JP2002097198A - 腸管伝播性非ａ非ｂ肝炎ウイルス因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス因子由来
のウイルスタンパクおよびその断片からなる新規の組成
物、ならびに該組成物の調製法および使用法を提供す
る。ＥＴ−ＮＡＮＢウイルスタンパクの調製法は、ＥＴ
−ＮＡＮＢゲノム配列の同定を含み、それに続いて、ク
ローニングおよび宿主細胞注での発現が行われる。その
結果得られた組換型ウイルスタンパクは、診断薬および
ワクチンとして使用される。ゲノム配列およびその断片
は、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルスタンパクの調製に、および
ウイルスの検出プローブとして使用される。 【解決手段】 ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号の大腸菌Ｂ
Ｂ４株に担持されるプラスミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ
１．１）中に存在する１．３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲ
Ｉ挿入片に相同な領域を含むゲノムを有する腸管伝播性
非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由来するタンパク。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】（関連出願に対するクロスリ
ファレンス）この出願は、１９８９年４月１１日に提出
された米国特許出願第３３６，６７２号の一部継続出願
であり、後者は、１９８８年６月１７日に提出された米
国特許出願第２０８，９９７号の一部継続出願である。
この両方の一部継続出願は、この明細書に組み込まれた
ものとする。

【０００２】（緒言） （発明の分野）この発明は、組換型タンパク、遺伝子お
よび遺伝子プローブに関し、さらに詳細には、腸管伝播
性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由来するタンパクおよび
プローブに関する。また、この発明は、該タンパクおよ
びプローブを使った診断法およびワクチンヘの応用に関
する。

【０００３】

【従来の技術】（背景）腸管伝播性非Ａ非Ｂ（ＥＴ−Ｎ
ＡＮＢ）肝炎ウイルス因子は、アジア、アフリカ、イン
ド亜大陸にみられる何らかの流行性および散在性肝炎の
原因と報告されている。感染は、一般に便の夾雑した水
によって起こるが、ウイルスは、身体の密接な接触によ
っても伝播する可能性がある。しかし、そのウイルスが
長期的な感染を引き起こすとは考えられない。ＥＴ−Ｎ
ＡＮＢにおける病因は、プールした便の分離物を使った
志願者の感染によって示されてきた。また、免疫電子顕
微鏡法（ＩＥＭ）による研究では、感染者の便中に直径
２７〜３４ｎｍのウイルス粒子の存在が示された。この
ウイルス粒子は、地理的に隔たった地域の感染者からの
血清抗体と反応するため、単独のウイルス、すなわち１
種類のウイルスが、世界中に見られるＥＴ−ＮＡＮＢ肝
炎の大部分の原因であると示唆された。抗体反応は、血
液伝播性非Ａ非Ｂウイルスでの感染者の血清中には見ら
れないため、２つの非Ａ非Ｂタイプには異なった特異性
のあることが指摘された。

【０００４】血清学的相異に加えて、非Ａ非Ｂ感染の２
つのタイプには、異なった臨床像が認められる。ＥＴ−
ＮＡＮＢには、特徴的な急性の感染があり、しばしば発
熱および関節痛を伴い、肝生検の検体での門脈の炎症お
よび胆汁の鬱血が認められている（アランカレ）。症状
は、通常６週間以内に消失する。これとは対照的に、血
液伝播性非Ａ非Ｂは、約５０％の症例に慢性感染をもた
らす。この場合、発熱および関節痛の発現は稀であっ
て、炎症は実質組織で顕著である（クーロー、１９８０
年）。２種類のウイルスは、霊長類の宿主感受性を基準
に区別することもできる。ＥＴ−ＮＡＮＢは、血液感染
性ウイルスとは異なり、カニクイザルヘの伝播が可能で
ある。血液伝播性ウイルスは、チンパンジーにＥＴ−Ｎ
ＡＮＢよりも一層容易に感染する（ブラッドレー、１９
８７年）。

【０００５】ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎に関連したウイルスの
ゲノム配列を同定し、クローニングするために、世界中
で多大の努力が払われてきた。この努力の一つの目標
は、ウイルス特異的ゲノム配列の解明を目指し、ウイル
スおよびその産生タンパクの性質を同定して特性を決定
することである。もう一つの目標は、抗体診断法および
ワクチンに使用できる組換型ウイルスタンパクを産生す
ることである。そういった努力とは裏腹に、ＥＴ−ＮＡ
ＮＢ肝炎の関連ウイルスの塩基配列は、今まで同定およ
びクローニングされておらず、いかなるウイルス特異的
タンパクも同定および産生されていない。

【０００６】（関連文献） Ｖ．Ａ．アランカレら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，５５０
（１９８８年３月１２日） Ｄ．Ｗ．ブラッドレイら、Ｊ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，
６９：１（１９８８年） Ｄ．Ｗ．ブラッドレイら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４：６２７７（１９８７年） Ｃ．Ｒ．グラベラら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ，１３１：１６７（１９７５年） Ｍ．Ａ．カーネら、ＪＡＭＡ，２５２：３１４０（１９
８４年） Ｍ．Ｓ．クーロー Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ，４８：８１８
（１９８０） Ｍ．Ｓ．クー口ーら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，６８：８１
８（１９８３年） Ｔ．マニアチスら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ１，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ（１９８２年） Ｂ．Ｓｅｔｏら、Ｌａｎｃｅｔ，１１：９４１（１９８
４年） Ｍ．Ａ．ｍ．スリーニバサンら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
１．，６５：１００５（１９８４年） Ｅ．Ｔａｂｏｒら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１４
０：７８９（１９７９年）

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】（発明の要約）この発
明は、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス因子由来のウイルスタン
パクおよびその断片からなる新規の組成物、ならびに該
組成物の調製法および使用法を提供する。ＥＴ−ＮＡＮ
Ｂウイルスタンパクの調製法は、ＥＴ−ＮＡＮＢゲノム
配列の同定を含み、それに続いて、クローニングおよび
宿主細胞注での発現が行われる。その結果得られた組換
型ウイルスタンパクは、診断薬およびワクチンとして使
用される。ゲノム配列およびその断片は、ＥＴ−ＮＡＮ
Ｂウイルスタンパクの調製に、およびウイルスの検出プ
ローブとして使用される。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＡＴＣＣ寄託
第６７７１７号の大腸菌ＢＢ４株に担持されるプラスミ
ドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）中に存在する１．３３
ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領域を含むゲ
ノムを有する腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由
来するタンパクを提供する。

【０００９】好ましい実施態様において、上記タンパク
は、前記１．３３ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入片中のコード領
域にてコードされている。

【００１０】本願発明はまた、以下の第１配列、第２配
列、第３配列もしくは第４配列、またはそれらに相補的
な配列をもった２本鎖ＤＮＡに相同な領域を含むゲノム
を有する腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由来す
る組換型タンパク： 第１配列

【００１１】

【化１】

【００１２】第２配列

【化２】

【００１３】第３配列

【化３】

【００１４】第４配列

【化４】

【００１５】本発明はまた、（ａ）腸管伝播性非Ａ非Ｂ
感染個体に存在する抗体と免疫反応性しそして（ｂ）Ａ
ＴＣＣ寄託第６７７１７号の大腸菌ＢＢ４株に担持され
るプラスミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する
１．３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領域
を含むゲノムを有する腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス
因子に由来するタンパクを提供する。

【００１６】好ましい実施態様において、上記タンパク
は、前記１．３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片中の
コード領域にコードされる。

【００１７】本発明はまた、被験個体において腸管伝播
性非Ａ非Ｂウイルスの感染を検出する方法であって、
（ａ）腸管感染性非Ａ非Ｂ感染者に存在する抗体と免疫
反応性しそして（ｂ）ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号の大
腸菌ＢＢ４株に担持されるプラスミドｐＴＺ−ＫＦ１
（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩ挿入片に相同な領域を含むゲノムを有する腸管伝
播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由来するペプチド抗原
を用意すること、被験個体から得た血清を該抗原と反応
させること、および該抗体を検出して、結合した抗体の
存在を調べること、を含んでなる検出法を提供する。

【００１８】好ましい実施態様において、上記の検出法
では、前記血清抗体がＩｇＭもしくはＩｇＧ抗体または
両者の混合物であり、用意される前記抗原が支持体に結
合しており、前記反応が該抗体と該支持体との反応を含
み、および前記検出が該支持体ならびに結合血清抗体と
リポーター標識抗ヒト抗体との反応を含んでなる。

【００１９】本発明はまた、腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎感
染の診断を下せる血清抗体の存在を確認するためのキッ
トであって、（ａ）腸管感染性非Ａ非Ｂ感染者に存在す
る抗体と免疫反応性しそして（ｂ）のゲノムが、ＡＴＣ
Ｃ寄託第６７７１７号の大腸菌ＢＢ４株に担持されるプ
ラスミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．
３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領域を含
むゲノムを有する腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子
に由来する表面結合性組換型ペプチド抗原をもつ支持
体、およびリポーター標識抗ヒト抗体を含んでなるキッ
トを提供する。

【００２０】本発明はさらに、ＡＴＣＣ寄託第６７７１
７号の大腸菌ＢＢ４株に担持されるプラスミドｐＴＺ−
ＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ｋｂ ＤＮＡ
のＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領域を含むゲノムを有する
腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由来するＤＮＡ
断片を提供する。

【００２１】好ましい実施態様において、上記断片は、
前記１．３３ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入片に由来する。

【００２２】本発明はさらに、以下の第１配列、第２配
列、第３配列もしくは第４配列、またはそれらに相補的
な配列をもった２本鎖ＤＮＡに相同の領域を含むゲノム
を有する腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由来す
るＤＮＡ断片： 第１配列

【００２３】

【化５】

【００２４】第２配列

【化６】

【００２５】第３配列

【化７】

【００２６】第４配列

【化８】 を提供する。

【００２７】好ましい実施態様において、上記ＤＮＡ断
片は、前記第１配列の２番目から１０１番目のヌクレオ
チド、前記第２配列の５９４番目から６４３番目のヌク
レオチド、または前記コード配列に相補的配列と相同な
コード配列を含む。

【００２８】本発明はまた、１つの容器または複数の容
器に、ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号の大腸菌ＢＢ４株に
担持されるプラスミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）に
存在する１．３３ｋｂＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片に相同
な領域を含むゲノムを有する腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウ
イルス因子に由来する２本鎖ＤＮＡの対立鎖の相同領域
に由来する一対の１本鎖プライマーを含むキットを提供
する。

【００２９】好ましい実施態様において、上記キットの
プライマーは、前記プラスミド中のＥｃｏＲＩ２本鎖挿
入片の対立鎖に由来する。

【００３０】本発明はまた、生物試料中における腸管伝
播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子の有無を検出する方法で
あって、試料由来の２本鎖ＤＮＡ断片の混合物を調製
し、該２本鎖断片を変性させ、該変性ＤＮＡ断片に、Ａ
ＴＣＣ寄託第６７７ｌ７号の大腸菌ＢＢ４株に担持され
るプラスミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する
１．３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領域
を含むゲノムを有する腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス
因子に由来する２本鎖ＤＮＡの対立鎖の相同領域に由来
する一対の１本鎖プライマーを添加し、腸管伝播性非Ａ
非Ｂ肝炎ウイルス因子由来の２本鎖ＤＮＡ断片の対立鎖
の相同領域に前記プライマーをハイブリッドさせ、配列
の増幅が目的の程度に達するまで、該プライマー断片鎖
をＤＮＡヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼと
反応させて、該プライマー配列を含む新たなＤＮＡ２本
鎖を形成させ、そして前記の変性、添加、ハイブリッ
ド、および配列の各工程を繰り返す、ことを含んで成る
検出法を提供する。

【００３１】好ましい実施態様では、上記方法におい
て、前記プライマーが、前記プライマー中のＥｃｏＲＩ
挿入片２本鎖の対立鎖に由来する。

【００３２】別の好ましい実施態様では、上記方法は、
前記ウイルス因子に感染した培養細胞試料中でウイルス
因子の有無を検出するために使用される。

【００３３】本発明はさらに、腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎
ウイルス因子に大して個体を免疫するワクチンであっ
て、生理学的に許容性のあるアジュバントと、ＡＴＣＣ
寄託第６７７１７号の大腸菌ＢＢ４株に担持されるプラ
スミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３
３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領域を含む
ゲノムを有する腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に
由来する２本鎖ＤＮＡの対立鎖の相同領域に由来する組
換型タンパクとを含んで成るワクチンを提供する。

【００３４】好ましい実施態様では、上記ワクチンは、
前記タンパクが、前記プラスミド中のＥｃｏＲＩ挿入片
に由来する。

【００３５】本発明はまた、腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウ
イルス因子または該ウイルス因子によって産生された核
酸断片を分離する方法であって、前記ウイルス因子源と
して、腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎に感染したヒトまたはカ
ニクイザルから得られた胆汁を利用することを特徴とす
る分離法を提供する。

【００３６】好ましい実施態様では、上記方法におい
て、胆汁が、感染したカニクイザルから得られる。

【００３７】本発明はさらに、ＡＴＣＣ寄託第６７７１
７号の大腸菌ＢＢ４株に担持されるプラスミドｐＴＺ−
ＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３ｋｂ ＤＮＡ
のＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領域を含むゲノムを有する
腸管伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由来する２本鎖
ＤＮＡの対立鎖の相同領域に由来するタンパクで免疫し
たヒトから得られるヒトポリクローナル抗血清を提供す
る。

【００３８】

【発明の実施の形態】（特殊な態様の説明）ＥＴ−ＮＡ
ＮＢウイルス由来の遺伝子配列およびその断片からなる
組成物、ならびに該ゲノム配列を使って産生した組換型
ウイルスタンパクおよび該組成物の使用法が提供され
る。

【００３９】ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス因子のゲノムは、
ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号の大腸菌株ＢＢ４に担持さ
れる１．３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入断片と相同
性のある領域を含むことが確かめられている。初期の研
究では、この挿入断片の両末端領域および中間領域の配
列が決定された。この挿入断片の５’末端領域は、以下
の配列を含む：

【００４０】

【化９】

【００４１】中間領域は以下の配列を有する：

【化１０】

【００４２】３’−末端領域は次の配列を有する：

【化１１】

【００４３】以下に述べるように、追加の研究から、両
方向の全配列が提供された。どちらのＤＮＡ鎖に遺伝子
が位置するか不明であるため、両方のＤＮＡ鎖の配列を
提供する。しかし、既知のタンパクに統計的類似性がみ
られるため、一方向の配列を「順方向」配列と呼ばれて
いる。この配列は、考え得る３つの翻訳配列と共に、以
下に述べる。イソロイシンに対する１４５番目のヌクレ
オチドで始まり、配列未端に伸長する、１つの長鎖オー
プンリーディングフレームが存在する。その他の２つの
オープンリーディングフレームには、多くの終止コドン
がある。この明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸
に対する標準的な略号を使用する。

【００４４】

【化１２】

【００４５】この明細書で「逆方向配列」とした相補的
鎖を以下に、上記で示した順方向配列と同じ方法で記載
する。いくつかのオープンリーディングフレームは、順
方向配列に見いだされた長鎖オープンリーディングフレ
ームより短く、この逆方向方法配列も見いだされる。

【００４６】

【化１３】

【００４７】上記の配列を病原因子中の配列であるとす
る同定は、ビルマで分離されたウイルス株に相当する配
列を決定することによって確認された。このビルマの分
離株には、以下のヌクレオチド配列が含まれる。

【００４８】非Ａ非ＢＥＴ：ビルマ株

【化１４】

【００４９】この明細書で記載した方法が、その他のＮ
ＡＮＢ肝炎株からの遺伝子物質を分離して同定する能力
は、メキシコで得られた分離株からの遺伝子物質を同定
することによって確認された。上記の分離株の配列は、
前記のＥＴ１．１配列と７５％の一致をみた。配列は、
以下の第ＩＩ．Ｂ節で述べる条件でのハイブリダイゼー
ションによって同定した。１６１１個のヌクレオチドか
らなるｃＤＮＡの部分的配列を以下に示す。

【００５０】非Ａ非ＢＥＴ：メキシコ株

【化１５】

【００５１】上記のビルマ株とメキシコ株とを比較する
と、メキシコ株の１３番目のヌクレオチドおよびビルマ
株の３３１番目のヌクレオチドから始まる１３７２個の
ヌクレオチドに重複が認められている。

【００５２】分子遺伝学の技術者には、上記の２つの配
列はどちらも、相対する相補的ＤＮＡ配列、ならびに該
主配列および相補的ＤＮＡの両方に対するＲＮＡ配列を
開示する、ことが明らかである。また、ペプチドをコー
ドするオープンリーディングフレームが存在しており、
発現可能なペプチドは、アミノ酸配列を明言せず、上記
のヌクレオチド配列によって開示される。それは、ＥＴ
１．１配列の場合のように、あたかもアミノ酸が分かっ
ているときと同様の方法で行われる。

【００５３】（発明の詳細な説明） （第Ｉ節 定義）以下に定義する用語は、次の意味をも
つ。

【００５４】１．「腸管伝播性非Ａ非Ｂ（ＥＴ−ＮＡＮ
Ｂ）肝炎ウイルス因子」とは、（１）水系感染性肝炎を
引き起こす、（２）カニクイザルで伝播可能である、
（３）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）とは血清学的に区別
される、および（４）ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号と同
定された大腸菌ＢＢ４株に担持されるプラスミドｐＴＺ
−ＫＦ１（ＥＴ１．１）中の１．３３ｋｂ ｃＤＮＡに
相同なゲノム領域を含む、ウイルス、ウイルス型または
ウイルス種をいう。

【００５５】２．２つの核酸断片が、ハイブリド鎖にせ
いぜい約２５〜３０％の塩基対のミスマッチが含まれる
ハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズ
可能であれば、これらの断片は「相同」である。一般
に、２つの短鎖核酸種が、マニアチスら（ｏｐ．ｃｉ
ｔ．，ｐｐ．３２０−３２３）記載の条件下で、洗浄操
作〔２×ＳＣＣ， ０．１％ＳＤＳ、室温で２回各３０
分 ； ２×ＳＣＣ， ０．１％ＳＤＳ，５０℃で１回
３０分； ２×ＳＣＣ，０．１％ＳＤＳ、室温で２回各
１０分〕に従ってハイブリダイズすれば、これらの核酸
は相同といえよう。相同核酸鎖が１５〜２５％の塩基対
のミスマッチを含むものであれば尚好ましく、それが５
〜１５％であれば更に好ましい。これら相同性の程度
は、当該技術で周知のように、遺伝子ライブラリー（ま
たはその他の遺伝子材料源）の洗浄条件を変えることに
よって、選定可能である。

【００５６】３．ＤＮＡ断片は、それがＥＴ−ＮＡＮＢ
ウイルス因子ゲノムと同一または実質的に同一の塩基対
をもてば、そのウイルス因子に「由来」する。

【００５７】４．タンパクは、それがＥＴ−ＮＡＮＢウ
イルス因子からのＤＮＡまたはＲＮＡのオープンリーデ
ィングフレームにコードされていれば、そのウイルス因
子に「由来」する。

【００５８】（第ＩＩ節 クローニングＥＴ−ＮＡＮＢ
断片の採取）この発明の一態様に従えば、ウイルス特異
的ＤＮＡクローンは、（ａ）既知のＥＴ−ＮＡＮＢ感染
症にかかったカニクイザルの胆汁からＲＮＡを分離す
る、（ｂ）ｃＤＮＡ断片をクローニングして断片のライ
ブラリーを作成する、および（Ｃ）感染または非感染胆
汁源から得られた放射能標識ｃＤＮＡに対する識別ハイ
ブリダイゼーションによってライブラリーをスクリーニ
ングする、ことによって産生可能である。

【００５９】（Ａ）ｃＤＮＡ断片混合物 カニクイザルでのＥＴ−ＮＡＮＢ感染は、この動物に感
染症のヒト（２７〜３４ｎｍＥＴ−ＮＡＮＢ粒子−平均
粒径３２ｎｍ−陽性）の便から得られた１０容量％懸濁
液を静脈接種することによって始まる。感染した動物
は、アルカリ性アミノトランスフェラーゼのレベル上昇
を監視し、肝炎感染を調べる。ＥＴ−ＮＡＮＢ感染は、
既法（グラベレ）に従って、血清学的陽性の抗体の免疫
特異的結合を調べることによって確認される。すなわ
ち、感染３〜４週後に感染動物から得られた便（または
胆汁）検体をリン酸緩衝液で１０倍に希釈し、この１０
％懸濁液を低速遠心で清澄化してから、１．２および
０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過する。材料
は、３０％ショ糖層を通してペレット化することによっ
て更に精製が可能である（ブラッドレイ）。一晩のイン
キュベーションの後、混合物を一晩遠心して免疫凝集体
をペレット化し、これらを染色して、ＶＬＰ結合抗体を
電子顕微鏡で検鏡する。

【００６０】また、ＥＴ−ＮＡＮＢ感染は、ＶＬＰ陽性
血清のセロコンバージョンによっても確認できる。ここ
で、感染動物の血清は、感染症にかかったヒトの便検体
から分離した２７〜３４ｎｍＶＬＰで上記のように混合
し、免疫電子顕微鏡法によってＶＬＰに結合する抗体を
調べる。

【００６１】胆汁は、胆管への挿管および胆汁の採取、
または剖検中の胆管ドレナージによって採取することが
できる。全ＲＮＡは、実施例１Ａで概説するように、熱
フェノール抽出によって胆汁から抽出される。ＲＮＡ断
片は、やはり実施例１Ａで概説するように、ランダムプ
ライミングによって相当の二重鎖ｃＤＮＡを合成するた
めに使用する。ｃＤＮＡは、ゲル電気泳動または密度勾
配遠心によって分画して、目的サイズの断片（すなわ
ち、５００〜４，ＯＯＯ塩基対断片）を得ることができ
る。

【００６２】便検体（実施例４記載）から得られるＶＬ
Ｐなど、別のウイルス材料もｃＤＮＡを産生するのに使
用できるが、胆汁源が好ましい。この発明の一態様に従
えば、ＥＴ−ＮＡＮＢ感染のサルから得られる胆汁に
は、免疫電子顕微鏡法で判明するように、便試料から得
られる材料より、多数の完全なウイルス粒子数が認めら
れることが分かった。ＥＴ−ＮＡＮＢ感染ヒトまたはカ
ニクイザルから得られる胆汁（ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス
タンパクまたはゲノム材料源として利用するため）、ま
たは完全なウイルスは、この発明の一部をなす。

【００６３】（Ｂ）ｃＤＮＡライブラリーおよびスクリ
ーニング 上記で得られるｃＤＮＡ断片を適当なクローニングベク
ターにクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを形成す
る。これは、断片の平滑末端に、ＥｃｏＲＩ配列などの
適当な末端リンカーをつなげ、ユニークなＥｃｏＲＩ部
位でのようにクローニングベクターの適当な挿入部位に
断片を挿入することができる。最初のクローニングの
後、必要に応じて、断片の挿入片を含むベクターの割合
を増加させることもできる。実施例１Ｂに記載したライ
ブラリーの作成は、一例である。ここでは、ｃＤＮＡ断
片が平滑末端であって、ＥｃｏＲＩ部位につなげ、λフ
ァージベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入する。ライブラ
リーファージは、挿入断片の５％未満であって、これを
単離して、断片挿入片をλｇｔ１０ベクターに再クロー
ニングすると、９５％以上の挿入片含有ファージが産生
される。

【００６４】ｃＤＮＡライブラリーは、感染または非感
染源由来のｃＤＮＡプローブでの識別的ハイブリダイゼ
ーションによって、ＥＴ−ＮＡＮＢ特異的配列に対して
スクリーニングする。感染または非感染源の胆汁または
便の分離物から得られるｃＤＮＡ断片は、上記のように
調製することができる。断片の放射能標識は、従来法
（マニアチス、ｐ．１０９）に従った、ランダムラベッ
リング、ニックトランスレイションまたはエンドラベッ
リングによるものである。ｃＤＮＡライブラリーは、実
施例２で説明するように、２組のニトロセルロースフィ
ルターへのトランスファー、ならびに感染源および非感
染源（対照）の放射能標識プローブでのハイブリダイゼ
ーションによってスクリーニングする。塩基対ミスマッ
チの好ましい上限値２５〜３０％でハイブリドするため
に、マニアチスら（ｏｐ．ｃｉｔ．，ｐｐ．３２０−３
２３）記載の条件下で、かつ洗浄条件〔２×ＳＣＣ，
Ｏ．１％ＳＤＳ、室温で２回各３０分；２×ＳＣＣ，
０．１％ＳＤＳ，５０℃で１回３０分；２×ＳＣＣ，
Ｏ．１％ＳＤＳ、室温で２回各１０分〕に従ってハイブ
リダイズするか否かを調べて、クローンを選択する。こ
れらの条件によれば、プローブにＥＴ１．１を使うこと
によって上記のメキシコ分離物の同定が可能である。感
染源プローブに対する選択的ハイブリダイゼーションを
示すプラークは、低プレート濃度で再プレーティングす
ることが好ましく、ＥＴ−ＮＡＮＢ配列にスペクトラム
な単独クローンを分離する。実施例２で示されるよう
に、感染源プローブと特異的にハイブリッドする１６個
のクローンは、一連の手順を踏んで同定された。これら
クローンの１つは、λｇｔ１０１．１と命名され、１．
３３ｋｂの挿入断片を含むものである。

【００６５】（Ｃ）ＥＴ−ＮＡＮＢ配列 （Ｂ）からのＥＴ−ＮＡＮＢ断片のクローニング領域の
塩基配列を、標準的な配列決定法によって決定する。実
施例３に記載した１例では、選ばれたクローニングベク
ターからの挿入断片を切り出し、これを挿入部位の片側
の塩基配列が未知のクローニングベクターに挿入する。
実施例３で使用する特定のベクターは、図１の左側に示
すｐＴＺ−ＫＦ１ベクターである。λｇｔｌ０１．１フ
ァージからのＥＴ−ＮＡＮＢ断片は、ｐＴＺ−ＫＦ１プ
ラスミドのユニークなＥｃｏＲＩ部位に挿入した。目的
の挿入片をもつ組換体は、実施例３に記載したように、
分離した１．３３ｋ断片とのハイブリダイゼーションに
よって同定した。ある選ばれたプラスミドは、ｐＴＺ−
ＫＦ１（ＥＴ１．１）と同定され、ベクターをＥｃｏＲ
Ｉで消化したのち、予想どうり１．３３ｋｂ断片を生じ
る。

【００６６】ｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミド
を感染させた大腸菌ＢＢ４株は、アメリカ基準培養コレ
クション（ロックビル，メリーランド州）に寄託され、
ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号と同定された。

【００６７】ｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミド
を図１の下に例示する。この挿入片は、それぞれＡおよ
びＢと命名した５’末端領域および３’末端領域、なら
びにＢと命名した中間領域をもつ。上記のこれら領域
は、標準的なジオキシ法によって塩基配列の決定を行
う。３つの短い配列（Ａ，ＢおよびＣ）は、同一の挿入
片鎖のものである。実施例３にみられるように、Ｂ領域
の配列は、実際には、対立鎖から決定されたものなの
で、上記のＢ領域配列は、配列決定された鎖の相補的配
列である。部分配列の塩基数は、おおよその値である。

【００６８】発明者らのその後の研究では、上記のよう
に、完全な配列が同定された。この全配列の各断片は、
制限エンドヌクレアーゼを使って容易に調製することが
できる。順方向と逆方法配列の両者のコンピュータ解析
によって、多数の切断部位が同定された。特異的切断部
位（順方向に）を以下の表に示す。

【００６９】

【表１】

【００７０】（第ＩＩＩ節 ＥＴ−ＮＡＮＢ断片）別の
態様によれば、この発明は、ＥＴ−ＮＡＮＢゲノム配列
またはそれ由来のｃＤＮＡ断片を含む。これら断片は、
第ＩＩ節で記載したような完全な長さのｃＤＮＡ断片を
含むこともあり、クローニングされたｃＤＮＡ断片中の
短配列領域由来の場合もある。短かい断片は、目的のサ
イズの断片を生じる条件下で完全な長さの断片を酵素的
に消化することによって調製できる。これは第ＩＶ節に
記載する。また、断片は、ｃＤＮＡ断片由来の配列を使
って、オリゴヌクレオチド合成法によって調製すること
もできる。特定配列のオリゴヌクレオチド断片を調製す
る方法または機関も利用できる。

【００７１】あるＥＴ−ＮＡＮＢ断片が実際にＥＴ−Ｎ
ＡＮＢウイルス因子に由来することを確かめるために、
断片が感染源由来のｃＤＮＡと選択的にハイブリッドす
ることが示される。例を挙げると、ｐＴＺ−ＫＦ１（Ｅ
Ｔ１．１）プラスミドの１．３３ｋｂ断片がＥＴ−ＮＡ
ＮＢ起源であることを確認するには、断片をｐＴＺ−Ｋ
Ｆ１（ＥＴ１．１）から切り出して精製し、ランダムラ
ベリングによって放射能標識した。放射能標識した断片
は、感染または非感染源からの分画ｃＤＮＡとハイブリ
ッドさせ、プローブが感染源ｃＤＮＡとのみ反応するこ
とを確かめた。この方法を実施例４に示すが、これで
は、ｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミドからの放
射能標識１．３３ｋｂ断片が、感染および非感染源から
調製したｃＤＮＡと結合するか否かを調べた。感染源
は、（１）既知のＥＴ−ＮＡＮＢ感染症にかかているビ
ルマの患者の便試料由来のウイルス株を感染させたカニ
クイザルからの胆汁、および（２）メキシコのＥＴ−Ｎ
ＡＮＢ感染者の便試料由来のウイルス因子、である。各
断片混合物中のｃＤＮＡは最初に、実施例４に記載した
リンカー／プライマー増幅法によって増幅した。断片の
分離は、アガロースゲル上で、続いてサザン法で、さら
に分画ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによっ
て行った。感染源からのｃＤＮＡを含む列は、予想どう
り、結合プローブの塗抹バンドを示した（リンカー／プ
ローブ増幅法によって増幅させたｃＤＮＡは広範囲のサ
イズを有することが予想された）。非感染源からの増幅
ｃＤＮＡに結合したプローブは認められなかった。この
結果から、１．３３ｋｂプローブは、ＥＴ−ＮＡＮＢ感
染に関連したｃＤＮＡ断片に特異的であることが分か
る。これと同じタイプの研究では、ＥＴ１．１をプロー
ブにして、タシュケント、ソマリア、ボルネオおよびパ
キスタンから集めたＥＴ−ＮＡＮＢ試料に対するハイブ
リダイゼーション傾向が示された。第二に、そのプロー
ブが様々な大陸（アジア、アフリカおよび北アメリカ）
由来の、ＥＴ−ＮＡＮＢ関連配列に特異的である事実か
ら、クローニングされたアフリカからのＥＴ−ＮＡＮＢ
配列が、一般的なＥＴ−ＮＡＮＢウイルス（すなわち、
全世界的なＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎感染症の原因となるウイ
ルス種）由来であることが分かる。

【００７２】関連の確認的研究では、ヒトまたはアカゲ
ザルのゲノムＤＮＡから調製された分画ゲノム断片に対
するプローブの結合が調べられた。プローブの結合は、
どちらのゲノム断片に対しも認められず、これは、ＥＴ
−ＮＡＮＢ断片がヒトまたはアカゲザルの内因性断片で
はないことを示している。

【００７３】断片中のＥＴ−ＮＡＮＢ特異的配列の別の
確認手段は、断片中のコード領域から得られるＥＴ−Ｎ
ＡＮＢタンパクを発現能である。以下の第ＩＶ節では、
断片を使ったタンパクの発現法を考察する。

【００７４】ＥＴ−ＮＡＮＢ特異的断片の一つの重要な
使用法は、配列のその他の情報を含むＥＴ−ＮＡＮＢ由
来ｃＤＮＡを同定することである。新たに同定されたｃ
ＤＮＡは、続いて、新しい断片プローブを生じ、全ウイ
ルスゲノムが同定され配列決定されるまで一層の反応を
可能にする。さらに別のＥＴ−ＮＡＮＢライブラリーの
クローンを同定する手順、およびそれから新しいプロー
ブを生み出す手順は、第ＩＩ節に記載したクローニング
および選択の後に行われる。

【００７５】断片（および下記の配列に基づいて調製さ
れたオリゴヌクレオチド）も、患者のＥＴ−ＮＡＮＢゲ
ノム材料を検出する、ポリメラーゼ鎖反応法のプローブ
として有用である。この診断法は、以下の第Ｖ節に記載
されよう。

【００７６】（第ＩＶ節 ＥＴ−ＮＡＮＢタンパク）上
記のごとく、ＥＴ−ＮＡＮＢタンパクは、ＥＴ−ＮＡＮ
Ｂ断片でオープンリーディングフレーム領域を発現させ
ることによって調製が可能である。一つの好ましい態様
では、タンパクの発現に使われるＥＴ−ＮＡＮＢ断片
が、目的のサイズの断片、好ましくは、主要なサイズが
約１００ないし３００塩基対の間にあるランダム断片を
生じる処理を行ったクローニングｃＤＮＡ由来である。
実施例５では、ＤＮＡ消化による断片の調製法を記載す
る。アミノ酸数が約３０ないし１００のペプチド抗原を
得ることが好ましいので、消化断片は、約１００ないし
３００塩基対範囲のものを、例えばゲル電気泳動でサイ
ズ的に分画することが望ましい。

【００７７】（Ａ）発現ベクター ＥＴ−ＮＡＮＢ断片を、適当な発現ベクターに挿入す
る。代表的な発現ベクターは、λｇｔ１１であって、こ
れは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の翻訳終始コドン上
流のユニークなＥｃｏＲＩ挿入部位５３塩基対を含む。
こうして、挿入された配列は、β−ガラクトシダーゼの
Ｎ末端遺伝子、ヘテロペプチド、および任意にβ−ガラ
クトシダーゼペプチドのＣ末端（Ｃ末端部分は、配列を
コードするヘテロペプチドが翻訳終始コードをもたない
とき発現される）。このベクターも、許容温度（例え
ば、３２℃）ではウイルスを溶原性とし、高温（例え
ば、４２℃）ではウイルスを溶解させる温度感受性レプ
レッサー（ｃ１８５７）を産生する。さらに、ヘテロ挿
入片を含む不活性β−ガラクトシダーゼを産生させるの
で、挿入片をもったファージはβ−ガラクトシダーゼ呈
色−基質反応によって容易に同定することができる。

【００７８】発現ベクターへの挿入では、ウイルスの消
化断片は、必要に応じて、従来の方法に徒ってＥｃｏＲ
Ｉリンカーなどの特定制限部位リンカーを含めるため
に、修飾することもできる。実施例１では、λｇｔ１１
へ消化断片をクローニングする方法を例示するが、これ
には、断片を平滑末端にする工程、ＥｃｏＲＩリンカー
で連結する工程、およびその断片をＥｃｏＲＩで切り出
したλｇｔ１１中に導入する工程が含まれる。得られた
ウイルスゲノムのライブラリーを調べて、比較的大きな
（代表的な）ライブラリーを産生されることを確認する
こともできる。これは、λｇｔ１１ベクターの場合、適
当な細菌宿主を感染させ、その細菌をプレートにまい
て、プラークでβ−ガラクトシダーゼ活性の喪失を見い
だすことによって実施できる。実施例１に記載した方法
を使うと、約５０％のプラークに酵素活性の喪失が認め
られた。

【００７９】（Ｂ）ペプチド抗原の発現 上記で作成したウイルスゲノムのライブラリーは、ＥＴ
−ＮＡＮＢ血清型陽性の患者からの抗血清と免疫反応す
るペプチド抗原（融合タンパクとして発現）の産生に対
して、スクリーニングする。好ましいスクリーニング法
では、ファージライブラリーのゲノムを上記のようにプ
レートにまき、このプレートをニトロセルロースフィル
ターでブロットし、細胞によって産生された組換型タン
パク抗原をニトロセルロースフィルター上に移し取る。
続いて、このフィルターをＥＴ−ＮＡＮＢ抗血清と反応
させ、未結合抗体を除くために洗浄して、レポーター標
識抗ヒト抗体と反応させる。サンドイッチ法では、この
抗体は、抗ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体を介してフィルターに結
合させる。

【００８０】一般に、目的の組換型抗原の産生を調べて
同定されるファージのプラークは、抗体反応性融合タン
パクの産生に関して比較的低濃度で再検査する。免疫反
応性組換型抗原を産生する何個かの組換型ファージのク
ローンが、この方法で同定された。

【００８１】選ばれた発現ベクターは、組換型タンパク
の精製を目的として、大量産生用に使用することもでき
る。大量産生は、（ａ）大腸菌などの適当な宿主をλｇ
ｔ１１組換体で溶原化する、（ｂ）高レベルのヘテロベ
プチドを産生する条件下で導入細胞を培養する、および
（ｃ）溶解した細胞から組換型抗原を精製する、様々な
既法の一つを使って行われる。

【００８２】上記のλｇｔ１１クローニングベクターに
関する、ある好ましい方法では、高生産性の大腸菌宿主
ＢＮＮｌ０３に所定のライブラリーを感染させ、レプリ
カを２枚のプレートにとる。このプレートの１枚はウイ
ルスの溶原性が生じる３２℃で培養し、もう１枚は、感
染ファージが溶菌状態であって細胞増殖を抑制する４２
℃で培養する。従って、低温で増殖するが高温では増殖
しない細胞が、巧みに溶原化すると考えられる。

【００８３】続いて、溶原化した宿主細胞は、ウイルス
挿入片を含む融合タンパクの高産生に有利な条件下で増
殖させ、急速凍結によって溶解して、目的の融合タンパ
クを放出させる。

【００８４】（Ｃ）ペプチドの精製 組換型ペプチドは、標準的なタンパク精製法、例えば、
分別沈澱、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、等電点フォーカシング、ゲル電気
泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどによって
精製することができる。上記で調整したβ−ガラクトシ
ダーゼ融合タンパクなどの融合タンパクの場合、使用す
るタンパク分離技術は、もとのタンパクの分離に使われ
ているものからの応用が可能である。こうして、β−ガ
ラクトシダーゼ融合タンパクの分離には、このタンパク
を、簡単なアフィニティークロマトグラフィー（表面結
合性の抗β−ガラクトシダーゼ抗体をもつ固体担体上に
細胞溶解物を通過させる方法）によって容易に分離する
ことができる。

【００８５】（Ｄ）ウイルスタンパク この発明のＥＴ−ＮＡＮＢは、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス
因子から直接由来するものでもよい。上記のごとく、感
染者の便試料から分離したＶＬＰは、ウイルスタンパク
の適切な材料源である。便試料から分離したＶＬＰは、
タンパク分離に先立って、クロマトグラフィーによって
一層精製することができる（以下参照）。ウイルス因子
はまた、培養細胞中で発現し、これが、都合のよいウイ
ルスタンパク濃縮源となる可能性がある。

【００８６】１９８６年４月１日に出願さた共有の米国
特許第８４６，７５７号には、培養細胞中でＮＡＮＢ感
染を支える永久分裂性のトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）肝
細胞が記載されている。トリオーマ細胞系は、ヒト染色
体の安定性に着目して選択した。マウス／ヒト融合細胞
とヒト肝細胞を融合することによって調製される。目的
のＮＡＮＢウイルス因子を含む細胞は、抗ＥＴ−ＮＡＮ
Ｂヒト抗体を使った免疫蛍光法によって同定することが
できる。

【００８７】ウイルス因子は、タンパクの分離に先立っ
て、従来法（超音波処理、高濃度もしくは低濃度の塩処
理、または界面活性剤の使用）によって破砕する。

【００８８】ＥＴ−ＮＡＮＢウイルスタンパクの精製
は、標準法で結合させた抗ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体を使った
アフィニティークロマトグラフィーによって実施するこ
とができる。免疫血清源からの抗ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体の
分離には、上記のような免疫反応性の組換体ＥＴ−ＮＡ
ＮＢタンパクを固体支持体に結合させるアフィニティー
クロマトグラフィーによって抗体自体を精製することも
できる。結合抗体は、標準的な方法によって支持体から
放出する。

【００８９】また、抗ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体は、組換型Ｅ
Ｔ−ＮＡＮＢタンパクでマウス、その他の動物を免疫す
ること、動物から得られるリンパ球を分離して細胞を適
当な融合細胞で永久分裂性を獲得させること、および組
換体タンパク免疫原と反応する融合タンパクを選択する
ことによって調製したモノクローナル抗体（Ｍａｂ）で
あってもよい。次に、これらは、上記のごとく、アフィ
ニティークロマトグラフィーで精製して、もとのＥＴ−
ＮＡＮＢ抗原を得ることもできる。

【００９０】（第Ｖ節 利用法） （Ａ）診断法 この発明の粒子および抗原、ならびに遺伝子材料は、診
断法に使用することができる。ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎の罹
患を検査する方法は、ＥＴ−ＮＡＮＢ肝ウイルスの関連
被検体の存在に対して、血液試料、便試料、肝生検検体
などの生物試料を解析するものである。

【００９１】この被検体は、少なくとも約１６個のヌク
レオチド（通常、３０〜２００ヌクレオチド）から実質
的には上記の塩基配列（ｃＤＮＡ）の全配列までの配列
からなるプローブとハイブリドするヌクレオチド配列の
場合もある。被検体は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡでもよ
い。一般に、被検体はＥＴ−ＮＡＮＢまたは分類不能な
粒子の存在が疑われるウイルス粒子である。さらに、こ
のウイルス粒子の特徴は、上記の「順方向」および「逆
方向」配列の少なくとも１２個連続したヌクレオチド配
列に少なくとも約８０％相同な配列（一般には、配列中
で少なくとも約６０個連続したヌクレオチドに少なくと
も９０％相同なヌクレオチド配列）からなるＲＮＡウイ
ルスゲノムを持つことであるが、このウイルス粒子は、
全長の配列に実質的に相同な配列を含むこともある。プ
ローブにハイブリドする被検体を検出するには、プロー
ブが検出可能な標識を含む場合もある。

【００９２】この被検体はまた、ＥＴ−ＮＡＮＢ上にあ
る、細胞表面抗原などの抗原を認識する抗体からなるこ
ともある。さらに、被検体は、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス
粒子でもあり得る。被検体が抗体または抗原である場
合、それぞれ標識した抗原または抗体のどちらかを、被
検体に結合させて免疫複合体を形成させることが可能で
あって、これらは、標識を介して検出される。

【００９３】一般に、被検体（表面抗原および／または
全粒子など）の検出法は、イムノアッセイに基づいてい
る。イムノアッセイは、ＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎ウイルス感
染によって形成された宿主の抗体を測定して行うか、ウ
イルス粒子または抗原の存在を直接測定する検出法によ
って行うことができる。こういった手法は既知であっ
て、ここで詳細に記載する必要はない。例えば、ヘテロ
およびホモイムノアッセイ法の両者が可能である。両方
の手法は、ウイルス粒子またはウイルス抗原と相当する
特異的抗体との間の免疫複合体の形成に基づくものであ
る。ウイルス抗原用のヘテロ検出法では一般に、固体表
面に結合した特異的モノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体が使われる。サンドウッチ法は次第に人気が
高まっている。ホモ検出法は、固相を必要とせず、例え
ば、酵素−抗原結合体への遊離抗体の結合によって生じ
る酵素活性の差を測定することによって溶液中で行われ
る。適切な多数の検出法が、米国特許第３，８１７，８
３７号、第４，００６，３６０号、第３，９９６，３４
５号に開示されている。

【００９４】ＥＴ−ＮＡＮＢウイルスによって誘導され
た抗体の存在を検定する場合、この発明のウイルスおよ
び抗原は、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体のどちらかを検出す
る特異的結合因子として使用することができる。ＩｇＭ
抗体は、感染の経過中現れる最初の抗体であるので、Ｉ
ｇＧ合成が開始されないうちは、宿主の血中に存在する
ＩｇＧとＩｇＭとを識別することで、内科医、その他の
研究者は感染が急性か慢性かを判定できよう。

【００９５】ある診断法では、試験血清を、表面結合性
タンパク抗原を有する固相試薬と反応させる。抗ＥＴ−
ＮＡＮＢ抗体を試薬に結合させ、洗浄によって未結合成
分を除去してから、試薬をリポーター標識抗ヒト抗体と
反応させ、固体担体上で結合した抗ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体
の量に比例してリポーターが試薬に結合する。試薬を再
び洗浄して未結合標識抗体を除去し、試薬に結合したリ
ポーターの量を測定する。通常、リポーターは、適当な
蛍光または呈色性基質の存在下で固相をインキュベーシ
ョンすることによって検出される酵素である。

【００９６】上記検出法での固体表面試薬は、重合体ビ
ーズ、ディップスティック、フィルター材料などの固体
支持体材料にタンパク物質を結合させる既知の方法によ
って調製される。これらの結合法には、通常、支持体へ
のタンパクの非特異的吸着、または一般に遊離アミノ基
を介して、活性化カルボキシル基、水酸基もしくはアル
デヒド基などの固体支持体上の化学的反応基へのタンパ
クの共有結合が挙げられる。

【００９７】ホモ検出法として知られる二番目の診断法
では、固体支持体に結合する抗体が、培地中で直接検定
可能な、反応培地中の変化をもたらす。前記ホモ検定法
の一般的なタイプでは、（ａ）抗原結合性抗体が報告さ
れている移動度の変化（スピン分裂ピークの広域化）に
よって検出されるスピンラベルリポーター、（ｂ）結合
が蛍光効率の変化によって検出される蛍光リポーター、
（Ｃ）抗体結合が酵素／基質相互作用を起こす酵素リポ
ーター、および（ｄ）結合がリポソームの溶解およびカ
プセル化リポーターの放出につながるリポソーム結合性
リポーター、が含まれる。ホモ検出法試薬の調製のため
の従来法に続いて、この発明のタンパク抗原に対する一
連の方法を適用する。

【００９８】上記の各検出法では、それらに、被験者か
らの血清をタンパク抗原と反応させる工程、および結合
抗体の存在を抗原で調べる工程が関与してもよい。検査
には、第１の方法のように、被検抗体（急性期でのＩｇ
Ｍ、または回復期でのＩｇＧ）に対する標識抗ヒト抗体
を反応させる工程、および固体支持体に結合するリポー
タの量を測定する工程が関与してもよい。また、第２の
方法のように、ホモ検定法試薬上での抗体結合の効果を
観察する工程が関与してもよい。

【００９９】さらに、この発明を構成する一部は、上記
に記載した検定法を実施するための検定系またはキット
である。キットは一般に、表面結合性の組換型タンパク
抗原を持った支持体を含むが、この抗原は、（ａ）腸管
経由感染性非Ａ非Ｂウイルス因子による感染者に存在す
る抗体に免疫反応性を示して、（ｂ）ウイルス肝炎因子
のゲノムが、大腸菌ＢＢ４（ＡＴＣＣ寄託第６７７１７
号）に担持されるプラスミドＫＦ１（ＥＴ１．１）に存
在する１．３ｋｂのＤＮＡ ＥｃｏＲＩ挿入片に相同な
領域を含む、そのウイルス肝炎因子由来である。キット
のリポーター標識抗ヒト抗体は、表面結合性抗ＥＴ−Ｎ
ＡＮＢ抗体を検出するために使われる。

【０１００】（Ｂ）ウイルスゲノム診断法の応用 この発明の遺伝子材料はこれ自体、天然に存在する感染
物中の遺伝子材料用のプローブとして様々な検定に使用
することができる。標的核酸のある増幅法は、ハイブリ
ダイゼーション法による後の解析であるが、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）として知られている。このＰＣ
Ｒ法は、感染の疑わしい試料でこの発明のウイルス粒子
の検出に応用することができる。その検出は、互いに離
れたオリゴヌクレオチドプライマーが使われ、上記の遺
伝子配列に基づいている。これらのプライマーは、２本
鎖ＤＮＡ分子の反対方向の鎖に相補的であって、約５０
〜４５０以上のヌクレオチド（通常、２０００ヌクレオ
チド以下）で隔てられている。この方法では、特異的オ
リゴヌクレオチドプライマーの調製し、標的ＤＮＡの変
成の反復サイクルおよびＤＮＡポリメラーゼでの伸長が
行われ、プライマーのスペーシングを基準とする予想断
片が得られる。あるプライマーから生じた伸張産物は、
他のプライマー用の標的配列の役割を兼ねる。標的配列
の増幅の程度は、サイクルの反復回数によって調節さ
れ、理論的には、単純式２ⁿ（ｎは、サイクル数）によ
って計算する。１サイクル当たりの平均効率が約６５％
ないし８５％の範囲であれば、２５サイクルで０．３な
いし４．８万回の標的配列コピーが生じる。ＰＣＲ法
は、多数の出版物〔サイキら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
５）２３０：１３５０−１３５４；サイキら、Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９８６）３２４−１６３−１６６；およびシャ
ーフら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８６）２３３：１０７
６−１０７８など〕に記載されている。米国特許第４，
６８３，１９４号、第４，６８３，１９５号、および第
４，６８３，２０２号も参照。

【０１０１】この発明には、ＥＴ−ＮＡＮＢ断片の選択
的増幅に基づく、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス因子を決定す
るための特異的診断法が含まれる。この方法では、２本
鎖断片の対立鎖の非相同領域由来の１本鎖対プライマー
が用いられる。なお、この２本鎖断片は、腸管感染性ウ
イルス肝炎因子由来であって、この因子のゲノムは、大
腸菌ＢＢ４株（ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号）に担持さ
れるプラスミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在す
る１．３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領
域を含む。これらのプライマー断片は、この発明の一つ
の態様をなすが、上記第ＩＩＩ節に記載したようなＥＴ
−ＮＡＮＢ断片から調製される。この方法に続いて、上
記の米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている
ような特定の核酸配列を増幅する方法が行われる。

【０１０２】（Ｃ）ペプチドワクチン この発明のどの抗原も、ワクチンの調製に使用すること
ができる。ワクチン調製用の好ましい出発物質は、胆汁
から分離した粒子状の抗原である。これらの抗原は、最
初、上記のような完全な粒子として回収することが好ま
しい。しかし、他の起源または非粒子の組換型抗原から
分離した粒子で適切なワクチンを調製することも可能で
ある。非粒子の抗原を使う場合（一般には可溶性抗
原）、ウイルスのエンベロープまたはキャプシドをワク
チンの調製に使用することが好ましい。これらのタンパ
クは、アフィニティークロマトグラフィーによって精製
できる（上記参照）。

【０１０３】この精製タンパクがそれ自体で免疫性を持
たなければ、これを担体に結合させてタンパク免疫原と
することもできる。これら担体には、ウシ血清アルブミ
ン、キーホール・リンピット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍ
ｐｅｔ）のヘモシアニンなどが含まれる。常にではない
が、実質上ヒトのタンパクを含まない抗原を精製するこ
とが望ましい。しかし、抗原類は、タンパク、ウイル
ス、その他のヒト起源でない材料を含まないことがより
重要である。これらは、栄養培地、細胞系、またはウイ
ルスが培養および収穫される病原液から導入されるか、
それらの夾雑によって導入される場合がある。

【０１０４】ワクチン接種は、従来の方法によって実施
できる。例えば、抗原は、ウイルス粒子かタンパクかに
よらず、水、生理食塩水、塩添加緩衝液、完全または不
完全アジュバントなどの適当な希釈物中に混合して使用
することができる。免疫源は、抗体誘導の標準法を用
い、不活化または弱毒化されたウイルス粒子または抗原
を含む生理学的適合性のある滅菌溶液を皮下注射するな
どして、投与される。免疫反応を起こすウイルス粒子の
量は、通常、１ｍｌ以下の容量のワクチン注射で投与さ
れる。

【０１０５】ワクチン組成物の特殊な例としては、生理
学的に許容し得るアジュバントに混合した、腸管感染性
非Ａ非Ｂウイルス肝炎因子由来の組換型タンパクまたは
タンパク混合物が挙げられる。これには、大腸菌ＢＢ４
株（ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号）に担持されるプラス
ミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）に存在する１．３３
ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ挿入片に相同な領域が含まれ
る。ワクチンは、ＥＴ−ＮＡＮＢの有為な力価が血清中
に検出されるまで、周期的に投与する。このワクチン投
与は、ＥＴ−ＮＡＮＢ感染を予防するためである。

【０１０６】（Ｄ）予防および治療を目的とする抗体お
よび抗原 ワクチンとしての使用に加えて、上記の組成物は、ウイ
ルス粒子に対する抗体を調製するために使うことができ
る。抗体を調製するには、宿主の動物をウイルス粒子で
免疫処置するか、必要に応じて、ウイルス粒子のもとの
非粒子抗原を上記のようにワクチン用の担体に結合させ
る。宿主の血清または血漿を適当な時間間隔をおいて採
取すると、ウイルス粒子に反応性の抗体を含む組成物が
得られる。ＩｇＧ分画またはＩｇＧ抗体は、例えば、飽
和ＮＨ₄Ｓ０₄またはＤＥＡＥセファッデクスの使用する
か、または当該分野の技術者に既知の方法を使って、得
られる。これらの抗体には、薬剤などの他の抗ウイルス
因子が関連し得る多数の副作用が実質上ない。抗体組成
物は、起こり得る副作用の免疫系応答を最小限にするこ
とによって、宿主系との適合性をより高めることができ
る。これは、異種抗体のＦｃ領域の全部もしくは一部を
除去するか、または宿主動物と同種の抗体の使用（例え
ば、ヒト／ヒトハイブリドーマの使用によって、実施さ
れる。

【０１０７】また、抗体／ウイルス複合体がマクロファ
ージによって認識されるので、抗体は、免疫応答を高め
る手段としても使用できる。これらの抗体は、その他、
抗体の治療用投与に使われる量と類似の量で投与するこ
とができる。例えば、プールしたＩｇＧは、狂犬病、は
しか、Ｂ型肝炎など他のウイルス疾患の初期潜伏期に体
重１ポンド当たり０．０２〜０．１ｍｌで投与し、ウイ
ルスが細胞内に入るのを阻止する。従って、ＥＴ−ＮＡ
ＮＢに反応性の抗体は、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルスに感染
した宿主に単独またはその他の抗ウイルス因子と組み合
わせて受動的に投与し、抗ウイルス薬の免疫応答および
／または効果を高めることができる。

【０１０８】また、抗ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体は、免疫原と
して抗イディオタイプ抗体を投与することによって調製
できる。好都合なことに、上記のように調製した、抗Ｅ
Ｔ−ＮＡＮＢウイルス抗体調製物を使って、宿主動物に
抗イディオタイプ抗体を誘導する。組成物は、適当な希
釈剤に溶かして、宿主の動物に投与する。この投与（通
常は反復的投与）の後、宿主は、抗イディオタイプ抗体
を産生する。Ｆｃ領域に対する免疫応答を除去するため
に、宿主と同種の動物によって産生された抗体を使用す
るか、投与抗体のＦｃ領域を除くことができる。宿主動
物における抗イディオタイプ抗体の誘導後、血清または
血漿を除いて、抗体組成物が出来る。この組成物は、上
記のように抗イディオタイプ抗体の精製をするか、アフ
ィニティーマトリックスに結合した抗ＥＴ−ＮＡＮＢウ
イルス抗体を使ったアフィニティークロマトグラフィー
によって精製することができる。産生された抗イディオ
タイプ抗体は、本来のＥＴ−ＮＡＮＢ抗原とコンホーメ
イションが類似しており、ＥＴ−ＮＡＮＢ粒子抗原の直
接使用ではなく、ＥＴ一ＮＡＮＢワクチンを調製するの
に使用される。

【０１０９】患者に抗ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス抗体を誘
導する手段として使用する場合、ワクチン用に抗体を注
射する方法は、筋肉内、腹腔内、皮下などで同じであっ
て、アジュバントの有無にかかわらず、生理学的に適切
な希釈剤中に溶かした有効濃度で投与される。１種類ま
たは２種類以上のブースターの注射が望ましい。抗ＥＴ
−ＮＡＮＢウイルス抗体誘導の抗イディオタイプ法は、
抗ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス抗体の受動投与によって引き
起こされることがある問題、例えば、副作用の免疫応
答、および未発見ウイルスの感染といった精製血液成分
の投与との関連問題を緩和し得る。

【０１１０】さらに、この発明のＥＴ−ＮＡＮＢ由来タ
ンパクは、ウイルス暴露前または後の予防用抗血清の産
生に使用されることがある。ここでは、ＥＴ−ＮＡＮＢ
タンパクまたはタンパクの混合物が、適当なアジュバン
トとともに調剤され、ヒト抗血清の既知の産生法に従っ
て志願者に投与される。投与タンパクに対する抗体の応
答は、免疫処置に続く数週間監視されるが、これは、第
ＩＩＡ節に記した通り、血清の周期的な採取で抗ＥＴ−
ＮＡＮＢウイルス抗体の存在を検出することによって行
われる。

【０１１１】免疫処置から患者からの抗血清は、接触感
染の危険にさらされている人達への暴露前の予防的方法
として投与することができる。抗血清は、Ｂ型肝炎ウイ
ルスの暴露後の発症予防に対する高力価抗血清の使用に
類似した、ウイルス暴露後の処置にも有用である。

【０１１２】（Ｅ）モノクローナル抗体 ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス粒子およびタンパクに対する抗
体と抗イディオタイプ抗体の両者のｉｎ ｖｉｖｏ使
用、ならびに診断的使用に関して、モノクローナル抗体
の利用が好ましいことがある。免疫処置した動物の膵臓
またはリンパ球を摘出して、株化するか、当該分野の技
術者に既知の方法によってハイブリドーマを作成するた
めに利用する。ＥＴ−ＮＡＮＢウイルスに感染したこと
のあるドナー（この場合の感染は、例えば、血中の抗ウ
イルス抗体の存在またはウイルスの培養によって確認さ
れる）が、リンパ球のドナーにふさわしいことがある。
リンパ球は、抹消血液試料から分離するか、ドナーが膵
臓生検の患者であれば膵臓細胞が使用可能である。エプ
シュタイン−バー・ウイルス（ＥＢＶ）はヒトのリンパ
球を株化するのに使用でき、ヒトのリンパ球もヒト／ヒ
トハイブリドーマの作成に利用できる。ヒトのモノクロ
ーナル抗体の産生には、まず、ペプチドによるｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの免疫処置が行われる。

【０１１３】株化細胞によって分泌される抗体をスクリ
ーニングして、目的の特異性をもつ抗体を分泌するクロ
ーンを捜し出す。モノクローナルの抗ウイルス粒子抗体
の場合には、抗体をＥＴ−ＮＡＮＢウイルス粒子に結合
させねばならない。目的の特異性抗体を産生する細胞を
選択する。

【０１１４】以下の実施例は、この発明の様々な局面を
説明するものであるが、その請求の範囲を限定させる意
図はない。

【０１１５】

【実施例】（材料）以下の実施例で用いられた材料は、
次の通りである。

【０１１６】酵素：ＤＮアーゼおよびアルカリフォスフ
ァターゼは、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＢＭＢ，インジアナポリ
ス，ＩＮ）から；ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＩメチラーゼ、
ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩは、Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ，ベルリ
ー，ＭＡ）から；またＲＮアーゼＡは、Ｓｉｇｍａ（セ
ントルイス，ＭＯ）から、それぞれ入手した。

【０１１７】その他試薬：ＥｃｏＲＩリンカーは、ＮＥ
Ｂから；またニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、
５−ブロム−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣ
ＩＰ）、５−ブロム−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）およびイソプ
ロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
は、Ｓｉｇｍａから、それぞれ入手した。

【０１１８】ｃＤＮＡ合成用キットおよびランダムプラ
イミング標識用キットは、Ｂｏｅｈｒｉｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＢＭＢ，インジ
アナポリス，ＩＮ）から入手できる。

【０１１９】（実施例１） ｃＤＮＡライブラリーの調製 （Ａ）ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス源 便中の２７−３４ｎｍのウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）
が、ＥＴ−ＮＡＮＢ患者から得た免疫血清に結合するこ
とで明らかではあるが、便がＥＴ−ＮＡＮＢに陽性の、
ビルマでの症例から分離されたＥＴ−ＮＡＮＢウイルス
株に感染した第二継代のカニクイザル（ｃｙｎｏ ＃３
７）から得た便プールの１０％浮遊液を２匹のカニクイ
ザルに静注した。この動物では、免疫後２４−３６日の
間に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＴ）レベルが上
昇し、１匹は、感染の前急性期に、胆汁中に２７−３４
ｎｍのＶＬＰｓを排泄した。

【０１２０】それぞれの感染動物の胆管にカニューレを
挿入し、毎日１−３ｃｃの胆汁を集めた。ＲＮＡは、標
準的なＲＮＡ分離法を用い、ホットフェノール抽出によ
って、１例の胆汁（ｃｙｎｏ ＃１２１）から抽出し
た。二本鎖ｃＤＮＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ（インジアナポリス，ＩＮ）から入手したｃ
ＤＮＡ合成用キットを用いて、１本鎖のランダムプライ
ミングにより、分離したＲＮＡから生成した。

【０１２１】（Ｂ）２本鎖断片のクローニング ２本鎖ｃＤＮＡ断片は、標準的条件下（マニアチス、
ｐ．１１８）にてＴ４ＤＡＮポリメラーゼで平滑末端と
し、フェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノール
で沈澱させた。平滑末端としたｃＤＮＡを標準的条件下
（マニアチス、ｐｐ．３９６−３９７）にてＥｃｏＲＩ
リンカーで連結させ、リンカーの余分な末端を除去する
ため、ＥｃｏＲＩで消化した。非連結性リンカーは、イ
ソプロパノール沈澱を繰り返すことによって、除去し
た。λｇｔ１０ファージベクター（Ｈｕｙｎｈ）は、Ｐ
ｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ（マジソン，Ｗ１）から入
手した。このクローニングベクターは、ファージｃＩレ
プレッサー遺伝子に、ユニークなＥｃｏＲＩクローニン
グ部位を有している。上記のｃＤＮＡ断片は、０．５−
１．０ｕｇのＥｃｏＲＩ消化のｇｔｌ０，０．５−３μ
ｌの上記２本鎖断片、０．５μｌの１０Ｘ連結反応用バ
ッファー、０．５．μｌのリガーゼ（２００単位）、お
よび蒸留水を混合（５μｌ）して、ＥｃｏＲＩ部位に導
入した。混合物は、１４℃にて一晩インキュベートし、
次いで標準法（マニアチス、ｐｐ．２５６−２６８）に
従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングした。

【０１２２】パッケージ層は、ＨＧ４１５株などの大腸
菌ｈｆ１株を感染させるために用いた。また、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ（マジソン，ＷＩ）から入手でき
る大腸菌のＣ６００ｈｆ１株を用いることができた。Ｅ
ｃｏＲＩ末端消化断片の挿入によって得られた組替え型
プラークの割合は、ランダムな２０個のプラークを解析
したところ、５％に満たなかった。

【０１２３】その結果得られたｃＤＮＡライブラリーを
プレートにまき、溶出用バッファーを添加して、選択プ
レートからファージを溶出した。ファージからＤＮＡを
抽出した後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、ヘテロ挿
入片を放出させ、ＤＮＡ断片をアガロースでフラクショ
ン化して、ファージ断片を除いた。５００−４０００個
の塩基対挿入片が分離され、上記のλｇｔｌ０の中に再
クローン化し、パッケージングしたファージを大腸菌株
ＨＧ４１５の感染に用いた。組替えが成功する割合は、
９５％を越えていた。約５０００プラーク／プレートに
て、全部で８枚のプレートを用い、ファージライブラリ
ーを大腸菌株ＨＧ４１５でプレート培養した。

【０１２４】（実施例２） ＥＴ−ＮＡＮＢクローン化断片の選択 （Ａ）ｃＤＮＡプローブ 非感染およびＥＴ−ＮＡＮＢ感染のカニクイザル由来の
２本鎖ｃＤＮＡ断片を、実施例１と同様に調製した。ｃ
ＤＮＡ断片に、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ（インジアナポリス，ＩＮ）社製のランダムプライミ
ング標識用キットを用いて、ランダムプライミングによ
る放射能標識を行った。

【０１２５】（Ｂ）クローンの選択 実施例１でプレート培養したｃＤＮＡライブラリーを２
個のニトロセルロースフィルターのそれぞれに移植し、
標準的方法（マニアチス、ｐｐ．３２０−３２３）に従
って、加熱によりファージＤＮＡをフィルターに固定し
た。２つのフィルターは、感染源または上記のようにし
て得られた対照のｃＤＮＡプローブのどちらかとハイブ
リダイゼーションを行った。フィルターのオートラジオ
グラフで、感染源のみに由来する（すなわち、非感染源
から得たｃＤＮＡプローブとは、ハイブリダイゼーショ
ンしなかった）、放射能標識ｃＤＮＡプローブとハイブ
リダイゼーションしたライブラリークローンを同定する
試験を行った。このような削減的選択法で、全部で約４
００００個の試験したクローンのうち、そのようなクロ
ーンは１６個同定された。

【０１２６】１６個のクローンはどれも、寒天プレート
上で低濃度にて選択し、プレートにて再培養した。それ
ぞれのプレート上のクローンは、２系列でニトロセルロ
ースに移し、上記のように、感染および非感染源の放射
能標識ｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション試
験を行った。クローンは、感染源プローブと選択的に結
合するものを選んだ（すなわち、感染源プローブと結合
し、実質上非感染源プローブとは結合しないもの）。感
染源プローブに選択的に結合するクローンのうちの一つ
を、さらに研究を進めるために、分離した。選択したベ
クターは、図１に示した、λｇｔｌ０−１．１と同定さ
れた。

【０１２７】（実施例３） ＥＴ−ＮＡＮＢの配列 実施例２のクローン、λｇｔ１０−１．１で、ヘテロ挿
入片を除くため、ＥｃｏＲＩ消化を行い、ベクー断片か
らゲル電気泳動によって分離した。電気泳動での断片の
泳動度は、１．３３ｋｂ断片と一致していた。この断片
は、ＥｃｏＲＩ末端を含み、ｐＴＺ−ＫＦ１ベクターの
ＥｃｏＲＩ部位に入り込んでいたが、その構造と性質
は、１９８７年１１月２５日に提出された共有の米国特
許出願第１２５６５０号「クローニングベクター系およ
びユニークなクローンの同定」に記載されている。要約
すると、図１に図解したとおり、このプラスミドにはユ
ニークなＥｃｏＲＩ部位が含まれ、隣にはＴ７ポリメラ
ーゼプロモーター部位およびプラスミドならびにファー
ジの複製開始点がある。ＥｃｏＲＩ部位の両側の隣接配
列がわかっている。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョラ，
ＣＡ）から入手した大腸菌ＢＢ４は、プラスミドで形質
転換した。

【０１２８】放射能標識したＥＴ−ＮＡＮＢプローブ
は、実施例２でのλｇｔｌ０−１．１ファージから１．
３３ｋｂ挿入片を切り出し、ゲル電気泳動で断片を分離
し、上記のようにランダムに標識することによって調製
した。上記のｐＴＺ−ＫＦ１でトランスフェクションさ
せた。目的のＥＴ−ＮＡＮＢ挿入片を有する細菌を、実
施例２に概要を示した方法に従って、レプリカ法および
放射能標識ＥＴ−ＮＡＮＢプローブとのハイブリダイゼ
ーションによって選択した。

【０１２９】組換えに成功した１個の細菌コロニーを、
１．３３ｋｂ挿入片の一部の配列決定に用いた。この分
離菌は、ｐＴＺ−ＫＦ１と命名され（ＥＴ１．１）、ア
メリカ基準培養コレクションに寄託されており、ＡＴＣ
Ｃ寄託第６７７１７号である。標準的なジデオキシ法で
ＥｃｏＲＩ部位の側面にある配列のプライマーを用い
て、挿入片の５’末端領域および３’末端領域から約２
００−２５０個の塩基対を得た。配列は、第ＩＩ節に示
してある。同じ技法を用いて後のほうの配列を決定する
ことによって、両方向の配列が完全に分かった。

【０１３０】（実施例４） ＥＴ−ＮＡＮＢ配列の決定 非感染およびＥＴ−ＮＡＮＢ感染したカニクイザルの胆
汁から得られたｃＤＮＡ断片混合物は、上記のようにし
て調製した。ヒト便検体から得られたｃＤＮＡ断片は、
以下のようにして調製した。ＥＴ−ＮＡＮＢが突発した
結果、ＥＴ−ＮＡＮＢ感染と診断されたあるメキシコ人
から得た１０％便浮遊液３０ｍｌ、および健康な非感染
者から得た同容量の便を、３０％ショ糖の密度勾配法に
かけ、ＳＷ２７ローターで１５℃にて２５０００ｘｇで
６時間遠心した。感染体から得た便での沈澱物には、感
染便検体でのＥＴ−ＮＡＮＢ感染に特徴的な２７−３４
ｎｍのＶＬＰ粒子が含まれていた。感染および非感染の
両検体のショ糖勾配ペレットからＲＮＡが分離された
が、分離したＲＮＡは、実施例１に述べたｃＤＮＡ断片
の作成に用いた。

【０１３１】感染および非感染の胆汁、また感染および
非感染のヒトの便を起源として得られたｃＤＮＡ断片混
合物はそれぞれ、１９８８年６月１７日出願の「ＤＮＡ
の展開および削減法」という共有の特許出願第０７／２
０８５１２号に記載された、新しいリンカー／プライマ
ー複製法によって展開させた。要約すると、各検体中の
断片は、ＤＮＡポリメラーゼＩで平滑末端とし、次いで
フェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈
澱させた。平滑末端とした物質は、以下の配列を有する
リンカーで連結した。

【０１３２】 ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３’ ３’−ＴＴＣＣＴＴＡＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣ−
５’。

【０１３３】２量体リンカーを除くため、２本鎖断片を
ＮｒｕＩで消化し、５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣ
ＧＣＴＣＧ−３’を有するプライマーと混合した後、熱
変成させ、単鎖ＤＮＡ／プライマー複合体にするため
に、室温まで冷却した。その複合体は複製され、サーマ
スアクアティクス（Ｔｈｅｒｍｙｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ， Ｔａｑ）ポリメラーゼおよび４つの全デオキシヌ
クレオチドを添加することによって、２本鎖断片を形成
した。連続的な鎖の変成を含めた複製過程、鎖／プライ
マー複合体の形成および複製を、２５回繰返した。

【０１３４】展開したｃＤＮＡ配列は、２％アガロース
基質を用いて、アガロースゲル電気泳動によって分画し
た。ＤＮＡ断片をアガロースゲルからニトロセルロース
紙に移した後、（ｉ）上記のようにして得たｐＴＺ−Ｋ
Ｆ１（ＥＴ１．１）プラスミドをＥｃｏＲＩで処理す
る、（ｉｉ）遊離した１．３３ｋｂ ＥＴ−ＮＡＮＢ断
片を分離する、および（ｉｉｉ）分離した断片をランダ
ムに標識することによって、ランダムに標識された³²Ｐ
プローブにフィルターをハイブリダイゼーションした。
プローブのハイブリダイゼーションは、簡便なサザン法
（マニアチス、ｐｐ．３８２−３８９）で行った。図２
に、感染（Ｉ）ならびに非感染体（Ｎ）の胆汁（２
Ａ）、および感染（Ｉ）ならびに非感染体（Ｎ）のヒト
便（２Ｂ）由来の、ｃＤＮＡｓで得たハイブリダイゼー
ションパターンを示す。明らかに、ＥＴ−ＮＡＮＢプロ
ーブは、両感染体から得た断片とハイブリダイゼーショ
ンしたが、非感染体から得た配列にはどちらも、同等の
ことは見られなかったため、誘導された配列の特異性が
確かめられた。

【０１３５】放射能標識した１．３３ｋｂ断片と、ヒト
およびカニクイザルの両ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ断片
とのサザン法ブロットを調製した。プローブのハイブリ
ダイゼーションが、どちらのゲノム断片混合物へも見ら
れなかったことから、ＥＴ−ＮＡＮＢ配列は、ヒトまた
はカニクイザルのゲノムのどちらでも、外因性のもので
あることが確認された。

【０１３６】（実施例５） ＥＴ−ＮＡＮＢタンパクの発現 （Ａ）ＥＴ−ＮＡＮＢコード配列の調製 実施例２で得たｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）プラスミ
ドは、ゲル電気泳動で直線化したプラスミドから精製し
た、１．３３ｋｂ ＥＴ−ＮＡＮＢ挿入片を除くため、
ＥｃｏＲＩで消化した。精製した断片は、標準的な消化
用バッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ， ｐＨ
７．５； １ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ；１０ｍＭ ＭｎＣｌ
₂）中に、濃度約１ｍｇ／ｍｌになるように浮遊させ、
ＤＮアーゼＩで室温にて約５分間消化した。これら反応
条件は、予め行っておいた較正試験から決定したが、そ
こでは１００−３００塩基対からなる断片の生成に要す
るインキュベート時間を決定した。その物質は、エタノ
ールで沈澱させる前に、フェノール／クロロフォルムで
抽出した。

【０１３７】消化混合物中の断片は、実施例１と同様
に、平滑末端になっており、ＥｃｏＲＩとリガンドを形
成していた。その他断片は、ＰｈｉＸ１７４／ＨａｅＩ
ＩＩおよびラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩのサイズマーカーを
用いて、１．２％アガロースゲル上での電気泳動（５−
１０Ｖ／ｃｍ）で解析した。１００−３００ｂｐの分画
がＮＡ４５ストリップに溶出したが（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒとＳｃｈｕｅｌｌ）、その後これを溶出用溶液（１
Ｍ ＮａＣ１， ５０ｍＭアルギニン、ｐＨ９．０）の
入った１．５ｍｌの小管中に移し、６７℃にて３０−６
０分間インキュベートした。溶出してきたＤＮＡは、フ
ェノール／クロロフォルムで抽出した後、２倍量のエタ
ノールで沈澱させた。沈澱物は、２０μｌＴＥ（０．０
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．００１Ｍ
ＥＤＴＡ）中に再浮遊させた。

【０１３８】（Ｂ）発現ベクター中でのクローニング λｇｔ１１ファージベクター（Ｈｕｙｎｙ）は、Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ（マジソン，Ｗ１）から入手し
た。このクローニングベクターは、β−ガラクトシダー
ゼ翻訳末端コドンから５３塩基対上方に、ユニークなＥ
ｃｏＲＩクローニング部位を有する。それから得たゲノ
ム断片を、０．５−１．０μｇのＥｃｏＲＩで開裂され
たｇｔ１１，０．３−３μｌの上記サイズの断片、０．
５μｌの１０Ｘ連結反応用バッファー（上記）、０．５
μｌリガーゼ（２００単位）、および蒸留水を混合（５
ｍｌ）することによって、ＥｃｏＲＩ部位に導入した。
混合物は１４℃にて一晩インキュベートした後、標準的
方法（マニアチス、ｐｐ．２５６−２６８）に従って、
ｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージ化した。

【０１３９】パッケージングファージは、ＤＮＡＸ（パ
ロアルト，ＣＡ）のＫｅｖｉｎ Ｍｏｏｒｅ博士から譲
渡された、大腸菌株ＫＭ３９２の感染に用いた。また、
アメリカ基準培養コレクション（ＡＴＣＣ ＃３７１９
７）から入手可能なＥ．Ｃｏｌｉ株Ｙｌ０９０を使用で
きた。感染菌は、プレート培養し、その結果得られたコ
ロニーで、標準的Ｘ−ｇａｌ基質プラーク測定法（マニ
アチス）を用いてＸ−ｇａｌ存在下でのβ−ガラクトシ
ダーゼ活性の消失（明瞭なプラーク）をチェックした。
約５０％のファージプラークで、β−ガラクトシダーゼ
の酵素活性の消失が見られた（組換型）。

【０１４０】（Ｃ）ＥＴ−ＮＡＮＢ組換型タンパクのス
クリーニング メキシコ、ボルネオ、パキスタン、ソマリア、およびビ
ルマで突発的に発生したＥＴ−ＮＡＮＢによって感染し
た患者から、ＥＴ−ＮＡＮＢの回復期の抗血清を得た。
その血清は、別のＥＴ−ＮＡＮＢ肝炎患者の数人からそ
れぞれ得られた便検体中のＶＬＰｓと、免疫反応性を示
した。

【０１４１】約１０⁴ｐｆｕの上記ファージストックに
感染した大腸菌ＫＭ３９２細胞のクローンを、１５０ｍ
ｍプレート上で調製し、倒置させて、３７℃にて５−８
時間インキュベートした。クローンをニトロセルロース
シートで覆うことによって、発現したＥＴ−ＮＡＮＢの
組換型タンパクをプラークから紙に移した。相当するプ
レートおよびフィルターの位置を合わせるため、プレー
トとフィルターに指標を付けた。フィルターは、ＴＢＳ
Ｔバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０；１０
５ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で２
度洗浄し、ＡＩＢ（１％ゼラチンを含むＴＢＳＴバッフ
ァー）で阻害し、ＴＢＳＴで再洗浄し、抗血清（ＡＩＢ
で１：５０に希釈して、１２−１５ｍｌプレート）を添
加して、一晩インキュベートした。シートをＴＢＳＴで
２度洗浄した後、フィルター中の抗血清によって認識さ
れた抗原を含む部位に標識した抗体を付けるため、酵素
標識した抗ヒト抗体と接触させた。最終洗浄した後、５
ｍｌのアルカリフォスファターゼバッファー（１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ９．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５
ｍＭ ＭｇＣｌ₂、）中で、１６μｌＢＣＩＰ（５℃に
保った、５０ｍｇ／ｍｌストック用溶液）と混合した、
３３μｌＮＴＢ（５℃に保った、５０ｍｇ／ｍｌストッ
ク用溶液）を含む基質培地中で、フィルターを展開し
た。抗血清を確認すると、抗原生成部位が紫色を呈し
た。

【０１４２】（Ｄ）スクリーニング用プレート培養 前段階で決定した抗原生成領域を、径８２ｍｍのプレー
ト上で約１００−２００ｐｆｕにて再びプレート培養し
た。ＥＴ−ＮＡＮＢ抗体と反応できる抗原を分泌するフ
ァージをプラークから精製するため、５−８時間のイン
キュベーションに始まって、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ展開を経
る、上記の諸段階を繰り返し行った。同定されたプラー
クを、ファージ用バッファーで選択的に溶出した（マニ
アチス、ｐ．４４３）。

【０１４３】（Ｅ）エピトープの同定 実施例２で、本来的ｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ１．１）プラ
スミドから誘導された一連のサブクローンを、上に述べ
た方法と同じ方法を用いて分離した。これら５つのサブ
クローンは、それぞれ（Ｃ）の抗−ＥＴ抗血清プールと
免疫反応性を有していた。そのサブクローンには、以前
述べた「逆方向」配列からの短い配列が含まれていた。
サブクローン中の配列の開始点および終了点（完全な逆
方向配列に相対的）は以下の表のように同定された。

【０１４４】

【表２】

【０１４５】表２で同定された全遺伝子配列には、エピ
トープをコードする配列が含まれるはずなので、エピト
ープのコード用配列は、５９４番目のヌクレオチド
（５’末端）と６４３番目のヌクレオチド（３’末端）
間の領域に入り込んでいることは明らかである。従っ
て、この比較的短い配列に長さが等しくて相補的な遺伝
子配列は、このコード化領域を用いて生成されたペプチ
ドと同様に、この発明の様々な態様に特に好ましい。全
く異なったエピトープを同定する、２番目の一連のクロ
ーンが、メキシコ人の一血清で単離された。

【０１４６】

【表３】

【０１４７】このエピトープのコード体系は、２番目の
ヌクレオチド（５’−末端）と１０１番目のヌクレオチ
ド（３’−末端）の間に入り込んでいる。従って、この
コード化領域を用いて生成したペプチドと同様に、この
短い配列に関する遺伝子配列も好ましいものである。発
明は、特別な実施例、方法、構成体および使用法に関し
て記載されたが、当該分野の技術者には、この発明逸脱
することなく、種々の変化および修飾を行うことができ
よう。

【０１４８】

【発明の効果】本発明により、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルス
因子由来のウイルスタンパクおよびその断片からなる新
規の組成物、ならびに該組成物の調製法および使用法が
提供される。ＥＴ−ＮＡＮＢウイルスタンパクの調製法
は、ＥＴ−ＮＡＮＢゲノム配列の同定を含み、それに続
いて、クローニングおよび宿主細胞注での発現が行われ
る。その結果得られた組換型ウイルスタンパクは、診断
薬およびワクチンとして使用される。ゲノム配列および
その断片は、ＥＴ−ＮＡＮＢウイルスタンパクの調製
に、およびウイルスの検出プローブとして使用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】クローニングＥＴ−ＮＡＮＢ断片を得て配列決
定をする際に使われるベクター構成体および操作を示す
図である。

【図２】図２Ａ〜２Ｂは、感染（Ｉ）した胆汁源（２
Ａ）および非感染（Ｎ）の胆汁源（２Ａ）、ならびに感
染（Ｉ）した便試料源（２Ｂ）および非感染（Ｎ）の便
試料源（２Ｂ）から分離したＲＮＡより調製した増幅ｃ
ＤＮＡ断片と放射能標識ＥＴ−ＮＡＮＢをハイブリドさ
せたときのサザン法による展開図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 398029728 アメリカ合衆国 アメリカ合衆国 メリーランド 20852, ロックビル，スイート326，エグゼキュー ティブ ブールバード6011，オフィス オ ブ テクノロジー トランスファー (72)発明者 ダニエル ダブリュ． ブラッドレー アメリカ合衆国， ジョージア 30244, ローレンスビル， ケリー コート 2938 (72)発明者 グレゴリー アール． レイズ アメリカ合衆国， カリフォルニア 94303， パロアルト， セント フラン セス ドライブ 2112 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 BA33 CA04 EA03 HA14 4H045 AA10 CA02 DA86 EA31 EA53 FA74

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＡＴＣＣ寄託第６７７１７号の大腸菌Ｂ
   Ｂ４株に担持されるプラスミドｐＴＺ−ＫＦ１（ＥＴ
   １．１）中に存在する１．３３ｋｂ ＤＮＡのＥｃｏＲ
   Ｉ挿入片に相同な領域を含むゲノムを有する腸管伝播性
   非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス因子に由来するタンパク。