TWI816315B - 表現新型冠狀病毒sars-cov-2蛋白質的大腸桿菌 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 940692；本發明之大腸菌係表現新型冠種病毒的核殼蛋白，可以用於製備檢測抗新型冠狀病毒抗體的製品。
Description
本發明係有關於一種表現新型冠狀病毒SARS-COV-2蛋白質的大腸桿菌，其係可以大量表現SARS-COV-2的核殼蛋白。
新型冠狀病毒(SARS-COV-2)的基因體約29~30Kb，包含了四個結構蛋白質的基因，結構蛋白質分別是棘蛋白(spike，S蛋白)、套膜蛋白(envelope，E蛋白)、膜蛋白(membrane，M蛋白)以其核殼蛋白(nucleocapsid，N蛋白)。新型冠狀病毒感染人類後會造成上呼吸道症狀，且症狀嚴重者還會導致肺炎、肺纖維化等傷害；目前確定人體是否感染新型冠狀病毒的方法，是利用即時定量聚合酶鏈鎖反應(real-time polymerase chain reaction)偵測人類的鼻咽樣本中是否帶有新型冠狀病毒的核酸。然而，部分新型冠狀病毒的感染者屬於輕症患者或是沒有明顯症狀表現，且其體內的病毒核酸也可能被排出，因此無法以即時定量聚合酶鏈鎖反應得知其是否感染過新型冠狀病毒；但是針對此類型的個體，可以藉由偵測其體內抗新型冠狀病毒抗體的表現，判斷該個體是否已經感染過新型冠狀病毒、或是推斷其可能的感染期間。又，在人體施打疫苗之後，也需要藉由被施打者體內的
抗體表現，以判斷該疫苗誘發免疫能力的效果，因此目前亟需要準備適合的抗原，以製備偵測新型冠狀病毒抗體的產品。
此外，目前開發的新型冠狀病毒疫苗，包含了核酸疫苗與蛋白質疫苗，在蛋白質疫苗的開發上，也需要製備具有又導免疫反應的新型冠種病毒蛋白質或是胜肽；例如中國專利第CN 111718951(A)號公開案為一種重組新型冠狀病毒COVID-19的棘蛋白(S蛋白)、其製備方法及應用，是利用酵母菌作為宿主，表現新型冠狀病毒的S蛋白，以作為抗體試劑的開發或是做為疫苗的抗原。但，新型冠種病毒的結構蛋白並不只有S蛋白，目前並沒有表現其他新型冠狀病毒的相關研發。
今，發明人即是鑑於目前用於表現新型冠狀病毒蛋白質的方法仍有不足之處，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，其可以大量表現SARS-COV-2的棘(spike)蛋白或是核殼(nucleocapsid)蛋白。
本發明之表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌係寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC940692。
於本發明之一實施例中，此大腸桿菌表現新型冠狀病毒的核殼(nucleocapsid)蛋白。
於本發明之一實施例中，此大腸桿菌係將一帶有新型冠狀病毒的核殼蛋白基因的質體DNA轉化(transform)到一大腸桿菌中所獲得。
於本發明之一實施例中，係為在培養該大腸桿菌時，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以誘發該帶有新型冠狀病毒的核殼蛋白基
因的質體DNA表現該核殼蛋白基因。
於本發明之一實施例中，質體DNA上帶有的核殼蛋白的去氧核醣核酸序列係為SEQ ID NO：14。
於本發明之一實施例中，該質體DNA所表現的核殼蛋白的胺基酸序列係為SEQ ID NO：15。
於本發明之一實施例中，核殼蛋白為重組蛋白質，且帶有組氨酸標籤(His tag)。
藉此，本發明藉由將表現SARS-COV-2核殼蛋白的基因進行密碼子優化之後，以提高其在大腸桿菌內的轉錄能力，進而提高其在大腸桿菌內的表現量。
第一圖：以PCR擴增SARS-COV-2基因片段之洋菜膠電泳分析照片。
第二圖：以PCR篩選帶有正確質體DNA菌落的洋菜膠電泳分析照片。
第三圖：分析大腸桿菌表現SARS-COV-2蛋白質之SDS-PAGE分析照片(一)。
第四圖：分析大腸桿菌表現SARS-COV-2蛋白質之SDS-PAGE分析照片(二)。
第五圖：偵測感染者血清中抗S蛋白RBD片段IgG分析照片。
第六圖：偵測感染者血清中抗S蛋白RBD片段IgM分析照片。
第七圖：偵測感染者血清中抗S蛋白S2片段IgG分析照片。
第八圖：偵測感染者血清中抗S蛋白S2片段IgM分析照片。
第九圖：偵測感染者血清中抗N蛋白IgG分析照片。
第十圖：偵測感染者血清中抗N蛋白IgM分析照片。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。又下述具體實施例，係用於進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
一、質體DNA建構
本實驗中，是以是使用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)擴增(amplification)COV-SARS-2棘蛋白的去氧核醣核酸(後簡稱DNA)片段以及核殼蛋白DNA片段，以DH5 α/pUC57-SE的DNA lysate作為擴增COV-SARS-2棘蛋白DNA的模板(template)，且使用DH5 α/pET15b-NE的DNA lysate作為擴增COV-SARS-2核殼蛋白DNA的模板，其中DH5 α/pUC57-SE是帶有COV-SARS-2棘蛋白DNA片段的質體DNA(pUC57-SE)的DH5 α菌株，以及DH5 α/pET15b-NE是帶有COV-SARS-2核殼蛋白DNA片段的質體DNA(pET15b-NE)的DH5 α菌株菌株是從中華民國中央研院所獲得；又因後續用來表現COV-SARS-2蛋白質的生物體為大腸桿菌，因此本發明將進一步擴增的棘蛋白或是核殼蛋白的基因序列進行密碼子優化(codon optimization)，以提高蛋白質在大腸桿菌中的表現能力，但是密碼子優化後的核酸序列，最後表現的蛋白質胺基酸序列，會與COV-SARS-2蛋白質的胺基酸序列完全相同。
請參見表一，為本案序列表之序列編號以及其對應序列，並簡單敘述如下：用於擴增棘蛋白N端區域(N-terminal domain，後簡稱NTD)DNA片段的引子(primer)序列為SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2、且獲得可表現棘蛋白NTD的DNA序列為SED ID NO：3；用於擴增棘蛋白受體結合區域(receptor binding domain，後簡稱RBD)DNA片段的引子序列為SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：5，且獲得可表現棘蛋白RBD的DNA序列為
SEQ ID NO：6；用於擴增棘蛋白S2區域(S2 domain，後簡稱S2)DNA片段的引子序列為SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8，且獲得可表現棘蛋白S2的DNA序列為SEQ ID NO：9；用於擴增棘蛋白R3區域(R3 domain，後簡稱R3)DNA片段的引子序列為SEQ ID NO：10與SEQ ID NO：11；以及擴增核殼蛋白DNA片段的引子序列為SEQ ID NO：12與SEQ ID NO：13，且獲得的核殼蛋白基因序列為SEQ ID NO：14。又，所表現的核殼蛋胺基酸序列為SEQ ID NO：15。表一中、引子序列中注記的「F」代表「前置(forward)引子」，引子序列中注記的「R」代表「反置(reverse)引子」。
請參見第一圖，分別為核殼蛋白與棘蛋白的不同DNA片段、經過PCR擴增後的洋菜膠電泳分析圖，以初步確定擴增出來的DNA片段為所需要的片段，其中NTD代表棘蛋白的N端區域(N-terminal domain)、RBD代表棘蛋白的受體結合區域(receptor binding domain)、S2代表棘蛋白的S2區域(S2 domain)、R3代表棘蛋白的區域3(Region 3)以及N代表核殼蛋白。
接著，將擴增後的DNA片段自洋菜膠中純化，並與限制酶(restriction enzyme)作用後，再以連接酶(ligase)將DNA片段分別與具有對應酵素缺口的質體DNA骨架pQE80L(Qiagen,Hilden,Germany)進行黏接，以獲得不同的質體DNA，並分別將其命名為pSE-NTD、pSE-RBD、pSE-S2、pSE-R3以及pNE。
二、SARS-COV-2蛋白質表現菌株製備
將上述製備的質體DNA，分別轉化(transform)到編號為ATCC53868的大腸桿菌DH5為標準菌株，再將轉化後的菌液塗抹到LB洋菜培養平板上(LB agar plate)，於37℃培養箱內培養約16小時；接著將培養平板上生長的單一菌落(colony)選出，進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)，並將擴增後的產物進行洋菜膠電泳分析，以確認轉化後的菌落是否帶有質體DNA；請參見第二圖，為各菌落的電泳分析圖，其中菌落#10帶有pSE-NTD，菌落#17、#21以及#25帶有pSE-RBD，菌落#27、#30、#32、#35、#37、#38以及#41帶有pSE，菌落#57帶有pNE，以及菌落#129、#164、#178、#187帶有pSE-R3；這些菌落會再被放大培養，並且抽取其質體DNA以進行DNA定序，確認其質體DNA中帶有DNA片段的序列正確性；經過定序，上述菌株的質體DNA中確實都帶有對應的DNA片段，且其序列也都正確，又其中菌落#57被命名為pNE57。
三、純化SARS-COV-2蛋白質表現菌株所表現的SARS-COV-2蛋白質
將帶有質體DNA的菌株，先塗抹到LB洋菜培養平板上，於37℃培養箱內培養約16小時；接著再沾取培養平板上生長的單一菌落，培養於0.5mL的LB培養基內，並於37℃培養箱內培養震盪培養約14-16小時，以獲得一種子菌液；將種子菌液加入50mL新鮮的LB培養基內，並於37℃培養箱內震盪培養，直到菌液的OD600吸光值達到0.6；於菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside，後簡稱IPTG)，且IPTG的終濃度為1mM；再繼續於37℃培養箱內震盪培養3小時，之後將菌液取出並以4000g的轉速離心15分鐘，並移除上清液，將細菌沉澱物保存於-80℃；此外，同時培養一組沒有添加IPTG的菌液，作為對照組。
萃取細菌內總蛋白質的方法簡述如下：將上述獲得的細菌沉澱物先以一結合溶液(binding buffer)回溶，將其放置於-80℃冷凍，再取出並放置於室溫解凍，並重複三次此「冷凍-解凍」的步驟，上述結合溶液的成分為5mM咪唑(imidazole)、0.5mM氯化鈉(NaCl)以及20mM Tris-HCl(pH8.0)的水溶液；接著以超音波、於4℃環境處理上述經過三次冷凍-解凍處理的菌液，以將菌體破碎，並將超音波處理後的菌液於4℃環境、轉速17000g離心30分鐘；保留上清液，即獲得細菌總蛋白質溶液，並以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析。
此外，因為本發明所表現的SARS-COV-2的蛋白質上融合了組氨酸標籤(His-tag)，因此上述獲得的細菌總蛋白質溶液可進一步的以鎳親合層析法(Ni-affinity chromatography)進行純化，將細菌內表現的病毒重組蛋白質純化出來；最後，純化前後所得到的產物，都以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析。
請參見第三圖與第四圖，為帶有pSE-NTD、pSE-RBD、pSE-R3、pSE-S2以及pNE57質體的菌株的SARS-COV-2蛋白質表現分析，是將進行SDS-PAGE後的電泳凝膠、以考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue)
染劑染色之後所得到的電泳凝膠，其中「Non-I」為未添加IPTG培養的細菌的總蛋白質，「I」為添加IPTG培養的細菌的總蛋白質，而「P」為添加IPTG培養的細菌總蛋白質、經過鎳親合層析法純化後的蛋白質樣本；又本試驗中，帶有pNE質體的菌株為pNE57菌株。根據第三圖，帶有pSE-NTD質體的菌株蛋白質，純化後的樣本中，於分子量29.8KDa處可以觀察到少量S蛋白NTD片段的表現；而帶有pSE-RBD質體或是帶有pSE-R3質體的菌株蛋白質，純化後的樣本中，分別於分子量27.9KDa處或是分子量14.8KDa處觀察到S蛋白RBD片段或區域3(R3)片段的表現。又請參見第四圖(A)，帶有pSE-S2質體的菌株蛋白質，純化後的樣本中，於分子量66.6KDa處可以觀察到S蛋白的S2片段表現；第四圖(B)的結果顯示，pNE57菌株，添加IPTG的組別、於純化前便可以在分子量46.4KDa處觀察到大量核殼蛋白(N蛋白)的表現，其表現量約占總蛋白質的30%，而經過純化後的樣本中，更是可純化出大量的N蛋白。
四、患者的血清辨識以細菌表現的SARS-COV-2的S蛋白或N蛋白之測試
此試驗中，先將上述經過純化後的S蛋白RBD片段、S蛋白S2片段、以及純化後的N蛋白，分別進行SDS-PAGE電泳，之後再將電泳凝膠中的蛋白質轉移到聚偏氟乙烯膜(poly(vinylidene fluoride)membrane)上，並以購買自Acess Biologicals,USA公司的SARS-COV-2感染者的血清套組(Mitek,COVID-19 Panel,2X Pane l1.1,PW：56435)作為一級抗體，再分別以抗IgG抗體或是抗IgM抗體作為二級抗體進行免疫點墨法(Immunoblotting)，觀察患者血清辨識本發明以大腸桿菌表現的S蛋白RBD片段、S蛋白S2片段、以及N蛋白的情形。其中，進行電泳時，每一個樣本中包含1.5μg的S蛋白RBD片段、8.5μg的S蛋白S2片段、以及0.5μg的S蛋白RBD片段；又，所購買的SARS-COV-2感染者的血清套組中，編號第1~15的樣本為感染者的血清，編號第16的樣本為正對
照組(positive control)，以及編號第17、18的樣本為負對照組(negative control)。
請先參見第五圖，所使用的15個感染者血清中、7個樣本中有辨識S蛋白RBD片段的IgG抗體；又第六圖顯示，15個感染者血清中、9個樣本中有辨識S蛋白RBD片段的IgM抗體。根據第七圖，15個感染者血清中、9個樣本中有辨識S蛋白S2片段的IgG抗體；又第八圖顯示，15個感染者血清中、僅1個樣本中有辨識S蛋白RBD片段的IgM抗體。參見第九圖，15個感染者血清中、13個樣本中有辨識N蛋白的IgG抗體；又第十圖顯示，15個感染者血清中、12個樣本中有辨識N蛋白的IgM抗體。
請再參見表二，為可偵測到各蛋白質的樣本編號、以及所偵測到的訊號強度；表格中「-」代表沒有訊號，「+」代表有訊號，且「+」越多，代表訊號強度越強。
根據第五圖至第十圖以及表二，可得知感染者的血清中都具有辨識S蛋白或是N蛋白的抗體，但是感染者血清中具有辨識N蛋白質抗體者的人數遠高於具有辨識S蛋白抗體的人數，顯然N蛋白更適合作為檢測患者是否感染過SARS-COV-2的分子。
由上述之實施說明可知，本發明利用大腸桿菌表現新型冠狀病毒的S蛋白的不同片段與N蛋白，都能夠成功表達所要表現的蛋白質，其中又以N蛋白的表現情形最佳；此外，以SARS-COV-2感染者的血清進行測試，其對於N蛋白的反應情形也比對S蛋白的反應佳，即本發明以大腸桿菌表現的N蛋白可以被應用於製造偵測抗SARS-COV-2抗體是否存在的檢測套組、以判斷該個體是否感染過SARS-COV-2。因本案挑選的各菌株中，pNE57菌株具有大量表現N蛋白的能力，本案申請人便將其寄存於財團法人法人食品工業發展研究所，獲得的寄存編號為BCRC 940692。
又，本發明使用之大腸桿菌做為表現SARS-COV-2蛋白質的宿主，因大腸桿菌的培養方法簡單，也容易大量培養，除了容易大量表現SARS-COV-2蛋白質之外，也能降低所需要的成本。
綜上所述，本發明表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
國內寄存資訊
財團法人食品工業發展研究所
民國110年1月28日
寄存編號BCRC 940692
Claims (7)
- 一種表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 940692。
- 如請求項1所述之表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，係表現新型冠狀病毒的核殼(nucleocapsid)蛋白。
- 如請求項2所述之表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，其中該大腸桿菌係將一帶有新型冠狀病毒的核殼蛋白基因的質體(plasmid)轉化(transform)到一大腸桿菌中所獲得。
- 如請求項3所述之表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，係為在培養該大腸桿菌時，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷以誘發該帶有新型冠狀病毒的核殼蛋白基因的質體DNA表現該核殼蛋白基因。
- 如請求項3所述之表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，其中該質體DNA上帶有的核殼蛋白基因去氧核醣核酸序列係為SEQ ID NO：14。
- 如請求項5所述之表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，其中該質體DNA所表現的核殼蛋白的胺基酸序列係為SEQ ID NO：15。
- 如請求項2所述之表現新型冠狀病毒(SARS-COV-2)蛋白質的大腸桿菌，其中該核殼蛋白為重組蛋白質，且帶有組氨酸標籤(His tag)。
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| TW111107578A TWI816315B (zh) | 2022-03-02 | 2022-03-02 | 表現新型冠狀病毒sars-cov-2蛋白質的大腸桿菌 |
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- 2022-03-02 TW TW111107578A patent/TWI816315B/zh active
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