KR20230004444A - 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템 및 그 제조 방법, 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템 및 그 제조 방법, 용도를 제공한다. 본 발명의 마이크로에멀젼은 일련의 금속 이온 화합물을 흡착하고 제조 과정에 항원을 첨가하여 항원의 포집을 실현함으로써 안정적인 백신 제제를 얻을 수 있다. 본 발명에 의해 제조된 백신은 항원 제시 세포에 의해 효율적으로 흡수되고 림프절에 효과적으로 전달되어 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있으며, 광범위한 응용 전망을 갖는다.

Description

마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템 및 그 제조 방법, 용도

본 출원은 2020년 4월 13일에 중국특허국에 출원한 출원번호가 202010283350.9이고 출원명칭이 “마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템 및 그 제조 방법, 용도”인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 참조로 본 출원에 원용된다.

본 발명은 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템 및 그 제조 방법에 관한 것이며, 의약품 기술 분야에 속한다.

백신 접종은 현대 의학의 가장 위대한 발명 중 하나이며, 많은 질병을 예방하고 근절하는 효과적인 수단이며, 다양한 전염병을 방제할 수 있다. 백신 발전의 세가지 중요한 방향에는 신생 항원의 발견, 새로운 어쥬번트 기술 및 새로운 벡터 플랫폼이 포함된다.

전통적인 약독화 생백신 및 불활성화 생백신은 천연 어쥬번트 성분을 본질적으로 함유할 수 있으며, 과립 형태의 단백질, 지질 및 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러나 이러한 약독화 및 불활성화 백신 자체의 예컨대 약독화 병원성 미생물이 강한 병원성 미생물로 돌연변이되거나 또는 불활성화 백신이 제조 과정에서 완전히 불활성화되지 않는 것과 같은 일부 한계로 인해, 이러한 백신이 신체에 작용하면 신체에 직접 질병을 유발할 수 있다. 소단위 백신은 병원성 미생물로부터 화학적 분해, 재조합 발현 등 방법으로 면역 활성을 갖는 단편을 추출하여 제조한 백신을 말한다. 불활성화 백신, 약독화 생백신에 비해, 소단위 백신은 안전성이 높고 안정성이 우수하며 대량 생산이 가능한 장점이 있어, 현대 백신 개발 및 응용의 주요한 경향이 되었다. 그러나, 소단위 백신도 면역원성이 약하고, 보호 효과 시간이 짧고, 작용 개시가 느린 단점이 있으며, 이러한 소단위 백신의 단점을 보완하기 위해, 소단위 백신에 어쥬번트가 널리 사용되고 있다. 백신 전달 벡터의 사용은 면역 응답 수준을 향상시키고 백신 제제의 안정성을 향상시킬 수 있다. 지난 10년 동안 리포솜, ISCOMS, 고분자 및 분해성 나노구, 나노입자 등과 같은 나노크기(<1000 nm) 물질은 백신 항원의 전달 벡터로 주목을 받아 왔으며, 상기 벡터는 백신 항원을 안정화하고 항원의 분해를 피할 수 있을 뿐만 아니라 특정 어쥬번트 효과도 있어 체내 항원의 면역 응답 수준을 향상시킬 수 있다.

에멀젼은 인간 및 동물 백신의 어쥬번트로서 오랜 역사를 가지고 있다. 프로인트 어쥬번트(Freund’s adjuvant)는 1935년에 헝가리계 미국인 세균학자 프로인트에 의해 성공적으로 연구되었으며, 프로인트는 마이코박테리아와 결합된 광유(파라핀)가 어쥬번트 효과가 있음을 최초로 증명하였고, 이 어쥬번트를 "프로인트 완전 어쥬번트"라고 한다. 박테리아가 포함되지 않는 유중수(w/o) 에멀젼(프로인트 불완전 어쥬번트)는 나중에 동물용 백신에 사용되었다. 프로인트 불완전 어쥬번트와 같은 에멀젼은 인플루엔자 백신을 포함하여 인간에게도 사용되었지만 부작용이 발생하기 쉽다. 광유 대신 분해성 유상 스쿠알렌을 사용하여 제조된 수중유형 에멀젼 MF59의 보조 인플루엔자 백신은 1997년 유럽연합에서 승인되었으며 현재 30개국 이상에서 승인되었다. 미국과 유럽에서 임상적으로 승인된 에멀젼 어쥬번트에는 AS03 및 AF03도 포함된다.

금속 이온 화합물 어쥬번트가 널리 적용되고 있으며, 알루미늄 염, 칼슘 염, 아연 염, 철 염 및 지르코늄 염이 항원 흡착제로 종종 사용된다. 알루미늄염 어쥬번트는 백신에 널리 사용되는 어쥬번트로서, 황산알루미늄칼륨, 인산알루미늄 및 수산화알루미늄을 포함하며, 이러한 어쥬번트는 항원 보유, 느린 방출을 가능하게 하고 국소 염증 반응을 유도할 수 있으므로 활성 림프구를 유인하고 면역 응답을 강화하며 보체 시스템을 강화할 수 있고, 알루미늄 어쥬번트는 주로 세포성 면역 응답보다는 체액성 면역 응답을 유발하며; 인산칼슘 어쥬번트는 프랑스에서 DPT, 소아마비, BCG, 홍역, 황열병, B형 간염, HIV 당단백질 및 기타 백신의 제조에 성공적으로 사용되었고, 그 보조 효과는 알루미늄 어쥬번트의 효과와 유사할 수 있고, 칼슘은 인체의 천연 구조 성분이므로 신체가 인산칼슘 어쥬번트에 대한 내성이 높으며; 수산화제이철 어쥬번트는 신체의 체액성 및 세포성 면역 응답을 동시에 향상시킬 수 있으므로 미래에 백신의 면역 어쥬번트 적용에서 한 자리 차지할 수 있을 것이며; 수산화아연 콜로이드는 단독으로 또는 ATP와 함께 사용하면 광견병 바이러스 항원에 대한 면역 응답을 어느 정도 향상시킬 수 있고, 아연 원소는 독성 및 부작용이 극히 낮으므로 개발 및 응용 가능성이 매우 높다.

본 발명에서, 금속 이온 화합물이 마이크로에멀젼 표면에 흡착되어 마이크로에멀젼의 비표면적이 극적으로 증가시켜 마이크로에멀젼은 높은 표면 반응성, 많은 활성 중심, 높은 흡착 용량 등의 특성을 가지고, 동일한 금속 이온 화합물 함량 조건에서 보다 많은 항원을 흡수할 수 있기 때문에, 백신 전달에 사용되는 나노 크기 입자로 제조될 수 있다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼에 의해 흡착된 금속 이온 화합물, 항원 및 마이크로에멀젼으로 구성된 백신 전달 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명은 고압 균질화, 초음파 및 고속 교반과 같은 방법으로 마이크로에멀젼을 제조하고, 금속 이온 화합물을 마이크로에멀젼 표면에 흡착시킨 후, 상이한 항원 성분을 첨가하여 백신을 제조한다. 본 발명에 의해 제조된 백신은 항원을 림프절로 전달하고, 항원 제시 세포에 의해 효율적으로 흡수되고, 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명에 따르면, pH값이 4.0-10.0 사이인 조건에서 에멀젼의 오일상과 유화제에 함유된 카르복실기, 인산기, 술폰산기, 황산기, 아황산염, 페놀성 수산기, 에놀기 등 그룹은 부분적으로 또는 완전히 이온화되어 음이온을 생성하고, 금속 양이온은 마이크로에멀젼 표면의 음이온과 반응하여 마이크로에멀젼 표면에 부착되며, 금속 양이온은 금속 이온 화합물의 음이온 부분을 추가적으로 흡착함으로써, 금속 이온 화합물이 흡착된 마이크로에멀젼을 제조할 수 있다. 따라서, 마이크로에멀젼 표면에 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 수산화제이철, 인산칼슘 등 다양한 금속 이온 화합물을 흡착시킬 수 있다. 금속 이온 화합물이 흡착된 마이크로에멀젼은 원래 마이크로에멀젼의 안정성에 영향을 미치지 않으며, 분산성이 우수하고 조작이 간단하며 임상 사용이 용이하다.

용어 "마이크로에멀젼"은 분산액, 액적 및 기타 지질 구조를 포함하며, 상기 기타 지질 구조는 수불용성 오일상이 수상과 혼합될 때 비극성 잔류물(즉, 긴 탄화수소 사슬)을 물에서 멀리 이동시키고 극성 헤드 그룹을 물 쪽으로 이동시키는 소수성 힘으로 인해 형성된다. 이러한 지질 구조는 단층, 올리고층 및 다중층 지질 소포, 미셀 및 라멜라 구조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 “금속 이온 화합물”은 당업계에서 널리 이해되는 바와 같이, 금속 양이온과 음이온으로 이루어진 화합물을 가리킨다. 본 발명의 금속 이온은 알루미늄, 철, 지르코늄, 칼슘, 망간, 카드뮴, 마그네슘, 세륨, 카드뮴, 코발트, 갈륨 또는 아연 중 하나 이상으로부터 선택되고, 상기 금속 이온 화합물은 무기염 또는 유기 복합체의 형태를 나타내며; 바람직하게는, 금속 이온 화합물은 금속 이온의 수산화물 또는 인산염이고; 특히 바람직하게는, 금속 이온 화합물은 수산화알루미늄, 수산화제이철, 인산알루미늄, 인산칼슘 또는 수산화아연 중 하나 이상이다.

용어 “계면활성제”는 극성 헤드 그룹(에너지적으로 물 용매화되기 쉬움)과 소수성 꼬리(수용매화되지 않음)를 모두 갖는 분자를 의미한다. 용어 “양이온성 계면활성제”는 양이온성 헤드 그룹을 갖는 계면활성제를 지칭한다. 용어 “음이온성 계면활성제”는 음이온성 헤드 그룹을 갖는 계면활성제를 지칭한다. 용어 “비이온성 계면활성제”는 전하를 띠지 않는 헤드 그룹을 갖는 계면활성제를 지칭한다. “양쪽성 이온 계면활성제”는 동시에 양이온성 및 음이온성 기를 갖는 계면활성제를 지칭한다.

용어 "약학적으로 허용되는"은 숙주(예를 들어, 동물 또는 인간)에 투여될 때 유해한 알레르기 또는 유해한 면역 반응을 실질적으로 일으키지 않는 성분을 지칭한다. 이러한 제제는 임의의 약학적으로 허용되는 제형을 포함한다. 이러한 약학적으로 허용되는 제형의 예는 침지, 분무, 외부 적용, 주사 및 동결건조 제형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

상기 마이크로에멀젼에서, 상기 수상은 임의의 유형의 수상을 포함할 수 있으며, 물(예를 들어, 물, 증류수, 정제수, 주사용수, 탈이온수, 수돗물) 및 용액(예를 들어, HEPES용액)을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 수상은 추가로 멸균되고 발열원이 없을 수 있다. 바람직하게는, 상기 수상은 주사용수이다.

상기 마이크로에멀젼에서, 상기 오일상은 임의의 화장품 또는 약학적으로 허용되는 오일일 수 있고, 바람직하게는, 상기 오일상은 동물성 오일, 식물성 오일, 천연 오일, 합성 오일, 탄화수소 오일, 실리콘 오일, 이들의 반합성 유도체 및 이들의 조성물로부터 선택될 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼에 적용되는 오일은 미네랄 오일, 스쿠알렌 오일, C6-C30 지방 및 이들의 방향족 산 및 알코올, 대두유, 중쇄 트리글리세리드, 에센셜 오일, 실리콘 오일, 정유, 수불용성 비타민, 이소프로필 스테아레이트, 부틸 스테아레이트, 옥틸팔미테이트, 헥사데실팔미테이트, 트리데실베헤네이트, 디이소프로필 아디페이트, 디옥틸 세바케이트, 멘톨 프탈레이트, 헥사데실 옥타노에이트, 옥틸 살리실레이트, 이소프로필 미리스테이트, 네오펜틸 글리콜 헥사데칸올 디아세테이트, Ceraphyls®, 데실 올레에이트, 디이소프로필 아디페이트, 12 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 알킬 락테이트, 헥사데실 락테이트, 라우릴 락테이트, 이소스테아릴 네오펜타노에이트, 미리스테이트, 이소스테아릴 스테아레이트, 옥틸 스테아레이트, 탄화수소 오일, 이소프렌, 유동 파라핀, 이소도데칸, 바셀린, 아르간 오일, 유채 오일, 칠레 오일, 코코넛유, 옥수수유, 면실유, 아마인유, 포도씨유, 겨자유, 올리브유, 팜유, 팜핵유, 땅콩유, 잣유, 양귀비씨유, 호박씨유, 쌀겨유, 홍화유, 차유, 트러플유, 식물성 오일, 아몬드(커넬)유, 호호바유(몬모릴로나이트), 포도유, 마카다미아유, 밀배아유, 아몬드유, 카놀라유, 박유, 대두유, 참기름, 헤이즐넛유, 옥수수유, 해바라기 오일, 대마 오일, 보이스 오일, 비터 아몬드 오일, 아보카도 오일, 호두 오일, 어유, 베리 오일, 올스파이스 오일, 주니퍼 오일, 씨 오일, 아몬드 씨 오일, 펜넬 씨 오일, 셀러리 씨 오일, 커민씨오일, 육두구씨오일, 잎오일, 바질잎오일, 월계수잎오일, 계피잎오일, 세이지잎오일, 유칼립투스잎오일, 레몬그라스 잎 오일, 멜라루카 잎 오일, 오레가노 잎 오일, 패출리 잎 오일, 페퍼민트 잎 오일, 솔잎 오일, 로즈마리 잎 오일, 스피어민트 오일, 차잎 오일, 타임 잎 오일, 윈터그린 잎 오일, 꽃 오일, 캐모마일 오일, 세이지 오일, 정향 오일, 제라늄 플라워 오일, 히솝 플라워 오일, 자스민 플라워 오일, 라벤더 플라워 오일, 마누카 플라워 오일, 마조람 플라워 오일, 오렌지 플라워 오일, 로즈 오일, 일랑일랑 오일, 수피 오일, 계피 오일, 계피 수피 오일, 사사프라스 수피 오일, 목재 오일, 녹나무 오일, 삼나무 오일, 로즈우드 오일, 샌달우드 오일, 뿌리 줄기(생강) 목재 오일, 수지 오일, 유향 오일, 몰약 오일, 과일 껍질 오일, 베르가못 껍질 기름, 자몽 껍질 기름, 레몬 껍질 기름, 라임 껍질 기름, 오렌지 껍질 기름, 오렌지 껍질 기름, 뿌리 기름, 발레리안 기름, 올레산, 리놀레산, 이소스테아릴 알코올, 메틸페닐 폴리실록산, 사고실록산, 디메티콘, 페닐 트리메티콘(또는 유기적으로 변형된 버전), 폴리실록산의 알킬화 유도체, 세틸디메틸실록산, 도데실트리메틸실록산, 폴리실록산의 히드록실화 유도체, 휘발성 실리콘 오일, 환형 및 선형 실리콘 오일, 시클로메티콘, 시클로메티콘, 헥사메틸시클로트리실록산 오일, 옥타메틸시클로테트라실리콘 오일, 데카메틸시클로펜탄 실리콘 오일, 휘발성 선형 디메티콘, 이소헥사데칸, 이소에이코산, 이소테트라아세트산, 폴리이소부틸렌, 이소옥탄, 이소도데칸, 테르펜, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 카민, 아주롤, 멘톨, 장뇌, 리조마 파리디스, 티몰, 네롤, 리날로올, 리모넨, 게라니올, 페릴릴 알코올, 네롤, 파르네솔, 일랑 유전자, 비사보롤, 파르네센, 아스카리돌, 베라트룸 오일, 시트로넬랄, 시트랄, 시트로넬롤, 베굴린, 야로우, 구아이엔, 카모마일, 및 이들의 반합성 유도체 또는 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

특히 바람직하게는, 상기 오일상은 스쿠알렌, 대두유, 중쇄 트리글리세리드 및 올레산의 하나 이상의 조합물이다.

본 발명의 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템의 계면활성제는 약학적으로 허용되는 이온성 계면활성제, 약학적으로 허용되는 비이온성 계면활성제, 약학적으로 허용되는 양이온성 계면활성제, 약학적으로 허용되는 음이온성 계면활성제 또는 약학적으로 허용되는 양쪽성 계면활성제일 수 있다. <Applied Surfactants: Principles and Applications>에 계면활성제의 예시적인 적용이 기술되어 있다. (Tharwat F. Tadros, Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 3-527-30629-3)은 특히 참고로 여기에 포함된다.

또한, 계면활성제는 약학적으로 허용되는 이온성 폴리머 계면활성제, 약학적으로 허용되는 비이온성 폴리머 계면활성제, 약학적으로 허용되는 양이온성 폴리머 계면활성제, 약학적으로 허용되는 음이온성 폴리머 계면활성제 또는 약학적으로 허용되는 양쪽 이온성 폴리머 계면활성제일 수 있다. 폴리머 계면활성제의 예는 다중(적어도 하나) 폴리에틸렌 글리콜(PEO) 측쇄를 갖는 폴리(메틸메타크릴레이트) 골격의 그래프트 공중합체, 폴리하이드록시스테아르산, 알콕실화 알킬페놀 포름알데히드 축합물, 지방산으로 폴리알킬렌글리콜 개질된 폴리에스테르, 폴리에스테르, 그 반합성 유도체 또는 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

계면 활성 성분 또는 계면활성제는 극성 또는 이온의 친수성 부분에 부착된 비극성 소수성 부분(보통 선형 또는 분지형 탄화수소 화합물 또는 8-18 탄소 원자의 탄화플루오르 사슬)으로 구성된 양친매성 분자이다. 친수성 부분은 비이온성, 이온성 또는 양쪽성 이온성일 수 있다. 수성 환경에서 탄화수소 사슬은 물 분자와 약하게 상호 작용하는 반면, 극성 또는 이온성 헤드 그룹은 쌍극자 또는 이온-쌍극자 상호 작용을 통해 물 분자와 더 강한 상호 작용을 한다. 계면활성제는 친수성기의 성질에 따라 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 고분자 계면활성제로 구분될 수 있다.

바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼에 적합한 계면활성제는 에톡실화 노닐페놀, 에톡실화 운데칸올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 지방산 에스테르(스팬), 에톡실화 수소화 피마자유, 나트륨 도데실 설페이트, 에톡시 및 프로폭시 이블록 공중합체, 에틸렌옥사이드-프로필렌옥사이드 블록 공중합체, 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드를 기반으로 하는 4작용성 블록 공중합체, 모노글리세리드, 글리세릴 카프로에이트, 글리세릴 카프릴레이트, 글리세릴코코에이트, 글리세릴 에루케이트, 히드록시에스테르글리세리드, 글리세릴 이소스테아레이트, 글리세릴시아네이트, 글리세릴라우레이트, 글리세릴리놀레이트, 글리세릴 미리스테이트, 글리세릴 올리에이트, PABA 글리세리드, 글리세릴팔미테이트, 글리세릴 리시놀레이트, 글리세릴스테아레이트, 글리세롤 티오글리콜레이트, 글리세릴디라우레이트, 글리세릴디올레이트, 글리세릴 미리스테이트, 글리세롤 테트라올레이트, 스테아르산글리세리드, 글리세릴아실스테아레이트, 디라우릴글리세롤에스테르, 글리세롤디올레이트, 디글리세리드 에스테르, 글리세롤 디글리세리드, 글리세롤 테트라올레이트, 글리세릴스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 지방족 에테르, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 미리스테이트, 스테로이드, 콜레스테롤, 베타 스테롤, 비스페놀알코올, 알코올 지방산 에스테르, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 이소프로필 에스테르, 이소프로필 n-부티레이트, 이소프로필 n-헥사노에이트, 이소프로필 n-데카노에이트, 이소프로필 팔미테이트, 옥틸도데실 미리스테이트, 알콕실화 알코올, 알콕실화 산, 알콕실화 아미드, 알콕실화 당 유도체, 천연 오일 및 왁스의 알콕시화 유도체, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 노녹실-14, PEG-8 라우레이트, PEG-6 코카미드, PEG-20 메틸 포도당 세갈락테이트, PEG-40 라놀린, PEG-40 피마자유, PEG-40 수소화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 지방족 에테르, 디글리세리드, 폴리옥시에틸렌 스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 미리스테이트, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르, 글리세릴디라우레이트, 글리세릴디스테아레이트, 글리세릴라우레이트, 글리세릴 미리스테이트, 글리세릴디라우레이트, 그 반합성 유도체 및 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

상기 비이온성 계면활성제는 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콜 콜레스테롤, 폴리에틸렌 글리콜 폴리락트산(PEG-PLA), 폴리에틸렌 글리콜 폴리글리콜산(PEG-PLG), 폴리에틸렌 글리콜-폴리(락트-코-글리콜산(PEG-PLGA), 토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트(TPGS), 폴리에틸렌 글리콜 660-12-히드록시스테아레이트(HS-15), 폴리옥시에틸렌-8-옥틸 및 데실 라브라솔(Labrasol), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(DSPE-PEG), 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르(Transcutol), 에톡실화 계면활성제, 에톡실화 알코올, 에톡실화 알킬페놀, 에톡실화 지방산, 에톡실화 모노에탄올아민, 에톡실화 소르비톨 에스테르, 에톡실화 지방족 아민, 에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드 공중합체, 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다졸릴 카르보닐]), 노난올-9, 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다졸릴 카르보닐]), Brij®35, Brij®56, Brij®72, Brij®76, Brij®92V, Brij®97, Brij®58P, Cremophor®EL, 데칸디올 모노도데실 에테르, N-카프릴-N-메틸글루카민, N-카프릴 알파-D-피라노사이드, 데실 베타-D-메틸글루카민, N-도데실-N-메틸글루카민, N-도데실 알파-D-말토사이드, N-도데실 베타- D-말토시드, 헵타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 헥사에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 헵타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, N-헥사데실 베타-D-말토시드, 헥사틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 헥사틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, 헥사틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르 및 헥사틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, Igepal CA-630, Igepal CA-630, 메틸-6-O-(N-헵틸아미노)-알파-D-글리코피라노사이드, 비글리콜 모노도데실 에테르, N-노닐-N-메틸글루카민, N-노닐-N-메틸글루카민, 옥타글리콜모노도데실에테르, 옥타글리콜모노헥사데실에테르, 옥틸글리콜모노옥타데실에테르, 옥틸글리콜모노테트라데실에테르, 옥틸베타-D-피라노시드, 펜타메틸렌글리콜모노데실에테르, 펜타메틸렌글리콜모노도데실에테르, 펜타메틸렌글리콜모노헥사데실에테르 col 모노헥실 에테르, 펜타메틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, 펜타메틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르, 펜타메틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 에테르 W-1, 폴리옥시에틸렌 10 트리알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 100 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 20 이소헥사데실 에테르, 폴리올레에이트0, 폴리옥시테아레이트 20 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 8 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 비스(이미다졸릴 카보닐), 폴리옥시에틸렌 25-프로필렌 글리콜 스테아레이트, Quillaja 나무 껍질 사포닌, Span®20, Span®40, Span®60, Span®65, Span®80, Span®85, 15- S-12형 터지톨, 15-S-30형 터지톨, 15-S-5형 터지톨, 15-S-7형 터지톨, 15-S-9형 터지톨, NP-10형 터지톨, NP-4형 터지톨, NP-40형 터지톨, NP-7형 터지톨, NP-9형 터지톨, TMN-10형 터지톨, TMN-6형 터지톨, 테트라데실베타-D-말토시드, 테트라에틸렌글리콜모노도데실에테르, 테트라에틸렌글리콜모노테트라데실에테르, 테트라에틸렌글리콜모노도데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, Triton CF-21, Triton CF-32, Triton DF-12, Triton DF-16, Triton GR-5M, Triton QS-15, Triton QS-44, Triton X-100, Triton X-102, Triton X-15, Triton X-151, Triton X-200, Triton X-207, Triton®X-100, Triton®X-114, Triton®X-165, Triton®X-305, Triton®X-405, Triton®X-45, Triton®X-705-70, TWEEN®20, TWEEN®21, TWEEN®40, TWEEN®60, TWEEN®61, TWEEN®65, TWEEN®80, TWEEN®81, TWEEN®85, 틸록사폴, n-운데실 β-D-피라노사이드, 그 반합성 유도체 및 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

상기 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 화합물, 알킬 트리메틸 암모늄 클로라이드 화합물, 디알킬 디메틸 암모늄 클로라이드 화합물, 양이온성 할로겐 함유 화합물, 예를 들어, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤질디메틸세틸암모늄 클로라이드, 테트라데실디메틸벤질암모늄 클로라이드, 벤질도데실디메틸암모늄 브로마이드, 벤질트리메틸암모늄 테트라클로로요오드산염, 디메틸옥타데실암모늄 브로마이드, N-메틸 브로마이드, N-세틸 암모늄 브로마이드, 도데실디메틸암모늄 브로마이드, 도데실트리메틸암모늄 세틸 브로마이드, N-에스테르-1,3-디아미노프로판, 벤질암모늄 브로마이드, 트리메틸(테트라데실) 암모늄 브로마이드, 1,3,5-트리아진-1,3,5(2H,4H,6H)-트리에탄올아민, 1-데실아민, N-데실-N,N-디메틸-클로라이드, 디데실디메틸암모늄 클로라이드, 2-(2-(p- (디-이소부틸)메톡시)에톡시)에틸디메틸벤질암모늄 클로라이드, 2-(2-(p-(디-이소부틸)페녹시)에톡시)에틸디메틸벤질암모늄 클로라이드, 알킬 1 또는 3 벤질-1-(2-히드록시에틸)-2-이미다졸린 클로라이드, 알킬 비스(2-히드록시에틸) 벤질암모늄 클로라이드, 알킬탈메틸화 벤질암모늄 클로라이드, 알킬디메틸 3,4-디클로로벤질 암모늄 클로라이드(100% C12), 알킬디메틸 3,4-디클로로벤질 암모늄 클로라이드(50%C14, 40%C12, 10%C16), 알킬디메틸 3,4-디클로로벤질 암모늄 클로라이드(55%C14, 23%C12, 20%C16), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드, 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(100%C14), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(100%C16), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(41%C14, 28%C12), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(47%C12, 18%C14), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(55%C16, 20%C14), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(58%C14, 28%C16), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(60%C14, 25%C12), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(61%C11, 23%C14), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(61%C12, 23%C14), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(65%C12, 25%C14), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(67%C12, 24%C14), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(67%C12, 25%C14), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(90%C14, 5%C12), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(93%C14, 4%C12), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(95%C16, 5%C18), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드, 알킬 디데실 디메틸 암모늄 클로라이드, 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(C12-16), 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(C12-18), 디알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드, 알킬디메틸디메틸벤질암모늄 클로라이드, 알킬디메틸에틸암모늄 브로마이드(90%C14, 5%C16, 5%C12), 알킬디메틸에틸암모늄 브로마이드(대두 지방산의 혼합 알킬 및 알케닐 오일), 알킬디메틸에틸벤질암모늄 클로라이드, 알킬디메틸에틸벤질암모늄 클로라이드(60%C14), 알킬디메틸이소프로필벤질암모늄 클로라이드(50%C12, 30%C14, 17%C16, 3%C18), 알킬트리메틸암모늄클로라이드(58%C18, 40%C16, 1%C14, 1%C12), 알킬트리메틸암모늄클로라이드(90%C18, 10%C16), 알킬디메틸(에틸벤질)암모늄 클로라이드(C12-18), 디-(C8-10)-알킬디메틸암모늄 클로라이드, 디알킬디메틸암모늄 클로라이드, 디알킬메틸벤질암모늄 클로라이드, 디알킬디메틸암모늄 클로라이드, 디이소데실디메틸암모늄 클로라이드, 디이소옥틸디메틸암모늄 클로라이드, 도데실비스(2-하이드록시에틸)옥틸암모늄 염화수소, 도데실디메틸벤질암모늄 클로라이드, 도데실카르바모일메틸디에틸벤질암모늄 클로라이드, 헵타알킬하이드록시에틸이미다졸린 클로라이드, 헥사하이드로-1,3,5-트리스(2-하이드록시에틸)-s-트리아진, 헥사하이드로-1,3,5-트리스(2-하이드록시에틸)-s-트리아진, 육두구 염화 암모늄(및) 4차 암모늄 염 14, N,N-디메틸-2-히드록시프로필암모늄 클로라이드 폴리머, N-테트라데실디메틸벤질암모늄 클로라이드 일수화물, 옥틸데실디메틸암모늄 클로라이드, 옥틸도데실디메틸암모늄 클로라이드, 옥틸페녹시에톡시에틸디메틸벤질암모늄 클로라이드, 옥시디에틸비스(알킬디메틸암모늄 클로라이드) 4차 암모늄 화합물, 디클로로알킬디메틸클로라이드, 트리메톡시실릴프로필디메틸옥타데실암모늄 클로라이드, 트리메톡시실릴 4차 암모늄염, 트리메톡시도데실벤질암모늄 클로라이드, 그 반합성 유도체 및 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

적합한 음이온성 계면활성제는 카르복실산염, 황산염, 술폰산염, 인산염, 인산, 케노데옥시콜산, 나트륨 케노데옥시콜산, 콜산, 소 또는 양의 담즙, 데히드로콜산, 데옥시콜산, 메틸데옥시콜레이트, 디곡신, N,N-디메틸도데실아민 N-옥사이드, 라우르산나트륨, 글리코콜산나트륨, 수화글리코콜산, 글리콜산 일수화물, 3-글리콜산 황산이나트륨, 에틸 글리콜레이트, N-라우로일사르코신나트륨, N-라우로일사르코신용액, N-라우로일사르코신용액, 리튬 도데실 설페이트, 루골 솔루션, 나이아프루프 타입 4, 나트륨 1-옥탄 설포네이트, 1-옥탄술폰산나트륨, 1-부탄술폰산나트륨, 1-데칸술폰산나트륨, 1-데칸술폰산나트륨, 1-도데칸술폰산나트륨, 무수나트륨1-헵탄술폰산나트륨, 무수나트륨1-헵탄술폰산나트륨, 1-프로판술폰산나트륨, 나트륨 2-브로모에탄술폰산나트륨, 나트륨콜레이트수화물, 나트륨콜레이트, 데옥시콜산나트륨, 라우릴황산나트륨, 무수헥산술폰산나트륨, 옥틸황산나트륨, 무수펜탄설폰산나트륨, 타우로콜산나트륨, 나트륨 타우로데옥시콜레이트, 나트륨 타우로데옥시콜레이트 수화물, 타우로콜산 3-설페이트 이나트륨 염, Trizma® 도데실 설페이트, 우르소데옥시콜산, C6-C30 지방과 그 방향족산의 염, 그 반합성 유도체 및 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

상기 양쪽성 계면활성제는 N-알킬베타인, 도데실아미노프로필 디메틸 베타인, 알킬디메틸글리시네이트, N-알킬아미노프로피오네이트, CHAPS, CHAPSO, 3-(데실디메틸아미노)프로판술포네이트 내염, 3-(도데실디메틸아미노)프로판술포네이트 내염, 3-(N,N-디메틸미리스틸아미노)프로판술포네이트, 3-(N,N-디메틸옥타데실아미노)프로판술포네이트, 3-(N,N-디메틸옥틸아미노)프로판술포네이트 내염, 3-(N,N-디메틸팔미틸아미노)프로판술포네이트, 콩 레시틴, 난황 레시틴, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 그 반합성 유도체 및 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 보다 바람직하게는, 상기 유화제는 트윈 80, 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(DSPE-PEG), 난황 레시틴, Span 85의 하나 이상의 조합물일 수 있다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 마이크로에멀젼의 오일상과 유화제에는 카르복실기, 인산기, 술폰산기, 황산기, 아황산염, 페놀성 수산기, 에놀기, 보론산기의 하나 이상의 조합물이 포함되고, 상기 오일상과 유화제는 C6-C30 지방 및 방향족산, 올레산, 리놀레산, 이소테트라아세트산, 티몰, 비스페놀알코올, 디스테아로일포스파티딜에타놀아민-폴리에틸렌글리콜(DSPE-PEG), 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하며, 상기 마이크로에멀젼 입자 크기는 1000nm미만이고, 바람직하게는 300nm미만이고, 특히 바람직하게는 200nm미만이다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 마이크로에멀젼의 pH값은 4.0-10.0 이고, 바람직하게는 pH값은 5.0-9.0 이며, 특히 바람직하게는 pH값은 6.0-8.0 이다.

본 발명의 마이크로에멀젼 백신에 적합한 첨가제는 하나 이상의 용매, 예를 들어 약학적으로 허용되는 방부제, pH 조절제, 완충제, 유기 용매, 킬레이트제, 항산화제, 충전제, 착색제, 부형제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 상기 첨가제는 이전에 유화된 마이크로에멀젼에 첨가될 수 있거나 상기 첨가 화합물을 원래 혼합물에 첨가하여 유화할 수 있다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 방부제는 세틸피리디늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 벤질 알코올, 클로르헥시딘, 이미다졸리디닐우레아, 페놀, 소르빈산 칼륨, 벤조산, 크레졸, 클로로크레졸, 파라벤, 페녹시에탄올, 소르브산, 알파 토코페롤, 아스코르브 산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 아스코르브산나트륨, 메타중아황산나트륨, 구연산, 에데트산, 그 반합성 유도체 및 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.상기 방부제는 벤질 알코올, 클로르헥시딘(비스(p-클로로페닐디아구아니딜)헥산), 클로르페니라민(3-(-4-클로로옥시)-프로판-1,2-디올), 카손 CG(메틸 및 메틸클로로이소티아졸리논), 파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 안식향산부틸), 페녹시에탄올(2-페녹시에탄올), 페노닙(페녹시에탄올, 메틸, 에틸, 부틸, 프로필파라벤), Phenoroc, Liquipar Oil, Liquipar PE, Nipaguard MPA, 메틸파라벤 설포네이트(프로필렌 글리콜, 메틸파로반 및 프로필 에스테르), 니파긴 펩타이드(메틸파로반, 에틸 및 프로필 에스테르), 니파긴 에스테르(메틸파로반, 부틸, 에틸 및 프로필 에스테르), Elestab 388, Killitol중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 pH 조절제는 HEPES, 디에탄올아민, 젖산, 모노에탄올아민, 트리에틸아민, 수산화나트륨, 인산나트륨, 그 반합성 유도체 및 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 마이크로에멀젼은 킬레이트제를 포함할 수 있고, 상기 킬레이트제의 예는 에틸렌디아민, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 피트산, 폴리인산, 시트르산, 글루콘산, 아세트산, 젖산, 디머캅토프로판올 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 완충제는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, L-(+)-주석산, ACES, ADA, 아세트산, 아세트산암모늄 용액, 중탄산암모늄 용액, 구연산이암모늄 용액, 포름산암모늄 용액, 옥살산암모늄 일수화물, 인산이암모늄용액, 인산일암모늄용액, 인산이나트륨테트라수용액, 황산암모늄 용액, 주석산암모늄 이염기성 용액, BES 완충 식염수 용액, BICINE 완충용액, BIS-TRIS, 중탄산나트륨 완충제, 붕산, CAPS, CHES, 초산칼슘수화물, 구연산농축액, 구연산, 디에탄올아민, EPPS, 개미산 수용액, 글리신-글리신-글리신, 글리신-글리신, 글리신, HEPES 완충 식염수, 이미다졸 완충액, 지단백질 리폴딩 완충액, 리튬 아세테이트 이수화물, 시트르산리튬삼염기사수화물, MES용액, MOPS, 초산마그네슘용액, 구연산마그네슘삼염기무수화물, 포름산마그네슘용액, 인산마그네슘이염기삼수화물, 옥살산 이수화물, PIPES, 인산염 완충 식염수, 퍼옥시다제 접합체 세척 완충액, 피페라진, 포타슘 D-타르트레이트, 포타슘 아세테이트 용액, 포타슘 바이카보네이트, 탄산칼륨, 염화칼륨, 구연산칼륨 일염기산염, 구연산칼륨삼염기산염용액, 포름산칼륨용액, 옥살산칼륨일수화물, 인산이수소칼륨, 칼륨 프탈레이트, 칼륨 타르타르산나트륨 용액, 칼륨 타르타르산나트륨 4수화물, 사붕산칼륨 사수화물, 칼륨 테트라옥살레이트 이수화물, 프로피온산 용액, STE 완충액, 5,5-디에틸바르비탈나트륨, 아세트산 나트륨 용액, 탄산 수소 나트륨, 타르타르산나트륨 일수화물, 탄산나트륨, 구연산 나트륨 용액, 포름산나트륨 용액, 옥살산나트륨, 인산수소이나트륨 용액, 인산이수소나트륨 용액, 인산나트륨 용액, 피로인산나트륨 이원액, 피로인산나트륨 4차 십수화물 용액, 주석산나트륨 이원액, 사붕산나트륨 십수화물, TAPS, TES, TM완충제, TNT완충제, 트리글리신 완충액, 디에틸 트리아세테이트 EDTA 완충 용액, 나트륨 도데실 트리글리신 설페이트 완충 용액, 에틸렌디아민 트리포스페이트 테트라아세테이트 완충 용액, 트리아진, 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 트리에틸아민 아세테이트 완충 용액, 트리에틸암모늄 포스페이트 용액, 트리메틸암모늄 아세테이트 용액, 트리메틸암모늄 포스페이트 용액, Tris-EDTA 버퍼 용액, Trizma® 아세테이트 및 Trizma® 알칼리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 유기 용매는 탄소수 1 내지 12의 알코올, 디올, 트리올, 디알킬포스페이트, 트리알킬포스페이트(트리-n-부틸포스페이트 등), 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 글리세롤, 중쇄 트리글리세리드, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 아세톤, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 초산, n-부탄올, 부탄디올, 향주알코올, 이소프로판올, n-프로판올, 포름산, 프로필렌글리콜, 소르비톨, 공업용 메틸화액, 글리세린트리아세테이트, 헥산, 벤젠, 톨루엔, 디에틸에테르, 클로로포름, 1,4- 디옥산, 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드, 포름산, 그 반합성 유도체 및 이들의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 마이크로에멀젼은 첨가제를 더 포함하며, 상기 첨가제는 항산화제(예를 들어, 비타민 C 및 비타민 E), 향미제(예를 들어, 포도당 및 자일리톨), 삼투 조절제(예를 들어, 글리세롤), 증점제(예를 들어, 카라기난 및 펙틴), 충전제(예를 들어, 전분), 착색제(레몬옐로우, 선셋옐로우), 부형제(아라비아 고무, 아라비아검시럽) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 마이크로에멀젼은 금속 이온 화합물을 흡착하고, 다시 직접 표면 흡착 또는 소수성 상호작용을 통해 항원과 백신을 형성한다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 항원은 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 올리고당, 다당류, 종양 세포 용해물, 박테리아 용해물, 박테리아 세포막, 마이코플라즈마 세포막, 클라미디아 세포벽, 스피로헤타, 리케차 마이크로캡슐, 바이러스 외피, 엑소좀, 바이러스 또는 박테리아 용해물 항원, 바이러스 또는 박테리아 외부막 소포 항원, 종양 세포막 소포 항원, 종양세포 엑소좀 항원, 모델 항원인 닭 오브알부민(OVA) 등의 하나 이상의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 항원은 모델 항원인 닭 오브알부민(OVA), 흑색종 항원 펩티드 GP100(ITDQVPFSV)의 하나 이상의 조합물이다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 금속 이온 화합물이 흡착된 마이크로에멀젼 자체가 어쥬번트 효과를 가지고, 다양한 어쥬번트를 첨가하여 면역 반응을 추가적으로 향상시킬 수 있으며, 상기 추가 어쥬번트는 항원 관련 분자 패턴 어쥬번트: 톨 유사 수용체 작용제: 펩티도글리칸, 리포테이코산, MPLA, 이미퀴모드, 레퀴모드, CpG-ODN, 박테리아 플라겔린, 폴리 I:C, RIG -I 유사 수용체 작용제: 3pRNA, 짧은 이중 가닥 RNA, NOD 유사 수용체 작용제: 무라밀 디펩티드(MDP), N-아세틸글루코사민, C형 렉틴 수용체: β-글루칸 당, 트레할로스 디보레이트, STING 작용제: cGAMP, 박테리아 독소 및 유도체: 콜레라 독소(CT), 대장균 열 불안정성 장독소(LT), 콜레라 독소 B 소단위체, 사포닌: QS21, Tomatin, Quil-A, 사이토카인: GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-6, IFN-γ, Flt-3, 림프구 케모카인; 기타 어쥬번트: 열 충격 단백질, A151, GTP-GDP, 불화나트륨, 알킬 폴리아크릴레이트 중합체, 디메틸 디옥타데실 4차 암모늄 브로마이드(DDA)의 하나 이상의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.바람직하게는, 상기 추가 어쥬번트는 CpG 1826, A151의 하나 이상의 조합물이다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하는 것이며, 상기 마이크로에멀젼은 다음 중량부의 성분, 즉: 적절한 양의 수상, 오일상 0.01%-50%, 유화제 0.001%-10%을 포함하고, 금속 이온 화합물의 중량부는 0.0001%-1%, 항원의 중량부는 1%-0.0001%이다.

바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템에서, 상기 마이크로에멀젼은 다음 중량부의 성분, 즉: 적절한 양의 수상, 오일상 0.1%-5%, 유화제 0.01%-2%를 포함하고, 금속 이온 화합물의 중량부는 0.001%-1%, 항원의 중량부는 0.1%-0.0001%이다.

바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템에서, 상기 마이크로에멀젼은 다음 중량부의 성분, 즉: 적절한 양의 주사용수, 스쿠알렌 0.1%-5%, 트윈 80 0.01%-2%, 스팬 85 0.01%-2%, DSPE-PEG 0.01%-2%, 수산화알루미늄 0.01%-1%, 모델 항원인 닭 오브알부민(OVA) 0.1%-0.001%을 포함한다.

바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템에서, 상기 마이크로에멀젼은 다음 중량부의 성분, 즉: 적절한 양의 주사용소, 대두유 0.1%-5%, 중쇄 트리글리세리드 0.1%-5%, 난황 레시틴 0.01%-2%, DSPE-PEG 0.01%-2%, 수산화제이철 0.1%-0.001%, 흑색종 항원 펩티드 GP100 0.01%-0.0001%을 포함한다.

보다 바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템에서, 상기 마이크로에멀젼은 다음 중량부의 성분, 즉: 적절한 양의 주사용수, 스쿠알렌 0.1%-2%, 트윈 80 0.1%-2%, 스팬 85 0.1%-2%, DSPE-PEG 0.1%-2%, 수산화알루미늄 0.01%-0.1%, 모델 항원인 닭 오브알부민(OVA) 0.1%-0.01%을 포함한다.

보다 바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템에서, 상기 마이크로에멀젼은 다음 중량부의 성분, 즉: 적절한 양의 주사용수, 대두유 0.1%-2%, 중쇄 트리글리세리드 0.1%-2%, 난황 레시틴 0.1%-2%, DSPE-PEG 0.1%-2%, 수산화제이철 0.01%-0.001%, 흑색종 항원 펩티드 GP100 0.01%-0.001%을 포함한다.

바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템은 0.1%-0.001%의 함량을 갖는 추가 어쥬번트 CpG 1826, A151 중 하나 이상을 추가로 함유한다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하며, 상기 마이크로에멀젼의 제조 방법은 다음 단계, 즉:

(1) 친유성 유화제를 오일상에 용해하고 친수성 유화제를 수상에 용해한 후, 양자를 충분히 혼합하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계;

(2) 상기 마이크로에멀젼에 pH 완충액 및/또는 금속 이온 화합물의 음이온 부분을 첨가하는 단계;

(3) 단계(2)에서 제조된 혼합물에 금속 이온 화합물의 양이온 부분을 첨가하는 단계;

(4) 단계(2) 또는 단계(3)에서 제조된 혼합물에 항원을 첨가하고 균일하게 혼합하여 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 얻는 단계;를 포함한다.

바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼의 제조 방법은 다음 단계, 즉:

(1) 친유성 유화제를 오일상에 용해하고 친수성 유화제를 수상에 용해한 후, 양자를 혼합하여 초유를 형성하고, 초유를 다시 고압 균질화, 초음파 또는 고속 교반 등 방법으로 충분히 혼합하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계;

(2) 상기 마이크로에멀젼에 pH 완충액 및/또는 금속 이온 화합물의 음이온 부분을 첨가하는 단계;

(3) 볼텍싱(vortexing), 교반 또는 초음파 처리 조건에서 또는 마이크로 주사기 펌프를 통해 단계(2)에서 제조된 혼합물에 금속 이온 화합물의 양이온 부분을 첨가하는 단계;

(4) 단계(2) 또는 단계(3)에서 제조된 혼합물에 항원을 첨가하여 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 얻는 단계;를 포함한다.

본 발명의 목적 중 하나는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 제공하며, 상기 마이크로에멀젼의 제조 방법은 다음 단계, 즉:

(1) 친유성 유화제를 오일상에 용해하고 친수성 유화제를 수상에 용해한 후, 양자를 충분히 혼합하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계;

(2) 상기 마이크로에멀젼에 금속 이온 화합물의 양이온 부분을 첨가하는 단계;

(3) 단계(2)에서 제조된 혼합물에 pH 완충액 및/또는 금속 이온 화합물의 음이온 부분을 첨가하는 단계;

(4) 단계(2) 또는 단계(3)에서 제조된 혼합물에 항원을 첨가하고 균일하게 혼합하여 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 얻는 단계;를 포함한다.

바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼의 제조 방법은 다음 단계, 즉:

(1) 친유성 유화제를 오일상에 용해하고 친수성 유화제를 수상에 용해한 후, 양자를 혼합하여 초유를 형성하고, 초유를 다시 고압 균질화, 초음파 또는 고속 교반 등 방법으로 충분히 혼합하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계;

(2) 상기 마이크로에멀젼에 금속 이온 화합물의 양이온 부분을 첨가하는 단계;

(3) 볼텍싱(vortexing), 교반 또는 초음파 처리 조건에서 또는 마이크로 주사기 펌프를 통해 단계(2)에서 제조된 혼합물에 pH 완충액 및/또는 금속 이온 화합물의 음이온 부분을 첨가하는 단계;

(4) 단계(2) 또는 단계(3)에서 제조된 혼합물에 항원을 첨가하여 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 얻는 단계;를 포함한다.

본 발명은 OVA를 모델 항원으로 선택하고, 백신 벡터가 항원 특이적 체액성 및 세포 면역을 유도할 수 있음을 시험관내 및 생체내 실험에 의해 입증하였다. 본 발명은 OVA 또는 흑색종 항원 펩티드 GP100(ITDQVPFSV)를 모델 항원으로 선택하고, CpG1826 또는 A151을 모델 어쥬번트로 선택하여 상기 백신 벡터가 항원과 핵산 어쥬번트의 동시 포집을 실현할 수 있음을 시험관내 실험에 의해 입증하였다. 본 발명의 바람직한 실시예 중 하나로서, 제조된 백신 벡터는 DC2.4 항원 제시 세포에 의해 효율적으로 흡수될 수 있다. 본 발명의 백신 전달 시스템은 마이크로에멀젼을 사용하여 금속 이온 화합물을 흡착함으로써, 더 높은 안정성을 가지며, 쉽게 응집되지 않고, 우수한 분산성을 가지며, 임상 사용에 더 적합하다. 본 발명의 백신 전달 시스템은 입자 크기가 200nm미만이므로 림프절 전달의 요구 사항을 만족하고, 림프절을 효과적으로 표적화할 수 있고 백신의 표적화된 전달을 실현할 수 있다. 본 발명의 백신 벡터는 항원 제시 세포에 의해 효율적으로 흡수될 수 있어, 다음 면역 응답의 발생에 유리하다. 기존의 알루미늄 겔 어쥬번트는 주사 부위에서 육아종을 유발하기 쉽고 신장 기능 저하와 같은 특정 조건에서 알루미늄이 체내에 축적되며, 많은 량의 알루미늄은 먼저 뇌와 뼈 조직에 영향을 미치고 심각한 신경 증후군과 투석 치매를 유발한다. 알루미늄 독성은 또한 근위 축성 측삭 경화증 및 알츠하이머병과 관련이 있다. 본 발명에서는 알루미늄 마이크로에멀젼 백신을 제조할 때, 본 발명에 따른 백신의 알루미늄 함량이 시판되는 알루미늄 겔(Alhydrogel® 2%, 미국 InvivoGene사)에 비해 훨씬 낮으므로 금속 이온이 축적되는 위험과 국소적 부작용을 줄이고 독성이 낮아 환자의 적응력을 향상시킨다.

종래 기술과 비교하면, 본 발명은 다음과 같은 장점을 갖는다.

1. 본 발명은 금속 이온 화합물을 에멀젼 표면에 흡착시키고, 금속 이온 화합물을 흡착하는 에멀젼의 보편적인 제조 방법을 제공한다.

2. 본 발명에서 금속 이온 화합물은 백신 벡터로서 에멀젼의 표면에 흡착되며, 에멀젼은 우수한 분산성, 높은 안정성 및 큰 제어 가능한 입자 크기 범위를 가지며 거대 분자 항원을 포집하여 림프 전달을 달성할 수 있다.

3. 본 발명은 친수성 항원과 소수성 항원을 동일한 벡터에 포집하여 서로 다른 특성을 가진 여러 항원의 공동 전달을 실현하고, 신체가 병원체에 대해 포괄적이고 효과적인 면역 응답을 생성하도록 유도할 수 있다.

4. 본 발명은 모두 FDA 승인을 받은 부형제를 사용하여 제조할 수 있으며, 안전하고 저렴하며 입수가 용이하고 산업 생산에 적합하며, 제조 방법이 간단하고 신속하고 조건이 온화하며, 유기 시약을 첨가하지 않고 항원성 단백질의 변성을 일으키지 않으며, 항원성 단백질의 구조와 활성을 효과적으로 유지할 수 있다.

5. 본 발명은 방법이 간단한데, 고압 균질화, 초음파 처리 또는 고속 교반과 같은 혼합 방법으로 마이크로에멀젼을 제조한 후, 볼텍싱, 교반, 초음파 조건에서 또는 마이크로 주사기 펌프를 통해 금속 이온 화합물의 양이온 또는 음이온 부분과 항원을 첨가하며, 대량 생산이 가능하고 산업 변환에 유리하며, 광범위한 응용 및 시장 전망을 갖는다.

이하, 첨부도면을 결부하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.
도 1은 유리 CpG 1826(CpG 1826), 2.4μg CpG 1826(NE-80μg/ml)가 포집된 20μl 수산화알루미늄 마이크로에멀젼, 4.8μg CpG 1826(NE-160μg/ml)가 포집된 20μl 수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 세파덱스 전기영동도를 나타낸다.
도 2는 유리 A151(A151), 3.0μg A151의 수산화제이철 마이크로에멀젼(NE-A151)이 포집된 20μl 수산화제이철 마이크로에멀젼의 세파덱스 전기영동도를 나타낸다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 전자현미경 사진이다.
도 4는 실시예 9에서 제조된 흑색종 항원 펩티드GP100가 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼의 전자현미경 사진이다.
도 5는 유리 FITC 표지된 OVA(Free OVA), 및 DC2.4 세포에서 FITC 표지된 OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼(NE-OVA)의 흡수 결과를 나타낸다.
도 6은 유리 FITC 표지된 GP100(Free-GP100), 및 DC2.4세포에서 FITC 표지된 GP100가 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼(NE@Fe-GP100)의 흡수 결과를 나타낸다.
도 7은 유리 OVA(OVA), OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼(NE-OVA), 유리 OVA와 CpG(OVA+CpG)로 동물을 면역화한 CTL결과이다.
도 8a 내지 도 8c는 유리 OVA와 CpG(OVA+CpG), OVA와 CpG가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼(NE-OVA-CpG)으로 면역화한 동물의 혈청 항체 IgG(도 8a), IgG1(도 8b) 및 IgG2a(도 8c)이다.

다음의 실시예는 본 발명을 추가적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 추가적으로 설명하지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명이 이들 실시예 및 사용된 제조 방법에 의해 제한되는 것이 아님을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 설명에 기초하여 본 발명에 대해 균등한 대체, 조합, 개량 또는 변형을 수행할 수 있고, 이들 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

실시예 1

수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 제조 방법: 스쿠알렌 0.5g에 Span 85 0.2g을 용해하고 주사용수에 트윈 80 0.2g을 용해하고 혼합하여 초유를 형성하고, 초유를 고압으로 균질화하여 마이크로에멀젼 40ml를 형성하고, 마이크로에멀젼 1ml를 취하고 여기에 DSPE-PEG 분말 5mg을 첨가하여 교반하여 용해시키며, 37.5mM 황산알루미늄 수용액 312.5μl를 첨가하고 pH 8의 100mM HEPES 완충액 1.75ml를 와류 하에 첨가하여 중성으로 조정하여 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 2

수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 제조 방법: 난황 레시틴 0.35g, 트윈 80 0.01g을 주사용수에 용해하고, 스쿠알렌 0.5g에 혼합하여 초유를 형성하며, 초유를 고압으로 균질화하여 40ml의 마이크로에멀젼을 형성한다. 상기 에멀젼 1ml를 취하여 37.5mM 황산알루미늄 수용액 123μl를 첨가하고, pH 8의 100mM HEPES 완충액 615μl를 와류 하에 첨가하여 중성으로 조정하여 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 3

수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 제조 방법: 올레산 0.1g와 Span 85 0.2g를 스쿠알렌 0.5g에 용해하고 트윈 80 0.2g을 주사용수에 용해하고 혼합하여 초유를 형성하고, 초유를 고압으로 균질화하여 마이크로에멀젼 40ml를 형성한다. 상기 에멀젼 1ml를 취하여 37.5mM 황산알루미늄 수용액 100μl를 첨가하고, pH 8의 100mM HEPES 완충액 550μl를 와류 하에 첨가하여 중성으로 조정하여 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 4

인산알루미늄 마이크로에멀젼의 제조 방법: 스쿠알렌 0.5g에 Span 85 0.2g을 용해하고 주사용수에 트윈 80 0.2g을 용해하고 혼합하여 초유를 형성하고, 초유를 고압으로 균질화하여 마이크로에멀젼 40ml를 형성하고, 마이크로에멀젼 1ml를 취하고 여기에 DSPE-PEG 분말 5mg을 첨가하여 교반하여 용해시키며, 5mM 황산알루미늄 수용액 1ml를 첨가하고 10mM 인산나트륨 수용액 1ml를 와류 하에 첨가하여 인산알루미늄 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 5

인산칼슘 마이크로에멀젼의 제조 방법: 스쿠알렌 0.5g에 Span 85 0.2g을 용해하고 주사용수에 트윈 80 0.2g을 용해하고 혼합하여 초유를 형성하고, 초유를 고압으로 균질화하여 마이크로에멀젼 40ml를 형성하고, 마이크로에멀젼 1ml를 취하고 여기에 DSPE-PEG 분말 5mg을 첨가하여 교반하여 용해시키며, 10mM 염화칼슘 수용액 1ml 를 첨가하고 6.6mM 인산나트륨 수용액 1ml를 와류 하에 첨가하여 인산칼슘 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 6

OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 제조 방법: 실시예 1에서 제조된 수산화알루미늄 함유 마이크로에멀젼을 180μl 취하고, 여기에 2mg/ml의 OVA수용액 20μl 을 첨가하고, 37도에서 30분 동안 배양하여 OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 7

OVA, CpG1826가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 제조 방법: 실시예 1에서 제조된 수산화알루미늄 함유 마이크로에멀젼 160μl을 취하고, 여기에 2mg/ml OVA의 수용액 20μl 및 200μg/ml CpG1826의 수용액 20μl 을 첨가하고, 37도에서 30분 동안 배양하여 OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 8

난백 라이소자임이 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 제조 방법: 스쿠알렌 0.5g에 Span 85 0.2g을 용해하고 주사용수에 트윈 80 0.2g을 용해하고 혼합하여 초유를 형성하고, 초유를 고압으로 균질화하여 마이크로에멀젼 40ml를 형성하고, 마이크로에멀젼 1ml를 취하고 여기에 DSPE-PEG 분말 5mg을 첨가하여 교반하여 용해시키며, 100mM pH 8의 HEPES완충액 1.75ml, 4 mg/ml의 난백 리소자임 수용액 100 μl를 첨가하고, 37.5 mM 알루미늄 설페이트 수용액 312.5 μl를 와류 하에 첨가하여 난백 라이소자임이 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 9

흑색종 항원 펩타이드 GP100이 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼의 제조 방법: 대두유 0.5g, 중쇄 트리글리세리드 0.5g, 난황 레시틴 0.5g을 균일하게 혼합하고 주사용수를 첨가하고 혼합하여 초유를 형성하고, 초유를 고압으로 균질화하여 마이크로에멀젼 40ml를 형성하고, 마이크로에멀젼 1ml를 취하고 여기에 DSPE-PEG 분말 5mg을 첨가하여 교반하여 용해시키며, 3μl(200mM) 염화제이철 수용액을 첨가하고, 약 20μl(0.1M) 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 거의 중성으로 조정하고, 7mg/ml 흑색종 항원 펩티드 GP100(ITDQVPFSV) 수용액 10μl를 첨가하고 균일하게 혼합하여 흑색종 항원 펩타이드 GP100이 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼을 얻는다.

실시예 10

OVA 및 뉴클레오티드 CpG 1826가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 제조 방법: 실시예 6에서 제조된 수산화알루미늄 함유 마이크로에멀젼 20μl를 취하여, 2.4μg 또는 4.8μg CpG 1826을 함유하는 수용액 10μl를 첨가하고, CpG 1826의 서열은 5'-TCCATGAC GTTCCTGACGTT-3'이며, 30분 동안 흔들어 OVA 및 뉴클레오티드 CpG 1826이 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 제조하고, 세파덱스 전기 영동 실험을 수행하여 마이크로에멀젼의 핵산 포집 능력을 검출한다. 검출 결과는 도 1을 참조할 수 있으며, 20μl 마이크로에멀젼에 2.4μg CpG 1826가 포집될 수 있다. 도면에서, CpG1826는 유리 CpG 1826를 나타내고; NE-80μg/ml는 20μl 마이크로에멀젼에 2.4μg CpG 1826가 포집되고, 최종 농도는 80μg/ml임을 나타내고; NE-160μg/ml는 20μl 마이크로에멀젼에 4.8μg CpG 1826가 포집되고, 최종 농도는 160μg/ml임을 나타낸다.

실시예 11

뉴클레오티드 A151 및 흑색종 항원 펩티드 GP100가 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼의 제조 방법: 실시예 9에서 제조된 수산화제이철 마이크로에멀젼 20μl를 취하여, 뉴클레오티드 A151를 3μg첨가하고, 그 서열은 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG이며, 30분 동안 흔들어 뉴클레오티드 A151 및 흑색종 항원 펩티드 GP100이 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼을 제조하고, 세파덱스 전기 영동 실험을 수행하여 마이크로에멀젼의 핵산 포집 능력을 검출한다. 검출 결과는 도 2를 참조할 수 있으며, 20μl 마이크로에멀젼에 3μg A151가 포집될 수 있다. 도면에서, A151는 유리 A151를 나타내고, NE-A151는 20μl 마이크로에멀젼에 3μg A151가 포집됨을 나타낸다.

실시예 12

마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템의 마이크로에멀젼의 입자 크기 측정: Zetasizer Nano ZS90 레이저 입도 분석기를 사용하여 실시예 1 내지 실시예 9의 금속 이온 화합물 함유 마이크로에멀젼 또는 항원이 포집된 백신 전달체의 입도 분포를 측정하고, 실시예 1 내지 실시예 9의 마이크로에멀젼 용액을 각각 0.1ml씩 취하여 순수 수용액 0.9ml를 첨가하여 희석하고 검체를 검체셀에 넣고 측정 온도를 25℃로 설정한다. 측정 결과는 표 1을 참조할 수 있으며, 나노 입자의 크기는 100-150nm 이고, PDI 요구 사항을 충족하고 분포가 균일하다.

표 1 실시예 1 - 9의 금속 이온 화합물 함유 마이크로에멀젼의 입자 크기

실시예 13

수산화알루미늄 마이크로에멀젼의 투과전자현미경: 실시예 1에서 제조된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼 시료를 동메쉬에 올려 5분 동안 방치한 후 인텅스텐산으로 1분간 염색하고, 동메쉬의 과잉의 염색액을 여과지에 흡수시킨 후 상온에서 자연 건조시키고, 200kv 조건에서 투과전자현미경으로 시료를 관찰한다. 결과는 도 3을 참조할 수 있으며, 실험 결과로부터 마이크로에멀젼은 모두 100nm 미만의 입자 크기를 갖는 둥근 입자임을 알 수 있다.

실시예 14

흑색종 항원 펩티드 GP100가 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼의 투과전자현미경: 실시예 9에서 제조된 흑색종 항원 펩티드가 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼 시료를 동메쉬에 올려 5분 동안 방치한 후 인텅스텐산으로 1분간 염색하고, 동메쉬의 과잉의 염색액을 여과지에 흡수시킨 후 상온에서 자연 건조시키고, 200kv 조건에서 투과전자현미경으로 시료를 관찰한다. 결과는 도 4을 참조할 수 있으며, 실험 결과로부터 마이크로에멀젼은 모두 100nm 미만의 입자 크기를 갖는 둥근 입자임을 알 수 있다.

실시예 15

DC2.4세포에서 수산화알루미늄 마이크로에멀젼백신 시스템의 흡수: 12-웰 플레이트에서, 1 x 10⁶개 DC2.4 세포를 각 웰에 파종하고, 인큐베이터에 4-6시간 동안 두어 세포가 부착된 후, 5 μg의 FITC 표지된 OVA 또는 실시예 6에 따라 제조된 동일한 양의 FITC 표지된 OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 각 웰에 첨가한다. 37°C에서 1.5시간 동안 흡수한 후 상층액을 버리고, PBS로 세포 표면을 부드럽게 두 번 헹군 다음 PBS로 직접 피펫하고, 세포를 2000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 두 번 세척하고, 마지막으로, 세포를 400 μl PBS에 재현탁시키고 유세포 분석으로 검출한다. 결과는 도 5를 참조할 수 있으며, 유리 OVA는 DC2.4 세포에서 거의 흡수되지 않지만, DC2.4 세포에서 본 발명의 백신 전달 시스템의 흡수율은 약 70%로서 유리 OVA보다 훨씬 더 높고 유의한 차이(****, P < 0.0001)를 가지며, 상기 약물 전달 시스템에 의한 항원의 캡슐화는 면역 세포에 의한 항원의 흡수 효율을 유의하게 향상시킴을 알 수 있다. 도면에서, Free OVA는 유리 FITC 표지된 OVA를 나타내고, NE-OVA는 FITC 표지된 OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 나타낸다.

실시예 16

DC2.4세포에서 수산화제이철 마이크로에멀젼 백신 시스템의 흡수: 12-웰 플레이트에서, 1×10⁶개 DC2.4 세포를 각 웰에 파종하고, 인큐베이터에 4-6시간 동안 두어 세포가 부착된 후, 2μg의 FITC 표지된 흑색종 항원 펩티드 GP100(ITDQVPFSV) 또는 실시예 9에서 제조된 동일한 양의 FITC 표지된 흑색종 항원 펩티드 GP100(ITDQVPFSV)가 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼을 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 1.5시간 동안 흡수한 후 상층액을 버리고, PBS로 세포 표면을 부드럽게 두 번 헹군 다음 PBS로 직접 피펫하고, 세포를 2000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 두 번 세척하고, 마지막으로, 세포를 400 μl PBS에 재현탁시키고 유세포 분석으로 검출한다. 결과는 도 6을 참조할 수 있으며, 유리 흑색종 항원 펩티드는 DC2.4 세포에서 거의 흡수되지 않지만, DC2.4 세포에서 본 발명의 백신 전달 시스템의 흡수율은 약 60%로서 유리 폴리펩티드보다 훨씬 더 높고 유의한 차이(***, P < 0.001)를 가지며, 마이크로에멀젼에 의한 항원의 캡슐화는 면역 세포에 의한 항원의 흡수 효율을 유의하게 향상시킴을 알 수 있다. 도면에서, Free-GP100는 유리 FITC 표지된 GP100를 나타내고, NE@Fe-GP100는 FITC 표지된 GP100가 포집된 수산화제이철 마이크로에멀젼을 나타낸다.

실시예 17

수산화알루미늄 마이크로에멀젼백신 시스템의 세포독성 T 림프구(CTL) 실험 및 면역 항체 검출: 제0일째, 제7일째, 제14일째에 마우스의 발바닥에 25ul의 실시예 6에서 제조된 OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼, 실시예 7에서 제조된 OVA 및 CpG가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼, 유리 OVA 또는 유리 OVA 및 CpG를 주사하여 면역화하되 5ug OVA, 0.5ug CpG를 포함하며, 제21일째에 CFSE 염색에 의해 생체내 CTL 반응을 검출한다.결과는 도 7을 참조할 수 있으며, 유리 OVA와 OVA의 수산화알루미늄 마이크로에멀젼은 항원 특이적 세포 면역 반응을 유도할 수 없고, OVA 및 CpG가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼은 강력한 항원 특이적 세포 면역 반응을 생성할 수 있으며, CTL은 유리 OVA+CpG군보다 훨씬 높으며 유의한 차이(*, P < 0.05)를 갖는다. 결과는 본 발명의 백신 시스템이 CD8+ T 세포의 면역 응답을 유의하게 개선할 수 있고, 종양, 바이러스 감염 등 분야에서 광범위한 응용 전망을 갖는다는 것을 보여준다. 도면에서, OVA는 유리 OVA를 나타내고, NE-OVA는 OVA가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 나타내고, OVA+CpG는 유리 OVA와 CpG를 나타내고, NE-OVA-CpG는 OVA와 CpG가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 나타낸다.

실시예 18

수산화알루미늄 마이크로에멀젼 백신 시스템의 면역 항체 검출: 제0일째, 제7일째, 제14일째에 마우스의 발바닥에 25ul의 실시예 7에서 제조된 OVA와 CpG가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼, 유리 OVA 및 CpG를 주사하되 5ug OVA, 0.5ug CpG를 포함하며, 제21일째에 안와 혈액을 채취하여 혈청 내 OVA 특이 항체를 검출한다. 결과는 도 8a 내지 도 8c를 참조할 수 있고, 상기 도 8a, 도 8b 및 도 8c는 IgG, IgG1 및 IgG2a의 항체 검출 결과이며, 실험 결과로부터 수산화알루미늄 마이크로에멀젼 백신 시스템은 강한 항원 특이적 면역 반응을 생성하고, IgG 수준이 유리 OVA+CpG군보다 훨씬 높은 유의한 차이(****, P < 0.0001)를 가지며, Th2형 면역 응답을 나타내는 IgG1도 유리 OVA+CpG군보다 훨씬 높은 유의한 차이(****, 즉 P < 0.0001)를 가지며, Th1형 면역 응답을 나타내는 IgG2a수준이 유리 OVA+CpG군보다 훨씬 높은 유의한 차이(***, 즉 P < 0.001)를 가지며, 본 발명의 백신 시스템은 항원 면역원성을 유의하게 향상시키는 장점을 갖는다는 것을 알 수 있다. 도면에서, OVA+CpG는 유리 OVA 및 CpG를 나타내고, NE-OVA-CpG는 OVA 및 CpG가 포집된 수산화알루미늄 마이크로에멀젼을 나타낸다.

상기 설명은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐이고, 본 발명을 어떠한 형태로든 한정하는 것은 아니며, 본 발명은 바람직한 실시예와 함께 상기와 같이 개시되었지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 해결책의 범위를 벗어나지 않는 전제 하에서 상기에 개시된 기술적 내용을 이용하여 균등한 변경 또는 수정을 실시할 수 있으며, 본 발명의 기술적 해결책의 내용을 벗어나지 않는 범위에서 본 발명의 기술적 본질에 따라 상기 실시예에 대해 수행한 모든 간단한 수정, 균등한 변경 및 대체는 모두 본 발명의 기술적 해결책의 범위에 속한다.

Claims (14)

1. 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템에 있어서,
   상기 마이크로에멀젼은 수상, 오일상, 유화제, 금속 이온 화합물 및 항원을 포함하고, 상기 마이크로에멀젼의 표면에는 금속 이온 화합물이 흡착됨과 동시에 항원이 포집되며, 상기 마이크로에멀젼의 pH값은 4.0-10.0 이고, 상기 마이크로에멀젼의 오일상과 유화제에는 카르복실기, 인산기, 술폰산기, 황산기, 아황산염, 페놀성 수산기, 에놀기, 보론산기 중 하나 이상이 포함되고 부분적으로 또는 완전히 이온화되어 음이온을 생성할 수 있으며, 금속 이온 화합물은 금속 양이온을 포함하고, 상기 금속 이온 화합물은 마이크로에멀젼 표면의 음이온과 반응하여 마이크로에멀젼 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
2. 제1항에 있어서,
   상기 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템의 각 성분의 중량부는 오일상 0.01%-50%, 유화제 0.001%-10%이고, 상기 금속 이온 화합물의 중량부는 0.0001%-1%이고, 상기 항원의 중량부는 0.0001%-1%인 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 금속 이온 화합물의 금속 이온은 알루미늄, 철, 지르코늄, 칼슘, 망간, 카드뮴, 마그네슘, 세륨, 카드뮴, 코발트, 갈륨 또는 아연 중 하나 이상으로부터 선택되고, 상기 금속 이온 화합물은 무기염 또는 유기 복합체 형태인 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
4. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 금속 이온 화합물은 수산화알루미늄, 수산화제이철, 인산알루미늄, 인산칼슘 또는 수산화아연 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
5. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 오일상은 미용학적으로 또는 약학적으로 허용되는 임의의 오일인 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
6. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 유화제는 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 이온 계면활성제의 하나 이상의 조합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
7. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 마이크로에멀젼의 입자 크기는 1000nm미만인 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
8. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 마이크로에멀젼의 입자 크기는 300nm미만인 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
9. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 마이크로에멀젼의 입자 크기는 200nm미만인 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
10. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로에멀젼은 첨가제를 더 포함하고, 상기 첨가제는 방부제, pH 조절제, 완충액, 유기 용매, 킬레이트제, 항산화제, 충전제, 착색제 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
11. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 올리고당, 다당류, 종양 세포 용해물, 종양 세포막 소포 항원, 박테리아 용해물, 박테리아 세포막, 마이코플라즈마 세포막, 클라미디아 세포벽, 스피로헤타, 리케차 마이크로캡슐, 바이러스 외피, 엑소좀, 바이러스 용해물 항원, 박테리아 외부 소포 항원의 하나 이상의 조합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템의 제조 방법으로서,
    (1) 친유성 유화제를 오일상에 용해하고 친수성 유화제를 수상에 용해한 후, 양자를 충분히 혼합하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계;
    (2) 상기 마이크로에멀젼에 pH 완충액 및/또는 금속 이온 화합물의 음이온 부분을 첨가하는 단계;
    (3) 단계(2)에서 제조된 혼합물에 금속 이온 화합물의 양이온 부분을 첨가하는 단계;
    (4) 단계(2) 또는 단계(3)에서 제조된 혼합물에 항원을 첨가하고 균일하게 혼합하여 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템의 제조 방법.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템의 제조 방법으로서,
    (1) 친유성 유화제를 오일상에 용해하고 친수성 유화제를 수상에 용해한 후, 양자를 충분히 혼합하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계;
    (2) 상기 마이크로에멀젼에 금속 이온 화합물의 양이온 부분을 첨가하는 단계;
    (3) 단계(2)에서 제조된 혼합물에 pH 완충액 및/또는 금속 이온 화합물의 음이온 부분을 첨가하는 단계;
    (4) 단계(2) 또는 단계(3)에서 제조된 혼합물에 항원을 첨가하고 균일하게 혼합하여 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템의 제조 방법.
14. 예방 및/또는 치료를 위한 면역 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 마이크로에멀젼 기반 백신 전달 시스템 또는 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항의 제조 방법에 따라 제조된 백신 전달 시스템의 용도.

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