017837B1
Application number: BR112012017837-7A
Authority: BR
Inventors: Petrus Josephus Marie Rottier; Hui Wen Chang; Herman F. Egberink
Original assignee: Universiteit Utrecht Holding B.V.
Priority date: 2010-01-18
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2021-02-17
Also published as: JP5926194B2; US9796996B2; DK2526209T3; EP2526209B1; CN102791886A; KR20120130759A; US20130071833A1; AU2011205863B2; AU2011205863A1; MX2012008387A; BR112012017837A2; CA2787385A1; CA2787385C; JP2013516983A; CN102791886B; EP2526209A1; PL2526209T3; ES2534362T3; WO2011087366A1

Abstract

MÉTODO PARA DETERMINAR SE O VÍRUS DA PERITONITE INFECCIOSA FELINA (FIPV) ESTÁ PRESENTE EM UMA AMOSTRA, PAR DE PRIMER COMPREENDENDO UMA SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE OU ISOLADO, SONDA, ANTICORPO OU EQUIVALENTE FUNCIONAL DIRIGIDO ESPECIFICAMENTE CONTRA UM EPÍTOPO DE UMA PROTEÍNA DA ESPÍCULA FIPV, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E USO A presente invenção provê métodos e meios para distinguir FECV e FIPV, e métodos e meios para determinarem se o FIPV está presente em uma amostra. Adicionalmente são providos primers e sondas para detecção da sequência do ácido nucléico específico de FIPV codificante de uma proteína da espicula, anticorpos para detecção de um FIPV, e uma composição imunogênica, e o uso da mesma para extração de uma resposta imune contra um coronavírus felino, proferivelmente, um FIPV.

Description

MÉTODO PARA DETERMINAR SE O VÍRUS DA PERITONITE INFECCIOSA FELINA (FIPV) ESTÁ PRESENTE EM UMA AMOSTRA E USO

Campo da invenção

[001] A invenção refere-se ao campo do diagnóstico veterinário, mais especificamente, a invenção se refere ao campo dos coronavírus felinos e a identificação dos mesmos.

[002] Os coronavírus felinos (FCoVs) são patógenos comuns de felinos domésticos e felinos não-domésticos, incluindo mas não limitados aos gatos, leões, tigres, leopardos, jaguar, linces, gato selvagem da África e Ásia (“caracals”), chita, pumas e gatos selvagens da floresta (“servals”). No meio doméstico de múltiplos gatos, até 90% de soropositividade de FCoV é alcançada. Os FCoV são proximamente relacionados aos coronavírus caninos (CCoV) e transmissíveis pelo vírus da gastroenterite (TGEV) de suínos. Dois sorotipos, I e II, existem de FCoV, dos quais o sorotipo I predomina, com 80-95% de infecções FCoV. O tipo II de FCoV resulta, presumivelmente da recombinação do RNA em animais duplamente infectados pelo sorotipo I de FCoV e CCov, durante o que um gene da espícula de CCoV ou parte do mesmo é incorporado dentro do genoma de FCoV, aparentemente um evento não frequente de ocorrência. O coronavírus entérico felino (FECV) é o tipo patógeno mais comum de FCov, para ambos os sorotipos I e II. O FECV é principalmente confinado aos intestinos, disseminando-se via rota oral-fecal, e é altamente contagioso. A infecção de FECV geralmente ocorre não aparentemente; algumas vezes, entretanto, ele causa sintomas, tais como, enterite branda (Haijema et al., 2007).

[003] Nas peritonites infecciosas felinas dos anos 1970 (FIP), uma (então) rara, mas séria doença nos gatos foi reportada por ser causada por um coronavírus felino, que foi chamado de vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV). Contrariamente ao FECV, o FIPV é altamente virulento, a infecção FIPV pode ser tanto granulomatosa (seca) quanto efusiva (úmida) e é uma doença progressiva e usualmente fatal. Os sintomas de FIP incluem falha no desenvolvimento de gatos jovens, mancar, febre flutuante, inapetência e perda de peso resultando em morte (Pedersen, 2009). Uma desregulagem dramática do sistema imune adaptativo acompanhada da progressão de FIP como demonstrado por meio da hiper-gamaglobulinemia e depleção dos linfoides e células T periféricas (Haijema et al., 2007). Embora FECV seja confinado aos intestinos, o FIPV é capaz de infectar e replicar em monócitos e macrófagos causando doença sistêmica com múltiplos órgãos sendo afetados.

[004] Duas teorias prevalecentes existem em relação a origem de FIPV. De acordo com a “hipótese de mutação”, o FIPV originou de FECV por meio de uma nova mutação em felinos infectados resultando em um vírus FIP altamente virulento. A mutação resultando no FIPV não foi identificada, mas foi proposta por ser em um gene não estrutural 3c, 7a ou 7b (ver figura 1), que codifica proteínas com funções desconhecidas (Vennema et al., 1998), Poland et al., 1996, Kennedy et al., 2001, Pedersen 2009). Portanto, acredita-se que uma mutação no gene 3c, 7a ou 7b ou uma combinação de mutações nesses genes altere as propriedades biológicas dos vírus permitindo que o coronavírus entérico infecte os monócitos e macrófagos, espalhando, desse modo, a infecção aos órgãos e causando FIP (Pedersen, 2009); a transição de FECV para FIPV. A hipótese da mutação não foi formalmente provada.

[005] De acordo com uma outra teoria, duas cepas distintas de FECV circulam na população natural, uma cepa virulenta e a outra não virulenta, e apenas os felinos infectados pela cepa virulenta irão desenvolver FIP (Brown et al., 2009). Brown et al., (2009) isolaram sequências virais de gatos sofrendo de FIP, e a partir de gatos FECV infectados, mas assintomáticos (saudáveis). Usando análise filogenética, eles descobriram que sequências virais distintas estão presentes em gatos doentes e em gatos saudáveis. Dye e Siddell (2007) compararam as sequências virais de coronavírus felinos isolados a partir do jejuno e de fígado de um gato sofrendo de FIP. De acordo com a teoria da mutação, FECV é confinado aos intestinos, enquanto FIPV, que é capaz de infectar macrófagos e monócitos, está presente no fígado. Assim, Dye e Siddell descobriram 100% da identidade de nucleotídeo e, assim, questionaram a hipótese da mutação de acordo com a qual o coronavírus do fígado é um coronavírus de jejuno mutado. Eles sugeriram que em gatos sofrendo de FIP, a mesma cepa de coronavírus felino virulento estava presente em ambos, fígado e jejuno.

[006] Previamente, os inventores da presente invenção identificaram um número de diferenças na proteína da espícula do tecido de coronavírus felinos sorotipo II adaptado a cultura de tecido FECV 79-1683 e FIPV 79-1146 não são coronavírus felinos prototípicos e não são assim representativos para o sorotipo I de FECV e FIPV, muitos gatos são infectados com (Pedersen 2009). Primeiramente, o sorotipo II de coronavírus felino origina de recombinação de RNA de coronavírus caninos e felinos e contem a proteína da espícula de coronavírus canino. As proteínas da espícula de coronavírus felino e canino têm apenas aproximadamente 45% da identidade da sequência de aminoácidos (Motokawa et al., 1996). Em segundo lugar, FECV 79-1683 e FIPV 79-1146 são adaptadas à cultura de tecido para outras linhas celulares além dos macrófagos. Devido ao FIPV infectar os monócitos e macrófagos in vivo, o tropismo dessas cepas de laboratório difere dos coronavírus felinos prototípicos. Em terceiro lugar, o FIPV 79-1146, distinta do sorotipo I de FIPV que infecta os monócitos e macrófagos é excepcionalmente virulento em cada rota comum de infecção (Pedersen, 2009). Em quarto lugar, FECV 79-1683 não pode ser qualificado como um FECV verdadeiro como argumentado extensivamente por Pedersen em sua revisão recente (Pedersen, 2009). Notavelmente, FECV 79-1683 perde muito dos genes 7b, que está presente nas cepas adaptadas a cultura de não tecido de FECV e tem uma mutação deletéria em seu gene 3c, indicando que ela pode ter originada de um FIPV.

[007] A infecção de coronavírus felino é geralmente demonstrada por meio da presença de anticorpos no sangue. Um tratamento eficaz ou vacina para a infecção FIPV não existe. O gato desenvolveu FIP morre dentro de dias ou semanas no caso de FIP efusivo ou meses, no caso de FIP seco ou granulomatoso. Uma vacina comercialmente disponível consiste de um mutante sensível a temperatura de uma cepa de FIPV não tem provado convincentemente sua eficácia protetora em um número de estudos de imunização (McArdle et al., 1995; Fehr et al., 1997). Além disso, até a presente data, não existe nenhum teste de diagnóstico para discriminar entre FECV e FIPV.

[008] Um fator de complicação adicional é que a figura clínica de FIP é altamente variável e, como consequência, a doença não pode ser facilmente estabelecida sem equívocos. O diagnóstico é frequentemente uma conjectura, com base no histórico da doença, nos parâmetros clínicos e não específicos de laboratório. Porque não existe um teste específico de diagnóstico para FIPV, também não é frequentemente possível discriminar entre FIP e outras doenças com sobreposição de sintomas. Ambos os testes de diagnósticos para e as vacinas contra FIPV são altamente necessários devido ao curso progressivo e debilitante de FIP.

[009] É um objetivo da presente invenção a provisão de meios e métodos para distinguir FIPV e FECV.

[010] Os inventores da presente invenção descobriram que FIPV hospeda uma alteração específica relativa ao FECV na proteína da espícula no aminoácido da posição 1049 como representado na figura 2B.

[011] A invenção provê, portanto, um método para identificação do vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV) compreendendo a determinação da identidade de um aminoácido de uma proteína da espícula de coronavírus felino em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049 como representado na figura 2B; e a identificação do coronavírus felino como FIPV, se determinada à identidade do aminoácido não for uma metionina. De acordo com esse método da invenção, FECV é identificado se a identidade determinada do aminoácido é metionina.

[012] Com a identificação de FIPV ou FECV significa que a identificação de um coronavírus felino do tipo virulento (FIPV) ou um tipo não virulento (FECV). A identificação é realizada pela determinação da identidade de um aminoácido e/ou da sequência de ácido nucléico do referido coronavírus felino.

[013] Uma sequência de ácido nucléico de coronavírus felino compreende uma cadeia de nucleotídeos, preferivelmente, (c)DNA ou RNA, que é parte de um coronavírus felino ou obtida a partir de um coronavírus felino, tanto diretamente, quanto após o processamento, tal como, por exemplo, pelo uso de PCR de transcriptase reversa, e/ou amplificação.

[014] Uma proteína da espícula de coronavírus felino é uma proteína de membrana compreendendo um ectodomínio. A proteína da espícula é uma das quatro proteínas estruturas canônicas do coronavírus e é responsável pela ligação a e entrada do vírus dentro da célula durante a infecção.

[015] FIPV obtido de lesões de gatos com FIP patologicamente confirmado foram comparados geneticamente com FECV obtido de gatos assintomáticos. As lesões típicas de FIP foram lesões (pio)granulomatosas apresentadas em diferentes órgãos internos, principalmente no baço, fígado, pulmão, rins, ou linfonodo mesentérico. Devido às altas taxas de mutação das viroses RNA, numerosas diferenças foram observadas entre as sequências FECV e FIPV individuais. Entretanto, em todos os 47 isolados de FECV em fezes e plasma, o aminoácido na posição 1049 da proteína da espícula como representado na Figura 2B é a metionina, enquanto em 52 fora da lesão FIPV 54 isola uma alteração do aminoácido na posição 1049 como representado na figura 2B está presente resultando em um outro aminoácido nessa posição além de metionina. Foi descoberto mais tarde que cindo sequências classificadas como derivadas de gatos saudáveis foram atualmente derivados de amostras de sangue de gatos com FIP confirmado (Q093501030_326B_4546.scf; Q093501032_327B_4546.scf; Q093501036_321S_4546.scf; Q093501038_321A_4546.scf e Q093501046_K11_019.ab1), significando que a identidade do aminoácido na posição correspondente à posição 1049 como representado na figura 2B foi determinado e demonstrado por ser metionina em 42, ao invés de 47, as amostras de FECV em fezes ou plasma isoladas de gatos saudáveis.

[016] A sequência de ácido nucléico codificante de metionina na posição 1049 da proteína da espícula de FECV corresponde ao códon compreendendo nucleotídeos na posição 3245, 3246 e/ou 3147 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino como representado na figura 2A. A sequência de nucleotídeo codificante da metionina na proteína da espícula de FECV na posição 1049 como representada na figura 2A, é adenina-timina-guanina (a-t-g), que corresponde com a sequência adenina-uridina-guanina (a-ug) no RNA genômico viral. Qualquer substituição de pelo menos um nucleotídeo nesse códon de nucleotídeo resulta em um outro aminoácido além da metionina na proteína da espícula de FECV na posição 1049 como representado na figura 2B. De acordo com a presente invenção, o nucleotídeo identificado e/ou a sequência de aminoácido no nucleotídeo das posições 3145, 3146 e/ou 3147 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, e o aminoácido na posição 1049 respectivamente como representado nas figuras 2A e 2B é utilizado para discriminar entre FIPV e FECV. Com a presente invenção para o primeiro período de um polimorfismo do coronavírus felino que capacita a distinção de FECV e FIPV foi identificado nos sorotipos prototípicos I FECV e FIPV.

[017] Os inventores da presente invenção descobriram ainda que uma parte significante da pequena porcentagem de FIPV que não guarda a alteração específica em relação ao FECV na proteína da espícula no aminoácido na posição 1049 como representado na figura 2B guarda uma alteração específica em relação ao FECV na proteína da espícula no aminoácido na posição 1051 como representado na figura 2B. Nesses casos, uma serina nessa posição parece ter sido substituída. Assim, a alteração específica no aminoácido na posição 1051 também prove uma abordagem para identificar FIPV.

[018] A invenção prove, também, portanto, um método para identificação do vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV) compreendendo a determinação da identidade de um aminoácido de uma proteína da espícula de coronavírus felino em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051 como representado na figura 2B, e a identificação do coronavírus felino como FIPV, se a identidade determinada do aminoácido não for uma serina. Também provido é um método para determinação se o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV) está presente em uma amostra, compreendendo a determinação se a referida amostra compreende um coronavírus felino, e se um coronavírus felino está presente, determinando a identidade de um aminoácido em uma proteína da espícula do referido coronavírus felino em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051 como representado na figura 2B, e a determinação que o PIPV está presente, se o referido aminoácido não for serina.

[019] Em um conjunto de 97 gatos com FIP confirmado patologicamente, em 87 das 97 lesões FIPV isolados de uma alteração de aminoácido na posição 1049 como representado na figura 2B está presente resultando em um outro aminoácido nessa posição além da metionina. Em cinco das dez lesões FIPV isolados nos quais uma metionina estavam presentes na posição 1049, como representado na figura 2B, uma alteração do aminoácido na posição 1051 como representado na figura 2B estava presente resultando em um aminoácido nessa posição além da serina. A sequência de ácido nucléico codificante da serina na posição 1051 da proteína da espícula de FECV corresponde ao códon compreendendo os nucleotídeos nas posições 3151, 3152 e 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino como representado na figura 2A. A serina é codificada pelos códons de nucleotídeos t/u-c-t/u, t/u-c-c, t/u-c-a, t/u-c-g, c-g-t/u e c-g-c. Qualquer substituição de um ou mais nucleotídeos nesse códon de nucleotídeos resultando em uma outra sequência de nucleotídeos além desses códons resulta em um outro aminoácido além da serina na proteína da espícula de FECV na posição 1051 como representado na figura 2B. De acordo com a presente invenção, o nucleotídeo identificado e/ou a sequência de aminoácido tanto os nucleotídeos nas posições 3151, 3152 e/ou 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula de coronavírus felino, e/ou o aminoácido na posição 1051 da proteína da espícula respectivamente, como representado nas figuras 2A e 2B, também é utilizado para discriminar entre FiPV e FECV. Em uma concretização preferida, uma alteração de uma serina em um aminoácido na posição correspondente a posição 1051 como representado na figura 2B é o resultado de uma substituição do nucleotídeo timina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3151 como representado na figura 2A com a nucleobase guanina.

[020] Em uma concretização, a identidade dos aminoácidos em uma proteína da espícula de um coronavírus felino nas posições correspondentes aos aminoácidos nas posições 1049 e 1051, como representado na figura 2B são ambos determinados. Se a identidade de ambos esses aminoácidos é determinada, uma alta precisão na distinção de FIPV e FECV é obtida. Em uma concretização, a identidade dos aminoácidos nas posições 1049 e 1051, como representado na figura 2B é determinada em um teste. Entretanto, também é possível determinar a identidade desses aminoácidos sequencialmente. Por exemplo, primeiro a identidade do aminoácido em uma posição correspondente á posição 1049 como representado na figura 2B é determinada. Se a presença de uma metionina é detectada nessa posição, subsequentemente, a identidade do aminoácido em uma posição correspondente à posição 1051 como representado na figura 2B é preferivelmente determinada. Se a presença de um outro aminoácido além da metionina for detectada nesse posição, a determinação da identidade do aminoácido em uma posição correspondente à posição 1051 como representado na figura 2B pode ser omitida. Entretanto, a identidade do aminoácido nessa posição pode também ser determinada nesse caso.

[021] Uma sequência de ácido nucléico do gene da espícula (nucleotídeos 1-4407) do coronavírus felino compreendendo os nucleotídeos 20395-24801, como representado na sequência de genes com número de acesso NC_012955 (Coronavírus felino UU10, genoma completo) e os nucleotídeos 20382-24788 como definido na sequência de genes com número de acesso NC_012952 (coronavírus felino UU8, genoma completo) está presente na figura 2A. Os nucleotídeos 20395-24801 de NC_012955 codificam a proteína da espícula do coronavírus felino (YP_003038574). Os nucleotídeos 20382-24788 de NC_012952 codifica a proteína da espícula do coronavírus felino (YP_003038543). Assim, os nucleotídeos 3145, 3146 e 3147 do gene codificante da proteína da espícula como utilizado durante a descrição e como representado na figura 2 A corresponde aos nucleotídeos 23539, 23540 e 23541 do genoma completo como definido na sequência de NC_012955 e/ou nucleotídeos 23526, 23527 e 23528 do genoma completo como definido na sequência NC_012952. Os nucleotídeos 3151, 3152 e 3153 do gene codificante da proteína da espícula como utilizado durante a descrição e como representado na figura 2A corresponde aos nucleotídeos 23545, 23546 e 23547 do genoma completo como definido na sequência de NC_012955 e/ou nucleotídeos 23532, 23533 e 23534 do genoma completo como definido na sequência de NC_012952.

[022] A sequência de aminoácido de uma proteína da espícula do coronavírus felino referindo a numeração do aminoácido definido na sequência de YP_003038574 e YP_003038543 que são traduções parciais de NC_012955 e NC_012952 respectivamente foi apresentada na figura 2B. O numero de posições de aminoácidos como utilizado durante a descrição se refere aos aminoácidos nas posições como definido em YP_003028574 e/ou YP_003038543. Um técnico no assunto é capaz de identificar as posições do nucleotídeo e do aminoácido em qualquer sequência determinada de coronavírus felino que corresponde ao nucleotídeo nas posições 3245, 3146 e/ou 3147 e ao aminoácido na posição 1049 e ao nucleotídeo nas posições 3151, 3152 e/ou 3153 e ao aminoácido na posição 1051 como representado nas figuras 2A e 2B, por exemplo, usando o software de alinhamento tal como “Alinhamento 2” ou “Biocondutor”.

[023] Os sintomas de FIP incluem, por exemplo, o acúmulo ou fluido ascítico dentro do abdome (apenas em FIP efusivo), retardo de crescimento, perda de apetite, febre, perda de peso e diarréia. Como indicado aqui acima, sintomas similares são também observados com gatos sofrendo de outras doenças, fazendo diagnósticos inequívocos de FIP até o momento impossível. Agora que um polimorfismo tem sido identificado para a proteína da espícula do coronavírus felino que permite a determinação da presença de FIPV em uma amostra pode ser determinada se um felino, por exemplo, um gato, sofre de FIP. Devido ao fato de atualmente não existir tratamento para FIP, e o curso da doença ser progressivo e debilitante, resultando inevitavelmente em morte, pode ser decidido pela eutanásia do referido gato quando o animal demonstrar transmissão de FIPV. Em adição, o gato ou o próprio criador pode tomar medidas adequadas para prevenir uma possível disseminação da infecção e/ou reduz as condições de pré-disposição tal como estresse. Entretanto, quando FIPV demonstrou ser ausente em um gato, a peritonite infecciosa felina pode ser eliminada como uma causa possível da doença. Portanto, nesse caso o gato pode não ser morto por eutanásia, mas o diagnóstico alcançado pode ser continuado e o animal pode ser encaminhado a um tratamento para os sintomas alternativos possíveis da doença, os quais são parecidos com aqueles de FIP. O referido tratamento pode, por exemplo, ser um tratamento sintomático adicional ou a aplicação de antibióticos para contração de uma bactéria possível da causa da doença.

[024] É ainda provido pela invenção, portanto, um método para determinação se o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV) está presente em uma amostra, compreendendo preferivelmente, de um felino ou de uma substância que esteve em contato com um felino, determinando se a referida amostra compreende um coronavírus felino e, se um coronavírus felino está presente, determinando a identidade de um aminoácido em uma proteína da espícula do referido coronavírus felino, em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049 e/ou 1051, como representado na figura 2B, e a determinação que FIP está presente, se o referido aminoácido, no aminoácido da posição 1049 não é metionina e/u se o referido aminoácido, no aminoácido da posição 1051 não é serina.

[025] Uma amostra compreendendo coronavírus entérico felino, vírus da peritonite infecciosa felina, proteína (espícula) do coronavírus felino ou ácido nucléico do coronavírus felino pode ser obtida a partir de qualquer felino diretamente ou indiretamente. A referida amostra pode, por exemplo, ser obtida a partir de qualquer tecido de felino ou fluido ou produto de excreção. Os tecidos de felino, fluidos ou produtos de excreção, a partir do qual a referida amostra foi obtida inclui, mas não estão limitados as lesões FIP, sangue, células brancas do sangue, plasma sanguíneo, soro sanguíneo, saliva, edema, urina, fezes, pele, músculo, linfonodos, e fígado. Uma amostra de acordo com a invenção que foi obtida indiretamente a partir de um felino pode compreender qualquer material que contém tecido de felino, fluido ou produto de excreção, tal como, por exemplo, sujeira ou resíduos de gato. Em uma concretização preferida da invenção, uma amostra foi obtida a partir de uma lesão FIP, fezes, sangue e/ou edema. Em uma concretização mais preferida, uma amostra foi obtida a partir das células brancas do sangue. As amostras de sangue são relativamente fácies de ser obtida a partir de um animal, e as células brancas do sangue são facilmente isoladas a partir de uma amostra subsequente do sangue. Os inventores da presente invenção descobriram que em 29 ou 31 amostras de células brancas do sangue obtidas a partir de gatos nas quais uma alteração do aminoácido em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049, como representado na figura 2B foi detectada em uma amostra de lesão FIP, a alteração do referido aminoácido estava também presente nas amostras de célula brancas do sangue. Assim, a detecção de uma alteração de um aminoácido é apuradamente detectada em amostras de célula brancas do sangue em felinos.

[026] Quando um felino for suspeito de sofrer de uma infecção de coronavírus felino, um ácido nucléico de coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula, através do qual o ácido nucléico compreende os nucleotídeos nas posições 3145, 3146, e/ou 3147 e/ou os nucleotídeos nas posições 3151, 3152 e/ou 3153, como representado na figura 2A, podem ser detectados em uma amostra obtida a partir do referido felino. Uma amostra obtida do referido felino pode compreender o ácido nucléico do coronavírus felino, ou isolado a partir do ácido nucléico do coronavírus felino. Opcionalmente, um ácido nucléico do coronavírus felino compreendendo os nucleotídeos nas posições 3145, 3146, e/ou 3147 e/ou os nucleotídeos nas posições 3151, 3152 e/ou 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A, é amplificado antes da detecção. Uma amostra de acordo com a invenção pode compreender ainda o coronavírus felino ou as proteínas do coronavírus felino incluindo, mas não limitado à proteína da espícula.

[027] De acordo com a presente invenção, a presença de metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049 de um coronavírus felino como representado na figura 2b é indicativo de FECV e a presença de qualquer outro aminoácido além de metionina na referida posição é indicativo de FIPV. Assim, a presença de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e/ou valina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049 de um coronavírus felino como representado na figura 2B é indicativo de FIPV. Em uma concretização preferida da presente invenção, o outro referido aminoácido além da metionina é leucina. A presença de qualquer outro aminoácido além da serina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051 de um coronavírus felino, como representado na figura 2B é indicativo de FIPV. Assim, a presença de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, treonina, triptofano, tirosina e/ou valina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051 de um coronavírus felino como representado na figura 2B é indicativo de FIPV. Em uma concretização preferida da invenção, dito outro aminoácido além da serina é alanina.

[028] A presença da nucleobase adenina (a) em uma posição corresponde ao nucleotídeo na posição 3145 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A, a nucleobase timina (t) em uma posição corresponde ao nucleotídeo na posição 3146 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2 A e a nucleobase guanina (g) na posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3147 do gene codificante de uma proteína da espícula de coronavírus felino como representado na figura 2A é indicativo de FECV e a presença de qualquer outra nucleobase além de adenina (a) em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino como representado na figura 2A, e/ou qualquer outra nucleobase além da timina (t) em uma posição correspondente ao nucleotídeo da posição 3146 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A e/ou qualquer outra nucleobase além de guanina (g) em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3147 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A é indicativo de FIPV. Assim, a presença de nucleobase timina (t), e/ou citosina (c), e/ou guanina (g) em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A, e/ou a nucleobase adenina (a), e/ou a citosina (c), e/ou guanina (g), em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3146 do gene codificante de uma proteína, como representado na figura 2A, e/ou a nucleobase adenina (a), e/ou a timina (t), e/ou a citosina (c) em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3147 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A é indicativo de FIPV, coronavírus felino é um vírus RNA. Portanto, quando um nucleotídeo é identificado aqui como timina, uma uracila também é abrangida pelo referido termo, como é conhecido por um técnico no assunto.

[029] Portanto, a invenção provê um método de acordo com a invenção, onde a identidade do aminoácido na posição 1049 é determinada através da determinação de uma sequência de ácido nucléico de um ácido nucléico de coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula, dito ácido nucléico compreendendo um nucleotídeo na, ou correspondente ao, da posição 3145, 3146 e/ou 3147 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A. Em uma concretização preferida, uma citosina ou timina ou guanina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3146 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A é indicativo de FIPV, e uma adenina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A é indicativo de FECV. A invenção também provê um método de acordo com a invenção, onde a identidade do aminoácido na posição 1051 é determinada através da determinação de uma sequência de ácido nucléico de um ácido nucléico de coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula, dito ácido nucléico compreendendo um nucleotídeo na, ou correspondente a, posição 3151, 3152 e/ou 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A.

[030] Os coronavírus são vírus RNA. O RNA viral pode ser isolado e processado com os métodos conhecidos do estado da técnica. Por exemplo, as amostras RNA podem ser preparações frescas a partir das células ou tecidos no momento da coleta, ou eles podem ser preparados a partir das amostras que são armazenadas a -70°C até o processamento para preparação da amostra. Alternativamente, os tecidos ou amostras celulares podem ser armazenados sob condições que conservam a qualidade do RNA. Exemplos dessas condições de conservação são a fixação usando, por exemplo, formalina, inibidores de RNase, tais como, RNAsin (Pharmingen) ou RNasecure (Ambion), soluções aquosas tais côo RNAlater (Assuragen), efeito protetor do solvente orgânico mediado por tampão ácido HepesGlutâmico (HOPE), e RCL2 (Alphelys), e soluções não aquosas, tais como Fixador Molecular Universal (Sakura Finetek USA, Inc.). O RNA pode, por exemplo, ser isolado de acordo com o método de Chomczynski e Sacchi (1987) ou o método de Boom et al. (1990), ou os sistemas comercialmente disponíveis (tais como, o kit de isolamento do RNA total RNeasy, da QIAGEN, Alemanha ou o Kit de isolamento de RNA de alta pureza (“HighPure-RNA-Isolation-Kit®), obtido na Roche Diagnostics, Basel, Suíça). Alternativamente, ou adicionalmente, o RNA é de transcrição reversa dentro do cDNA. A reação em cadeia de polimeriza de transcriptase reversa (RT-PCR) é, por exemplo, realizado usando primers específicos que hibridizam em uma sequência de RNA de interesse e uma enzima de transcriptase reversa. Além disso, o RT-PCR pode ser realizado com primers aleatórios, tal como, por exemplo, hexâmeros aleatórios ou decâmeros que hibridizam aleatoriamente junto ao RNA, ou oligo d(T) que hibridizam a cauda do poli(A) do mRNA, e a enzima da transcriptase reversa.

[031] A amplificação dos nucleotídeos derivadas do coronavírus felino, tanto diretamente quanto após o RT-PCR pode ser realizado usando qualquer método de amplificação do ácido nucléico, tal como a reação em cadeia de polimerase (PCR; Mullis e Faloona, 1987) ou por meio do uso de reações de amplificação, tal como reação em cadeia de ligase (LCR; Barany, 1991), A replicação da sequência de auto-sustentação (3SR; Guatelli et al., 1990), Amplificação de deslocamento de fita (DAS; Walker et al., 1992), Sistema de amplificação por transcrição (TAS; Kwoh et al., 1989). A replicase Q-Beta (Lizardi et al, 1988), Amplificação de enrolamento circular (RCA; U.S. Patente No. US 5,871,921), Amplificação baseada na sequência de ácido nucléico (NASBA; Compton, 1991), Polimorfismo de extensão do fragmento de clivagem (Patente norte-americana No.: US 5,719,028), Amplificação iniciada no primer quimérico e isotérmico do ácido nucléico (ICAN), Método de amplificação de extensão por ramificação (RAM; patentes norte-americanas Nos.: US 5,719,028 e US 5,942,391) ou outros métodos apropriados para amplificação dos ácidos nucléicos.

[032] Como utilizado aqui, o termo “ácido nucléico” ou “molécula de ácido nucléico” compreende uma cadeia de nucleotídeos, preferivelmente, DNA e/ou RNA.

[033] O termo “primer” como utilizado aqui se refere a um oligonucleotídeo que é capaz de anelamento para amplificação do alvo permitindo que uma DNA-polimerase se liga, servindo, desse modo, como um ponto de início de síntese do DNA quando colocado sob condições nas quais a síntese do produto de extensão do primer é induzida, ou seja, na presença de nucleotídeos e, um agente para polimerização, tal como DNApolimerase e em uma temperatura adequada. Um primer de amplificação é, preferivelmente, de fita única para eficiência máxima na amplificação. Preferivelmente, um primer é um oligodesoxirribonucleotídeo. Um primer deve ser suficientemente longo para iniciar a síntese dos produtos de extensão na presença do agente para polimerização. O comprimento exato dos primers irá depender de muitos fatores, incluindo temperatura e composição (A/T no conteúdo G/C) do primer. Um par de primer consiste de um sequencial e um reverso, como comumente utilizado na técnica de amplificação do DNA, tal como na amplificação por PCR.

[034] O termo “sonda” se refere a uma sequência de oligonucleotídeo de fita simples que irá reconhecer e formar uma dupla ligação de hidrogênio com uma sequência complementar em um analito (“analyte”) da sequência de ácido nucléico alvo ou seu derivado de cDNA. Para facilitar a detecção da ligação, uma sonda de detecção do amplicon específico pode compreender uma porção marcada, tal como, um fluoroforo, um cromóforo, uma enzima ou um radiomarcado, de modo a facilitar o monitoramento da ligação das sondas para o produto de reação da reação de amplificação. Os referidos marcadores são bem conhecidos daqueles técnicos no assunto e incluem, por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC). A [beta]-galactosidase, a peroxidase de rábano silvestre, estreptavidina, biotina, digoxigenina, ˂35˃S, ˂14˃C, ˂32˃P e ˂125˃I.

[035] Um primer ou sonda de acordo com a invenção compreende uma sequência de ácido nucléico, preferivelmente, DNA e/ou RNA. A referida sequência de ácido nucléico também abrange outros tipos de estruturas de ácido nucléico, tal como, por exemplo, uma hélice DNA/RNA, ácido nucléico de peptídeo (PNA), e/ou ácido nucléico travado (LNA). Portanto, o termo “sequência de ácido nucléico” também abrange uma cadeia compreendendo nucleotídeos não naturais, nucleotídeos modificados e/ou blocos de construção não nucleotídeos que apresentam a mesma função como nucleotídeos naturais.

[036] A hibridização é conhecida na técnica e refere-se a combinação da complementariedade, ácidos nucléicos de fita simples, preferivelmente sob condições de severidade. O termo “complementar” ou “sequência de complementariedade” também é conhecido da técnica e refere-se a duas fitas de ácido nucléico que pode ser conectada não-covalentemente pelos pares de base. Como utilizado aqui, “complementariedade” ou “substancialmente complementar” significa que duas sequências de ácido nucléico tem pelo menos cerca de 70%, preferivelmente, cerca de 80%, mais preferivelmente, 90%, e mais preferivelmente, cerca de 95% da complementariedade da sequência uma da outra. Isto significa que os primers e sondas devem apresentar complementação suficiente para seu padrão e o ácido nucléico alvo, respectivamente, para hibridizar sob condições severas. Portanto, as sequências de sonda e primer necessários não refletem a sequência de complementação exata da região de ligação sobre o padrão e o primer degenerado pode ser utilizado. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo nãocomplementar pode ser ligado a extremidade 5’ do primer, com o remanescente da sequência de primer sendo complementar à fita.

[037] O termo “condições severas” se refere às condições de hibridização que afetam a estabilidade dos híbridos, por exemplo, temperatura, concentração do sal, pH, concentração de formamida e do gênero. Estas condições são empiricamente otimizados para maximizar a ligação especifica e minimiza a ligação não específica do primer ou sonda para sua sequência de ácido nucléico alvo. O termo como utilizado inclui a referência as condições sob as quais uma sonda ou primer irão hibridizar a sua sequência alvo, para um grau detectavelmente maior do que as outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o anterior). As condições severas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes.

[038] O termo “% de identidade de sequência” é definido aqui como a porcentagem de resíduos em uma sequência de aminoácido candidato ou sequência de ácido nucléico candidato que é idêntico aos resíduos em uma sequência de referência após o alinhamento das duas sequências e intervalos de introdução, se necessário, para conseguir a porcentagem máxima de identidade. Os métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos da técnica. Um programa de computador que pode ser utilizado ou adaptado para os propósitos de determinação se uma sequência candidato dentro dessa definição é “Align 2”, de autoria da Genentech, Inc., que foi depositado com a documentação usuária no escritório de direitos autorais dos Estados Unidos, Washington, D.C., 20559, em Dezembro 10, 1991, ou o Pacote UWGCG que provê o programa BESTFIT (Devereux et al., 1984).

[039] Um ácido nucléico do coronavírus felino compreendendo um nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, 3146 ou 3147, e/ou o nucleotídeo nas posições 3151, 3152 ou 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A pode ser amplificado usando primers que são capazes de hibridizar pelo menos parte da referida sequência de ácido nucléico do coronavírus felino. Os referidos primers, por exemplo, para hibridizar a sequência de ácido nucléico de coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula entre uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3055 e uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3669 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A. Os referidos primers preferivelmente tem um comprimento entre 9 e 50 nucleotídeos, por exemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 nucleotídeos. O produto do ácido nucléico obtido com um método de amplificação usando os referidos primers, compreende, preferivelmente, pelo menos 35 nucleotídeos, mais preferivelmente, pelo menos 40 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente, pelo menos 50 nucleotídeos.

[040] Portanto, a invenção provê um método de acordo com a invenção, compreendendo ainda a amplificação de pelo menos parte de uma molécula de ácido nucléico do coronavírus felino compreendendo uma região incluindo, ou correspondendo ao nucleotídeo na posição 3145, 3146, e 3147 e/ou o nucleotídeo na posição 3151, 3152, e 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino como representado na figura 2A usando pelo menos um primer que é capaz da hibridização de pelo menos parte da referida sequência de ácido nucléico entre uma posição correspondendo ao nucleotídeo na posição 3055 e uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3669 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A.

[041] Um par de primer preferido par auso em um método de acordo com a presente invenção compreende um primer que tem pelo menos 70% de identidade da sequência com a sequência do ácido nucléico 5’-CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3’, preferivelmente, pelo menos 80% de identidade da sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 90% de identidade da sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, 95% de identidade da sequência com a citada sequência de ácido nucléico, e um primer que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico 5’-CAATATTACAATGGCATAATGG-3’, preferivelmente, pelo menos 80% de identidade da sequência com a citada sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 90% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico. Um outro par de primer preferido para uso em um método de acordo com a presente invenção compreende um primer que tem pelo menos 70% de identidade da sequência com a sequência de ácido nucléico 5’-GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3’, preferivelmente, pelo menos 80% de identidade da sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 90% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico, e um primer que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico 5’-TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3’, preferivelmente, pelo menos 80% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 90% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 95% de identidade da sequência com a referida sequência de ácido nucléico.

[042] Em uma concretização de um par de primer de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de uma sequência de ácido nucléico 5’-CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA3’ e uma sequência de ácido nucléico 5’- CAATATTACAATGGCATAATGG-3’, ou uma combinação de uma sequência de ácido nucléico 5’-GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3’ e uma sequência de ácido nucléico 5’-TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3’.

[043] Em uma concretização da presente invenção, os pares de primer indicado acima são utilizados em uma reação de PCR alojada. Em uma reação em cadeia de polimerase alojada, dois pares de primer são utilizados em reações de PCR sucessivas. O segundo par de primer é utilizado para amplificar um produto de ácido nucléico ou parte do mesmo obtido na reação de amplificação usando o primeiro par de primer. Portanto, em uma concretização, pelo menos parte de um ácido nucléico amplificado, é amplificado usando um primeiro par de primer, é ainda amplificado usando um segundo par de primer. Um primeiro par de primer de acordo com a presente invenção compreende, por exemplo, um primer que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico 5’- CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3’ e um primer que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico 5’-CAATATTACAATGGCATAATGG-3’, e um segundo par de primer de acordo com a invenção compreende, por exemplo, um primer que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico 5’-GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3’ e um primer que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico 5’-TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT3’.

[044] É também provido pela invenção o uso de um par de primer de acordo com a presente solução, preferivelmente, para identificação do coronavírus entérico felino (FECV) ou o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV), e/ou para determinação da presença de FIPV ou peritonite infecciosa felina (FIP) em um animal suspeito de sofrer de uma infecção de coronavírus felino.

[045] A identidade de um nucleotídeo na posição 3145, 3146 e/ou 3147 e/ou o nucleotídeo na posição 3151, 3152 e/ou 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino pode ser determinado por meio de qualquer método conhecido no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados aos oligonucleotídeos de alelo específicos (ASO), sequenciamento de uma sequência de ácido nucléico (por exemplo, mini-sequenciamento de arranjo tag [Fan et al., 2000) ou piro-sequenciamento {Fakhrai-Rad et al., 2002], PCR específico para alelo com um reagente de bloqueio (ASB-PCR, Morlan et al., 2009), análise de ligação do oligonucleotídeo (OLA, Baron et al., 1996), espectroscopia de massa (MS, por exemplo, dissorção/ionização de laser assistido por matriz, tempo de vôo (MALDI-TOF) MS, Crain e McCloskey 1998), reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR), hibridização eletrônica, análise de polimorfismo de conformação fluorescente de fita simples (F-SSCP) (Makino et al., 1992), cromatografia líquido de desnaturação de alto desempenho (DHPLC), eletroforese em gel (tal como, eletroforese em gel diagonal de arranjo em microplaca, [MADGE, Day et al., 1998] e eletroforese em gel com gradiente de desnaturação {DGGE, Fischer e Lerman 1980]), e análise de micro-arranjo.

[046] Os oligonucleotídeos de alelo específico (ASO) são sondas de nucleotídeo fluoroforo-cromóforo, enzima ou radio marcados que são curtos e específicos para sequências de RNA ou DNA particulares. ASO, por exemplo, compreende uma mutação no nucleotídeo e hibridiza apenas com as sequências de ácido nucléico compreendendo essa mutação. A sequência de ácido nucléico de uma sequência de ácido nucléico de coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula de um nucleotídeo na, ou correspondente a, posição 3145, 3146 e/ou 3147 e/ou o nucleotídeo na posição 3151, 3152 e/ou 3153, como representado na figura 2A é, por exemplo, detectado usando uma sonda que é capaz de hibridizar, especificamente, pelo menos parte da referida sequência de ácido nucléico do coronavírus compreendendo um nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, 3146 e/ou 3147 e/ou nucleotídeos na posição 3151, 3152 e/ou 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A. A referida sonda tem, preferivelmente, um comprimento entre 14 e 100 nucleotídeos, preferivelmente, 14,1 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou mais nucleotídeos. Portanto, em uma concretização de uma sequência de ácido nucléico de coronavírus felino compreendendo um nucleotídeo na, ou correspondente a posição 3145, 3146 e 3147, e/ou o nucleotídeo na posição 3151, 3152 e 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A é detectado usando uma sonda com um comprimento de pelo menos 14 nucleotídeos que é capaz de hibridizar especificamente a pelo menos parte do referido ácido nucléico. Em uma concretização preferida, uma sonda é capaz de hibridizar especificamente a um ácido nucléico de coronavírus felino compreendendo citosina ou timina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3146 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A.

[047] Uma sonda preferida compreendendo um correspondente nucleotídeo ao nucleotídeo nas posições 3145, 3146 e 3147, como representado na figura 2A, para uso em um método de acordo com a invenção compreende uma sequência que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico 5’-CCCARRGCCATAGG-3’, onde R é A ou G, preferivelmente, pelo menos 80% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 90% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico, mais preferivelmente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a referida sequência de ácido nucléico. Em uma concretização da invenção, é provido um método de acordo com a invenção, onde a referida sonda compreende a sequência CCCARRGCCATAGG. Também é provido pela invenção um uso de uma sonda de acordo com a invenção, preferivelmente, para identificação do coronavírus entérico felino (FECV) e/ou o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV), e/ou para determinação da presença da peritonite infecciosa felina (FIP) em um animal suspeito de sofrer de uma infecção de coronavírus felino.

[048] As sequências nucléicas de coronavírus felino podem ser determinadas pelos métodos de sequenciamento conhecido pelos técnicos no assunto, preferivelmente, diretamente após a amplificação de ácido nucléico relevante. Estes métodos compreendem, por exemplo, sequenciamento direto de nucleotídeos de fita dupla, usando terminais de dideoxinucleotídeos marcados fluorescentemente (Smith et al., 1986), mini-sequenciamento ou piro-sequenciamento de arranjo tag. Em geral, os referidos métodos de sequenciamento incluem o isolamento dos ácidos nucléicos do genoma viral por meio dos procedimentos de isolamento do ácido nucléico, e a determinação da sequência de nucleotídeo do ácido nucléico isolado, por exemplo, através de métodos de terminação da cadeia dideoxi (Sanger et al., 1977) opcionalmente, precedido pela transcrição reversa do RNA em DNA, e/ou amplificação do ácido nucléico alvo.

[049] Em uma concretização, pelo menos parte de uma sequência de ácido nucléico de coronavírus felino compreendendo um nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, 3146, e/ou 3147 e/ou nucleotídeo na posição 3151, 3152, e/ou 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino como representado na figura 2A é sequenciado.

[050] O arranjo de ligação do oligonucleotídeo (OLA) é um método para a detecção do conhecido polimorfismo de nucleotídeo simples. O método é com base na ligação de duas sondas de oligonucleotídeo adjacente usando uma DNA ligase enquanto eles são anelados em um DNA alvo complementar. Uma das sondas é, por exemplo, marcada fluorescentemente e com alelo específico. Tipicamente, existem duas sondas marcadas diferentemente, uma para cada alelo. Estas duas sondas diferem apenas na sequência na última base na 3’ extremidade, assim, no sítio do polimorfismo. A segunda sonda é uma sonda comum que é complementar a sequência de DNA alvo imediatamente a jusante (3’) do sítio contendo o polimorfismo, e assim, complementar ambos os alelos. Esta sonda não necessita ser marcada fluorescentemente. A discriminação do alelo ocorre pela capacidade da DNA-ligase para ligar as sondas perfeitamente combinadas; uma divergência 3’ na captura da sonda irá prevenir a ligação. Em um método da invenção, por exemplo, uma análise de ligação do oligonucleotídeo é utilizada onde uma das sondas é especificamente capaz de hibridizar a uma sequência de ácido nucléico do coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula compreendendo uma adenina no nucleotídeo da posição 3145, como representado na figura 2A que é indicativa do FECV. Assim, o primeiro nucleotídeo de uma sonda direita ou o último nucleotídeo de uma sonda da esquerda é uma timina. A segunda sonda é uma sonda comum, que é capaz de hibridizar ambas, as sequências de FECV e de FIPV iniciando próximo à posição 3145 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino como representado na figura 2A, por exemplo, iniciando na posição 3146 se a referida segunda sonda for uma sonda da direita. Na presença de FECV, a ligação das referidas duas sondas não é possível. Em uma concretização da invenção, uma sequência de ácido nucléico do coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula, compreendendo o nucleotídeo na posição 3145, 3146 e/ou 3147 é determinada usando uma análise de ligação do oligonucleotídeo (OLA).

[051] A tecnologia de PCR de tempo real pode ser utilizada para detectar um alelo específico de um gene quando um reagente de bloqueio for utilizado. Esta tecnologia é chamada de PCR alelo-específico com um reagente de bloqueio (ASB-PCR, Morlan et al., 2009). Durante a reação de PCR, um agente de bloqueio é adicionado à mistura de reação, para prevenir a amplificação de um alelo. Um dos primers, por exemplo, o primer sequencial, é designado como primer específico de alelo mutante. O outro primer é um primer comum, que é capaz de hibridizar a ambos os alelos. Um agente de bloqueio, que é fosforilado na extremidade 3’ para prevenir a amplificação, é então designado para ligar especificamente ao alelo do tipo selvagem. Durante a reação de PCR, o agente de bloqueio previne a hibridização do primer específico mutante ao alelo do tipo selvagem. Na presença apenas do alelo do tipo selvagem, nenhum produto de amplificação é obtido, enquanto na presença apenas do alelo mutante um produto de amplificação é obtido. Com o ASB-PCR é, por exemplo, possível discriminar entre uma sequência de ácido nucléico de coronavírus felino compreendendo uma adenina no nucleotídeo da posição 3146 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A e que é indicativo de FECV, e uma sequência de ácido nucléico do coronavírus felino compreendendo uma citosina ou timina na referida posição, que é indicativa de FIPV. Por exemplo, um conjunto de primer é utilizado, consistindo de um primer reverso comum e dois primers específicos de ácido nucléico de FIPV, a partir do qual o nucleotídeo da extremidade 3’ é complementar ao nucleotídeo da posição 3146 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A. Um desses primers específicos FIPV tem uma adenina em sua extremidade 3’ e o outro primer tem uma guanina em sua extremidade 3’ que capacita o referido primer a hibridizar com uma sequência de ácido nucléico de coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula contendo uma timina ou uma citosina ao nucleotídeo na posição 3146 respectivamente. Um agente de bloqueio compreendendo uma timina na extremidade 3’ pode ser utilizado, o qual é capaz de hibridizar uma adenina ao nucleotídeo na posição 3145. Usando o referido conjunto de primers, a amplificação irá ocorrer quando o ácido nucléico FIPV estiver presente, enquanto a amplificação não irá ocorrer quando apenas o ácido nucléico de FECV estiver presente. Em uma concretização preferida da presente invenção, uma sequência de ácido nucléico do coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula, compreende o nucleotídeo na posição 3145, 3146 e/ou 3147 e/ou o nucleotídeo na posição 3151, 3152 e/ou 3153 é determinado usando o PCR alelo-específico com um reagente de bloqueio (ASB-PCR).

[052] Usando MALDI-TOF MS, a detecção de baixas quantidades de DNA (fentomol) pode ser conseguida. Os ácidos nucléicos variando de 2 a 2000 nucleotídeos podem ser detectados através do uso de MALDI-TOF MS. MS pode ser utilizado para analisar as misturas de diferentes fragmentos de ácidos nucléicos sem o uso de qualquer marcador devido as diferenças de massa das nucleobases. Assim, em muitos casos, a separação de fragmentos de ácidos nucléicos não é necessária antes da medida MS. Usando MALDI-TOF MS é, por exemplo, possível determinar se um nucleotídeo de uma sequência de ácido nucléico de coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula no nucleotídeo da posição 3145 é uma adenina, que é indicativo de FECV, ou uma citosina ou timina, que é indicativa de FIPV. Em uma concretização da presente invenção, a massa de pelo menos parte de uma sequência de ácido nucléico de coronavírus felino, dita parte compreendendo um nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, 3146, e/ou 3147 e/ou nucleotídeo na posição 3151, 3152 e/ou 3153 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A é determinada. Em uma concretização preferida, a massa da referida sequência de ácido nucléico é determinada usando a espectrometria de massa em tempo de vôo com dissorção/ionização de laser assistido pela matriz (MALDI-TOF MS).

[053] A identidade de um aminoácido em uma sequência de aminoácido de coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula no aminoácido na posição 1049 e/ou o aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B pode ser detectada usando qualquer método conhecido no estado da técnica. O referido aminoácido é, por exemplo, detectado usando anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos, espectrometria de massa ou reações de degradação Edman. Opcionalmente, uma proteína de coronavírus pode ser purificada com métodos conhecidos do estado da técnica. Por exemplo, a proteína de coronavírus pode ser purificada usando eletroforese em gel ou métodos de cromatografia, tais como cromatografia por afinidade.

[054] Um equivalente funcional de um anticorpo é definido como um composto que tem pelo menos uma das mesmas propriedades dos referidos anticorpos da espécie, não necessariamente em quantidade. O referido equivalente funcional é capaz de se ligar ao mesmo antígeno que o referido anticorpo, embora não necessariamente na mesma extensão. Um equivalente funcional de um anticorpo compreende, preferivelmente, um anticorpo de domínio único, um anticorpo de cadeia simples, um nanocorpo, um unicorpo ou um fragmento variável de cadeia simples (scFv). Um equivalente funcional de um anticorpo é, por exemplo, produzido através da alteração de um anticorpo tal como, pelo menos uma propriedade, preferivelmente, uma propriedade de ligação ao antígeno do composto resultante é essencialmente do mesmo tipo, não necessariamente em quantidade. Isto é feito em muitos caminhos, por exemplo, através da substituição do aminoácido conservativo, desse modo, um resíduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo com propriedades geralmente similares (tamanho, hidrofobicidade, etc), tal como o funcionamento total não é provavelmente seriamente afetado.

[055] Uma parte imunogênica de um coronavírus felino compreendendo uma proteína da espícula de coronavírus felino é definida como uma parte que tem pelo menos uma propriedade em comum com um coronavírus felino compreendendo uma proteína da espícula do coronavírus felino da espécie, apesar de não necessariamente na quantidade. Uma parte imunogênica de uma proteína da espícula do coronavírus felino é definida como uma parte que tem pelo menos uma das mesmas propriedades que a de uma proteína da espícula de coronavírus felino do mesmo tipo, não necessariamente em quantidade. A referida parte imunogênica, é preferivelmente, capaz de extrair uma resposta imune contra um coronavírus felino, preferivelmente, um vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV), em um animal.

[056] Um aminoácido de uma sequência de aminoácido da proteína da espícula do coronavírus felino, correspondente ao aminoácido na posição 1049 e/ou ao aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B é, por exemplo, detectado usando um anticorpo ou equivalente funcional que é, especificamente dirigido contra um epítopo de uma proteína da espícula do coronavírus felino que compreende o aminoácido na posição 1049 e/ou aminoácido na posição 1051 como representado na figura 2B. O referido aminoácido na posição 1049 e/ou o aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B capacita a discriminação entre FECV e FIPV. Uma metionina no aminoácido na posição 1049 é indicativa de FECV, enquanto qualquer outro aminoácido além da metionina nessa posição, preferivelmente, leucina, é indicativo de FIPV e qualquer outro aminoácido além da serina no aminoácido na posição 1051, preferivelmente alanina, no indicativo de FIPV. Portanto, a invenção provê um método de acordo com a invenção, onde um aminoácido de uma proteína da espícula do coronavírus felino em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049 e/ou o aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B é detectado através do uso de um anticorpo ou equivalente funcional do mesmo, especificamente dirigido contra um epítopo de uma proteína da espícula de FIPV abrangendo o aminoácido 1049 e/ou o aminoácido 1051. Em uma concretização, o referido epítopo compreende um outro aminoácido além da metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049 e/ou dito epítopo compreende um outro aminoácido além da serina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B.

[057] Um anticorpo ou equivalente funcional do mesmo, especificamente dirigido contra um epítopo de uma proteína da espícula de FIPV, dito epítopo compreende um aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 1049 e/ou aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B pode ser detectado com qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, dito anticorpo ou equivalente funcional do mesmo é fluoroforo-cromóforo ou enzima-marcada, e pode assim, ser detectada com, por exemplo, microscopia fluorescente ou espectrofotometria. Um anticorpo ou equivalente funcional pode também ser detectado usando um segundo anticorpo que é, por exemplo, fluoroforo-, cromóforo- ou enzima-marcado. Os referidos marcadores são bem conhecidos pelos técnicos no assunto e incluem, por exemplo, isotiocianato de fluoresceina (FITC), [beta]-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre, estreptavidina, biotina ou digoxigenina.

[058] Também é provido pela invenção um anticorpo ou equivalente funcional, especificamente dirigido contra um epítopo de uma proteína da espícula FIPV, dito epítopo compreende um outro aminoácido além da metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049, como representado na figura 2B e um kit de partes compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção e os meios para detecção do referido anticorpo.

[059] Usando MALDI-TOF MS, a detecção de baixas quantidades das sequências de aminoácidos pode ser conseguida. O MS pode ser utilizado para analisar as misturas de diferentes sequências de aminoácidos sem o uso de qualquer marcador devido às diferenças de massas das sequências de aminoácido. Assim, em muitos casos, a separação das sequências de aminoácidos não é necessária antes da medida MS. Usando MALDI-TOF MS é, por exemplo, possível discriminar entre uma sequência de aminoácidos do coronavírus felino compreendendo uma metionina na posição do aminoácido 1049, como representado na figura 2B. Em uma concretização da presente invenção, a massa de pelo menos parte de uma sequência de aminoácido do coronavírus felino, dita parte compreendendo um aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 1049, como representado na figura 2B é determinada. Em uma concretização preferida, a massa da referida sequência de aminoácido é determinada usando espectrometria de massa em tempo de vôo por dissorção/ionização de laser assistido por matriz (MALDI-TOF MS).

[060] O desenvolvimento de vacinas contra FIPV foi malsucedido até o momento. Várias abordagens falharam em prover uma vacina que induz a proteção contra FIPV. Estes objetivos incluem a vacinação com proximidade relacionada ao coronavírus vivos heterólogos, quantidades sub-letais de FIPV virulento, FIPV de baixa virulência, e subunidades de coronavírus (recombinante) ou proteínas. Algumas dessas abordagens proveem alguma proteção, mas o resultado foi inconsistente. Ocasionalmente, a vacinação resultou ainda no aumento da progressão da doença e em morte. Estão disponíveis atualmente, apenas vacinas com base em cepas sensíveis a temperatura de FIPV das quais a eficácia é questionavelmente (McArdle et al., 1995; Fehr et al., 1997).

[061] Agora que um polimorfismo na proteína da espícula do coronavírus felino foi identificado, permitindo a discriminação entre FECV e FIPV é, possível, desenvolver composições imunogênicas compreendendo coronavírus felino compreendendo o ácido nucléico identificado ou aminoácido indicativo para FECV. Usando uma composição imunogênica compreendendo um coronavírus felino com um ácido nucléico ou aminoácido representativo de um FECV não há risco de a doença e/ou morte devido a referida composição imunogênica não compreender o FIPV virulento ou parte do mesmo. É agora também possível desenvolver uma composição imunogênica compreendendo a proteína da espícula do coronavírus felino contendo o aminoácido identificado indicativo para o FIPV. Usando uma composição imunogênica compreendendo a proteína da espícula de FIPV ou parte imunogênica do mesmo uma resposta imune melhor contra FIPV pode ser extraída, sem o risco de progressão aumentada da doença e/ou morte, devido ao uso apenas das proteínas virais isoladas.

[062] Portanto, em uma concretização, a invenção provê uma composição imunogênica compreendendo uma proteína da espícula do coronavírus felino ou parte imunogênica da mesma contendo um outro aminoácido além da metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049, e/ou um outro aminoácido além da serina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B, ou uma proteína da espícula codificante do ácido nucléico do coronavírus felino, compreendendo uma citosina ou timina em uma posição correspondente ao nucleotídeo da posição 3145, e/ou guanina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3151, como representado na figura 2A, ou um coronavírus felino compreendendo um ácido nucléico contendo uma adenina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, e/ou uma timina em uma posição correspondente a posição 3151 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A, ou um coronavírus felino compreendendo uma proteína da espícula do coronavírus felino ou a parte imunogênica da mesma compreendendo uma metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049, e/ou uma serina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B, ou qualquer combinação da mesma. Em uma concretização preferida, uma composição imunogênica de acordo com a invenção é utilizada como uma vacina.

[063] É provido adicionalmente uma proteína da espícula de coronavírus felino ou a parte imunogênica da mesma compreendendo um outro aminoácido além da metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049, e/ou um outro aminoácido além da serina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B, ou uma proteína da espícula codificante do ácido nucléico do coronavírus felino compreendendo uma citosina ou timina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, e/ou uma guanina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3151, como representado na figura 2A, ou um coronavírus felino compreendendo um ácido nucléico contendo uma adenina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, e/ou uma timina em uma posição correspondente a posição 3151 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A, ou um coronavírus felino compreendendo uma proteína da espícula do coronavírus felino ou parte imunogênica da mesma compreendendo uma metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049, e/ou uma serina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B, ou qualquer combinação do mesmo, para induzir uma resposta imune contra um coronavírus felino, preferivelmente, um vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV), em um felino.

[064] Em uma concretização é provido o uso de uma proteína da espícula do coronavírus felino ou a parte imunogênica da mesma contendo um outro aminoácido além de metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049, e/ou um outro aminoácido além da serina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B, ou uma proteína da espícula codificante do ácido nucléico de coronavírus felino contendo uma citosina ou timina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, e/ou uma guanina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3151, como representado na figura 2A, ou um coronavírus felino compreendendo um ácido nucléico contendo uma adenina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, e/ou uma timina em uma posição correspondente a posição 3151 do gene codificante de uma proteína da espícula do coronavírus felino, como representado na figura 2A, ou um coronavírus compreendendo uma proteína da espícula do coronavírus felino ou parte imunogênica da mesma, contendo uma metionina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1049, e/ou uma serina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051, como representado na figura 2B, ou qualquer combinação do mesmo, para a preparação de uma composição imunogênica ou agente profilático para induzir uma resposta imune contra um coronavírus felino, preferivelmente, um vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV), em um felino.

[065] A invenção será explicada adicionalmente através dos exemplos a seguir. Esses exemplos não limitam o escopo de proteção da invenção, mas servem meramente para esclarecer a invenção.

Legenda das Figuras

[066] A figura 1 ilustra uma representação esquemática do genoma de RNA do coronavírus felino. A parte 5’ (esquerda) especifica o precursor codificante da função de replicação e de transcrição derivada da região de abertura de leitura (ORFs) 1a e 1b. A jusante do mesmo, em direção a extremidade 3’, os genes para as proteínas estruturas S (proteína da espícula), E (proteína envelope), M (proteína de membrana) e N (proteína de nucleocapsídeo), e para as proteínas acessório 3a, 3b, 3c, 7a e 7b são localizadas;

[067] A figura 2A ilustra as sequências de nucleocapsídeo do gene de proteína da espícula do coronavírus felino (nucleotídeos 1-4407), correspondente aos nucleotídeos 20395- 24801 de um coronavírus felino, como definido na sequência de nucleotídeo de NC_012955 (coronavírus felino UU10, genoma completo) e nucleotídeos 20382-24788 de um coronavírus felino como definido na sequência de nucleotídeo de NC_012952 (coronavírus felino UU8, genoma completo). A figura 2B ilustra as sequências de aminoácidos da proteína da espícula do coronavírus felino, como definido na sequência de aminoácido de YP_003038574 e YP_003038543;

[068] A figura 3 ilustra a eletroforese em gel de agarose de RNA amplificado a partir de 6 amostras clínicas obtidas de fezes de gatos infectados. A coluna M é um tamanho molecular padrão, colunas 1 a 6 são amostras clínicas e a coluna 7 é um controle negativo;

[069] A figura 4A ilustra o alinhamento parcial das sequências de fezes ou plasma derivada do RNA FCoV isolado de 42 gatos saudáveis e cinco sequências parciais derivadas de amostras de gatos com FIP confirmado, ou seja, Q093501030_326b_4546.scf (derivados de células brancas do sangue). Q093501032_327B_4546.scf (derivados de células brancas do sangue). Q093501036_321S_4546.scf (derivado do soro). Q093501038_321A_4546.scf (derivado de edema) e Q093501046_K11_019.ab1 (derivado de células brancas do sangue). A figura 4B ilustra o alinhamento das sequências parciais do RNA FCoV derivado de lesão isolado a partir de 54 gatos com FIP confirmado. A figura 4C ilustra o alinhamento das sequências parciais de RNA FCoV derivado de fezes isolados a partir de gatos com FIP confirmado; Na direita das figuras 4A, 4B, e 4C, o código de identidade do coronavírus felino analisado é indicado. Os nucleotídeos alvos e os aminoácidos previsíveis estão indicados por uma seta.

EXEMPLOS Exemplo 1:

[070] Neste exemplo, 6 amostras clínicas (fezes) foram analisadas. O RNA foi extraído a partir das amostras clínicas, o RT-PCR foi aplicado aos RNAs extraídos e os produtos foram analisados por eletroforese em gel de agarose (ver figura 3) após o primeiro PCR (1ª corrida) e após o PCR alojado (2ª corrida).

Materiais e Métodos

[071] Um RT-PCR foi utilizado para amplificar a região do gene da espícula FCoV contendo a mutação do ponto alvo. O RNA genômico foi extraído a partir das fezes de 6 gatos saudáveis usando o Kit de Mini RNA viral QIAamp e o Kit de RNeasy Qiagen (Qiagen, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. A síntese do cDNA foi realizada com a transcriptase reversa M-MLV (RT) e seguida por amplificação com reação em cadeia de polimerase (PCR) com polimerase TaqDNA. Todas as enzimas foram utilizadas de acordo com as instruções do fabricante (Promega Corp., Madson, WI). Ambas as reações foram preparadas com primers específicos (ver a tabela 1 de primers). Os primers foram designados usando as sequências de genoma FCoV com números de acesso de NC_012955 e NC_012952. As amplificações foram realizadas usando 30 ciclos de 94°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 1 minuto e, extensão adicional a 72°C durante 7 minutos na extremidade de amplificação. Os fragmentos de PCR foram isolados e purificados a partir do gel de agarose após a eletroforese usando o kit de extração do gel Qiagen (Qiagen Benelux B.V., Venlo, The Netherlands). O sequenciamento foi realizado por BAseClear Holding B.V. (Leiden, The Netherlands).

Resultados:

[072] Após o primeiro PCR, um fragmento de 601-bp foi obtido apenas em uma amostra clínica, como é visto na coluna 2, da figura 3. Após a segunda rodada do PCR, um fragmento de 139-bp foi amplificando, quando os primers alojados foram aplicados sobre os produtos da 1ª corrida de RT-PCR. Agora um produto foi visto não apenas na coluna 2, mas também com o RNA amplificado mostrado nas colunas 3, 5 e 6.

Exemplo 2:

[073] Neste exemplo, amostras de fezes ou plasma de 47 gatos saudáveis, as amostras clínicas de 54 gatos com FIP confirmado e amostras de fezes de 14 gatos com FIP confirmado foram analisadas.

Material e método:

[074] A extração do RNA genômico, síntese de cDNA, amplificação e sequenciamento foram realizadas de acordo com os materiais e métodos de Exemplo 1.

Resultados:

[075] A sequência de ácido nucléico codificante de uma metionina no aminoácido da posição 1049 foi detectado em todas as amostras de fezes ou plasma (47/47) derivado de FCoVs a partir de gatos saudáveis (figura 4A). Foi mais tarde observado que a figura 4A contém cinco sequências derivadas das amostras de gatos com FIP confirmado (Q093501030_326b_4546.scf, Q093501032_327B_4546.scf, Q093501038_321A_4546.scf e Q093501046_K11_019.ab1, significa que em fezes ou plasma 42/42 derivado de FCoVs obtido de gatos saudáveis uma metionina estava presente no aminoácido na posição 1049. Esta sequência foi também observada nos derivados de lesão 2/54 (figura 4B) e nos derivados de fezes 12/14 (figura 4C), RNAs amplificados a partir de gatos com FIP confirmados. Importantemente, RNAs derivados de lesão 52/54 (96%) obtida de gatos confirmados de FIP teve uma alteração de A para C ou T na posição 3145, conduzindo a uma alteração no aminoácido na posição 1949 que muda uma metionina dentro de uma leucina (figura 4B).

Exemplo 3:

[076] Nós continuamos colhendo amostras e os gatos através dos veterinários e proprietários na Holanda. Neste exemplo, as amostras a seguir foram analisadas:

- amostras fecais de 352 gatos saudáveis;
- amostras de células brancas do sangue de 89 saudáveis ou gatos suspeitos de não-FIP;
- amostras de plasma de 89 gatos saudáveis e gatos suspeitos de não-FIP;
- amostras de soro de 56 gatos saudáveis e não suspeitos de FIP;
- amostras de lesão FIP (linfonodo mesentérico (LN) e/ou rim e/ou baço e/ou omento e/ou pulmão e/ou LN e/ou fígado e/ou edema) de 97 gatos com FIP confirmado;
- amostras de células brancas de sangue de 34 gatos com FIP conformado;
- amostras de plasma de 34 gatos com FIP confirmado; e
- amostras de soro de 15 gatos com FIP confirmado.

Material e métodos:

[077] Extração de RNA genômico, síntese de cDNA, amplificação e sequenciamento foram realizadas de acordo com os materiais e métodos do exemplo 1.

Resultados: Amostras obtidas de gatos saudáveis.

[078] 137/352 (39%) de amostras de fezes foram FCoV positivas. Uma sequência de ácido nucléico codificante de uma metionina no aminoácido da posição 1049 e uma serina no aminoácido da posição 1051 foi detectado em todos os FCoVs derivados de fezes 9137) obtidos de gatos saudáveis.

Amostras obtidas de gatos saudáveis ou de gatos não suspeitos de FIP.

[079] As amostras de sangue EDTA, obtidas de 89 gatos saudáveis e de gatos suspeitos de não-FIP foram obtidas e separadas em células brancas do sangue (WBC) e plasma. As amostras de soro obtidas de 56 gatos saudáveis e de gatos suspeitos de não-FIP foram obtidas.

[080] 20/89 amostras de células brancas do sangue, 4/89 amostras de plasma e 8/56 amostras de soro foram FCoV positivas. Todas as 4 amostras plasma-positivo foram também positivas na fração WBC e em cada animal, a sequência no plasma foi 100% idêntica àquela em WBC. Uma sequência de ácido nucléico codificante de uma metionina no aminoácido na posição 1049 e um serina no aminoácido na posição 1051 foi detectado em todas as amostras testadas positivas para FCoV.

Amostras obtidas de gatos FIP confirmado:

[081] Um total de 97 gatos com FIP confirmado foram estudados. 97/97 órgãos com lesões FIP típicas (incluindo LN mesentérico, e/ou rim, e/ou baço, e/ou omento, e/ou pulmão, e/ou LN e/ou fígado, e/ou edema) testadas positivas para FCoV. 87/97 (90%) do RNAs derivados de lesão obtidos de gatos com FIP confirmado tiveram uma alteração no aminoácido da posição 1049 que muda uma metionina em uma leucina, 5/97 (5%) de RNAs derivados de lesão obtida de gatos com FIP confirmado tiveram uma alteração de aminoácido na posição 1051 que muda uma serina em uma alanina. Em todas as 5 amostras nas quais uma alanina estava presente na posição 1051, uma metionina estava presente na posição 1049. Assim, 92 dos 97 (95%) dos RNAs derivados da lesão obtidos de gatos com FIP confirmado tiveram uma alteração no aminoácido indicativo para FIP, enquanto 5 das 97 (5%) não tiveram uma alteração no aminoácido indicativo para FIP.

[082] Dos 34 dos 97 amostras de sangue de gatos com FIP confirmado foram obtidos antes dos animais serem eutanizados. As amostras de sangue foram separadas em células branca do sangue (camadas de células brancas) e plasma. As amostras de soro obtidas de 15 gatos com FIP confirmado foram obtidas daquelas do sangue-EDTA também foram obtidas.

WBC:

[083] 34/34 (100%) de amostras WBC foram FCoV positivas. Em 29/34 (85%) de RNAs derivados de WBC, obtido de gatos com FIP confirmados, uma leucina estava presente na posição 1049 e uma serina estava presente na posição 1051; para todas as 29, uma leucina estava presente também na posição 1049 nas amostras de órgãos. Dos 5 gatos com um metionina na posição 1049 em amostras WBC, 2 tiveram uma leucina nessa posição nos órgãos contendo lesões FIP, as outras 3 não tiveram as alterações nos aminoácidos indicativos para FIPV. Assim, a partir de 31/34 (90%) de gatos com FIP nos quais uma leucina foi detectada na posição 1049 no material de órgão, a leucina foi detectada nessa posição em WBC em 29/31 (94%) dos casos.

Plasma:

[084] 14/34 (41%) das amostras de plasma foram FCoV positivo. Em 11/34 (32%) de RNA derivado do plasma, obtidos de gatos com FIP confirmado, uma leucina estava presente na posição 1049 e uma serina estava presente na posição 1051. Dos 3 gatos FCoV positivo com uma metionina na posição 1049 na plasma. 1 tinha uma leucina nessa posição no RNA FCoV dos órgãos contendo lesões FIP, os outros 2 não teve as alterações no aminoácido indicativo para FIPV. Assim, obtido de 31/34 (90%) de gatos FIP nos quais uma leucina foi detectada na posição 1049 no material do órgão, a leucina foi também detectada no plasma em 11/31 (35%) dos casos.

Soro:

[085] 4/15 (27%) de amostras do soro foram FCoV positivas. Em 2/15 (13%) do RNA derivado do soro, obtido de gatos com FIP confirmado, uma leucina estava presente na posição 1051. 15/15 (100%) desses gatos tiveram uma leucina na posição 1049, no órgão derivado de RNA FCoV.

Claims

Método para determinar se o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV) está presente em uma amostra, compreendendo determinar se a referida amostra compreende um coronavírus felino, e se um coronavírus está presente, dito método sendo caracterizado pelo fato de:
- - determinar a identidade de um aminoácido em uma proteína da espícula do referido coronavírus felino em uma posição correspondente a do aminoácido na posição 1049, tal como, representado na SEQ ID NO:8; e determinar se FIPV está presente se o referido aminoácido é leucina; e/ou
- - determinar a identidade de um aminoácido em uma proteína da espícula do referido coronavírus felino em uma posição correspondente a do aminoácido na posição 1051, tal como representado na SEQ ID NO:8, e determinar se FIPV está presente se o referido aminoácido for alanina.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a identidade do aminoácido na posição 1049 ser determinada pela determinação de uma sequência de ácido nucléico de um coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula, dita sequência de ácido nucléico compreendendo um nucleotídeo na, ou correspondente a, posição 3145, 3146 e/ou 3147 como representado na SEQ ID NO:6.
Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de compreender ainda a amplificação de pelo menos parte de uma molécula de ácido nucléico coronavírus felino compreendendo uma região incluindo, ou correspondendo ao, nucleotídeo na posição 3145, 3146 e 3147 como representado na SEQ ID NO:6 usando pelo menos um primer que é capaz de hibridizar pelo menos parte da referida sequência do ácido nucléico entre uma posição correspondente à posição de nucleotídeo 3055 e uma posição correspondente a posição de nucleotídeo 3669 como representado na SEQ ID NO:6; sendo que dito pelo menos um primer é selecionado a partir dos primers listados abaixo:
CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA (posição 3642-3656),
CAATATTACAATGGCATAATGG (posição 3055-3076),
GGCATAATGGTTTTACCTGGTG (posição 3067-3088),
TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT (posição 3188-3206).
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a identidade do aminoácido na posição 1051 ser determinada através da determinação de uma sequência de ácido nucléico de um coronavírus felino codificante de uma proteína da espícula, dita sequência de ácido nucléico compreendendo um nucleotídeo na, ou correspondente à posição 3151, 3152 e 3153 como representado na SEQ ID NO:6.
Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a amplificação de pelo menos parte de uma molécula de ácido nucléico coronavírus felino compreendendo uma região incluindo, ou correspondendo a, posição de nucleotídeo 3151, 3152 e 3153 como representado na SEQ ID NO:6, usando pelo menos um primer que é capaz de hibridizar pelo menos parte da referida sequência de ácido nucléico entre uma posição correspondente a posição do nucleotídeo 3055 e uma posição correspondente a posição de nucleotídeo 3669 como representado na SEQ ID NO:6; sendo que dito pelo menos um primer é selecionado a partir dos primers listados abaixo:
CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA (posição 3642-3656),
CAATATTACAATGGCATAATGG (posição 3055-3076),
GGCATAATGGTTTTACCTGGTG (posição 3067-3088),
TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT (posição 3188-3206).
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizado pelo fato de a referida sequência de ácido nucléico ser detectada usando uma sonda tendo a sequência 5’CCCARRGCCATAGG-3’, onde R é A ou G.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 6, caracterizado pelo fato de compreender ainda o sequenciamento de pelo menos parte de uma sequência de ácido nucléico coronavírus felino, dita parte compreendendo um nucleotídeo correspondente a posição de nucleotídeo 3145, 3146 e 3147, ou um nucleotídeo correspondente a posição de nucleotídeo 3151, 3152 e 3153, como representado na SEQ ID NO:6.
Uso, caracterizado pelo fato de compreender:
- - uma proteína da espícula de coronavírus felino ou parte imunogênica da mesma, compreendendo uma alanina em uma posição correspondente ao aminoácido na posição 1051 como representado na SEQ ID NO:8; ou
- - uma sequência de ácido nucléico da proteína da espícula como representada na SEQ ID NO:6, compreendendo uma citosina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3145, e/ou uma guanina em uma posição correspondente ao nucleotídeo na posição 3151; para a preparação de uma composição ou agente profilático para induzir uma resposta imune contra um coronavírus felino, preferivelmente, um vírus de peritonite infecciosa felina (FIPV), em um felino para prevenção da infecção FIPV.