CN114306647A - 一种高循环性的四氧化三铁mri造影剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，采用乙酰丙酮化铁、油酸、油胺反应体系制备得到超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；再通过薄膜挤出将Fe₃O₄纳米颗粒包裹于脂质体中，取适量的纳米颗粒与特定的细胞孵育48h，收集细胞上清提取细胞外囊泡，获得细胞外囊泡包裹的Fe3O4MRI造影剂。细胞外囊泡为生物膜结构，作为造影剂的递药载体，将显著改善Fe₃O₄造影剂细胞毒性，提高生物相容性。肿瘤细胞外囊泡表达CD47“别吃我”配体，Fe₃O₄纳米颗粒可以在包覆细胞外囊泡后将降低血液中的单核巨噬细胞对其的摄取，提高造影剂的体内循环时间。

Description

一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物医用材料技术领域的方法，具体是一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法。

背景技术

肿瘤的早期诊断在现阶段仍然是医学上的难题，磁共振（Magnetic ResonanceImaging, MRI）成像作为最强大的医学诊断技术之一，与电子计算机断层扫描(ComputedTomography, CT)相比，有着软组织分辨率高，无电离辐射等优势。从应用的角度来看，MRI造影剂可分为纵向弛豫造影剂（T1制剂）和横向弛豫造影剂（T2制剂），超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒（SPIONs）是一种典型的T2加权造影剂，其具备低毒性和优良的生物可降解性在临床上得到了广泛的应用。然而SPIONs仍存在着一定的局限性：虽然纳米颗粒的粒径小并可通过高通透性和长滞留效应(Enhanced Permeability And Retention Effect, EPR)穿透肿瘤血管被动靶向肿瘤组织，但由于生物体内免疫消除作用的存在，Fe₃O₄纳米颗粒在进入体内后容易被单核细胞，巨噬细胞以及网状内皮系统清除，导致在肿瘤部位积累效率低下，成像效果不明显。鉴于此，研究者采用了表面修饰等技术对材料进行功能化，例如使用PEG修饰延长血液循环时间，或修饰以靶向多肽、抗体等等增强纳米颗粒的主动靶向性，但这些策略的效果仍不理想。

细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）是天然的生物材料，直径在40-100nm之间，EVs起源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，随后多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中形成EVs。研究表明，CD47是肿瘤细胞外泌体高表达的整合素相关跨膜蛋白，其能通过与其受体SIRP-α的相互作用产生“不要吃我”的信号，抑制吞噬细胞的吞噬作用[SushrutKamerkar et al. Nature, 2017]，因此EVs有着优良的循环稳定性。此外，EVs显示还出优良的生物相容性，低毒性以及高效的细胞摄取和靶向归巢能力。基于以上特点，EVs被认为是极具潜力的纳米递药载体。

通常EVs包覆纳米颗粒的技术例如反复的物理挤压、反复冻融将破坏EVs膜表面的蛋白完整性，影响EVs的生物功能。因此，在构建EVs包覆Fe₃O₄纳米颗粒的MRI诊断平台的过程中，保持EVs膜完整性亦是十分重要的。鉴于此，本发明将Fe₃O₄纳米颗粒使用脂质体包裹降低其细胞毒性，随后与人肿瘤细胞共孵育最终获得EVs包覆的Fe₃O₄ MRI造影剂，该制备方法维持了EVs膜蛋白完整性，使其具备高循环性和生物相容性，为MRI造影剂的开发提供一种新的思路。

发明内容

本发明目的在于提供一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法。

本发明目的通过以下方案实现：一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，采用乙酰丙酮化铁、油酸、油胺反应体系制备得到超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；再通过薄膜挤出将Fe₃O₄纳米颗粒包裹于脂质体中，取适量的纳米颗粒与特定的细胞孵育48h，收集细胞上清提取细胞外囊泡，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄MRI造影剂，包括以下步骤：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和3.8 -6.3mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将8 -12mL 油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物。

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h。将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒。

（3）将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和胆固醇（CHOL）按照质量比4：1：1溶解于三氯甲烷中，加入适量Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂。加入磷酸盐缓冲液（PBS）超声分散瓶壁上的脂质体，并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

（4）将上述纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将HCT116人结直肠癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h。

（5）提取细胞培养上清，2500g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片。提取上清液中的细胞外囊泡，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

将脂质体包裹的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒与人类肿瘤细胞系孵育后，取细胞上清液收集细胞外囊泡，获得的Fe₃O₄纳米颗粒具有高血液循环性和生物相容性，可用于磁共振MRI成像。

本发明的优点在于：

1、细胞外囊泡为生物膜结构，作为造影剂的递药载体，将显著改善Fe₃O₄造影剂细胞毒性，提高生物相容性。

2、肿瘤细胞外囊泡表达CD47“别吃我”配体，Fe₃O₄纳米颗粒在包覆细胞外囊泡后将降低血液中的单核巨噬细胞对其的摄取，提高造影剂的体内循环时间。

3、通过与细胞共孵育的方式对Fe₃O₄纳米颗粒进行包覆对细胞外囊泡表面的蛋白造成破坏。

具体实施方式

以下实施例以发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。

实施例1

一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂，采用乙酰丙酮化铁、油酸、油胺反应体系制备得到超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；再通过薄膜挤出将Fe₃O₄纳米颗粒包裹于脂质体中，取纳米颗粒与细胞孵育48h，收集细胞上清提取细胞外囊泡，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄MRI造影剂，按以下步骤制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和3.8 mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将12 mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

（3）将40 mg二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），10 mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和10 mg胆固醇（CHOL）溶解于30 mL三氯甲烷中，加入Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，加入磷酸盐缓冲液（PBS）超声分散瓶壁上的脂质体，并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将HCT116人结直肠癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h；然后，

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

实施例2

一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂，超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒制备和脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒的制备方法与实施例1相同，按以下步骤制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和3.8 mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将12 mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

（3）将40 mg DPPC，10 mg DSPE-PEG2000和10 mg胆固醇CHOL溶解于30 mL三氯甲烷中，加入Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，加入磷酸盐缓冲液PBS超声分散瓶壁上的脂质体，并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将A549人非小细胞肺癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h；然后，

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

实施例3

一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂，与实施例1步骤近似，按以下步骤制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和6.3 mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将8 mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

（3）将40 mg DPPC，10 mg DSPE-PEG2000和10 mg胆固醇CHOL溶解于30 mL三氯甲烷中，加入Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，使用PBS水化脂质体并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将HCT116人结直肠癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h；然后，

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

实施例4

一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂，与实施例1步骤近似，按以下步骤制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和6.3 mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将8 mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

（3）将40 mg DPPC，10 mg DSPE-PEG2000和10 mg胆固醇CHOL溶解于30 mL三氯甲烷中，加入Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，使用PBS水化脂质体并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将A549人非小细胞肺癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h；然后，

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

Claims (8)

1.一种高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，其特征在于，采用乙酰丙酮化铁、油酸、油胺反应体系制备得到超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；再通过薄膜挤出将Fe₃O₄纳米颗粒包裹于脂质体中，取纳米颗粒与细胞孵育48h，收集细胞上清提取细胞外囊泡，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄MRI造影剂，包含以下步骤：

超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和3.8 -6.3mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将8 -12mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒的制备：

（3）将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和胆固醇（CHOL）按照质量比4：1：1 溶解于三氯甲烷中，加入适量Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，加入磷酸盐缓冲液（PBS）超声分散瓶壁上的脂质体，并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将人类肿瘤细胞系或巨噬细胞系HCT116人结直肠癌细胞使用该培养基于37℃，5%CO₂的条件下培养48 h；

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，其特征在于，所述的Fe₃O₄纳米颗粒的制备方法为溶剂热法。

3.根据权利要求1所述的高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述Fe₃O₄的纳米粒的粒径为10-30nm。

4.根据权利要求1所述的高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的细胞外囊泡提取方法包括超速离心法和基于PEG的试剂盒法。

5.根据权利要求1至4任一项所述的高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，其特征在于按以下步骤制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和3.8 mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将12 mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

（3）将40 mg二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），10 mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和10 mg胆固醇（CHOL）溶解于30 mL三氯甲烷中，加入Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，加入磷酸盐缓冲液（PBS）超声分散瓶壁上的脂质体，并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将HCT116人结直肠癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h；然后，

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

6.根据权利要求1至4任一项所述的高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，其特征在于按以下步骤制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和3.8 mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将12 mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

（3）将40 mg DPPC，10 mg DSPE-PEG2000和10 mg胆固醇CHOL溶解于30 mL三氯甲烷中，加入Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，加入磷酸盐缓冲液PBS超声分散瓶壁上的脂质体，并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将A549人非小细胞肺癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h；然后，

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

7.根据权利要求1至4任一项所述的高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，其特征在于按以下步骤制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和6.3 mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将8 mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

（3）将40 mg DPPC，10 mg DSPE-PEG2000和10 mg胆固醇CHOL溶解于30 mL三氯甲烷中，加入Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，使用PBS水化脂质体并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将HCT116人结直肠癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h；然后，

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。

8.根据权利要求1至4任一项所述的高循环性的四氧化三铁MRI造影剂的制备方法，其特征在于按以下步骤制备：

（1）1.05 g乙酰丙酮化铁和6.3 mL油酸溶解于20 mL 的1-十八烯中，将混合物加热至120℃，并搅拌2 h，蒸发去除低沸点化合物，将8 mL油胺加入上述混合物中，在120℃下搅拌1h，产生深红色前驱物；

（2）将上述前驱物转移到50 mL聚四氟乙烯高压釜中，加热至200℃，保持0.5 h，将前体加热至220℃并在此温度下保持2 h，然后自然冷却至室温，获得超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

（3）将40 mg DPPC，10 mg DSPE-PEG2000和10 mg胆固醇CHOL溶解于30 mL三氯甲烷中，加入Fe₃O₄纳米颗粒超声分散10 min，使用旋转蒸发仪在52℃下减压去除有机溶剂，使用PBS水化脂质体并依次通过800 nm、400 nm、200 nm、100 nm的聚碳酸酯微孔薄膜，获得脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒；

（4）将上述脂质体包裹的Fe₃O₄纳米颗粒溶解于1640完全培养基内配置成200 μg/mL的溶液，并将A549人非小细胞肺癌细胞使用该培养基于37℃，5% CO₂的条件下培养48 h；然后，

（5）提取细胞培养上清，2500 g下离心10 min取上清，去除上清中残留的细胞以及细胞碎片，再30000 g离心30 min弃上清，用PBS重悬并清洗沉淀物，获得细胞外囊泡包裹的Fe₃O₄纳米颗粒。