CN116019911B - 一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒及其制备方法与应用，该纳米颗粒包括基体材料功能化二氧化硅、靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽、磷脂、胆固醇和诊疗试剂。该纳米颗粒可用于可视化诊疗的药剂递送到肿瘤深处，增强对实体瘤的治疗效果。本发明纳米颗粒制备简单，且价格低廉，在肿瘤光诊疗方面，能显著提高光热转换效率，增强光声成像的信号。同时也可负载化疗药物、佐剂、抗体等非水溶性分子，因而即可作为肿瘤深度浸润与靶向药物释放载体，实现多模态成像诊断及多方法联合治疗，在癌症的诊断和治疗等领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本公开涉及药物制剂和生物科学技术领域，尤其涉及一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
目前，中晚期恶性肿瘤的治疗面临严峻挑战，由于肿瘤显著的异质性、缺氧、供血不足和间质液压升高，大多数纳米药物不能充分渗透到实体瘤内，导致诊断和治疗效果不佳。
如何实现纳米药物在肿瘤部位的深度渗透及高效富集，是目前实体瘤治疗中亟待解决的问题之一。目前纳米药物深度渗透的解决方法包括尺寸依赖的级联递送策略和细胞介导的药物递送策略，前者受限于不同肿瘤的复杂多样性，纳米药物不具有普适性；后者的药物载体制备工艺复杂且价格昂贵。一种制备简单，价格低廉，能增强负载药剂在肿瘤内的渗透性，进而提高实体瘤的治疗效果的纳米载药颗粒是临床转换的关键。
同时，光声成像技术是近年来发展起来的一种非入侵式和非电离式的新兴生物医学成像技术，结合力光学成像的光谱选择性与超声成像的高分辨率和深度穿透性的优点。吲哚青绿血管造影(Indocyanine green angiography，ICG)作为食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证的光热试剂，也能作为光声造影剂。但作为小分子，ICG存在在体半衰期非常短(2-4分钟)，与血清蛋白结合迅速，快速清除到体外等问题。近年来，结合纳米技术能提高ICG在体稳定性，延长循环时间，但缺乏一种靶向递送ICG到实体瘤深处，且便于临床转化的纳米载体。
发明内容
本公开提供了一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒及其制备方法与应用，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题，该纳米颗粒具有靶向递送ICG到实体瘤深处且便于临床转化的优势。
根据本公开的第一方面，提供了一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒，包括基体材料功能化二氧化硅、靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽、磷脂、胆固醇和诊疗试剂。
在一可实施方式中，所述功能化二氧化硅包括阳离子化修饰二氧化硅和多肽表面修饰二氧化硅。
在一可实施方式中，所述多肽序列包括FAEKFKEAVKDYFAKFWD。
在一可实施方式中，所述磷脂包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(DOTAP)、甲氧基聚乙二醇磷脂和甲氧基PEG磷脂(DSPE-PEG2000)。
在一可实施方式中，所述诊疗试剂包括光热试剂或药物分子。
根据本公开的第二方面，提供了一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒的制备方法，所述方法包括：
制备功能化二氧化硅；
制备脂质层：将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中，混匀成混合物；然后将有机溶剂挥发完全，得到一层均匀的药膜；再加入去离子水重悬药膜，超声至澄清；
纳米颗粒组装：将功能化二氧化硅加入到诊疗试剂的水溶液中，室温静置孵育24-36h，再加入脂质层混合均匀；
再加入靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽，4℃静置孵育24-36h，使用超滤管离心，去除游离的多肽，获得基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒。
在一可实施方式中，所述制备功能化二氧化硅，包括：
将阳离子表面活性剂溶解在水中，在搅拌条件下加入碱，将阳离子表面活性剂溶液pH调节至8-14；
将正硅酸乙酯加入到阳离子表面活性剂溶液中，70-80℃反应2-4h；反应结束后离心收集沉淀，将沉淀在50-70℃下真空干燥处理；
用甲醇重悬沉淀，将3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入到甲醇溶液中，室温反应12-24h；反应结束后离心收集沉淀，甲醇和水分别洗涤多次，真空干燥，获得氨基化二氧化硅纳米粒子。
在一可实施方式中，所述正硅酸乙酯与阳离子表面活性剂质量比为2:1-5:1。
在一可实施方式中，所述脂质层与功能化二氧化硅的摩尔比为1:5～5:1。
根据本公开的第三方面，提供了一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒在实体瘤深度成像和肿瘤多模态诊疗中的应用。
本发明提供一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒及其制备方法与应用，纳米颗粒由功能化二氧化硅、靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽、磷脂、胆固醇和诊疗试剂组成，与现有技术相比，本发明至少具备以下有益效果：
1、制备简单，价格低廉：纳米颗粒表面修饰靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽序列为人工合成，与细胞膜包被或体外活细胞共孵相比，制备简单，质量可控；
2、治疗效果好：本发明制备的功能化二氧化硅并携带光热试剂的纳米颗粒能显著提高光热转换效率，增强光声成像信号，利于负载药剂在肿瘤内的渗透性，同时激活肿瘤内免疫响应，增强对实体瘤的治疗效果；
3、功能可拓展：该功能化纳米载体还可以负载化疗药物、佐剂、抗体等非水溶性或水溶性分子，可作为靶向药物释放载体，实现多模态成像诊断及多方法联合治疗；也可装载其它类型的靶向多肽或治疗性多肽，实现疾病的协同靶向或协同治疗的功效。
应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
附图说明
通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：
在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。
图1示出了本公开实施例一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒的制备方法的流程示意图；
图2为实施例1制备的功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒R4F-ICG@MSNs的粒径图；
图3为实施例1制备的功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒R4F-ICG@MSNs的zeta电位变化图；
图4为实施例1制备的功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒R4F-ICG@MSNs的稳定性评估；
图5为实施例1制备的功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒R4F-ICG@MSNs的光声和光热性能增强图；
图6为实施例1制备的功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒R4F-ICG@MSNs的靶向肿瘤和吞噬类细胞图；
图7为实施例1制备的功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒R4F-ICG@MSNs在体光声成像图；
图8为实施例1制备的功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒R4F-ICG@MSNs在体光热治疗肿瘤效果图。
具体实施方式
为使本公开的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而非全部实施例。基于本公开中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
本发明第一方面提供一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒，包括基体材料功能化二氧化硅、靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽、磷脂、胆固醇和诊疗试剂。
其中，功能化二氧化硅包括阳离子化修饰二氧化硅和多肽表面修饰二氧化硅。
靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽序列为FAEKFKEAVKDYFAKFWD(R4F)。
磷脂包括但不限于二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(DOTAP)、甲氧基聚乙二醇磷脂和甲氧基PEG磷脂(DSPE-PEG2000)。
胆固醇包括但不限于胆固醇、胆固醇油酸脂等。诊疗试剂包括光热试剂或药物分子，其中光热试剂为PI或ICG等临床应用造影试剂，药物分子为化疗药物、佐剂、抗体等非水溶性或水溶性分子。
本发明的纳米颗粒能显著提高光热转换效率，增强光声成像信号，增强负载药剂在肿瘤内的渗透性，激活肿瘤内免疫响应，增强对实体瘤的治疗效果。
本发明又一方面提供一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒的制备方法，如图1所示为该方法的流程示意图，该方法包括如下步骤：
S1、制备功能化二氧化硅；
在一个示例中，制备功能化二氧化硅，包括如下步骤：
将阳离子表面活性剂溶解在水中，在搅拌条件下加入碱，将阳离子表面活性剂溶液pH调节至8-14；阳离子表面活性剂可以为十六烷基三甲基溴化铵，例如在搅拌条件下加入氢氧化钠或氨水等碱液将阳离子表面活性剂溶液pH调节至8-14。
将正硅酸乙酯TEOS加入到阳离子表面活性剂溶液中，70-80℃反应2-4h；反应结束后离心收集沉淀，将沉淀在50-70℃下真空干燥处理；正硅酸乙酯TEOS与阳离子表面活性剂的质量比为2:1-5:1。
用甲醇重悬沉淀，将3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入到甲醇溶液中，室温反应12-24h；反应结束后离心收集沉淀，甲醇和水分别洗涤多次，真空干燥，获得氨基化二氧化硅纳米粒子。
S2、制备脂质层：将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中，混匀成混合物；然后将有机溶剂挥发完全，得到一层均匀的药膜；再加入去离子水重悬药膜，超声至澄清；有机溶剂可以为三氯甲烷；
优选的，将摩尔比为30:1:1:0.005～1:30:30:0.01的DMPC、DOTAP、胆固醇和DSPE-PEG2000溶于含有机溶剂的容器中，混匀成混合物；然后将有机溶剂挥发完全，得到一层均匀的药膜；然后加入去离子水重悬药膜，超声至澄清。
S3、纳米颗粒组装：将功能化二氧化硅加入到诊疗试剂的水溶液中，室温静置孵育24-36h，再加入脂质层混合均匀；
诊疗试剂以光热试剂PI为例，将功能化二氧化硅加入到光热试剂PI的水溶液中，室温静置孵育24-36h；脂质层与功能化二氧化硅的摩尔配比在1:5～5:1，超声情况中混合均匀，获得产物记为PI@MSNs。
S4、再加入靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽，4℃静置孵育24-36h，使用超滤管离心，去除游离的多肽，获得基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒。
将靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽，例如R4F等加入到PI@MSNs中，4℃静置孵育24-36h；用1kD～100kD超滤管离心，去除游离的多肽，获得基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒，记为R4F-PI@MSNs。
下面结合具体实施例，对本发明做出详细说明。
实施例1
一种基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒的制备方法，诊疗试剂为光热试剂ICG，该方法包括如下步骤：
(1)称取1g CTAB溶于240ml纯水中，在磁力搅拌器上400r/min搅拌条件下，加入1.75ml NaOH溶液。在400r/min搅拌条件下，加入0.5mlTEOS，加热温度至70-80℃反应2-4h。反应结束后离心收集沉淀，将沉淀在50-70℃的条件下真空干燥处理；用10ml甲醇重悬沉淀，将0.5ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES加入到甲醇溶液中，室温反应12-24h；反应结束后离心收集沉淀，甲醇和水分别洗涤3次，真空干燥，获得氨基化二氧化硅纳米粒子。
(2)分别称取2mg DMPC、0.1mg DOTAP、0.5mg胆固醇和0.27mg DSPE-PEG2000溶于三氯甲烷中，混匀成混合物；然后将三氯甲烷挥发完全，得到一层均匀的药膜；然后加入1ml去离子水重悬药膜，超声至澄清，留着待用。
(3)将0.1mg氨基化的二氧化硅加入到10mg/ml ICG的水溶液中(1ml)，室温静置孵育24-36h；然后取200μl携带ICG的二氧化硅溶液加入到1ml脂质层中，超声作用下混合均匀，获得ICG@MSNs。
(4)然后加入1ml R4F多肽水溶液(1mg/ml)，4℃静置孵育24-36h；用30kD超滤管离心，去除游离的多肽，获得R4F-ICG@MSNs。
性能表征
1、制备出的基于功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒在体外对其进行表征，包括粒径分布、zeta电位以及稳定性评估。
图2(a)ICG@MSNs的粒径，图2(b)为功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒R4F-ICG@MSNs的粒径；图3为zeta电位变化图；图4为功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒的稳定性评估。
根据图2和图3可以看出，R4F-PI@MSNs的水合粒径在～72nm，zeta电位为-25eV。根据图4可以看出，R4F-PI@MSNs在PBS和10％FBS溶液中稳定性好。
2、制备出的基于功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒光声和光热性能体外表征。
根据图5功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒的光声和光热性能增强图，其中5(a)为R4F-ICG@MSNs与ICG的光声图像，5(b)为不同浓度的R4F-ICG@MSNs对应的光温度升高曲线，5(c)为R4F-ICG@MSNs与ICG的光声强度，5(d)为不同光通量密度对应的温度升高曲线。根据5(a)-(d)可以看出R4F-PI@MSNs能显著提高光声成像的信号和深度，同时温度升高曲线表明光热性能优秀。
3、一种基于功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒靶向性评估。
制备的纳米颗粒与巨噬细胞和肿瘤细胞共孵育2h，流式分析细胞摄取比例。图6为功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒的靶向肿瘤和吞噬类细胞图，根据图6可以看出R4F-PI@MSNs被巨噬细胞和4T1肿瘤细胞摄取的比例高。
4、一种基于功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒在体诊断和治疗实体瘤评估。
构建4T1皮下瘤模型，待肿瘤体积达到200mm3时，尾静脉注射200μl R4F-PI@MSNs，利用断层光声成像技术，对肿瘤区域纳米颗粒的信号实时进行3D成像。图7为功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒在体光声成像图，根据图7可以看出在给药12h后肿瘤内纳米颗粒的光声信号最强。选择光声信号最强的时间点(给药后12h)，对肿瘤区域进行近红外激光(808nm)照射(记为0天)，每隔2h进行一次，共进行3次，每次3min。在治疗过程中，隔天监控肿瘤体积和小鼠体重的变化曲线，如图8(a)所示。图8(b)为功能化二氧化硅并携载光热试剂的纳米颗粒在体光热治疗肿瘤效果图，根据图8可以看出R4F-PI@MSNs治疗效果最佳。
应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本公开公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
制备功能化二氧化硅：将阳离子表面活性剂溶解在水中，在搅拌条件下加入碱，将阳离子表面活性剂溶液pH调节至8-14；
将正硅酸乙酯加入到阳离子表面活性剂溶液中，70-80℃反应2-4h；反应结束后离心收集沉淀，将沉淀在50-70℃下真空干燥处理；
用甲醇重悬沉淀，将3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入到甲醇溶液中，室温反应12-24h；反应结束后离心收集沉淀，甲醇和水分别洗涤多次，真空干燥，获得所述功能化二氧化硅；
制备脂质层：将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中，混匀成混合物；然后将有机溶剂挥发完全，得到一层均匀的药膜；再加入去离子水重悬药膜，超声至澄清；
纳米颗粒组装：将功能化二氧化硅加入到诊疗试剂的水溶液中，室温静置孵育24-36h，再加入脂质层混合均匀；所述脂质层与所述功能化二氧化硅的摩尔比为1:5～5:1；
再加入靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽，4℃静置孵育24-36h，使用超滤管离心，去除游离的多肽，获得基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒；所 述 多 肽 序 列 为FAEKFKEAVKDYFAKFWD；
所述基于功能化二氧化硅并携载诊疗试剂的纳米颗粒，包括所述功能化二氧化硅、所述靶向肿瘤和吞噬类细胞的多肽、所述磷脂、所述胆固醇和所述诊疗试剂；所述纳米颗粒用于治疗或诊断乳腺癌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、甲氧基聚乙二醇磷脂。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述诊疗试剂包括光热试剂或药物分子。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正硅酸乙酯与阳离子表面活性剂质量比为2:1-5:1。
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