CN112843020A - 一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，属于抗肿瘤药物技术领域，根据化学法制备ZnO纳米粒子，然后通过晶种生长法原位还原得到ZnO‑Au纳米粒子，最后将ZnO‑Au和CPPO负载在由脂质体膜和肿瘤细胞膜复合而成的纳米囊泡中得到ZnO‑Au/CLM，本发明制备的抗肿瘤纳米药物能够分解肿瘤组织间隙中的水产生具有肿瘤杀伤作用的•OH，降低了肿瘤部位的IFP，增加了药物在瘤内的递送深度，并且实现了肿瘤杀伤的效果。

Description

一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，属于抗肿瘤药物技术领域。
背景技术
癌症是世界范围内的巨大公共卫生问题，因其逐渐增加的发病率和致死率，受到了人们越来越多的关注，根据国际癌症研究机构(IARC) 2019年全球癌症报告估计，2019年美国将有606,880人死于癌症，相当于每天有近1,700人死于癌症。因此，癌症依然是世界上最致命的疾病之一，严重威胁人类的生命健康。近年来，纳米药物因为其精准靶向性和特异性，在肿瘤诊疗等领域备受关注。
但是，大量研发和实用结果表明，纳米药物想要进入临床，还存在许多悬而未决的问题。其中一个问题就是纳米药物在肿瘤部位极低的积累量和渗透深度，导致肿瘤中心的干细胞不能被有效地清除，因此容易造成肿瘤的转移和复发。
纳米药物在肿瘤部位积累量低和穿透性差的主要原因之一是肿瘤部位存在着过高的组织间质液压(IFP)。在健康组织中，IFP接近0 mmHg，而实体肿瘤的IFP值通常为5-40mmHg，在某些类型的肿瘤中甚至能达到75-130 mmHg。IFP的升高明显减缓了纳米颗粒的扩散，甚至迫使纳米颗粒重新回到血管中。研究发现导致肿瘤IFP明显升高的物质主要是水，且含水量与IFP呈明显的正相关，当肿瘤部位的IFP为10 mmHg时，其含水量已达85%。因此，降低肿瘤部位水的含量，从而降低IFP是解决纳米药物在肿瘤积累量低和深层传输受阻问题的关键。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，由脂质体膜和肿瘤细胞膜复合而成的纳米囊泡（LM）作为载体，在脂相中负载双草酸酯（CPPO），水相中负载ZnO-Au纳米颗粒，最终得到ZnO-Au/CLM。在生物体内LM因为肿瘤细胞膜的同源靶向性，使纳米粒子更容易靶向到肿瘤细胞增加肿瘤部位纳米药物的积累量；到达肿瘤部位后，Au纳米粒子会和肿瘤细胞争夺养分催化分解葡萄糖产生H2O2，可以达到饥饿治疗的目的；所生成H2O2进一步和CPPO反应，激发ZnO纳米粒子分解肿瘤组织间隙中的水产生•OH，实现PDT同时增加药物在肿瘤部位的递送效率，最终达到抑制肿瘤生长并清除肿瘤的目的。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，根据化学法制备ZnO纳米粒子，然后通过晶种生长法原位还原得到ZnO-Au纳米粒子，最后将ZnO-Au和CPPO负载在由脂质体膜和肿瘤细胞膜复合而成的纳米囊泡中得到ZnO-Au/CLM，通过降低肿瘤间质液压从而增强药物瘤内递送效果，同时联合饥饿治疗实现更高效地肿瘤杀伤。
本发明技术方案的进一步改进在于：具体步骤包括：
S1、制备ZnO纳米粒子：将Zn(NO3)2溶于无水乙醇，得到Zn(NO3)2溶液，将Zn(NO3)2溶液放于磁力搅拌器，再匀速缓慢加入NaOH溶液中充分反应8～12 h，得到ZnO纳米粒子；
S2、制备ZnO-Au纳米粒子：将ZnO纳米粒子用柠檬酸三钠稀释，然后滴加HAuCl4溶液，得到第一混合溶液，第一混合溶液在室温下搅拌约8～10 h，得到ZnO-Au纳米粒子；
S3、制备ZnO-Au/CL溶液：将胆固醇、大豆卵磷脂以及CPPO溶解于4～6 mL无水乙醇中，得到第二混合溶液，将第二混合溶液置于圆底烧瓶中，40～45 °C旋转蒸发10～20 min使其成膜，再向圆底烧瓶中加入ZnO-Au纳米粒子溶液、Tween-80和PBS溶液，40～45 °C旋转20～30 min，得到ZnO-Au/CL溶液；
S4、将肿瘤细胞分装到离心管中，离心5～10 min，收集沉淀，用1～2 mL超纯水重悬，再用200～400 W的细胞破碎仪超声破碎10～20 min，超声破碎后的悬液离心30～60min获得肿瘤细胞膜碎片溶液；
S5、将ZnO-Au/CL溶液与肿瘤细胞膜膜碎片溶液混合，再通过规格为100～200 nm的脂质体挤出器挤出，获得包覆有肿瘤细胞膜的ZnO-Au/CLM纳米粒子。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤S1中Zn(NO3)2的加入量为10～30mg，无水乙醇的体积为5～15 mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤S1中NaOH溶液的浓度为1.0～1.5mg/mL，加入体积为5～10 mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤S2中ZnO纳米粒子的加体积为1～2mL，柠檬酸三钠的浓度为0.5～0.8 mg/mL，体积为4～6 mL，HAuCl4溶液的浓度为1～3mmol/L，体积为2～4 mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤S3中ZnO-Au/CL为脂质体包被的ZnO-Au/CPPO纳米粒子。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤S3中胆固醇的加入量为5～7 mg，大豆卵磷脂的加入量为50～70 mg，CPPO的加入量为1～3 mg。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤S3中ZnO-Au纳米粒子溶液的加入量为1～2 mL，Tween-80的加入量为10～20 μL，PBS溶液的加入量为8～10 mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤S4中第一次离心的速率为1000～2000 rpm，第二次离心的速率为12000～13000 rpm。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
1、本发明由脂质体膜和肿瘤细胞膜复合而成的纳米囊泡（LM）作为载体，在脂相中负载双草酸酯（CPPO），水相中负载ZnO-Au纳米颗粒，最终得到ZnO-Au/CLM；其中，ZnO-Au纳米颗粒先根据化学法制备ZnO纳米粒子，然后通过晶种生长法原位还原得到ZnO-Au纳米粒子；在生物体内LM因为肿瘤细胞膜的同源靶向性，使纳米粒子更容易靶向到肿瘤细胞增加肿瘤部位纳米药物的积累量；到达肿瘤部位后，Au纳米粒子会和肿瘤细胞争夺养分催化分解葡萄糖产生H2O2，可以达到饥饿治疗的目的；所生成H2O2进一步和CPPO反应，激发ZnO纳米粒子分解肿瘤组织间隙中的水产生•OH，降低了肿瘤部位的间质液压（IFP），增强了药物在组织渗透深度，实现PDT同时增加药物在肿瘤部位的递送效率，最终达到抑制肿瘤生长并清除肿瘤的目的。
2、本发明的抗肿瘤纳米药物具有良好的生物相容性，表现出了明显的生物安全性；与此同时，在增强药物渗透的基础上，联合了饥饿疗法，表现出显著的抗肿瘤活性。
3、本发明的抗肿瘤纳米药物制备简易，所用试剂无毒、无害，绿色环保。
附图说明
图1为本发明实施例1获得的抗肿瘤纳米药物的透射电镜图；
图2为本发明实施例2获得的抗肿瘤纳米药物的粒径分布图；
图3为本发明实施例3获得的抗肿瘤纳米药物的电位图；
图4为本发明实施例1获得的抗肿瘤纳米药物的产生•OH曲线图；
图5为本发明实施例2获得的抗肿瘤纳米药物治疗后的肿瘤IFP曲线图；
图6为本发明实施例3获得的抗肿瘤纳米药物治疗后的组织切片图。
图7为本发明实施例1获得的抗肿瘤纳米药物与传统抗肿瘤药物DOX治疗后的冷冻切片图。
图8为本发明实施例2获得的抗肿瘤纳米药物与生理盐水治疗后肿瘤相对体积曲线图。
具体实施方式
本发明由脂质体膜和肿瘤细胞膜复合而成的纳米囊泡（LM）作为载体，在脂相中负载双草酸酯（CPPO），水相中负载ZnO-Au纳米颗粒，最终得到ZnO-Au/CLM；其中，ZnO-Au纳米颗粒先根据化学法制备ZnO纳米粒子，然后通过晶种生长法原位还原得到ZnO-Au纳米粒子；在生物体内LM因为肿瘤细胞膜的同源靶向性，使纳米粒子更容易靶向到肿瘤细胞增加肿瘤部位纳米药物的积累量；到达肿瘤部位后，Au纳米粒子会和肿瘤细胞争夺养分催化分解葡萄糖产生H2O2，可以达到饥饿治疗的目的；所生成H2O2进一步和CPPO反应，激发ZnO纳米粒子分解肿瘤组织间隙中的水产生•OH，降低了肿瘤部位的间质液压（IFP），增强了药物在组织渗透深度，实现PDT同时增加药物在肿瘤部位的递送效率，最终达到抑制肿瘤生长并清除肿瘤的目的。
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
实施例1
将10 mg Zn(NO3)2（购于天津风船化学试剂科技有限公司）溶于5 mL无水乙醇，得到Zn(NO3)2溶液。将Zn(NO3)2溶液放于磁力搅拌器，再匀速缓慢加入5 mL浓度为1.0 mg/mL的NaOH（购于天津风船化学试剂科技有限公司）溶液充分反应8 h，得到ZnO纳米粒子。将1mL ZnO纳米粒子用4 mL浓度为0.5 mg/mL的柠檬酸三钠（购于天津市丰川科技有限公司）稀释，滴加2 mL浓度为1 mmol/L的HAuCl4（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶液，混合溶液在室温下搅拌约8 h，得到ZnO-Au纳米粒子。将5 mg胆固醇（购于沈阳天峰生物有限公司），50 mg大豆卵磷脂（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）以及1 mg双草酸酯（CPPO）（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶解于4 mL无水乙醇中，将混合溶液至于圆底烧瓶中，40 °C旋转蒸发10 min使其成膜。再向圆底烧瓶中加入1 mL ZnO-Au纳米粒子溶液、10 μL Tween-80和8 mL PBS溶液。40 °C旋转20 min，得到ZnO-Au/CL溶液，其中ZnO-Au/CL为脂质体包被的ZnO-Au/CPPO纳米粒子。将肿瘤细胞分装到离心管中，1000 rpm离心5min，收集沉淀用1 mL超纯水重悬，再用200 W的细胞破碎仪超声破碎10 min。超声后的悬液通过12000 rpm转离心30 min获得肿瘤细胞膜（TM）碎片。将ZnO-Au/CL溶液与TM溶液混合，磁力搅拌30 min，再通过规格为100 nm的脂质体挤出器挤出，获得复合有TM的ZnO-Au/CLM粒子。
应用透射电子显微镜对ZnO-Au/CLM的形貌进行表征，如图1所示，粒径在150 nm左右。对该药物产•OH的性能进行检测，利用DPBF探针吸光度的下降来获得•OH的产生情况，如图4所示，随着CPPO浓度的升高，DPBF的吸光度有着明显的下降，说明ZnO-Au/CLM有较好的产活性氧的能力。研究了ZnO-Au/CLM在肿瘤组织的渗透深度和积累量，如图7所示，ZnO-Au/CLM在肿瘤组织处的荧光强度大于传统的抗肿瘤药物DOX。证明ZnO-Au/CLM有着更好的积累量和渗透深度。
实施例2
将20 mg Zn(NO3)2（购于天津风船化学试剂科技有限公司）分别溶于10 mL无水乙醇，得到Zn(NO3)2溶液。将Zn(NO3)2溶液放于磁力搅拌器，再匀速缓慢加入8 mL浓度为1.5mg/mL的NaOH（购于天津风船化学试剂科技有限公司）溶液充分反应10 h，得到ZnO纳米粒子。将2 mL ZnO纳米粒子用5 mL浓度为0.7 mg/mL的柠檬酸三钠（购于天津市丰川科技有限公司）稀释，滴加2 mL浓度为3 mmol/L的HAuCl4（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶液，混合溶液在室温下搅拌约9 h，得到ZnO-Au纳米粒子。将6 mg胆固醇（购于沈阳天峰生物有限公司），60 mg大豆卵磷脂（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）以及2 mg双草酸酯（CPPO）（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶解于5 mL无水乙醇中，将混合溶液至于圆底烧瓶中，43 °C旋转蒸发15 min使其成膜。再向圆底烧瓶中加入2 mL ZnO-Au纳米粒子溶液、15 μL Tween-80和9 mL PBS溶液。42 °C旋转30 min，得到ZnO-Au/CL溶液，其中ZnO-Au/CL为脂质体包被的ZnO-Au/CPPO纳米粒子。将肿瘤细胞分装到离心管中，1500 rpm离心5 min，收集沉淀用2 mL超纯水重悬，再用300 W的细胞破碎仪超声破碎20 min。超声后的悬液通过13000 rpm离心40 min获得肿瘤细胞膜（TM）碎片。将ZnO-Au/CL溶液与TM溶液混合，磁力搅拌40 min，再通过规格为200 nm的脂质体挤出器挤出，获得包覆TM的ZnO-Au/CLM粒子。
应用激光粒度仪对ZnO-Au/CLM的粒径分布进行表征，如图2所示，从该图可以得出，ZnO-Au/CLM的粒径分布在150 nm左右。对ZnO-Au/CLM降低肿瘤IFP进行验证，如图5所示，在尾静脉注射2 h之内药物组相对于生理盐水组的IFP持续下降，并在100 min时达到最低，说明ZnO-Au/CLM可以很好的降低实体瘤的IFP。对ZnO-Au/CLM的抗肿瘤效果进行了研究，如图8所示，生理盐水组的肿瘤体积上升趋势明显，但经ZnO-Au/CLM治疗后肿瘤体积趋于下降，表明ZnO-Au/CLM不仅可以抑制实体肿瘤生长，还能进一步杀伤肿瘤细胞。
实施例3
将30 mg Zn(NO3)2（购于天津风船化学试剂科技有限公司）分别溶于15 mL无水乙醇，得到Zn(NO3)2溶液。将Zn(NO3)2溶液放于磁力搅拌器，再匀速缓慢加入5 mL浓度为1.5mg/mL的NaOH（购于天津风船化学试剂科技有限公司）溶液充分反应12 h，得到ZnO纳米粒子。将2 mL ZnO纳米粒子用6 mL浓度为0.8 mg/mL的柠檬酸三钠（购于天津市丰川科技有限公司）稀释，滴加4 mL浓度为3 mmol/L的HAuCl4（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶液，混合溶液在室温下搅拌约10 h，得到ZnO-Au纳米粒子。将7 mg胆固醇（购于沈阳天峰生物有限公司），70 mg大豆卵磷脂（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）以及3 mg双草酸酯（CPPO）（购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶解于6 mL无水乙醇中，将混合溶液至于圆底烧瓶中，45 °C旋转蒸发20 min使其成膜。再向圆底烧瓶中加入2 mL ZnO-Au纳米粒子溶液、20 μL Tween-80和10 mL PBS溶液。45 °C旋转30 min，得到ZnO-Au/CL溶液，其中ZnO-Au/CL为脂质体包被的ZnO-Au/CPPO纳米粒子。将肿瘤细胞分装到离心管中，2000 rpm离心10 min，收集沉淀用2 mL超纯水重悬，再用400 W的细胞破碎仪超声破碎20 min。超声后的悬液通过13000 rpm离心60 min获得肿瘤细胞膜（TM）碎片。将ZnO-Au/CL溶液与TM溶液混合，磁力搅拌50 min，再通过规格为200 nm的脂质体挤出器挤出，获得包覆TM的ZnO-Au/CLM粒子。
应用激光粒度仪对ZnO-Au/CLM的Zeta电位进行分析，由图3可知，ZnO纳米粒子电位约为-18 mV；ZnO-Au纳米粒子的Zeta电位约为-25 mV；ZnO-Au/CLM的Zeta电位约为-22mV，证明ZnO-Au成功被包覆在了复合囊泡中。进一步对ZnO-Au/CLM的生物安全性进行了评估，如图7所示，ZnO-Au/CLM和生理盐水组的组织切片几乎没有区别，证明ZnO-Au/CLM有很好的生物安全性。

Claims (9)

1.一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：根据化学法制备ZnO纳米粒子，然后通过晶种生长法原位还原得到ZnO-Au纳米粒子，最后将ZnO-Au和CPPO负载在由脂质体膜和肿瘤细胞膜复合而成的纳米囊泡中得到ZnO-Au/CLM，通过降低肿瘤间质液压从而增强药物瘤内递送效果，同时联合饥饿治疗实现更高效地肿瘤杀伤。
2.根据权利要求1所述的一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：具体步骤包括：
S1、制备ZnO纳米粒子：将Zn(NO3)2溶于无水乙醇，得到Zn(NO3)2溶液，将Zn(NO3)2溶液放于磁力搅拌器，再匀速缓慢加入NaOH溶液中充分反应8～12 h，得到ZnO纳米粒子；
S2、制备ZnO-Au纳米粒子：将ZnO纳米粒子用柠檬酸三钠稀释，然后滴加HAuCl4溶液，得到第一混合溶液，第一混合溶液在室温下搅拌约8～10 h，得到ZnO-Au纳米粒子；
S3、制备ZnO-Au/CL溶液：将胆固醇、大豆卵磷脂以及CPPO溶解于4～6 mL无水乙醇中，得到第二混合溶液，将第二混合溶液置于圆底烧瓶中，40～45 °C旋转蒸发10～20 min使其成膜，再向圆底烧瓶中加入ZnO-Au纳米粒子溶液、Tween-80和PBS溶液，40～45 °C旋转20～30 min，得到ZnO-Au/CL溶液；
S4、将肿瘤细胞分装到离心管中，离心5～10 min，收集沉淀，用1～2 mL超纯水重悬，再用200～400 W的细胞破碎仪超声破碎10～20 min，超声破碎后的悬液离心30～60 min获得肿瘤细胞膜碎片溶液；
S5、将ZnO-Au/CL溶液与肿瘤细胞膜碎片溶液混合，再通过规格为100～200 nm的脂质体挤出器挤出，获得包覆有肿瘤细胞膜的ZnO-Au/CLM纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中Zn(NO3)2的加入量为10～30 mg，无水乙醇的体积为5～15 mL。
4.根据权利要求2所述的一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中NaOH溶液的浓度为1.0～1.5 mg/mL，加入体积为5～10 mL。
5.根据权利要求2所述的一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中ZnO纳米粒子的加体积为1～2 mL，柠檬酸三钠的浓度为0.5～0.8mg/mL，体积为4～6 mL，HAuCl4溶液的浓度为1～3 mmol/L，体积为2～4 mL。
6.根据权利要求2所述的一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中ZnO-Au/CL为脂质体包被的ZnO-Au/CPPO纳米粒子。
7.根据权利要求2所述的一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中胆固醇的加入量为5～7 mg，大豆卵磷脂的加入量为50～70 mg，CPPO的加入量为1～3 mg。
8.根据权利要求2所述的一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中ZnO-Au纳米粒子溶液的加入量为1～2 mL，Tween-80的加入量为10～20 μL，PBS溶液的加入量为8～10 mL。
9.根据权利要求2所述的一种用于增强瘤内递送的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中第一次离心的速率为1000～2000 rpm，第二次离心的速率为12000～13000 rpm。
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