KR0180530B1 - 장을 통해 감염되는 비-a형/비-b형 간염 바이러스 병원체 - Google Patents

장을 통해 감염되는 비-a형/비-b형 간염 바이러스 병원체 Download PDF

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Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]
장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 간염 바이러스 병원체
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 재조합 단백질, 유전자 및 유전자 프로브, 특히 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 간염 바이러스 병원체로부터 유래한 단백질과 프로브에 관한 것이고, 상기 단백질과 프로브를 이용한 진단 방법 및 백신 응용에 관한 것이다.
[배경]
장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형(ET-NANB) 간염 바이러스 병원체는 아시아, 아프리카 및 인도 아대륙내에서 여러 전염성 및 산발성 증세로 나타나는 간염의 원인이다. 비록 간염 바이러스가 가까운 신체적 접촉에 의해 전파될 수도 있지만, 일반적으로 감염은 배설물로 오염된 물에 의해 전염된다. 이 바이러스는 만성 감염을 발생시키지는 않는다. ET-NANB 바이러스성 병인은 배설물의 분리물로 피험자를 감염시켜서 입증되었는데, 면역 전자 현미경(IEM)은 감염된 객체의 대변내에 지름이 27내지 34㎜인 바이러스가 있음을 보여준다. 이 바이러스는 지리적으로 격리된 지역의 감염된 객체들의 혈청내의 항체와 반응하여, 단일의 바이러스 병원체 또는 바이러스 군이 전세계적으로 관찰되는 대부분의 ET-NANB 간염의 원인임을 암시한다. 이 항체반응은 혈액으로 전염되는 NANB 바이러스로 감염된 객체의 혈청에서는 관찰되지 않으며, 이것은 두가지 NANB형 사이에 다른 특성이 있음을 나타내고 있다.
혈청학적 차이 이외에도 두가지 NANB형 감염은 다른 임상적인 차이를 나타낸다. ET-NANB는 급성 감염을 특징으로 하는데, 종종 이 급성 감염은 열 및 관절통, 및 문맥 염증과 관련되고, 간생검 시료내의 담즙울체와도 관련 있다(Arankalle). 이러한 증상들은 보통 6주내에 사라진다. 대조적으로 혈액으로 전염되는 NANB는 병세를 가진 사람 중 약 50%에서 만성 감염으로 발전한다. 여기에서는 열과 관절통은 거의 나타나지 않고, 염증은 주로 연조직에 분포한다(Khuroo, 1980). 이러한 두가지 바이러스 병원체는 영장류 숙주의 감수성을 기준으로 구별될 수 있다. ET-NANB는 시노몰거스 원숭이에게 감염될수 있지만 혈액으로 감염되는 병원체는 감염되지 않는다.
혈액으로 감염되는 병원체는 ET-NANB 보다 침팬지에게 쉽게 감염된다(Bradley, 1987).
ET-NANB 간염과 연관된 바이러스 게놈 서열을 확인하고 클론하려는 많은 노력들이 전세계적으로 있었다. 바이러스 특이적인 게놈 서열을 요구하는 이러한 노력의 한가지 목적은 상기 바이러스의 특성과 이것의 단백질 생성물을 확인하고 특성화하는 것이다. 또 다른 목적은 항체를 기초로 하는 진단 과정과 백신에 사용할 수 있는 재조합 바이러스 단백질을 제조하는데에 있다. 이러한 노력에도 불구하고, 지금까지 ET-NANB 간염과 연관된 바이러스의 게놈 서열은 성공적으로 확인되거나 클론되지 않았으며, 어떠한 바이러스 특이적인 단백질도 확인되거나 제조되지 않았다.
[참고 문헌]
Arankalle, V.A. 외, The Lancet, 550(1988. 3. 12).
Bradley, D.W. 외, J Gen. Virol., 69:1(1988).
Bradley, D.W. 외, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84:6277(1987).
Gravelle. C.R. 외, J. Infect, Disease, 131:167(1975).
Kane, M.A. 외, JAMA, 252:3140(1984).
Khuroo, M.S., Am. J. Med., 48:818(1980)
Khuroo, M.S. 외, Am. J. Med., 68:818(1983).
Maniatis, T. 외, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1982).
Seto, B. 외, Lancet, 11:941(1984).
Sreenivasan, M.A. m 외, J. Gen. Virol., 65:1005(1984).
Tabor, E. 외, J. Infect. Dis., 140:789(1979).
[본 발명의 요약]
ET-NANB의 바이러스 병원체로부터 유래한 바이러스 단백질 및 이들의 단편들을 포함하는 신규의 조성물 뿐만 아니라 상기 조성물의 제조방법 및 용도를 제공한다. ET-NANB 바이러스 단백질의 제조 방법은 숙주세포에서 클론되고 발현되는 ET-NANB 게놈 서열의 단리과정을 포함한다. 생성된 재조합 바이러스 단백질은 진단시약 및 백신으로서 사용된다. 유전자 서열과 이들의 단편은 ET-NANB 바이러스 단백질 제조에 사용되고 바이러스 검출을 위한 프로브로서 사용된다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 클론된 ET-NANB 단편을 수득하고 서열화하는데 사용된 벡터의 구성과 조작과정을 나타내고,
제2a도 내지 제2b도는 서던 블롯(Southern bolts)을 나타내는 도면으로서 방사능 표지된 ET-NANB 프로브가 감염(I) 및 비감염(N) 담즙원(2A)과 감염(I) 및 비감염(N) 대변시료원(2B)으로부터 분리한 RNA에서 제조된 증폭 cDNA 단편과 하이브리드되는 것을 나타낸다.
[특정 구체예에 대한 설명]
ET-NANB 바이러스 병원체로부터 유래한 유전자 서열 및 이들의 단편을 포함하는 신규의 조성물과 상기 게놈 서열을 이용하여 제조된 재조합 바이러스 단백질이 제공되며, 이들 조성물을 이용하는 방법도 제공된다.
ET-NANB 바이러스 병원체의 게놈은, E, coli 균주 BB4에서 운반되며, ATCC 기탁번호 67717을 갖는 플라스미드 pTZ-KF1(ET1,1)내에 존재하는 1.33Kb DNA EcoRI 삽입물과 상동인 영역을 포함하는 것으로 확인된다.
초기 연구는 삽입물의 양말단 영역과 중간 영역을 서열화하였다. 이 삽입물의 5'-말단 영역은 다음과 같은 서열을 갖는다 :
중간 영역은 하기의 서열을 갖는다 :
3' 말단 영역은 하기의 서열을 갖는다 :
추가의 작업은 아래에 기재된 것과 같이 양 방향의 전체 서열을 제공한다. 유전자가 어느 가닥에 위치해 있는지 알려져 있지 않기 때문에 양쪽 가닥의 서열이 제공된다. 그러나, 공지된 단백질에 대한 통계적 유사성 때문에 한쪽 방향의 서열을 전방 서열(forward sequence)로 명명한다. 이러한 서열을 3가지 가능한 번역 서열과 함께 아래에 기재하였다. 하기의 서열에는 뉴클레오티드 145에서 이소류신으로 시작되고, 서열의 말단으로 연장되는 하나의 긴 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 있다. 두 개의 다른 리딩 프레임은 많은 종결 코돈을 가지고 있다. 누클레오티드와 아미노산의 표준 약어는 본원 명세서 전반에 걸쳐 사용된다.
[전방서열]
하기에서는 후방 서열(reverse sequence)로서 언급되는 상보적 가닥을 상기 전방 서열과 같은 방법으로 아래에 기재하였다. 전방서열에서 발견되는 긴 오픈리딩프레임 보다 짧은 여러개의 오픈리딩프레임이 이러한 후방서열에서 발견될 수 있다.
[후방서열]
상기 서열과 병원체에서의 서열의 동일성은 버마 환자에서 분리한 바이러스 균주의 대응하는 서열을 위치시킴으로써 확인되었다. 버마형 분리 균주는 다음의 누클레오티드 서열을 가지고 있다.
[비-A형 비-B형 ET:버마 균주]
다른 NANB 간염 균주로부터 유전물질을 분리하여 확인하기 위한, 본원에 기재된 방법의 능력은 멕시코 균주로부터 분리된 유전물질을 확인함으로써 확인되었다. 상기 분리물의 서열은 상기 기재된 ET1.1 서열과 약 75%가 동일하다. 상기 서열은 II.B 절에 기재된 조건을 사용한 하이브리드에 의해 확인되었다. 1661개의 누클레오티드로 구성된 부분적인 cDNA 서열을 다음에 기재하였다.
[비-A형 비-B형 ET:멕시코 균주]
버마 균주와 맥시코 균주를 비교했을 때, 멕시코 균주의 누클레오티드 13과 버마 균주의 누클레오티드 331에서 시작되는 1372 누클레오티드 중복에서 76.7%의 동일성이 발견되었다. 최종 2개의 서열 각각이, 제시된 주요 서열과 상보적인 DNA 서열 모두에 상응하는 RNA 서열 뿐만 아니라 상응하는 상보적인 DNA 서열을 교시하고 있음은 분자유전학 분야의 당업자라면 인지할 것이다. 추가로, 펩티드를 코드화하는 오픈리딩프레임이 존재하고, 발현가능한 펩티드는 그 아미노산 서열을 명시적으로 설명하지 않더라도. 앞서 ET1.1 서열로 아미노산 서열이 명시적으로 설명된 것과 같은 방식으로 상기 누클레오티드 서열에 의해 개시되고 있다.
[발명의 상세한 설명]
1. 정의
아래에 정의된 항들은 다음과 같은 뜻을 갖는다 :
1. 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형(ET-NANB)형 간염 바이러스 병원체는 (i) 수인성 질병, 전염성 간염의 원인이 되고, (ii) 시노몰거스 원숭이를 전염시킬 수 있고, (iii) 혈청학적으로 A형 간염 바이러스(HAV)와 B형 간염 바이러스(HAB)와는 구별되고, (iv)ATCC 기탁번호 67717인 E. coli 세포주 BB4에서 운반되는 플라스미드 pTZ-KF1(ET1.1)에 존재하는 1.33Kb cDNA 삽입물과 상동인 게놈 부분을 포함한다.
2. 하이브리드된 가닥들이 최대 약 25내지 30%의 염기쌍 불일치를 함유하는 하이드리드화 조건하에서, 두 개의 핵산 단편이 서로 하이브리드될 수 있으면 이들은 동종이다. 일반적으로, 만일, 두 개의 단일가닥 핵산종을 다음 문헌［Maniatis et al., op. cit., pp. 320~323］에 기재된 조건하에서, 다음의 세척 조건 ［2×SCC, 0.1% SDS,상온-2회 각각, 30분; 다음 2×SCC, 0.1% SDS, 50℃-1회, 30분; 다음 2×SCC, 상온-2회, 각각 10분］을 사용하여 하이브리드시키면 이들은 동종일 것이다. 동종의 핵산 가닥은 15 내지 25% 염기쌍 불일치를 함유하는 것이 바람직하며, 5내지 15%의 염기쌍 불일치를 가지고 있으면 더욱 바람직하다. 이러한 상동성의 정도는 당분야에 공지된 바와 같이, 유전자 라이브러리(또는 다른 유전물질원)로부터 클론의 확인을 위한 보다 엄격한 세척조건을 사용하여 선택될 수 있다.
3. DNA 단편이 바이러스 병원체 게놈의 영역과 동일하거나 실질적으로 동일한 염기쌍 서열을 가지고 있으면, DNA 단편은 ET-NANB 바이러스 병원체로부터 유래한 것 이다.
4. 단백질이 ET-NANB 바이러스 병원체로부터 유래한 DNA 또는 RNA 단편의 오픈리딩프레임에 의해 코드화되는 경우, 단백질은 ET-NANB 바이러스 병원체로부터 유래한 것이다.
II. 클론된 ET-NANB 단편의 제조
본 발명의 한 태양에 따라, 바이러스 특이적인 DNA 클론은(a) 공지된 ET-NANB 감염을 갖는 시노몰거스 원숭이의 담즙으로부터 RNA를 분리하는 단계, (b) 단편 라이브러리를 형성하기 위해 cDNA 단편을 클론하는 단계, (c) 방사선 표지된 cDNA 에 대한 차별적인 하이브리드화에 의해 감염 및 비-감염된 담즙원으로부터 상기 라이브러리를 선별하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
A. cDNA 단편 혼합물
시노몰거스 원숭이에서의 ET-NANB 감염은 27내지 34㎚ ET-NANB 바이러스 (평균직경 32㎚)에 대해 양성인 인분의 10% w/v 현탁액을 정맥내로 원숭이에 접종하여 시작된다. 감염된 동물은 간염 감염을 나타내는 알라닌 아미노 전이효소의 상승된 수준에 대해 모니터된다. ET-NANB 감염은 공지된 방법(Gravelle)에 따라서, 혈청 반응 양성의 항체를 바이러스 유사 입자(VLPs)에 면역특이적으로 결합시켜 확인된다. 간략하게, 감염 3-4주 후 감염된 동물로부터 채취한 변(또는 담즙)시료를 인산염-완충 식염수로 1 : 10으로 묽히고, 10% 현탁액을 저속으로 원심분리하고 1.2 및 0.45 미크론 필터로 연속적으로 여과하여 청징시킨다. 또한, 이 재료는 30% 수크로오스 쿠션(Bradley)을 통한 펠렛팅에 의해 추가로 정제시킬 수도 있다. 생성된 VLPs를 공지된 ET-NANB 감염된 환자로부터 얻은 희석된 혈청과 혼합시킨다. 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 이 혼합물을 하룻밤 동안 원심분리하여 면역응집물을 펠렛화하고, 이것을 착색시켜 VLPs에 결합된 항체를 전자현미경으로 검사한다.
ET-NANB 감염은 VLP 양성 철청변환시켜 확인될 수도 있다. 여기에서 감염동물의 혈청을 감염 환자의 변에서 분리한 27 내지 34㎚ VLPs 와 상기와 같이 혼합시켜 VLPs에 결합된 항체를 면역전자 현미경으로 검사한다. 담즙은 담관의 캐뉼러 삽입과 담즙액의 수집에 의하거나, 부검할 동안 담관의 배수에 의해 ET-NANB 양성 동물로부터 수집될 수 있다. 전체 RNA 는 실시에 1A에서 약술된 바와 같이 고온 페놀 추출에 의해 담즙으로부터 추출한다. RNA 단편들은 실시예 1A에서와 같이, 무작위 프라이밍에 의해,상응하는 이중사슬 cDNA 단편을 합성하는 데에 사용된다. 원하는 크기의 단편군, 즉 500내지 4,000 염기쌍 단편을 얻기 위해서 cDNA 단편은 겔전기 영동법 또는 밀도 차등 원심분리에 의해 분리될 수 있다.
비록 변시료에서 수득된 VLP와 같은 바이러스 재료원이 cDNA 분획을 생산하는데 사용될 수도 있지만, 담즙원이 바람직하다. 본 발명의 한 태양에 따르면, ET-NANB로 감염된 원숭이의 담즙이 변시료에서 분리된 물질보다 휠씬 많은 무손상 바이러스입자를 가지고 있음이 면역전자 현미경에 의해 판명됨을 보여주었다. ET-NANB 감염환자 또는 시노몰거스 원숭이에서 분리된 담즙은 ET-NANB 바이러스 단백질 또는 유전물질, 또는 비손상 바이러스의 재료원으로서 사용하기 위해서, 본 발명의 일부를 구성한다.
B. cDNA 라이브러리 및 스크리닝
상기의 cDNA 단편은 cDNA 라이브러리를 형성하기 위해서 적당한 클로닝벡터로 클론된다. 이는 EcoRI 서열과 같은 적당한 말단 링커(linker)를 가진 블런트 끝처리된 단편을 구비하고, 상기 단편을 특이적 EcoRI 부위와 같은 클로닝벡터의 적당한 삽입 부위로 삽입시켜 수행될 수 있다. 최초 클로닝 후, 만약 필요하다면, 단편 삽입물을 포함하는 벡터의 백분율을 증가시키기 위해서 상기 라이브러리를 재클론시킬 수 있다. 실시예 1B에 기재된 라이브러리 구성은 실례이다. 여기에서 cDNA 단편은 블런트 끝처리(blunt end)되고, EcoRI 말단을 구비하며, 람다파아지 벡터 gt10의 EcoRI 부위로 삽입된다. 5% 미만의 단편 삽입물을 나타내는 라이브러리 파아지는 분리되고, 상기 단편 삽입물은 람다 gt10 벡터로 재클론되어 95% 이상의 삽입물을 포함하는 파아지가 수득된다. 이 cDNA 라이브러리는 감염 및 비감염원에서 유래한 cDNA 프로브에 차별적으로 하이브리되어 ET-NANB에 특이적인 서열에 대해 스크린된다. 감염 및 비감염원 담즙 또는 변에서 분리한 바이러스의 cDNA 단편은 상기와 같이 만들 수 있다. 상기 단편은 통상적인 방법(Maniatis, p.109)에 따르는 무작위 표지화, 닉 트랜스레이션(nick translation), 또는 말단표지화에 의해 방사선 표지된다. 실시예 2에 기재된 것과 같이, 상기의 cDNA 라이브러리는 이중 니트로셀룰로오스 필터로 이동시켜 스크린되고, 감염원 및 비감염원 (대조군) 방사선 표지된 프로브로 하이브리드시킨다. 바람직한 25 내지 30% 염기쌍 불일치의 제한조건으로 하이브리드된 서열을 회수하기 위하여, 만일 이들이 다음문헌［Maniatis 외, 참고문헌중, pp. 320-323］에 기재된 조건하에서, 그러나 다음 세척조건［2×SCC, 0.1% SDS, 실온-2회, 각각 30분; 다음 2×SCC, 0.1% SDS, 50℃-1회, 30분; 다음 2×SCC 실온-2회, 각각 10분］을 사용하여 하이브리드되면, 클론은 선별될 수 있다. 이러한 조건은 프로브로서 ET1.1 서열을 사용하여 상기 기재된 멕시코 분리균주의 확인을 허용한다. 감염원 프로브에 선택적으로 하이브리드되는 플라크를 낮은 플레이팅 밀도로 다시 플레이팅하고, 재스크린하여 ET-NANB 서열에 특이적인 단일 클론을 분리하는 것이 바람직하다. 실시예2에 기재된 것과 같이 감염원 프로브와 특이적으로 하이브리드되는 16개의 클론은 이러한 과정에 의해 확인된다. 람다 gt10-1.1로 명명되는 클론 중의 하나는 1.33Kb, 단편 삽입물을 함유한다.
C. ET-NANB 서열
B항의 ET-NANB 단편의 클론된 영역의 염기쌍 서열은 표준 서열화 방법에 의해 결정된다. 실시예3에 기재된 한 실례의 방법에서, 선별된 클로닝 벡터의 단편 삽입물은 겔 전기영동법에 의해 절출되어 분리되고, 삽입 부위 중 한쪽면의 염기쌍 서열이 공지된 클로닝 벡터로 삽입된다. 실시예 3에서 사용된 특정 벡터는 제1도의 왼편에 도시된 pTZ-KF1 벡터이다. gt10-1.1 파아지의 ET-NANB 단편은 pTZ-KF1 플라스미드의 독특한 EcoRI 부위에서 삽입된다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 원하는 삽입물을 운반하는 재조합체는 분리된 1.33Kb 단편과 하이브리드시켜 확인한다. pTZ-KF1(ET1.1)로 확인된 하나의 선별된 플라스미드는 벡터를 EcoRI 으로 소화시키면, 기대되는 1.33Kb 단편이 된다. pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드로 감염된 E. coli 균주 BB4는 다음 기관［American Type Culture Collection, Rockville, MD］에 기탁되어 있고, ATCC 기탁번호는 67717이다.
이 pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드는 제1도의 밑부분에 설명되어 있다.
상기 단편 삽입물은 A와 C로 표시된 5'와 3' 말단 영역 및 B 로 표시된 중간 영역을 가진다. 이들 영역에서의 서열은 표준 디데옥시 서열화에 의해 결정되고 상기에 기재되어 있다. 이들 3가지 짧은 서열(A,B 및 C)들은 동일한 삽입물의 가닥에서 유래한 것이다. 실시예3에서 보는 바와 같이, 상기 도시된 B-영역 서열은 실제로 반대쪽 가닥으로부터 결정되어, 서열화된 가닥에서 상보적인 서열을 나타낸다. 여기에서 부분 서열(partial sequences)의 염기수는 대략적인 값이다.
본 발명자 들은 실험실에서의 후속 작업으로 상기 기재된 완전 서열을 확인하였다. 이러한 전체 서열의 단편은 제한 엔도뉴클라아제를 사용하여 쉽게 얻어질수 있다. 전방서열 및 후방서열 들의 컴퓨터 분석은 수 많은 절단 부위를 확인한다. 이러한 특이적 절단 부위는 전방 방향에 대하여 다음 표에 요약되어 있다.
III. ET-NANB 단편
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 ET-NANB 게놈 서열 또는 ET-NANB 게놈 서열에서 유래한 cDAN 단편과 하이브리드되는 ET-NANB 특이적인 단편 또는 프로브를 포함한다. 상기 단편은 II. 절에 기재된 것과 같은 완전한 길이의 cDAN 단편을 함유할 수 있거나, 클론된 cDAN 단편내의 보다 짧은 서열 영역으로부터 유래할 수 있다. IV.절에 기재된 것과 같이, 짧은 단편은 원하는 크기의 단편을 생성시키는 조건하에서 완전한 길이의 단편을 효소로 절단시켜 제조될 수 있다. 대안으로, 상기 단편은 cDAN 단편으로부터 유래한 서열을 사용하여 올리고누클레오티드 합성법에 의해 제조될수 있다. 선택된 서열의 올리고누클레오티드 단편을 제조하기 위한 방법 또는 시설이 이용가능하다.
소정의 ET-NANB 단편이 ET-NANB 바이러스 병원체로부터 유래되는 것임을 확인하기 위해, 상기 단편을 감염원의 cDAN와 선택적으로 하이브리드시킬수 있다. 실례로서, pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드내의 1.33Kb 단편의 기원이 ET-NANB임을 확인하기 위해, 이 단편을 pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드로부터 절출하여, 정제하고, 무작위 표지화로 방사선 표지화한다. 방사선 표지된 단편을 감염 및 비-감염원의 cDAN와 하이브리드시켜 상기 프로브는 오로지 감염원 cDANs와 반응한다는 사실을 확인한다. 이러한 방법은 실시예4에 설명되어 있으며, 여기에서는 상기의 pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드의 방사선 표지된 1.33Kb 단편이 감염 및 비감염원으로부터 제조된 cDNAs의 결합에 대하여 조사된다. 감염원은 (1) 공지된 ET-NANB으로 감염된 버마지역 환자의 대변에서 얻은 바이러스 균주로 감염시킨 시노몰거스 원숭이의 담즙과 (2)멕시코에서 발생한 ET-NANB 환자의 대변에서 얻은 바이러스 병원체가 있다. 우선, 각 단편 혼합물내의 cDNAs 는 실시예 4에 기재된 링커/프라이머 증폭 방법에 의해 증폭된다. 아가로즈 겔 상에서 단편 분리가 일어난 다음, 서던 블로팅(Southern blotting)하고 방사선 표지된 1.33Kb 단편을 분획선 cDNAs 에 결합시켜 하이브리드시킨다. 감염원에서 얻은 cDNAs를 함유한 레인(lane)은 예기된 바와 같이 결합 프로브의 희미한 밴드를 나타낸다(링커/프라이머 증폭 방법에 의해 증폭된 cDNAs는 넓은 범위의 크기를 갖는 것이 예측될 수 있다). 프로브와 비감염원에서 얻은 증폭된 cDNAs와의 결합은 발견되지 않았다. 이 결과는 1.33Kb 프로브가 ET-NANB 감염과 연관된 cDNAs 단편에 대해 특이적임을 나타낸다. 프로브로서 ET1.1이 사용된 이와 동일한 형태의 연구는 타쉬켄트, 소말리아, 보르네오 및 파키스탄에 서 수집한 ET-NANB 샘플을 하이브리드시켜 증명된다. 두 번째로, 프로브가 다른 대륙(아시아, 아프리카 및 북미)에서 유래한 ET-NANB 관련 서열에 대해 특이적이라는 사실은 클론된 ET-NANB 아프리카 서열이 전세계적으로 퍼져있는 일반 ET-NANB 바이러스 또는 ET-NANB 간염 감염의 바이러스군에서 유래된 것임을 지적한다.
관련된 확인연구에서, 인간 또는 시노몰거스 원숭이의 게놈 DNA로부터 얻은 분획된 게놈 단편에 결합되는 프로브가 조사되었다. 어떠한 게놈 분획에도 프로브가 결합되지 않았으며, 이는 ET-NANB 단편이 내인성 인간 또는 시노몰거스 원숭이의 단편이 아니라는 사실을 증명하는 것이다.
단편내의 ET-NANB 특이적 서열의 또다른 확인 방법은 단편내의 코딩 영역으로부터 ET-NANB 단백질을 발현하는 능력이다. 단편을 사용한 단백질 발현방법이 다음 IV 절에 기재되어 있다.
ET-NANB 특이적 단편의 중요한 용도 중의 하나는 부가된 서열 정보를 포함하는 ET-NANB에서 유래된 cDNAs의 확인에 사용되는 것이다. 또한, 신규의 확인된 cDNAs는 신규의 단편 프로브를 생성하고, 이러한 과정은 전체 바이러스성 게놈이 확인되고 서열화될 때까지 반복된다. 부가된 ET-NANB 라이브러리 클론을 확인하고 이들로부터의 신규의 프로브를 생성하는 과정은 일반적으로 II절에 기재된 클로닝과 선별 과정을 따른다.
단편 및 상기 서열을 기본으로하여 제조된 올리고누클레오터드는 환자의 샘플에서 ET-NANB 바이러스 게놈 물질을 검출하는 중합효소 연쇄반응법의 프라이머로서 유용하다. 이 진단법은 하기 V절에 기재되어 있다.
IV. ET-NANB 단백질
상기 기재된 바와 같이, ET-NANB 단백질은 ET-NANB 단편내의 오픈리딩프레임의 코딩 영역을 발현시켜 제조될 수 있다. 하나의 바람직한 접근법에서, 단백질 발현에 사용되는 ET-NANB 단편은 원하는 크기의 단편을 생성하기 위해 처리된 클론된 cDNAs로부터 유래한 것이며, 바람직하게는 약 100 내지 약 300 염기쌍 크기의 무작위 단편이다. 실시예5에는 DNase 소화에 의한 상기 단편의 제조가 기재되어 있다. 약 30 내지 100 아미노산의 펩티드 항원을 얻는 것이 요구되기 때문에, 절단된 단편은 예를 들어 겔 전기영동법에 의해 바람직한 크기로 분획되어, 대략 100 내지 300 염기쌍 크기범위내의 염기쌍을 선별한다.
A. 발현 벡터
ET-NANB 단편은 적당한 발현벡터로 삽입된다. 발현벡터의 한 예는 람다 gt11이고, 람다 gt11은 EcoRI 특이적인 삽입 위치로서 베타-갈락토시다아제 유전자의 번역 종결코돈의 업스트림으로 53염기쌍을 함유한다. 또한, 삽입된 서열은 베타-갈락토시다아제 유전자의 N-말단부, 이종 펩티드 및 선택적으로 베타-갈락토시다아제 펩티드의 C-말단부(C-종말부는 이종펩티드코딩서열이 번역 종결코돈을 포함하지 않을 때 발현된다)을 포함하는 베타-갈락토시다아제 융합 단백질로서 발현될 것이다. 이러한 벡터는 온도-민감억제인자(c1857)도 생성하는데, 이 인자는 허용온도, 즉 32℃에서 바이러스를 용원화시키고, 상승온도, 즉 42℃에서 바이러스 용균을 유발한다. 이러한 벡터의 장점은 다음과 같다 : (1) 고효율 재조합체 생성, (2) 허용온도에서는 숙주세포가 생장하되 비-허용온도에서는 그러하지 않은 점을 기초로 한 용원화된 숙주세포를 선별하는 능력 및 (3) 높은 수준의 재조합 융합 단백질 생성, 또한 이중 삽입물을 포함한 파아지가 비활성 베타-갈락토시다아제 효소를 합성하기 때문에, 삽입물을 가진 파아지는 베타-갈락토시다아제에 의한 기질 변색에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 발현벡터로의 삽입의 경우, 만약 필요하다면, EcoRI 링커와 같은 선택된 제한부위 링커를 포함하도록 절단된 바이러스 단편은 통상적인 과정에 따라 변형될 수 있다. 실시예1에는 절단된 단편을 람다 gt11로 클로닝하기 위한 방법이 설명되고 있고, 이 방법은 상기 단편을 블런트 끝처리하고, EcoRI 링커로 연결하고, 이 단편을 EcoRI으로 절단된 람다 gt11로 도입하는 단계로 구성되어 있다. 비교적 큰(대표적인)라이브러리가 합성되었는지를 확인하기 위하여 생성된 바이러스 게놈 라이브러리를 분석할 수 있다. 람다 gt11 벡터의 경우에서, 상기 과정은 적당한 박테리아 숙주의 감염, 박테리아의 플레이팅, 베타-갈락토시다아제 활성의 손실에 대한 플라크의 조사에 의해 수행될 수 있다. 실시예1에 기재된 과정을 사용하여, 플라크의 약 50%가 효소 활성이 손실되었음을 입증하였다.
B. 펩티드 항원의 발현
상기에서 형성된 바이러스 게놈라이브러리는 ET-NANB 혈청반응 양성의 개체의 항혈청과 면역 반응하는 펩티드 항원(융합 단백질로 발현된다)의 합성을 위해 스크린된다. 바람직한 스크리닝법에서, 파아지 라이브러리벡터로 감염된 숙주세포는 상기와 같이 플레이팅되고, 이 플레이트는 니트로셀룰로오스 필터로 블롯(blot)되어 상기 세포들에 의하여 생성된 재조합 단백질 항원은 상기 필터로 이전된다. 이어서, 이 필터를 ET-NANB 항혈청과 반응시키고 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 항-ET-NANB 항체를 통한 샌드위치 형식으로 상기 필터에 결합하는 표지된 리포터인 항-인간 항체와 반응시킨다.
관심의 대상이 되는 재조합 항원의 합성에 의해 확인된 파아지 플라크는 항체반응성 융합 단백질의 생성을 위해 비교적 낮은 밀도에서 재조사된다. 면역반응성 재조합 항원을 생성하는 여러개의 재조합 파아지 클론은 이 과정에서 확인되었다.
선택된 발현벡터는 재조합 단백질 정체의 목적으로 스케일-업 생산을 위해 사용될 수 있다. 스케일-업 생산은 (a) 선택된 람다 gt11 재조합체를 가진 E. coli와 같은 적당한 숙주의 용원화, (b) 높은 수준의 이종 펩티드를 합성하는 조건하에서 형질도입된 세포의 배양, 및 (c) 용균된 세포의 재조합 항원의 정제를 위한 여러 가지 방법들 중 하나를 사용하여 수행된다.
상기 람다 gt11 클로닝벡터와 연관된 바람직한 방법에서, 높은 생산자인 E.coli숙주, BNN103은 선별된 라이브러리 파아지에 의해 감염되고, 레플리카는 두 개의 플레이트에 플레이팅된다. 플레이트 중 하나는 바이러스 용원화가 발생할 수 있는 32℃에서 배양되고, 다른 하나는 감염 파아지가 용균 단계에 있으므로 세포 생장을 방해하는 42℃에서 배양된다. 따라서 32℃보다 높고 42℃보다 낮은 온도에서 성장하는 세포는 성공적으로 용원화되리라고 추축딘다. 이어서, 용원화된 숙주세포는 바이러스 삽입물을 포함한 융합 단백질의 높은 생성에 유리한 액체 조건하에서 배양되고, 급냉에 의해 용균시켜 필요한 융합 단백질을 얻는다.
C. 펩티드 정제
재조합 펩티드는 표준 단백질 정제 과정에 의해 정제될 수 있으며, 이 과정은 분별침전, 분자체 크로마토그래피(molecular sieve chromatography), 이온 교환 크로마토그래피, 등전집중법, 겔 전기 영동법 및 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기와 같이 제조된 베타-갈락토시다아제 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 경우에, 사용된 단백질 분리 기술은 천연 단백질의 분리에 사용된 기술로부터 변형될 수있다. 그러므로, 베타-갈락토시다아제 융합 단백질의 분리를 위해서, 상기 단백질은 간단한 친화성 크로마토그래피에 의해, 또는 표면에 결합된 항-베타-갈락토시다아제 항체를 갖는 고체 지지체 위에 세포 용균 물질을 통과시켜 즉각 분리될 수 있다.
D. 바이러스 단백질
본 발명의 ET-NANB 단백질은 ET-NANB 바이러스 병원체로부터 직접 분리될 수도 있다. 상기 기재된 감염개체의 대변에서 분리한 VLPs는 하나의 적당한 바이러스 단백질원이다. 대변에서 분리한 VLPs는 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질 분리에 앞서 추가로 정제될 수 있다 (하기 참조). 바이러스 병원체는 세포 배양액에서 배양될 수도 있으며, 이것은 편리하면서도 잠재적으로 농축된 바이러스 단백질원을 제공한다. 1986년 4월 1일 출원된 본 발명자의 미국 특허출원 제 846,757호에는 세포 배양액에서 NANB감염을 유지시켜 주는 불멸화된 트리오마(trioma)간세포가 기재되어 있다. 이 트리오마 세포주는 사람의 염색체 안정도를 위해 선별된 생쥐/사람 융압짝과 사람의 간세포를 융합시켜 제조된다. 원하는 NANB 바이러스 병원체를 포함하는 세포는 항-ET-NANB 인간항체를 사용하는, 면역형광법에 의해 확인될 수 있다.
바이러스 병원체는 단백질 분리에 앞서 통상적인 방법에 따라서 분쇄되는데, 이 방법은 음파파쇄, 고-또는 저염 조건, 또는 계면활성제의 사용을 포함할 수 있다.
ET-NANB 바이러스 단백질의 정제는 표준 방법에 따라 적당한 고체지지체에 부착된 정제된 항-ET-NANB 항체를 사용하는, 친화성 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 이러한 항체 자신도 면역 혈청원으로부터 항-ET-NANB 항체를 분리하기 위해 상기 기재된 바와 같이 면역반응성 재조합 ET-NANB 단백질이 고체지지체에 부착된 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이 결합 항체는 표준 방법에 의해 상기 지지체로부터 분리된다.
대안으로, 항-ET-NANB 항체는 재조합 ET-NANB 단백질을 가진 생쥐 또는 다른 동물을 면역시키고, 이 동물로부터 림프구를 분리하고, 적당한 융합짝으로 세포를 불멸화시킨 후, 재조합 단백질 면역원과 반응하는 융합 생성물을 선별시켜 제조된 단일클론성 항체(Mab)일 수 있다. 차례로 이들은 원래의 ET-NANB 항원을 수득하기 위한 상기 기재된 친화성 정제 과정에 이용될 수 있다.
V. 유용성
A. 진단방법
유전물질 뿐만아니라 본 발명의 바이러스 입자와 항원도 진단학적 평가에 이용될 수 있다. ET-NANB간염의 존재를 검출하기 위한 방법은 ET-NANB 간염 바이러스와 연관된 검체의 존재를 검출하기 위해 혈액표본, 대변표본 또는 간검시표본과 같은 생물학적 표본을 분석하는 단계를 포함한다.
상기 검체는 16개 이상의 연속 누클레오티드의 서열, 일반적으로 30 내지 200 개의 누클레오티드, 실질적으로 상기 기재된 서열(cDAN 서열)의 완전서열까지를 포함하는 프로브와 하이브리드하는 누클레오티드 서열일 수있다. 상기 검체는 RNA 또는 cDNA 일 수 있다. 대표적으로 상기 검체는 ET-NANB 라고 생각되는 바이러스 입자 또는 이러한 분류가 배제된 입자이다. 상기 바이러스입자는 상기 기재된 전방 및 후방 서열의 12개 이상의 연속 누클레오티드 서열에 약 80%이상, 일반적으로 서열내의 약 60개 이상의 연속 누클레오티드에 약 90%이상이 일치하는 서열을 포함하는 RNA 바이러스게놈으로 특징지울 수 있으며 완전한 길이의 서열과 실질적으로 동종인 서열을 함유할 수도 있다. 검체가 프로브와 하이브리드되는 경우 검체를 검출하기 위해서 상기 프로브는 검출가능한 표지를 함유할 수도 있다. 이 검체는 ET-NANB 바이러스 입자위의 세포표면 항원과 같은 항원을 인지하는 항체를 함유할 수도 있다. 이 검체는 ET-NANB 바이러스 항원일 수도 있다. 검체가 항체 또는 항원인 경우, 표지된 항원 또는 항체 각각은 검체에 결합되어 표지에 의해 검출가능한 면역학적 복합체를 형성시키기 위해 사용될 수 있다.
대표적으로, 표면항원 및/또는 전체 바이러스입자와 같은 검체를 검출하는 방법은 면역학적 검정을 기본으로 한다. ET-NANB 간염바이러스로 감염된 숙주 내에서의 항체의 존재를 결정하거나 바이러스입자 또는 항원의 존재를 직접 결정하기 위한 분석에 의해 면역검정법은 수행될 수 있다. 실시예들에는 이종 및 동종 면역학적 검정 기술이 둘다 기재되어 있다. 양 기술은 바이러스 입자 또는 이것의 항원 및 대응하는 특정 항체 사이의 면역학적 복합체의 형성을 기초로 하고 있다. 전형적으로 바이러스 항원에 대한 이종 검정은 고체 표면에 결합되는 특이적 단일클론성 또는 다중클론성 항체를 사용한다. 여기에는 샌드위치 검정이 아주 널리 사용되고 있다. 고체상의 존재없이 용액에서 수행되는 동종검정법은 예를 들어 효소와 항원의 컨쥬게이트에 대한 유리된 항체의 결합에 의해 발생되는 효소활성의 차이를 검정함으로써 사용 될 수 있다. 수 많은 적합한 검정법들이 미국특허 제 3,817,837호, 제 4,006,360호, 및 제3,996,345호에 개시되어 있다.,
ET-NANB 바이러스들에 의해 유도된 항체의 존재에 대해 분석할 때, 본 발명의 바이러스와 항원들은 IgG 또는 IgM 항체를 검출하는 특이적 결합제로서 사용될 수 있다. IgM 항체는 , IgG 합성이 개시되지 않았을 때인 감염과정중에 나타나는 대표적인 최초 항체이므로, 특히 숙주의 혈관에 존재하는 IgM 과 IgG 항체의 구분은 의사 또는 다른 연구원이 상기 감염이 최근의 감염인지 또는 만성인지를 결정하는 것을 가능하게 할 것이다.
한 진단학적 구성에서, 시험혈청은 표면에 결합된 ET-NANB 단백질 항원을 가진 고체상 시약과 반응한다. 항-ET-NANB 항체를 시약에 결합시키고 결합되지 않은 혈청성분을 세척하여 제거한 후에, 상기 시약을 리포터-표지된 항-인간 항체와 반응시켜 상기 고체 지지물에 결합된 항-ET-NANB 항체에 비례하여 상기 시약에 리포터를 결합시킨다. 상기 시약을 다시 세척하여 결합되지 않은 표지된 항체를 제거하며, 상기 시약과 연관된 리포터의 양을 결정한다. 전형적으로, 상기 리포터는 적당한 형광분석 또는 비색분석 기질의 존재하에서 고체상을 인큐베이션시키면 검출되는 효소이다.
상기 검정에서의 고체표면 시약은 단백질 재료를 중합체 비드, 딥스틱 또는 필터재료와 같은 고체 지지물에 부착시키기 위한 공지된 기술에 의해 제조된다. 일반적으로 이러한 부착방법을 전형적으로, 유리된 아미노기를 통해 단백질 지지체 또는 공유결합 부착물에 단백질을 비특이적으로 흡착시키거나 활성카르복실, 히드록실 또는 알데히드기와 같은 고체 지지체상의 화학적 반응기에 단백질을 비특이적으로 흡착시키는 것을 포함한다.
동종검정법으로 알려진 두 번째 진단학적 구조에서, 고체지지체에 결합된 항체는 반응매질에서 약간의 변화를 유발하여 상기 매질에서의 직접검출을 가능하게 한다. 지금까지, 제안된 동종검정법의 공지된 일반형태는 다음과 같다 : (a) 항원에 대한 항체의 결합이 리포트된 이동성의 변화에 의해 검출되는 (스핀 스플릿피크의 넓은 분포), 스핀으로 표지된 리포터, (b) 항체의 결합이 형광효율의 변화에 의해 검출되는 형광리포터, (c) 항체결합이 효소/기질 상호작용에 영향을 주는 효소리포터, (d) 항체의 결합이 리포오좀 용균과 캡슐화된 리포터의 방출을 유도하는 리포오좀-결합리포터, 본 발명의 단백질 항원에 대한 이러한 방법들의 적용은 동종검정시약을 제조하기 위한 통상적인 방법에 따른다.
상기 기재된 각각의 검정에서, 검정 방법은 시험 개체의 혈청과 단백질 항원과의 반응단계와 결합된, 항체의 존재를 확인하기 위한 항원검사단계를 포함한다. 이 검사는 항체가 IgM(급성기)또는 IgG(회복기)인가를 검사하기 위해 표지된 항-사람 항체를 상기 항체에 부착하는 단계 및, 첫 번째 방법에서와 같이 고체 지지체에 결합된 리포터의 양을 측정하는 단계를 포함할수 있으며, 또는 두 번째 방법에서와 같이 동종 검정시약 상에서의 항체결합의 영향을 관찰하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일부를 구성하는 것은 진술한 검정 방법을 수행하기 위한 키트나 검정 시스템이다. 일반적으로, 이 키트는 표면 결합 재조합단백질 항원을 가진 지지체이고, 상기 항원은 장을 통해 감염되는 비-A형 바이러스 병원체/비-B형 바이러스 병원체에 감염된 개체내에 존재하는 항체들과 면역반응하며, E.Coli 균주 BB4에 운반되고, ATCC 기탁번호 67717을 갖는 플라스미드 pTZ-KF1(ET1.1)에 존재하는 1.33 Kb DNA EcoRI 삽입물에 상동인 영역을 함유하는 게놈을 가진 바이러스 간염 병원체로부터 유래한 것이다. 키트내의 리포터로 표지된 항-사람항체는 표면결합된 항-ET-NANB 항체를 검출하기 위해 사용된다.
B. 바이러스 게놈의 진단학적 응용
본 발명의 유전물질은 자연적으로 발생하는 감염체에 존재하는 유전 물질을 찾기 위한 많은 검정법에서 프로브로서 사용될 수 있다. 하이브리드 검정에 의한 차후분석을 위해 표적 핵산을 증폭시키는 하나의 방법은 중합효소연쇄반응 또는 PCR기술로서 공지되어 있다. 이 PCR 기술은 서로 일정간격을 두고 있고 전술한 유전자 서열을 기초로 하는 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 미심쩍은 병원성 표본내의 본 발명의 바이러스 입자의 검출에 응용될 수 있다. 상기 프라이머들은 이중가닥의 DNA 분자의 반대방향사슬들에 대해 상보적이고 전형적으로 약 50 내지 450 누클레오티드 이상(일반적으로 2000 누클레오티드 이하)의 간격으로 떨어져 있다. 이러한 방법은 특정 올리고누클레오티드 프라이머를 제조한 다음, 표적 DNA의 변성, 프라이머의 결합, DNA 폴리머라아제에 의한 연장과정을 반복하여 프라이머 간격을 기초로 하는 예상된 길이의 DNA 단편을 얻는다. 하나의 프라이머로부터 생성된 연장 생성물은 다른 프라이머에 대한 추가의 표적 서열로서의 역할을 수행한다. 표적 서열의 증폭정도는 수행되는 사이클의 수에 의해 제어되고 간단한 식 2n(n은 사이클수)에 의해 이론적으로 계산된다. 사이클당 평균 효율은 약 65% 내지 85%이고, 25 사이클은 약 삼십만 내지 사백팔십만개의 표적 서열 복제물을 생산한다. 이 PCR 방법은 다음 출판물[Saiki외, Science(1985) 230 : 1350-1354 ; Saiki외, Nature(1986) 324 : 163-166 및 Scharf외, Science(1986) 223 : 1076-1078]에 기재되어 있다. 또한 이것은 미국 특허 제 4,683,194호, 제4,683,195호, 및 제4,683,202호에도 기재되어 있다.
본 발명은 ET-NANB 단편의 선택적인 증폭을 기초로하여, ET-NANB 바이러스성 병원체를 결정하는 특이적 진단방법을 포함한다. 이러한 방법은 DNA 이중 단편의 반대방향 가닥들의 비-상동 영역에서 유래된 한쌍의 단일가닥 프라이머를 사용하며, 상기 DNA 이중단편은 E,Coli 균주 BB4에서 운반되고, ATCC 기탁번호 67717을 갖는 플라스미드 pTZ-KF1(ET1.1)에 존재하는 1.33 Kb DNA EcoRI 삽입물에 상동인 영역을 함유하는 게놈을 가지며, 장을 통해 감염되는 바이러스성 간염 병원체에서 유래한 것이다. 본 발명의 한면을 형성하는 이같은 프라이머 단편는 상기 III. 절에 기재된 것과 같은 ET-NANB 단편으로부터 제조된다. 이 방법을 상기 논의된 것과 같이 미국 특허번호 제4,683,202호에 개시된 선택된 핵산 서열을 증폭하는 방법을 따른다.
C. 펩티드 백신
본 발명의 모든 항원은 백신의 제조에 사용될 수 있다. 백신의 제조에 바람직한 출발물질은 담즙에서 분리된 바이러스 입자 항원이다. 이 항원은 상기 기재된 바와 같이 완전한 입자로서 초기에 회수되는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 원료 또는 비-입자 재조합 항원에서 단리한 입자로부터 적당한 백신을 제조하는 것도 가능하다. 비-입자 항원이 사용되었을 때(전형적으로 가용성 항원), 바이러스 외막 또는 바이러스 캡시드에서 유래된 단백질이 백신의 제조에 선호된다. 이러한 단백질은 상기 기재된 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
만일 정제된 단백질이 그 자체로 면역원성이 아니면, 면역원성 단백질을 만들기 위해 이것을 담체에 결합시킬 수 있다. 담체로는 소의 혈청 알부민, 삿갓조개의 키이홀 헤모시아닌 등이 있다. 항원을 정제하여 실질적으로 사람의 단백질을 제거하는 것이 바람직하지만 필요한 것은 아니다. 그러나, 상기 항원들은 영양배지, 세포주, 조직, 또는 바이러스가 배양되거나 수득되는 병원성 유동액에 의하거나 이들의 오염에 의해 도입될 수 있는 단백질, 바이러스, 및 인간기원이 아닌 다른 물질들이 없는 것이 보다 중요하다.
백신화는 통상적인 방법에 따라서 수행될 수 있다. 예로서, 바이러스 입자 또는 단백질인 항원은 물, 염수, 완충된 염수, 완전 또는 불완전 보조제등과 같은 적당한 희석액에서 사용될 수 있다. 면역원은 생리학적으로 적합한 비활성 또는 약화된 바이러스 입자 또는 항원을 함유한 멸균용액의 투여와 같은 항체 유도를 위한 표준 기술을 사용하여 투여된다. 면역반응을 이끄는 바이러스 입자의 양은 전형적으로 1㎖ 이하의 용적의 백신주사로 투여된다.
백신 조성물의 특징에는 E.coli 균주 BB4에 운반되고, ATCC 기탁번호 67717을 갖는 플라스미드 pTZ-KF1(ET1.1)에 존재하는 1.33Kb DNA EcoRI 삽입물과 상동인 영역을 함유하는 게놈을 가지며, 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 바이러스성 간염병원체에서 유래한 재조합 단백질 또는 단백질 혼합물을 약리학적으로 수용할 수 있는 보조제에 포함하는 것이다. 이 백신은 항-ET-NANB 항체의 상당한 역가가 혈청에서 검출될 때까지 주기적 간격으로 투여된다. 상기 백신은 ET-NANB 감염을 에방할 것이다.
D. 예방학적 및 치료학적 항체 및 항혈청
백신으로서의 사용 이외에도, 이 성분은 ET-NANB 바이러스 입자의 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 이 항체는 항바이러스 약제로서 직접 사용될 수 있다. 항체를 제조하기 위해서, 숙주동물은 바이러스 입자, 또는 적절하게는 상기 기재된 것과 같이 백신용 담체에 결합된 바이러스 입자 유래의 비-입자 항원을 사용하여 면역시킨다. 숙주혈청 또는 혈장은 바이러스 입자와 반응하는 항체를 포함하는 조성물을 제공하기 위하여 적절한 시간간격에 따라 수집된다. 감마-글로불린 파편 또는 IgG 항체는 예를 들어 포화된 황산암모늄 또는 DEAE 세파덱스, 또는 당분야에 기술적으로 공지된 다른 기술에 의해 얻어질 수 있다. 상기 항체는 의약과 같은 다른 항-바이러스 약제와 관련될 수도 있는 많은 불리한 부작용이 실질적으로 없다.
상기 항체 조성물은 불리한 면역계 반응의 가능성을 최소화시켜 보다 숙주 시스템에 적합하도록 만들 수 있다. 이것은 외래 종 항체의 Fc 부분의 전체 또는 일부를 제거하거나 숙주동물과 동일한 종의 항체, 예를 들어 사람/사람 하이브리도마의 항체를 사용함으로써 달성된다. 항체-바이러스 복합체는 대식세포에 의해 인지되기 때문에 항체는 면역반응을 향상시키는 수단으로 사용될 수도 있다. 상기 항체는 항체의 다른 치료학적 투여에 사용되는 양과 유사한 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 감마 글로불린 집단은 광견병, 홍역 및 B형 간염과 같은 다른 바이러스성 질병의 초기 잠복기 동안 0.02-0.1㎖/Ib 항체중량으로 투여되어 세포로의 바이러스 침입을 간섭한다. 따라서, ET-NANB 바이러스성 입자와 반응하는 항체는 단독으로 또는 다른 항-바이러스성 약제와 함께 ET-NANB 바이러스로 감염된 숙주에 수동적으로 투여되어 면역반응 및/또는 항바이러스성 약제의 효능을 향상시킬 수 있다. 다른 방법으로, 항-ET-NANB 바이러스 항체는 면역원으로서 항-이디오 타입 항체를 투여하여 유도될 수 있다. 편리하게, 상기 기재된 것과 같이 제조된 정제된 항-ET-NANB 바이러스 항체는 숙주 동물내에서 항-이디오 타입 항체를 유도하는데 사용된다. 상기 조성물은 적당한 희석액의 형태로 숙주동물에 투여된다. 투여 후, 일반적으로 반복된 투여 이후에, 숙주는 항-이디오 타입 항체를 생산한다. Fc 영역에 대한 면역반응을 제거하기 위하여, 숙주 동물과 동일한 종에 의해 생산된 항체가 사용되거나 투여된 항체의 Fc 부분이제거될 수 있다. 숙주동물내에 항-이디오 타입 항체의 유도에 이어서, 항체 조성물의 제공을 위해 혈청 또는 혈장은 제거된다. 상기 조성물은 항-ET-NANB 바이러스 항체에 대해 상기 기재한 것과 같이 정제되거나, 친화성 매트릭스에 결합된 항-ET-NANB 바이러스 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 생성된 항-이디오 타입 항체는 진성ET-NANB 항원과 입체 서열이 유사하며, ET-NANB 입자 항원을 사용하는 것보다 유리하게 ET-NANB 백신의 제조에 사용될 수도 있다.
환자에게 항-ET-NANB 바이러스 항체를 유도하는 방법으로서 사용되었을 경우, 상기 항체를 주사하는 방법은 백신화를 목적으로 하는 경우 보조제를 사용하거나 사용하지 않은 생리학적으로 적합한 희석액에서 효과적인 농도로, 즉, 근육내 주사, 복막내 주사, 피하주사 등과 같은 방식으로 주사된다. 한 번 이상의 추가면역 주사가 바람직할 수 있다. 항-ET-NANB 바이러스 항체를 유도하는 항-이디오 타입 방법은 불리한 면역반응과 같은 항-ET-NANB 바이러스 항체의 수동적 투여에 의해 나타날 수도 있는 문제점 및 아직 미확인된 바이러스에 의한 감염과 같은 정제된 혈액 성분의 투여와 관련된 문제점을 완화시킬 수 있다. 본 발명의 ET-NANB에서 유래된 단백질은 노출전 또는 누출 후 예방을 위해 고안된 항혈청을 생산하는데 그 이용목적이 있다. 여기에서, ET-NANB 단백질 또는 단백질 혼합물은 적당한 보조제로 제제화되고 인간 항혈청을 생산하는 공지의 방법에 따라 인간 피험자에게 주사에 의해 투여된다. 주사된 단백질에 대한 항체 반응은 면역화후의 여러주 동안 주기적인 혈청 샘플링에 의해 모니터되어 IIA. 편에 기재된바와같이, 항-ET-NANB 혈청 항체의 존재를 검출한다.
면역된 개체의 항혈청은 접촉감염의 위험에 있는 개체에 대한 노출전 예방수단으로 투여될 수 있다. 상기 항혈청은 노출 후 개체의 치료에 유용하고, 노출 후 예방을 위해서 B형 간염 바이러스에 대한 고역가의 항혈청을 사용하는 것과 유사하다.
E. 단일클론성 항체
ET-NANB 바이러스 입자 및 단백질에 대한 항체와 항-이디오 타입 항체의 생체내에서 사용 및 진단학적 사용을 위해, 단일클론성 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 단일클론성 항-바이러스 입자 항체 또는 항-이디오 타입 항체는 다음과 같이, 생산될 수 있다. 비장 또는 림프구는 면역화된 동물로부터 제거되어 불멸화되거나, 당분야에 공지된 방법에 의해 하이브리도마를 제조하는데 사용된다. 사람-사람 히아브리도마를 제조하기 위해, 사람의 림프구 공여체가 선별된다. ET-NANB 바이러스로 감염된 것으로 알려진 공여체(여기에서 감염은 예를 들어 혈액내의 항-바이러스 항체의 존재나 바이러스 배양에 의해 입증됨)는 적합한 림프구 공여체로서 사용될 수도 있다. 림프구는 말초혈액 표본에서 분리되거나, 상기 공여체가 비장 절제술의 대상이 되면 비장세포가 사용될 수 있다. 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV)는 사람의 림프구를 불멸화시키는데에 사용될 수 있으며 인간 융합파트너는 사람-사람 하이브리도마를 제조하는데 사용될 수있다. 시험관내에서 펩티드에 의한 1차 면역화는 사람의 단일클론성 항체의 생성에 사용될 수 있다.
불멸화된 세포에 의해 분비된 항체를 스크린하여 원하는 특이성을 가진 항체를 분비하는 클론을 결정한다. 단일클론성 항-바이러스 입자 항체에의 경우, 상기 항체는 ET-NANB 바이러스 입자에 결합되어야 한다. 단일클론성 항-이디오형 항체의 경우, 상기 항체는 항-바이러스입자 항체에 결합되어야 한다. 원하는 특이성을 가진 항체를 생산하는 세포가 선택된다.
다음 실시예는 본 발명의 다양한 면을 설명하는 것으로서 본 발명의 범위를 제한하고자 의도된 것은 아니다.
[재료]
다음 실시예들에 사용된 재료는 아래와 같다 : 효소 : Boehringer Mannheim Biochemicals(BMB, lndianapolis, IN)에서 입수한 알카린 포스파타아제 및 DNASEI : New England Biolabs(NEB, Beverly MA)에서 입수한 EcoRI, EcoRI 메틸라아제, DNA 리가아제, DNA 중합효소 I; 및 Sigma(St. Louis, MO)에서 입수한 RNase A.
기타 시약 : NEB에서 입수한 EcoRI 링커; 및 Sigma에서 입수한 니트로블루 테트라졸륨(NBT), 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 인산염(BCIP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-B-D-갈락토피란노시드(X-gal) 및 이소프로필 B-D-티오갈락토피란노시드(IPTG).
cDNA 합성키트 및 무작위 프라이밍 표지화 키트는 Boehringer-Mannheim Biochemicals(BMB, lndianapolis, IN)로부터 입수할 수 있다.
[실시예 1]
[cDNA 라이브러리 제조]
A. ET-NANB 바이러스원
버마 증상의 환자에서 분리한 ET-NANB 바이러스 균주로 감염된 2차-통변 시노몰거스(시노[cyno] #37)로부터 수득한 대변의 10% 현탁액을 2마리의 시노몰거스 원숭이(cynos)에게 정맥내로 주사하였고, 버마 환자의 대변이 ET-NANB에 대해 양성임은 공지된 ET-NANB 바이러스 환자의 면역혈청과 대변내의 27내지 34㎚ 바이러스 유사입자(VLPs)를 결합시켜 증명하였다. 상기 발병된 동물들은 접종후 24내지 36일 사이에 알라닌 아미노 전이효소(ALT)의 수준을 상승시켰고, 그 중 하나는 감염의 급성기 이전에 담즙내에 27내지 34㎚ VLPs를 분비하였다.
각각의 감염동물의 담관을 캐뉼러 삽입하여 약 1내지 3cc의 담즙을 매일 모은다. RNA는 표준 RNA분리 과정을 사용하여, 고온페놀 추출에 의해 하나의 담즙 표본(cyno #121)으로부터 추출한다. 이중가닥 cDNA를 Boehringer-Mannheim(lndianapolis, IN)에 입수한 cDNA 합성 키트를 사용하여 최초 가닥 생성을 위한 무작위 프라이머에 의해, 분리된 RNA로부터 합성하였다.
B. 이중사슬 단편의 클로닝
이중사슬의 cDNA 단편을 표준조건(Maniatis, p, 118)하에서 T4 DNA 중합효소로 블런트 끝처리한 다음, 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 블런트 끝처리된 재료를 표준조건(Maniatis, pp. 396-397)하에서 EcoRI 링커로 연결시키고 EcoRI으로 소화시켜 여분의 링커 말단을 제거한다. 연결되지 않은 링커는 연속된 이소프로판올 침전에 의해 제거한다.
람다 gt10 파이지 벡터(Huynh)를 Promega Biotec(Madison,WI)에서 입수한다. 상기 클로닝 벡터는 파지 cl 억제유전자내에 특이적인 EcoRI 클로닝 부위를 갖는다. 상기의 cDNA 단편은 0.5 내지 1.0㎍ EcoRI-절단된 gt10, 0.5 내지 3㎕의 상기 이중사슬 단편, 0.5㎕의 10×연결반응 완충용액, 0.5㎕ 리가아제(200units), 및 증류수를 5㎕로 혼합하여 EcoRI 부위로 도입된다. 상기 혼합물은 14℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시키고, 이어서 표준방법(Maniatis, pp.256-268)에 따라 시험관내 패키징을 수행한다. 패키징된 파아지를 HG415 균주와 같은 E. coli hfl 균주를 감염시키는데 사용한다. 다른 방법으로, Promega, Biotec, Madison, WI에서 입수할 수 있는 E. coli 균주 C600 hfl이 사용될 수 있다. EcoRI으로 끝처리된 단편의 삽입에 의해 수득된 재조합 플라크의 백분율은 20개의 무작위 플라크의 분석에 의해 5%미만이었다.
얻어진 cDNA 라이브러리를 플레이팅시키고 파아지를 용리 완충용액의 첨가에 의해 선별 플레이트로부터 용리시킨다. 파아지로부터 DNA를 추출한 후에, 이 DNA를 EcoRI으로 소화시켜 이종삽입물 집단을 방출시키고, 이 DNA단편을 아가로우즈에서 분획화하여 파아지 단편을 제거한다. 500내지 4,000 염기쌍 삽입물을 단리시켜 상기와 같은 람다 gt10에 재클론시키고, 패키징된 파아지를 E. coli 균주 HG415를 감염시키는데 사용한다. 성공적인 재조합체의 백분율은 95% 이상이다. 파아지 라이브러리는 총 8개 플레이팅 상에서 약 5,000 플라크/플레이트 비율로 E. coli 균주 HG415위에 플레이팅되었다.
[실시예 2]
[클론된 ET-NANB 단편의 선택]
A. cDNA 프로브
감염되지 않거나 ET-NANB로 감염된 시노몰거스 원숭이의 이중사슬 cDNA 단편을 실시예 1에서와 같이 제조한다. 이 cDNA 단편을 Boehringer-Mannheim(lndianapolis, IN)에서 입수한 무작위-프라이밍 표지화 키트를 사용하여, 무작위 프라이밍에 의해 방사선 표지화하였다.
B. 클론 선별
실시예 1에서 플레이팅된 cDNA 라이브러리를 두 개의 니트로셀룰로오스 필터로 각각 전달하고, 파아지 DNA를 표준방법(Maniatis, pp.320-323)에 따르는 베이킹(baking)에 의해 필터위에 고정시킨다. 복제된 필터를 감염원이나 상기의 대조군 cDNA 프로브와 하이브리드시킨다. 상기 필터의 자동 방사선 사진은 라이브러리 클론이 단지 감염원으로부터의 방사선 표지된 cDNA 프로브와 하이브리드되고, 비감염원의 cDNA 프로브와 하이브리드되지 않았음을 확인하기 위하여 조사된다. 총 약 40,000 개의 조사된 클론에서 16개가 이러한 감법 선별 방법에 의해 확인되었다.
각각의 16개 클론을 찍어, 낮은 농도로 아가로즈 플레이트 상에 재플레이팅시켰다. 각각의 플레이트 상의 클론을 레플리카 리프트(replica lift)로 두 개의 니트로 셀룰로오스로 이전시키고, 상기와 같이, 감염 및 비감염원의 방사선 표지된 cDNA 프로브와 하이브리드하여 검사한다. 감염원 프로브에 대한 선택적 결합을 나타내는 (즉, 감염원 프로브와 결합하고 비감염원 프로브와 결합하지 않음)클론이 선택된다. 감염원의 프로브에 선택적으로 결합된 클론중 하나를 또다른 연구를 위해서 분리한다. 선택된 벡터는 제1도에 나타난 바와 같이 람다 gt10-1.1로 확인되었다.
[실시예 3]
[ET-NANB 서열]
실시예 2에서 클론된 람다 gt10-1.1을 EcoRI으로 절단하여 이종삽입물을 분리하고, 이것을 겔 전기영동법에 의해 벡터단편으로부터 분리한다. 상기 단편의 전기영동 이동도는 1.33kb 단편과 일치한다. EcoRI 말단을 포함하는 이러한 단편은 pTZ-KF1 벡터의 EcoRI 부위로 삽입되고, 이들의 구성과 특성은 미국특허출원 제125,650호(1987.11.25 출원)[Cloning Vector System and Method for Rare Clone identification]에서 설명되어 있다. 간략하게, 제1도에 설명한 것과 같이, 이러한 플라스미드는 T7 중합효소 프로모터 부위에 인접한 특이적 EcoRI 부위 및 플라스미드와 파아지의 복제기점을 포함한다. EcoRI 부위의 각 측면에 바로 인접한 서열은 공지되어 있다. Stratagene(La Jolla, CA)에서 입수한 E. coli BB4 박테리아는 상기 플라스미드로 형질전환시킨다.
방사선 표지된 ET-NANB 프로브를 실시예 2에 기재된 람다gt 10-1.1 파아지부터 1.33kb 삽입물 절단, 겔전기영동법에 의한 단편분리 및 상기와 같은 무작위 표지화에 의해 제조한다. pTZ-KF1로 트랜스펙션되고 원하는 ET-NANB 삽입물을 함유하는 박테리아를 실시예 2에 개요된 방법에 따라 레플리카 리프트와 방사선 표지된 ET-NANB 프로브로 하이브리드하여 선별한다.
성공적인 재조합체를 포함한 하나의 박테리아 군체를 1.33kb 삽입물의 부위를 서열화하기 위해 사용한다. pTZ-KF1(ET1.1)로 명명된 이러한 분리물은 American Type Culture Collection에 기탁되어 있고, 기탁번호는 ATCC 기탁번호 no. 67717이다. 표준 디데옥시 시퀸싱 과정 및 EcoRI 부위를 플랭킹하는 서열을 위한 프라이머를 사용하여, 삽입물의 3'-말단 영역 및 5'-말단 영역으로부터 약200내지 250 염기쌍의 서열을 얻는다. 이 서열은 II.절에 기재된 것과 같다. 동일한 기술에 의한 차후의 서열화는 상기 제시된 바와 같이 양쪽 방향에서의 완전서열을 제공한다.
[실시예 4]
[ET-NANB 서열의 검출]
비감염 및 ET-NANB 로 감염된 시노몰거스 원숭이의 담즙에서 분리한 cDNA 단편 혼합물을 상기와 같이 제조한다. 인분시료로부터 얻은 cDNA 단편을 아래와 같이 제조한다. ET-NANB 발명의 결과로서 ET-NANB로 감염된 것으로 진단된 멕시코인의 개체로부터 얻은 30㎖의 10% 대변 현탁액, 건강하고, 비-감염된 개체로부터 같은 부피의 대변을 30% 수크로오스 밀도 구배큐션 상에 층상으로 만들고, 15℃에서 SW27 회전자에서 6시간 동안 25,000xg로 원심분리시킨다. 감염원의 대변으로부터 얻은 펠렛화된 재료는 감염된 대변시료내에 ET-NANBM 감염의 특성인 27내지 34㎚ VLP입자를 함유한다. RNA를 감염 및 비감염 시료 양쪽에서 수크로오스 구배 펠렛으로부터 분리하고, 분리된 RNA는 실시예 1에 기재된 것과 같은 cDNA단편을 생산하는데 사용된다.
감염 및 비-감염된 담즙원, 및 감염 및 비-감염된 인분원으로부터 분리된 cDNA단편 혼합물을 미국 특허출원 제07/208,512호(1988.6.17.출원)[DNA Ampli
fication and Subtraction Technique]에 기재된 신규의 링커/프라이머 복제 방법에 의해 각각 증폭시킨다. 간략하게, 각 시료의 단편을 DNA Pol 1으로 블런트 끝처리한 다음, 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 상기 블런트 끝처리된 재료를 다음 서열을 갖는 링커와 연결시킨다 :
이중사슬 단편을 Nrul으로 절단시켜 링커 이합체를 제거하고, 5'-GGAATTCGCGGCCGCTCG-3' 서열을 갖는 프라이머와 혼합한 다음, 열변성시키고 상온으로 냉각시켜 단일가닥 DNA/프라이머 복합체를 형성한다. 상기 복합체를 Thermus aquaticus(Taq) 중합효소 및 4개의 모든 데옥시누클레오티드의 부가에 의해 복제시켜 이중사슬의 단편을 형성한다. 성공적인 가닥 변성, 가닥/프라이머 복합체의 형성 및 복제를 포함하는 복제 과정을 25번 되풀이한다.
증폭된 cDNA 서열을 2% 아가로우즈 매트릭스를 사용하여 아가로우즈 겔 전기 영동법에 의해 분획화한다. 아가로우즈 겔로부터 니트로셀룰로오즈 페이퍼로 DNA 단편을 이전시킨 후에, (i) EcoRI으로 pTZ-KF1(ET1.1)프라스미드를 처리하고, (ii) 방출된 1.33Kb ET-NANB 단편을 분리하고, (iii) 분리된 단편을 무작위로 표지화하여 제조된, 무작위 표지된32P 프로브에 상기 필터를 하이브리드시킨다. 프로브 하이브리드화는통상적인 서던 블롯팅(Southern blotting)(Maniatis, pp.382-389)에 의해 수행된다. 제2도는 감염(I) 및 비감염(N) 담즙원(2A), 및 감염(I) 및 비감염(N) 인분원(2B)으로부터의 cDNAs에의해 얻어지는 하이브리드 패턴을 나타낸다. 위도면에서 보는바와 같이, ET-NANB 프로브는 양쪽의 감염원에서 얻은 단편과 하이브리드 하지만, 비감염원 중 하나로부터 얻은 서열과는 상동이 아니며, 이로부터 유래된 서열의 특이성을 확인하였다.
사람 및 시노몰거스 원숭이의 DNA로부터의 게놈 DNA단편과 방사선 표지된 1.33Kb 단편의 서던 블롯팅이 준비되었다. 게놈 단편 혼합물에 하이브리드하는 어떠한 프로브도 발견되지 않았으며, 이로부터 ET-NANB 서열이 사람 또는 시노몰거스 원숭이의 게놈에 외인성인 것을 확인하였다.
[실시예 5]
[ET-NANB 단백질 발현]
A. ET-NANB 코딩 서열의 제조
실시예 2의 pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드를 EcoRI 으로 절단하여 1.33Kb ET-NANB 삽입물을 제거하고, 상기 삽입물은 겔전기 영동법에 의해 직쇄화된 플라스미드로부터 정제하였다. 정제된 단편을 표준 절단 완충용액 (0.5M Tris HCI, pH 7.5; 1㎎/㎖ BSA ; 10mM MnCl2)에 약 1㎎/㎖의 농도로 현탁시키고 실온에서 약5분동안 DNAse 1으로 절단한다. 이러한 반응조건은 주로 100내지 300 염기쌍 단편을 생산하는데 필요한 인큐베이션 시간이 결정되는, 선행 보정연구로부터 결정된다. 상기 재료를 에탄올 침전 전에 페놀/클로로포름으로 추출시킨다. 절단 혼합물내의 단편을 실시예 1에서와 같이 블런트 끝처리하고 EcoRI 링커로 연결시킨다. 얻어진 단편을 PhiX174/Haelll 및 람다/Hindlll 사이즈 마커(size marker)를 사용하여 1.2% 아가로우즈 겔 위에서 전기 영동법(5-10V/cm)에 의해 분석한다. 100 내지 300bp 분힉을 NA45 스트립(Schleicher과 Schuell)으로 용리시키고, 이것을 용리액(1M NaCl, 50mM 아르기닌, pH 9.0)을 가진 1.5㎖ 마이크로 튜브로 위치시키며, 67℃에서 30 내지 60분동안 인큐베이션한다. 용리된 DNA를 페놀/클로로포름으로 추출시킨 다음, 2배 부피의 에탄올로 침전시킨다. 펠렛을 20㎕ TE(0.01M Tris HCl, pH 7.5 0.001M EDTA)에 재현탁시킨다.
B. 발현벡터에서의 클로닝
람다 gf11 파아지 벡터(Huynh)를 Promega Biotec(Madison, WI)으로부터 입수한다. 이러한 클로닝 벡터는 베타-갈락토시다아제 번역 종결코돈으로부터의 53개 염기쌍 업스트림에 특이적 EcoRI 클로닝 부위를 갖는다. 상기의 게놈단편을 0.5 내지 1.0㎕의 EcoRI으로 절단된 gt11,0.3 내지 3㎕의 상기 크기의 단편, 0.5㎕의 10× 연결반응 완충 용액(위와 동일), 0.5㎕의 리가아제 (200units), 및 증류수를 5㎕로 혼합시켜 EcoRI 부위로 도입한다. 이 혼합물을 14℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 다음, 표준방법(Maniatis, pp. 256-268)에 따라 시험관내에서 패키징한다.
패키징된 파아지를 Dr. Kevin Moore, DNAX(Palo ALTO, CA)로부터 입수한 E. coli 균주 KM392를 감염시키는데 사용한다. 다른 방법으로, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC # 37197)로부터 입수가능한 E. Coli 균주 Y1090 이 사용될 수 있다. 감염된 박테리아를 플레이팅시키고 얻어진 콜로니들을 표준 X-gal 기질 플라크 검정 방법(Maniatis)을 사용하여 X-gal의 존재하에 베타-갈락토시다아제 활성의 손실(투명한 플라크)에 대해 검사한다. 약 50%의 파아지플라크가 베타-갈락토시다아제 효소활성의 손실(재조합체)임을 나타낸다.
C. ET-NANB 재조합 단백질의 스크리닝
ET-NANB 회복 항혈청을 멕시코, 보르네오, 파키스탄, 소말리아 및 미얀마에서 발명한 ET-NANB 에 감염된 환자들로부터 얻는다. 이 혈청을 ET-NANB를 가진 몇몇 다른 환자들로부터 채취한 대변 시료에서의 VLPs와 면역반응시킨다.
약 104pfu의 파아지 원액으로 감염시킨 E. coli KM392 세포의 로운(lawn)을 150㎜ 플레이트 상에서 준비하고 37℃에서 5내지 8시간 s동안 인큐베이션하고 전화시킨다. 상기 로운을 니트로셀룰로오스 용지로 덮어 발현된 ET-NANB 재조합단백질을 플라크에서 용지로 이동시킨다. 대응하는 플레이트와 필터위치를 일치시키기 위해 플레이트와 필터를 인덱스(index)하였다.
필터를 TBST 완충액(10mM 트리스, pH 8.0, 105mM 염화나트륨, 0.05% Tween20)으로 2회 세척하고, AIB(1% 젤라틴을 첨가한 TBST 완충액)으로 블로킹한 후, TBST로 다시 세척하고 항혈청(12-15㎖/플레이트, AIB 중에서 1:50으로 희석시킨 것)을 부가한 후 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 상기 필터를 TBST로 두 번 세척하고 효소로 표지화된 항-인간 항체와 접촉시켜 항혈청에 의해 인지되는 항원을 포함하는 필터 위치에 상기 표지화한 항체를 부착시킨다. 마직막 세척후, 필터를 5㎖의 알칼리성 포스파타제 완충용액(100mM 트리스, pH9.5, 100mM 염화나트륨, 5mM 염화마그네슘)내의 16㎕의 BCIP(5℃에서 유지한 50㎎/㎖ 원액)과 혼합된 33㎕의 NBT(5℃로 유지한 50㎎/㎖ 원액)를 함유하는 기질배지에서 전개시킨다. 자주색이 항혈청에 의해 인지되는 바와 같은 항원 생성 위치에 나타난다.
D. 스크리닝 플레이팅
전 단계에서 결정한 항원 생성 지역을 82㎜ 플레이트 상에서 약 100-200 pfu로 재플레이팅시킨다. NBT-BCIP 전개 과정을 통해 5-8시간 인큐베이션하면서 시작한 상기 단계를 ET-NANB 항체와 반응가능한 항원을 분비하는 파아지 플라크를 정제하기 위해 반복실시한다. 확인한 플라크를 찍어내어 파아지 완충액에서 용리시킨다(Maniatis, p.443)
E. 에피토프의 확인
실시예 2로부터 얻은 pTZ-KF1(ET1.1) 원플라스미드에서 유도된 일련의 서브클론은 상기 설명한 것과 같은 기술을 이용하여 분리한다. 이러한 5개의 서브클론 각각을 C. 편에서 언급한 바 있는 항-ET 항혈청 집단으로 면역반응시킨다. 상기 서브클론들은 앞서 설명된 후방서열의 짧은 서열을 포함한다. 서브클론내 시발점 및 종말점의 서열(완전한 길이의 후방서열과 관련됨)은 하기표에서 확인된다.
표 1에서 확인된 모든 유전자 서열은 에피토프에 대한 코딩 서열을 포함해야 하므로 에피토프에 대한 코딩 서열이 누클레오티드 594(5'-말단)과 643(3'-말단)사이의 영역내에 존재한다는 것은 분명하다. 따라서 상기 코딩 영역을 이용하여 펩티드가 생성되기 때문에, 비교적 짧은 상기 서열과 동등하거나 상보적인 유전자 서열은 특히 본 발명의 바람직한 양태이다.
완전히 상이한 에피토프를 확인하는 두 번째의 일련의 클론들은 멕시칸(Mexican)혈청으로 분리시킨다.
상기 에피토프에 대한 코딩 시스템은 누클레오티드 2(5'-말단)과 101(3'-말단) 사이에 존재한다. 따라서, 상기 코딩영역을 이용하여 펩티드를 생성하기 때문에, 상기 짧은 서열과 관련된 유전자 서열이 또한 바람직하다.
본 발명은 특정 구체예, 방법, 구성 및 사용에 관하여 기술하고 있지만, 본 발명으로부터 크게 벗어남 없이 이 분야의 당업자들이 다양한 변화 및 수정을 할 수 있다는 것은 자명하다.

Claims (13)

  1. E. coli 균주 BB4에서 운반되고, ATCC 기탁번호 67717을 갖는 pTZ-KF1(ET1.1)플라스미드내에 존재하는 1.33 kb DNA EcoRI 삽입물내의 코딩 서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드.
  2. 하기의 제1서열, 제2서열, 제3서열, 또는 제4서열 또는 이들에 상보적인 서열을 갖는 이중사슬 DNA내의 코딩영역에 의해 코드화되는 재조합 폴리펩티드;
    제1서열
    제2서열
    제3서열
    제4서열
  3. a) 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 간염 바이러스 병원체로 감염된 개체내에 존재하는 항체아 면역 반응하며, b) E. coli 균주 BB4에서 운반되고, ATCC 기탁번호 67717을 갖는 pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드내에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물내의 코딩서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드.
  4. a) 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 간염 바이러스 병원체로 감염된 개체내에 존재하는 항체와 면역 반응하며, b) E. coli 균주 BB4에서 운반되고, ATCC 기탁번호 67717을 갖는 pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드내에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물내의 코딩서열에 의해 코드화되는 펩티드 항원을 제공하는 단계; (b) 피보험자로부터 얻은 혈청을 상기 항원과 반응시키는 단계; (c) 항체와 결합된 항원의 존재를 조사하는 단계를 포함하는, 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 간염 바이러스 병원체에 의한 감염을 피험자에서 검출하는 방법
  5. 제4항에 있어서, 상기 혈청 항체는 lgM 또는 lgG 항체 또는 이들의 혼합물이고, 제공되는 항원은 지지체에 부착되어 있으며, 상기 반응 단계는 혈청을 지지체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 조사 단계는 지지체 및 결합된 혈청 항체를 리포터로 표지화된 항-인간 항체와 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. E. coli 균주 BB4에서 운반되고, ATCC 기탁번호 67717을 갖는 pTZ-KF1(ET1.1)플라스미드내에 존재하는 1.33 kb DNA EcoRI 삽입물과 상동인 DNA 단편.
  7. 하기의 제1서열, 제2서열, 제3서열 또는 제4서열 또는 이들과 상보적인 서열내의 이중사슬 DNA 단편과 상동인 DNA 단편 :
    제1서열
    제2서열
    제3서열
    제4서열
  8. 제7항에 있어서, 상기 단편이 상기 제1서열 중 누클레오티드 2에서 101, 상기 제2서열 중 누클레오티드 594에서 643또는 상기 코딩 서열에 상보적인 서열과 상동인 코딩 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  9. 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 간염 바이러스 병원체의 존재를 생물학적 시료에서 검출하는 방법으로서, (a) 샘플로부터 유래한 이중사슬 DNA 단편 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 이중사슬 단편을 변성시키는 단계; (c) 상기 변성된 단편에 E.coli 균주 BB4에서 운반되고 ATCC 기탁번호 67717을 갖는 pTZ-KF1(ET1.1) 플라스미드 내에 존재하는 1.33 kb DNA EcoRI 삽입물과 상동인 영역을 포함하는 게놈을 가지며, 장을 통해 감염되는 간염 바이러스 병원체로부터 유래한 DNA 이중사슬 단편의 반대방향 가닥들의 비-상동 영역에서 유래한 한쌍의 단일가닥 프라이머를 첨가하는 단계; (d) 상기 프라이머를 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 간염 바이러스 병원체로부터 유래한 DNA 이중사슬 단편의 반대방향 가닥들의 상동 서열 영역에 하이브리드시키는 단계; (e) 프라이머가 히이브리드된 단편 가닥들을 DNA 누클레오티드 존재하에서 DNA 중합효소와 반응시켜, 프라이머 서열을 포함하는 새로운 DNA 이중사슬을 형성시키는 단계; 및 (f) 상기 변성시키는 단계, 첨가하는 단계, 하이브리드시키는 단계 및 이중사슬을 형성시키는 단계를 원하는 정도의 서열증폭에 도달할 때까지 반복하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 프라이머가 상기 플라스미드내 EcoRI 이중사슬 삽입물의 반대방향 가닥들로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 간염 바이러스 병원체로 감염된 배양 세포의 샘플내에서 바이러스 병원체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 바이러스 병원체 또는 상기 병원체로부터 생성된 핵산 단편을 분리하는 방법에 있어서, 상기 병원체의 공급원으로서 장을 통해 감염되는 비-A형/비-B형 간염에 감염된 시노몰거스 원숭이로부터 수득한 담즙을 이용함을 특징으로 하는 방법.
  13. E. coli 균주 BB4에서 운반되고, ATCC 기탁번호 67717을 갖는pTZ-KF1(ET1.1)플라스미드내에 존재하는 1.33 kb DNA EcoRI 삽입물내의 코딩 서열에 의해 코드화되는 단백질로 면역시킨 인간으로부터 수득한 인간의 다중클론성 항혈청.
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