CN104027821A - 一种装载siRNA的纳米颗粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种装载siRNA的纳米颗粒，将siRNA通过非静电作用装载进入介孔二氧化硅的孔道内，表面包覆正电性高分子，并连接生物相容性高分子聚乙二醇和修饰具备跨细胞膜和破溶酶体膜的多肽分子，具有良好的生物相容性，并且提高了siRNA的干扰作用，siRNA干扰效果明显强于商业化脂质体，制备在癌症基因治疗药物中的应用具有广阔的前景。

Description

一种装载siRNA的纳米颗粒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种装载siRNA的纳米颗粒及其在制备癌症治疗基因药物中的应用。

背景技术

随着细胞与分子生物学技术的进步，RNA干扰技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域(Nat.Rev.Mol.CellBiol.4卷，457页，2003年)。目前现有的RNA干扰技术主要是将化学合成的siRNA引入细胞，继而识别特异的信使RNA实现干扰功能。但体外合成的siRNA进入体内后存在易被降解、作用时间不稳定的缺点，因此，RNA干扰技术在应用方面所存在的最大障碍是缺少能够稳定有效地将siRNA诱导进入细胞的载体，如何开发低毒高效的载体成为RNAi技术发展所面对重要课题(Mol.Pharm.6卷，651页，2009年)。

近年来，将介孔二氧化硅纳米颗粒用于药物载体的研究成为了关注的焦点。由于介孔二氧化硅纳米颗粒特殊的孔道结构具有较高的比表面积，较大的孔容积等特点，使其不仅能够装载大量的药物分子，还能够在生理环境下实现对药物分子的可控释放(Chem.Mater.13卷，308页，2001年)。近期研究表明，纳米级的介孔二氧化硅颗粒不仅可以被哺乳动物细胞吞噬，还具有良好的生物相容性和低细胞毒性(Adv.Drug.Delivery Rev.60卷，1278页，2008年)。因此，介孔二氧化硅纳米颗粒成为了一种非常理想的药物载体，其在此领域中的突出表现也使人们尝试将其用于装载siRNA分子。现有的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法如：2009年,ACS Nano杂志公开报道了T.Xia等人的研究工作(ACS Nano，3卷，3273页，2009年),他们在介孔二氧化硅颗粒表面修饰PEI，实现了对siRNA的装载；2009年Small杂志报道了A.M.Chen等人的研究工作(Small，5卷，2673页，2009年)，他们通过相似的表面修饰正电性高分子的方法，成功实现了药物和siRNA的装载。但是，上述工作均只采用了修饰后的介孔二氧化硅纳米颗粒外表面来装载siRNA，没能发挥介孔纳米颗粒孔道结构、高比表面积、大孔容积的优点；而且由于颗粒外表面上大量的氨基被用来吸附siRNA分子，使得颗粒表面无法被进一步功能化如聚乙二醇等修饰，从而限制了颗粒在生物体内的应用。2011年，Biomaterials杂志上发表了X.Li等人(Biomaterials，32卷，35页，2011年)利用强疏水的环境将siRNA通过非静电作用装载进入介孔氧化硅的孔道的结果，充分发挥了介孔孔道装载siRNA的优点，同时颗粒外部包覆正电性高分子PEI来阻止siRNA释放和保护siRNA降解。该颗粒体系在细胞层面上初步取得了siRNA的干扰效果，但是效果甚微。2012年，Hartonno,S.B.等人(ACSNano，6卷，2104页，2012年)合成大孔径(大于10nm)的氧化硅纳米颗粒，并成功在颗粒外表面和孔道内修饰正电性的高分子材料多聚左旋赖氨酸PLL(Poly-L-Lysine)，通过静电作用吸附siRNA，实现siRNA干扰，但是该颗粒的干扰效果比较低，且颗粒在低浓度时具备较大毒性，生物相容性不高。2013年，Lin,D等人(Nanoscale，5卷，4291页，2013年)报道了合成大孔径(10nm)的介孔氧化硅纳米颗粒，通过在孔道内修饰正电性高分子甲基丙烯二甲胺基乙酯DMAEMA来吸附siRNA，并实现了靶基因的干扰，但是干扰效果差于商业脂质体。由于该颗粒体系中DMAEMA吸附了大量siRNA，DMAEMA的活性位点被siRNA大量占据，使得进一步的功能化修饰受阻。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种输送siRNA的纳米颗粒，具有良好的生物相容性，并且提高siRNA的干扰作用，是一个安全、高效的siRNA输送载体。

为实现上述目的，本发明在中国专利(申请号201110266192.7)的基础上，进一步将生物相容性高分子聚乙二醇和修饰具备跨细胞膜和破溶酶体膜的多肽分子KALA包覆在装载siRNA的介孔二氧化硅纳米颗粒表面，以及所述纳米颗粒在制备癌症基因治疗药物中的应用。

所述聚乙二醇-多肽分子复合物通过聚乙二醇的马来酰亚胺与多肽分子的巯基结合。

所述聚乙二醇-多肽分子复合物通过聚乙二醇的琥珀酰亚胺与所述介孔二氧化硅颗粒表面包覆正电性高分子的氨基特异性结合。

其中，介孔二氧化硅纳米颗粒的颗粒粒径为30～1000纳米，优选粒径为30～100纳米；颗粒的介孔孔径为2～10纳米，优选孔径为2～6纳米。

所述介孔二氧化硅纳米颗粒的化学成分可以是单一的二氧化硅，也可以是具有核壳结构的如以磁性氧化铁颗粒为内核，二氧化硅为外壳的颗粒材料。

所述聚乙二醇的分子量可以从200Da到5000Da甚至更大，所述PEG的溶剂包括但不限于二甲基亚砜、乙醇、甲醇等极性溶剂。

所述修饰的多肽可以是KALA以外的具备类似于KALA功能的其他多肽或者更强功能的多肽。

本发明还公开所述的输送siRNA的纳米颗粒在制备癌症基因治疗药物中的应用，尤其是在制备肺癌基因治疗药物中的应用。本发明通过细胞毒性实验证明本发明的输送siRNA的纳米颗粒具有良好的生物相容性，同时具有良好的稳定性，在基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。

在体外细胞实验中，成功修饰聚乙二醇和多肽分子的颗粒不仅提高生物相容性(较高的颗粒浓度下的细胞毒性非常低)，而且极大的提高了siRNA的干扰作用(siRNA干扰效果明显强于商业化脂质体)。

进一步的体内应用，聚乙二醇的接枝更有利于该颗粒在生理环境下保持较好的单分散性，通过尾静脉注射到实验动物体内后，能延长颗粒在体内的循环时间，减少被血液中的负性蛋白或红细胞等吸附和调理作用，也减少肝脏、脾脏等网状内皮系统的捕获，最终提高颗粒进入肿瘤区域的量，实现更高效的肿瘤抑制效果。同时，聚乙二醇的修饰还能减少正电性材料的瞬时暴露，提高体内重要脏器对高剂量颗粒的耐受程度，即提高颗粒的生物相容性。此外，多肽分子的修饰不仅提高肿瘤细胞对颗粒体系的吞噬，而且能帮助颗粒被溶酶体吞噬后及时从溶酶体释放出来进入细胞质，实现siRNA的干扰作用。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1为本发明的一种装载siRNA的介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜照片；

图2为图1所示纳米颗粒对人正常肝细胞(L02)和肺腺癌肿瘤细胞(A549)的细胞毒性比较；

图3为图1所示纳米颗粒与商业化脂质体在siRNA干扰效果上的比较；

图4为图1所示纳米颗粒对体内皮下瘤模型治疗后肿瘤的生长曲线图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

在以下实施例中我们选取了一种带有磁性内核的介孔二氧化硅纳米颗粒(magnetic mesoporous silica nanoparticles，M-MSNs)进行siRNA装载试验，介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法及参数条件参见申请号为201110266192.7的中国专利。本实施例中选取的M-MSNs粒径为50纳米左右，介孔孔道孔径为3.6nm。

一、M-MSN_siRNAPEI的制备

1.先将0.2mg M-MSNs加入到2mL离心管中，再向其中加入0.042mL纯乙醇，100w条件下超声振荡30s后使颗粒在溶液中均匀分散。

2.向1所得的溶液中加入0.01mL高盐溶液(此高盐溶液成分为：4摩尔每升的盐酸胍、25％的异丙醇，75％的灭菌水，pH为5)并混合均匀。

3.向2所得的在溶液中加入0.6mg/mL的siRNA水溶液0.01mL，并再次混合均匀。在此实施例中，乙醇、高盐溶液、siRNA水溶液三者之间的体积分数配比4.2:1:1。将混合物静置于25℃烘箱中1h。通过12000rpm离心将吸附siRNA的M-MSNs从溶液中分离。

4.将分离后所得的颗粒用0.1mL纯乙醇洗涤一次，再加入0.1mL纯乙醇，并利用100w超声振荡使颗粒均匀分散。

5.向其中加入聚乙烯亚胺浓度为4mg/mL的纯乙醇溶液0.015mL，100w超声振荡条件下使混合物反应20分钟。

6.通过12000rpm离心将颗粒从溶液中分离，并加入0.1mL pH值为4.5的去离子水，在100w超声振荡条件下反应10分钟除去颗粒表面游离的聚乙烯亚胺。通过10000rpm离心将颗粒从溶液中分离，再用0.1mL纯乙醇在100w超声振荡条件下反应10分钟，12000rpm离心将颗粒从溶液中分离，最后用纯乙醇配置成2mg/mL。此时0.2mg颗粒上的PEI的包覆量约为0.009mg，在生理环境条件下，siRNA将无法从颗粒中释放出来。

二、M-MSN_siRNAPEI接枝PEG-KALA的制备

1.取0.125mL异官能团PEG(一段带有琥珀酰亚胺NHS，另一段带有马来酰亚胺Mal，3500道尔顿)二甲基亚砜(DMSO)溶液(浓度为8mg/mL)，向上述DMSO溶液中加入0.01mLKALA多肽的离子水、双蒸水或灭菌水溶液(浓度为0.5mg/mL)，涡旋振荡15秒，37℃下静置0.5小时。

2.将步骤1的复合物加入实施例1中最终所得的颗粒中，涡旋振荡15秒，室温下放置0.5小时。

3.步骤2所得到的颗粒在高速离心(12500rpm)下5分钟，弃上清。加入pH为6～8的去离子水0.2mL，超声震荡(60～200W)条件下放置5分钟。所得分散性的颗粒溶液在高速离心(12000rpm)下3分钟，弃上清，除去未连接到颗粒表面的PEG，KALA，PEG-KALA复合物及其溶剂。

4.向步骤3中最终所得到的颗粒中加入pH为6～8的去离子水0.1mL，超声震荡(60～200W)条件下放置5分钟，配制成2mg/mL的溶液保存。

本实施例中所得的纳米颗粒的水力学尺寸为150nm左右，Zeta电位在+23.6mV，投射电子显微镜下照片显示的直径约50nm，T₂弛豫率为226.92mM^-1s^-1。

三、生物相容性实验

如图2所示，本发明装载siRNA的介孔二氧化硅纳米颗粒载带NCsiRNA后对人正常肝细胞(L02)和人肺腺癌肿瘤细胞(A549)在较高颗粒浓度下(200μg/mL)的细胞毒性较低(A)；颗粒浓度选择80μg/mL(可忽略颗粒本身对细胞的毒性)。

四、干扰效果对比

如图3所示，1为M-MSN_NC siRNAPEI-PEG-KALA(阴性对照siRNA颗粒组)；2为M-MSN_VEGF siRNAPEI-PEG-KALA(治疗siRNA颗粒组)；3为脂质体2000包覆VEGF siRNA。本发明装载siRNA的介孔二氧化硅纳米颗粒载带VEGF siRNA量为150nM时，与载带等量VEGF siRNA的商业脂质体Lipofectamine^TM2000相比，该颗粒体系的VEGF siRNA干扰效果要明显高于商业脂质体组。

五、应用效果

如图4所示，本发明装载siRNA的介孔二氧化硅纳米颗粒载带VEGFsiRNA对人肺腺癌肿瘤细胞(A549)的皮下瘤进行治疗过程中治疗组和不同对照组之间肿瘤大小变化统计图，实验结果证明，治疗组较其他对照组针对人肺腺癌肿瘤细胞(A549)的皮下瘤模型具有非常好的抑制作用。

本发明装载siRNA的介孔二氧化硅纳米颗粒载带VEGF siRNA对人肺腺癌肿瘤细胞(A549)的原位瘤及其转移灶进行治疗。实验结果证明，治疗组较其他对照组针对人肺腺癌肿瘤细胞(A549)的原位瘤及其肝转移灶具有非常好的抑制作用。

本发明装载siRNA的介孔二氧化硅纳米颗粒载带NC siRNA后，对实验动物进行5次重复注射(5天/次，1次100mg/kg的剂量)后48小时检测血常规、血液生化及重要脏器组织损伤。实验结果证明，注射载带NCsiRNA的磁性介孔氧化硅纳米颗粒不会造成血常规和肝、肾功能相关的血液生化的变化，也不会对重要脏器如肝脏(liver)、肺(lung)、脾脏(spleen)、肾脏(kidney)产生明显的损伤，生物安全性和生物相容性较高。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种装载siRNA的纳米颗粒，包括siRNA和介孔二氧化硅纳米颗粒，所述siRNA装载在所述介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道内，所述介孔二氧化硅颗粒表面包覆正电性高分子，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米颗粒表面接枝聚乙二醇-多肽分子复合物。

2.如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙二醇-多肽分子复合物通过聚乙二醇的马来酰亚胺与多肽分子的巯基结合。

3.如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙二醇-多肽分子复合物通过聚乙二醇的琥珀酰亚胺与所述介孔二氧化硅颗粒表面包覆的所述正电性高分子的氨基特异性结合。

4.如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米颗粒的颗粒粒径为30～100纳米，介孔孔径为2～6纳米。

5.如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量范围为200Da～5000Da。

6.如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述多肽分子为KALA。

7.如权利要求1-6任一所述的纳米颗粒在制备癌症基因治疗药物中的应用。