KR20160145508A - 광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자 - Google Patents

광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질의 서로 다른 에피토프 부위를 규명하였고, 이에 결합하는 결합 분자 및 이들을 혼합한 칵테일이 다양한 광견병 바이러스를 대상으로 중화 능력을 보유하고 있음을 확인하였다.

Description

광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자{Epitopes of rabies virus glycoprotein and a binding molecule able to neutralize rabies virus specifically binding to epitopes thereof}
본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질(glycoprotein)의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자에 관한 것이다.
광견병(rabies)은 바이러스성 인수공통 감염병이며, 주로 야생 및 애완 동물에 영향을 미칠 뿐 아니라 인간을 포함한 포유류에게 영향을 미쳐 급성 뇌 질환의 원인이 된다. 한 번 발생하면 거의 사망에 이르는 치명적인 질병으로, 에이즈와 더불어 치사율이 가장 높은 질병으로 알려져 있다. 이러한 광견병은 전세계적으로 퍼져 있으며, 매년 천만 명 이상이 감염 후 치료를 받으며 매년 40,000명에서 70,000명이 사망한다.
광견병은 타액과 피로 전염되는데, 주로 광견병에 감염된 개 또는 고양이 등에 물리게 되면 발병한다. 또한, 스컹크, 박쥐 등 대부분의 포유류에 의해 감염될 수 있다.
광견병 바이러스(rabies virus)는 신체의 말단 신경 조직을 통해 뇌 신경 조직으로 도달한 뒤 실제 발병 증상을 나타낸다. 원래 인간의 뇌에는 혈액 내 장벽(blood brain barrier)이 존재하여 외부 물질을 차단하기 때문에 바이러스 등이 침투할 수 없으나, 광견병 바이러스는 RVG(rabies virus glycoprotein) 단백질을 통해 혈액 내 장벽을 통과하여 중추신경계(central nervous system) 뇌를 감염시킨다.
초기에는 감기와 비슷한 증상 이외에, 물린 부위에 가려움증이나 열을 느낀다. 광견병이 진행되면서 불안감, 공수증(물 등의 액체를 삼키게 되면 근육이 경련을 일으키고 심한 통증을 느껴 물을 두려워하는 증상), 바람에 대한 두려움(바람이 감각 기관을 과민하게 함), 흥분, 마비, 정신 이상 등의 신경 이상 증상이 나타난다. 또한 햇빛에 과민 반응을 일으키기도 한다. 이러한 증상이 관찰된 지 2-7일 뒤에 전신의 신경이나 근육이 마비를 일으켜 혼수 상태에 빠지고, 결국 호흡장애로 사망하게 된다.
광견병에 노출된 후의 처치로는 교상 후 치료법(노출 후 예방요법)이 있다. 교상 후 치료법은 즉각적인 국소 상처 보호와 수동면역을 위한 항체 투여(항-광견병 이뮤노글로블린: 이하 "anti-rabies antibody"라 칭함), 능동 면역을 위한 백신 투여로 이루어져 있다. 현재 개발된 anti-rabies antibody는 인간 유래 광견병 항체(human derived rabies immunoglobulin: 이하 "HRIG"라 칭함)와 말 유래 광견병 항체(equine derived rabies immunoglobulin: 이하 "ERIG"라 칭함)가 있다. HRIG의 경우 공급이 원활하지 않으며 고가인데다 다클론 항체(polyclonal antibody)여서 단위 무게 당 효능이 높지 않다. 또한, 인간의 혈액에서 유래한 것이기 때문에 HIV 등 인간 유래 질병의 잠재적 감염 위험성이 높다. ERIG의 경우 HRIG보다 저가이기는 하나, HRIG보다도 치료 효율이 낮아 훨씬 높은 용량으로 환자에게 투여된다. 이러한 이유로 인간과는 다른 동물인 말에서 유래한 항체이므로 과민증(anaphylaxis)을 일으킬 수 있다. 이와 같이 원활하지 못한 공급과 다클론 항체가 갖는 단점을 극복하고자 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있은 단일 항체(monoclonal antibody)의 사용이 제안되었다. 1980년 대에 광견병-바이러스 중화 뮤린 단일 항체가 개발되었으나(Schumacher CL et al., J. Clin. Invest. Vol. 84, p. 971-975, 1989), 인체 내에서의 짧은 반감기와, 항체에 의한 체내 면역반응의 부재, 인간 항-뮤린 항체(HAMA ; human anti-mouse antibody)의 유도 등의 단점으로 인간 환자에 대한 직접적인 투여에는 제한되어 있다.
또한, WHO에서는 기존의 HRIG이나 ERIG을 교체하기 위해 몇 가지 권고사항을 제시하였다(WHO Consultation on a Rabies Monoclonal Antibody Cocktail for Rabies Post Exposure Treatment. WHO, Geneva, 23-24 May 2002). 그 중 단일 항체가 광견병 치료제가 되기 위해서는 2-3개의 항체가 칵테일화되어 광견병 바이러스 표면 당단백질에 서로 다른 부위에 결합해야 함을 제안하였다.
따라서 효과적인 광견병 치료를 위하여, 혈액에서 유래하지 않아 잠재적 감염에 대한 안전성이 높으며, 배양을 통한 생산으로 대규모 생산 공급이 가능하고, 효능을 갖는 항체만으로 구성되어 균일한 품질 확보와 단위량 당 효능이 높은 인간 단일클론 항체 및 다양한 광견병 바이러스를 대비한 혼합 칵테일의 개발이 시급한 실정이다.
이에 상기의 문제점들을 해결하고자, 본 발명자들은 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 인간 항체(대한민국 특허 출원번호 10-2014-0178030 참조)의 에피토프가 광견병 바이러스 G 단백질(서열번호 2 참조)의 아미노산 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번 위치 또는, 아미노산 331 및 333번 위치임을 확인하였고, 상기 서로 다른 에피토프에 결합하는 두 종류의 항체를 혼합한 항체 칵테일의 중화 능력을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 형질전환되어, 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 세포주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 이용한 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 세포주를 배양하여 상기 결합 분자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 이용한 광견병 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는
a) 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 제 1 결합 분자; 및
b) 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 제 2 결합 분자
를 포함하는 광견병 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는
a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 조성물을 투여하는 단계;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시에 투여하는 단계; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 순차적으로 투여하는 단계
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 광견병 바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명의 일 구체예는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프일 수 있고, 보다 구체적으로 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는 1X10-8 M 미만의 결합친화도(KD)를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5x10-9 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는
a) 서열번호 3의 CDR1 영역, 서열번호 4의 CDR2 영역, 및 서열번호 5의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및/또는
b) 서열번호 6의 CDR1 영역, 서열번호 7의 CDR2 영역, 및 서열번호 8의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 서열번호 15의 가변영역 및/또는 서열번호 16의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 서열번호 19의 중쇄 및/또는 서열번호 20의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프일 수 있고, 보다 구체적으로 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도(KD)를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-13 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-13 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다.
상기 결합친화도(KD)는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들면 BIACORE 시스템을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는
a) 서열번호 9의 CDR1 영역, 서열번호 10의 CDR2 영역, 및 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및/또는
b) 서열번호 12의 CDR1 영역, 서열번호 13의 CDR2 영역, 및 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 서열번호 17의 가변영역 및/또는 서열번호 18의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 서열번호 21의 중쇄 및/또는 서열번호 22의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 가변영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)] 참조). 본 발명에 사용된 CDR 결정은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 결합 분자도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 이것의 단편일 수 있다. 또한, 상기 결합 분자는 Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있으나, 이것에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서는 광견병 바이러스에 결합하는 완전한 인간 항체(fully human antibody)를 제공한다. 본 명세서에서 항체는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상(intact) 단일클론 항체, 다클론 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로, 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 항체의 기능적 변이체를 포함한다. 항체들은 변이체들이 광견병 바이러스 또는 이것의 G 단백질에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있다면 본 발명의 항체의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 생체외(in-vitro) 또는 생체내(in- vivo) 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품을 포함하며, 이들은 본 발명의 부모 단일클론 항체에서는 발견되지 않는다. 이와 같은 변형으로는 예를 들어 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 및 인산화 등이 포함된다. 기능적 변이체는 선택적으로 부모 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 더욱이 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체(truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 광견병 바이러스 또는 이것의 G 단백질에 결합할 수 있다. 일 예로, 골격구조, 초가변(Hypervariable) 영역, 특히 CDR 3 영역을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 가변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 일반적으로 경쇄 또는 중쇄 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 기능적 변이체는 본 명세서의 부모 항체와 약 50%~99%, 약 60%~99%, 약 80%~99%, 약 90%~99%, 약 95%~99%, 또는 약 97%~99% 아미노산 서열 동질성을 가질 수 있다. 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit 등을 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 일반 분자생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 광견병 바이러스는 개, 소, 몽구스, 박쥐, 스컹크, 너구리, 코요테, 여우 및 늑대로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 개체에서 유래될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate)를 제공한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체에 약물이 추가로 부착될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 항체는 약제가 결합된 항체-약물 접합체(conjugate)의 형태로 사용될 수 있다. 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체(Antibody Drug Conjugate, ADC), 즉 면역접합체를 사용하게 되면 상기 약물 모이어티를 감염된 세포에 표적화 전달할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 접합시키지 않은 채로 투여하게 되면, 정상 세포에 대해서도 허용될 수 없는 수준의 독성이 야기될 수 있기 때문이다. 약물-연결성 및 약물-방출성뿐만 아니라 다클론 항체(polyclonal antibody) 및 단일클론 항체(monoclonal antibody, mAb)의 선택성을 높임으로써 ADC의 최대 효능과 최소 독성을 개선할 수 있다.
약물 모이어티(Moiety)를 항체에 부착시키는, 즉 공유 결합을 통하여 연결시키는 통상적인 수단으로는, 일반적으로 약물 모이어티가 항체 상의 수많은 부위에 부착되는 불균질한 분자 혼합물이 유발된다. 예를 들어, 세포독성 약물을 전형적으로, 종종 항체의 수 많은 리신 잔기를 통하여 항체와 접합시켜 불균질한 항체-약물 접합체 혼합물을 생성시킬 수 있다. 반응 조건에 따라서, 이러한 불균질한 혼합물은 전형적으로, 약물 모이어티에 부착된 항체 분포도가 0 내지 약 8 이상이다. 또한, 특별한 정수비의 약물 모이어티 대 항체를 수반한 접합체의 각 아군은, 약물 모이어티가 항체 상의 각종 부위에 부착되는 잠재적으로 불균질한 혼합물이다. 항체는 크고, 복잡하며 구조적으로 다양한 생체 분자이고, 종종 많은 반응성 관능기를 갖고 있다. 링커(Linker) 시약 및 약물-링커 중간체와의 반응성은 pH, 농도, 염 농도 및 조용매와 같은 요인들에 의해 좌우된다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일 예로 본 발명은 상기 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
상기 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 항체의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드(Polynucleotide) 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터(Expression vector)를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터로는 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 벡터(한국특허등록 제10-1076602호 참조) 및 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 선택된 발현 벡터를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하며, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입시 인산칼슘 트랜스펙션(Transfection), 바이러스 감염, DEAE-Dextran 조절 트랜스펙션, 리포펙타민(Lipofectamin) 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커(Maker)를 함유하나 이에 제한되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터도 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선택되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 결합 분자의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그(Tag) 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 형질전환되어, 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 상기 세포주를 배양하는 단계; 및
b) 발현된 결합 분자를 회수하는 단계
를 포함하는 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포주는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 상기 포유동물 세포로는 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 및 HEK293T 세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 숙주 세포로 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 광견병 바이러스 중화 능력을 가지는 결합 분자 이외에 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 당업자에게 이미 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 적어도 하나의 다른 광견병 치료제를 포함할 수 있으며, 또한 여러 종류의 단일클론 항체를 포함할 수 있으며, 이를 통해 중화 활성에 상승 작용을 나타낼 수 있다.
아울러, 본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 상기 치료제로는 항-바이러스 약제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 약제로는 항체, 소분자, 유기 또는 무기 화합물, 효소, 폴리뉴클레오티드 서열, 항-바이러스성 펩티드 등일 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 무균하고 안정하며, 전달 시 또는 전달 전에 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제 중에 재구성을 위해 분말 형태로 존재할 수 있다. 살균성 주사용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 구성성분의 분말과 이의 미리 살균-여과된 용액으로부터 추가의 원하는 구성성분을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 본 발명의 의약 조성물은 용액 상태일 수 있고, 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 단위 투여량 주사형을 제공하기 위해 전달되기 전 또는 전달 시에 첨가 및/또는 혼합될 수 있다. 바람직하게 본 발명에 사용되는 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 약물농도에 알맞고, 알맞은 흐름성을 유지할 수 있고, 필요에 따라 흡수가 지연될 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물 투여의 최적 경로 선택은 의약 조성물 내의 활성 분자들의 물리-화학적 특성, 임상적 상황의 긴급성 및 원하는 치료용 효과에 대한 활성 분자의 플라즈마 농도의 관계를 포함하는 여러 인자들에 의해 영향을 받는다. 예를 들어 본 발명의 단일클론 항체는 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같은 그들의 신속한 방출을 막은 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한 단일클론 항체는 항체의 불활성화를 막은 물질 또는 화합물로 코팅되거나 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 적합한 담체-리포좀 또는 희석제-와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 투여 방법은 경구 및 비경구로 나뉠 수 있으며, 일 예로 투여 경로는 정맥 내일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 경구 형태로는 정제, 트로키제, 약용 드롭스제, 수성 또는 유성 현탁제, 산제 또는 분산과립제, 에멀젼제, 강성 캡슐제, 연성 젤라틴 캡슐제, 시럽제 또는 엘릭서제, 필제, 당의정, 액제, 겔제 또는 슬러리제로서 제제화될 수 있다. 이들 제형은 불활성 희석제, 과립화 또는 붕해제, 결합제, 광택제, 보존제, 착색제, 풍미제 또는 감미제, 식물성유 또는 미네랄유, 습윤제 및 점증제를 함유하는 약제학적적으로 허용 가능한 부형제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 비경구 형태로는 수성 또는 비수성 등장성 살균 비독성 주사 또는 주입 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 용액 또는 현탁액은 적용된 투여량 및 농도에서 수용체에 비독성인 1,3-부탄디올, 링거스 용액, 행크스 용액, 등장성 염화나트륨 용액과 같은 약제, 오일, 지방산, 국소마취제, 보존제, 완충액, 점도 또는 용해도 증가제, 수용성 항산화제, 유용성 항산화제 및 금속 킬레이트화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 투여량은 처리되는 대상, 질병 또는 상태의 심각도, 투여의 속도 및 처방 의사의 판단에 따른다. 일 예로 유효성분으로서 결합 분자는 포유 동물에 대해 하루 0.001 내지 10 mg/kg(체중), 또는 0.005 내지 1 mg/kg(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 비경구적으로 투여될 수 있다. 경우에 따라, 상기 언급된 범위보다 적은 투여량이 보다 적합할 수 있고, 해로운 부작용을 일으키지 않으면서도 보다 많은 양이 사용될 수 있으며, 보다 많은 투여량의 경우는 하루에 걸쳐 수회의 적은 분량으로 분배될 수 있다.
진단용 의약 조성물에 사용되는 본 발명의 결합 분자는 검출 가능하게 표식되는 것이 바람직하다. 생분자들을 표식시키는데 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들이 당 분야에 잘 알려져 있다. 검출 방법들로는 오토라디오그래피, 형광 현미경, 직접 및 간접 효소반응 등이 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로 사용되는 검출 분석법으로는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소 방법이 있다. 이들은 그 중에서도 웨스턴블롯팅, 오버레이-분석법, RIA(Radioimmuno Assay) 및 IRMA(ImmuneRadioimmunometric Assay), EIA(Enzyme Immuno Assay), ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA(Fluorescent Immuno Assay) 및 CLIA(Chemioluminescent Immune Assay)이 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 상기 결합 분자; 및
b) 용기
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단, 예방 또는 치료용 키트에 있어서, 상기 b)의 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 결합 분자는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체로는 다공성 또는 비다공성. 평면 또는 비평면일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상 시료와 상기 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 단계 a)의 결과를 분석하여 광견병 감염 여부를 판별하는 단계
를 포함하는 광견병 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 상기 샘플은 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 대상에게 상기 결합 분자를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 광견병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
예를 들어, 광견병 위험지역을 여행할 때 본 발명의 인간 단일 항체를 투여함으로써 1일, 2일, 3일 또는 수일 내에 광견병 바이러스에 대한 면역성을 부여할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상 시료와 상기 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 결합 분자가 대상 시료에 특이적으로 결합하는지 측정하는 단계
를 포함하는 광견병 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 광견병 바이러스 검출 방법에 있어서, 상기 대상 시료는 (잠재적) 감염 대상으로부터의 혈액, 혈청, 타액, 가래, 침, 땀, 조직 또는 다른 생물학적 물질을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다. (잠재적) 감염 대상은 인간 대상일 수 있지만, 또한 광견병 바이러스의 담체로써 의심되는 동물들일 수 있다. 대상 시료는 먼저 그것을 검출 방법에 더 적절하게 만들기 위해 조작될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 분자 또는 이뮤노컨쥬게이트는 결합 분자와 광견병 바이러스 또는 대상 시료에 존재하는 그것의 항원성 성분 사이의 면역학적 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 대상 시료와 접촉된다. 대상 시료 내의 광견병 바이러스의 존재를 나타내는 면역학적 복합체의 형성은 적절한 수단에 의해 검출되고 측정된다. 이러한 방법으로 방사면역측정법(RIA), ELISA, 면역형광법, 면역 조직 화학, FACS, BIACORE, 웨스턴 블롯 분석과 같은 면역분석이 있지만, 이것에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 제 1 결합 분자; 및
b) 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 제 2 결합 분자
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물(이하 "칵테일 조성물")을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 칵테일 조성물은 상기 a) 제 1 결합 분자와 b) 제 2 결합 분자를 농도 비율 1:9 내지 9:1로 포함할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 칵테일 조성물은 1:3 내지 9:1로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자가 결합하는 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자가 결합하는 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 1X10-8 M 미만의 결합친화도(KD)를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5x10-9 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도(KD)를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-13 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-13 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는
a) 서열번호 3의 CDR1 영역, 서열번호 4의 CDR2 영역, 및 서열번호 5의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및/또는
b) 서열번호 6의 CDR1 영역, 서열번호 7의 CDR2 영역, 및 서열번호 8의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 서열번호 15의 가변영역 및/또는 서열번호 16의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 서열번호 19의 중쇄 및/또는 서열번호 20의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는
a) 서열번호 9의 CDR1 영역, 서열번호 10의 CDR2 영역, 및 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및/또는
b) 서열번호 12의 CDR1 영역, 서열번호 13의 CDR2 영역, 및 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 17의 가변영역 및/또는 서열번호 18의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 21의 중쇄 및/또는 서열번호 22의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있고, 상기 항체에 항-바이러스 약물이 추가로 부착될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 칵테일 조성물은 멸균 주사용액, 동결건조 제형, 사전 충전식 주사 용액제, 경구형 제형, 외용제 또는 좌제일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 칵테일 조성물을 투여하는 단계;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시에 투여하는 단계; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 순차적으로 투여하는 단계
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 당업자에게 알려진 치료제를 함께 투여할 수 있다. 본 발명의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 투여 방법은 경구 및 비경구로 나뉠 수 있으며, 일 예로 투여 경로는 정맥 내일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 항-바이러스 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항-바이러스 약물은 항-광견병 바이러스 단일클론 항체, 항-광견병 바이러스 다클론 항체, DNA 폴리머라제 저해제, siRNA 제제 또는 치료 백신일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시에 투여하는 단계;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 투여하는 단계; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 투여하는 단계
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시 투여;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 순차 투여; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 순차 투여
하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
(1) 치료적 유효량의 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물; 및
(2) a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시 투여함;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 순차 투여함; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 순차 투여함을 지시하는 패키지 삽입물(package insert)
을 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 에피토프는 상기 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 에피토프는 상기 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드에 있어서, 상기 에피토프는 그 3차원 구조를 유지하거나, 백신 등의 조성물로 이용시 효율을 제고하기 위하여 담체(carrier)와 결합된 형태로 이용 가능하다. 본 발명에 따른 담체는 생체에 적합하며 본 발명에서 목적하는 효과를 거둘 수 있는 것이라면 모두 사용 가능한데, 펩타이드, 혈청 알부민, 면역 글로불린, 헤모시아닌 및 다당체 등에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에서 제공되는 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체로 유전자 백신 형태로 이용가능하다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 전달체 없이 그 자체로 이용가능할 수도 있으며, 바이러스성 또는 비바이러스성 전달체에 담지되어 체내로 전달될 수 있다. 바이러스성 또는 비바이러스성 전달체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용가능하다고 알려진 것이면 어떤 것이라도 이용가능하다. 구체적으로 바이러스성 전달체는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(letrovirus) 등이 가능하며, 비바이러스성 벡터로는 양이온성 폴리머, 비이온성 폴리머, 리포좀, 지질, 인지질, 친수성 폴리머, 소수성 폴리머 및 이들 중에서 선택된 하나 이상의 복합체 등이 이용가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 형질 전환된 재조합 미생물 또는 바이러스를 제공한다. 일 구체예로, 상기 재조합 미생물 또는 바이러스는 재조합 대장균, 재조합 효모, 또는 재조합 박테리오 파지일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프 또는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 미생물 또는 바이러스 표면에 발현하는 방법을 제공한다. 이때 유도하는 프로모터 또는 신호 단백질을 코딩하는 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 다양한 미생물 또는 바이러스가 사용될 수 있으며, 특히 적합한 미생물 또는 바이러스는 재조합 대장균, 재조합 효모 및 재조합 박테리오 파지 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 미생물 또는 바이러스 표면에 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 미생물 또는 바이러스 표면에 발현시키기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 디스플레이(display) 기술이 이용될 수 있으며, 특히 미생물 세포 또는 바이러스 표면에 발현되도록 유도하는 프로모터 또는 신호 단백질을 인코딩하는 서열에 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시켜 발현하거나, 원래 표면에 발현되는 단백질을 인코딩하는 유전자 부위의 일부를 결손시키고 이에 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는 방법 등이 이용가능하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법으로 미생물 또는 바이러스 표면에 발현된 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프는 그 자체로 분리, 정제되어 본 발명에 따른 특정한 용도로 사용할 수 있으며, 표면에 발현된 상태로 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하여 수득하는 용도로도 이용가능하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물 또는 바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 에피토프를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 에피토프, 또는 이 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 광견병 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 폴리펩타이드에 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝하는 방법은 임의의 면역분석법에 의해, 예를 들어, ELISA, 조직 또는 세포(형질주입된 세포를 포함)의 염색에 의해, 중화 분석(neutralization assay)에 의해 또는 목적으로 하는 특이성 또는 기능을 확인하기 위해 업계에서 잘 알려진 다른 방법들 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 광견병 바이러스 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 면역보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 면역보조제로는 체내에 주입시 항체 형성을 증진시키는 역할을 하여 본 발명에서의 목적 달성이 가능한 것이라면 어떤 것이라도 사용 가능하며, 알루미늄염(Al(OH)3, ALPO4), 스쿠알렌(squalene), 소르비탄 (sorbitane), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), CpG, 리포좀, 콜레스테롤, MPL(monophosphoryl lipid A), GLA(glucopyranosyl lipid A)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 본 발명에서 사용되는 단어를 아래와 같이 정의한다.
본 발명에서 사용되는 "결합 분자"라는 용어는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로믈린, 예를 들면 광견병 바이러스 또는 바이러스 외부의 G 단백질(Glycoprotein) 또는 그의 단편과의 결합을 위해 온전한 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 잔기, 5개 이상의 연속 아미노산 잔기, 10개 이상의 연속 아미노산 잔기, 15개 이상의 연속 아미노산 잔기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
항원-결합 단편은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로블린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 "에피토프"라는 용어는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로서, 본 명세서와 청구의 범위에 사용된 바와 같이 단일 또는 복수 펩타이드를 함유하는 펩타이드 물질을 의미하고, 본 명세서에 설명되고 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 데이터 및 이의 변형체를 갖고, 본 명세서와 청구의 범위에 설명된 활성 프로필을 갖는 펩타이드까지 포함한다. 따라서, 활성이 거의 동등하거나 변경된 활성을 나타내는 단백질도 이와 같은 의미로 해석되어야 한다. 이러한 변형은 고의적인 것, 즉 부위 지시된 돌연변이유발을 통해 수득한 변형이거나, 또는 우연한 것, 즉 복합체 또는 이의 지정된 서브유닛의 생산자인 숙주에서 돌연변이를 통해 수득된 것일 수 있다. 변형체를 비롯한 에피토프를 포함하는 펩타이드의 변형을 형성시키고 검사하는 방법으로서, 즉 부위 지시된 돌연변이유발 또는 랜덤 돌연변이유발 등은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"라는 용어는 용인 가능한 또는 편리한 투약 형태를 제조하기 위한 약물, 제제 또는 결합 분자와 같은 활성 분자로 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 비독성이거나, 적어도 독성이 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 이의 의도된 용도를 위해 허용될 수 있는 부형제이고, 약물, 제제 또는 결합 분제를 포함하는 제형화의 다른 성분과 양립할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "치료적 유효량"이라는 용어는 광견병 바이러스의 노출 전 또는 노출 후에 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 결합 분자의 양을 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 샷건 돌연변이법을 이용하여 신호 펩티드를 제외한 광견병 바이러스 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번 위치를 다른 아미노산 잔기로 치환하였을 때 본 발명에 따른 항체와의 결합능이 현저히 떨어지는 것을 확인함으로써, 이 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프임을 규명하였다. 또한, 샷건 돌연변이법을 이용하여 상기 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 331 및 333번 위치를 다른 아미노산 잔기로 치환하였을 때 본 발명에 따른 또 다른 항체와의 결합능이 현저히 떨어지는 것을 확인함으로써, 이 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프임을 규명하였다. 아울러, 상기 두 항체를 혼합한 항체 칵테일의 경우 서로 다른 에피토프에 결합하여 간섭 없이 광견병 바이러스에 대한 중화 능력을 가짐을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 에피토프 및 이에 결합하는 결합 항체, 이들의 항체 칵테일이 광범위한 개체에서 유래된 광견병 바이러스에 감염된 환자를 치료하는데 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질의 서로 다른 에피토프 부위를 규명하였고, 이에 결합하는 결합 분자 및 이들을 혼합한 칵테일이 다양한 광견병 바이러스를 대상으로 중화 능력을 보유하고 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는 광견병 진단, 예방 또는 치료에 유용하다.
도 1은 동물실험에서 SV2 바이러스에 대한 마우스의 생존율을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예 1: 항체의 에피토프 규명
대한민국 특허 출원번호 10-2014-0178030의 실시예 4에서 최종 선별된 4개의 항체 중 2개의 항체(이하 "항체 1" 또는 "항체 2" 라 칭함)의 에피토프를 규명하기 위하여, 광견병 바이러스 G 단백질(서열번호 1 참조) 내의 단일 돌연변이를 유발시키고, 각 돌연변이체들에 대한 항체 1 및 항체 2의 결합능력을 조사하였다. 각 돌연변이체의 제조 및 항체 1 및 항체 2의 결합능력 분석은 미국의 인테그랄 몰레큘라(integral Molecular) 사의 샷건 돌연변이법(shoutgun mutagenesis, J Am Cehm Xoc. 2009; 131(20): 6952-6954 등 참조)을 이용하였다.
샷건 돌연변이법은 진핵 세포 내의 돌연변이된 표적 단백질의 라이브러리의 발현 및 분석이 가능하다. 즉, 표적 단백질 중의 모든 잔기를 각각 다른 아미노산으로 돌연변이 시키고, 포유류 세포주에 발현하여 단일클론항체(MAb) 결합 또는 기능에서의 변화를 분석할 수 있다.
샷건 돌연변이법은 두 단계로 진행하였는데, 먼저 야생형 광견병 바이러스 CVS-11 주의 G 단백질 발현 플라스미드를 제조하여 포유류 세포주에 발현시킨 후 항체 1 및 항체 2의 결합능력 분석을 위한 항체 농도를 최적화하였다.
그런 다음 샷건 돌연변이법을 이용하여 광견병 바이러스 CVS-11 주의 G 단백질 내 아미노산 잔기 각각을 다른 아미노산으로 치환시킨 돌연변이 라이브러리(이하 "단일 돌연변이 라이브러리" 라 칭함)를 제작하고 항체에 대한 결합능력을 분석하여 항체 1 및 항체 2의 에피토프를 확인하였다.
실시예 1-1: 광견병 바이러스 G 단백질을 발현하는 플라스미드 제작
플라스미드는 광견병 바이러스 CVS-11 주의 G 단백질을 발현하는 유전자(Genbank Ref # AAC34683.1)를 사용했으며 발현 유무를 확인하기 위해 C-말단에 V5/HIS6를 태그하였다. 그 다음, HEK293 세포에서 상기 플라스미드를 발현하였다. HEK293 세포에 해당 플라스미드를 일시적으로 트랜스펙션 시켜서 하루 동안 양성 대조군인 광견병 바이러스 G 단백질체를 발현하는 구조물(WT RABV)과 음성 대조군인 벡터(vector) 만 포함된 플라스미드를 384 웰 플레이트에서 배양하였다.
실시예 1-2: 광견병 바이러스 G 단백질의 단일 돌연변이 라이브러리 제작
샷건 돌연변이법을 이용하여 신호 펩티드(signal peptide)를 제외한 광견병 바이러스 G 단백질(서열번호 2 참조)의 1 내지 505번 위치의 아미노산 잔기 각각이 다른 아미노산으로 치환된 단일 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. 플라스미드로 상기 실시예 1-1에서 제작한 플라스미드를 부모 플라스미드로 사용하였다. 돌연변이 발현 전략으로 알라닌 스캐닝 돌연변이법(Alanine Scaning Mutagenesis)를 진행하여 505 돌연변이 클론(이하 "알라닌 스캐닝 돌연변이" 라 칭함)을 제작하였다. 알라닌 스캐닝 돌연변이 방법이란 단백질의 아미노산을 알라닌으로 치환하여 특정 부위의 아미노산이 전체 단백질의 기능, 안정성 혹은 외부 반응에 미치는 기여도를 평가하는 방법이다. 또한, 탈출 돌연변이 바이러스(escape mutant virus) 실험 방법(대한민국 특허 출원번호 10-2014-0178030 참조)으로 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 34, 210, 331, 336 및 413번 위치 각각을 알라닌이 아닌 다른 아미노산 잔기로 치환한 단일 돌연변이 클론(이하 "맞춤형 돌연변이" 라 칭함)을 제작하였다. 따라서, 하기 [표 1]과 같이 총 라이브러리 크기는 512 돌연변이 클론들로 구성이 되었다.
에피토프 규명을 위해 사용된 라이브러리 특성
클론 명칭 클론 설명 클론 수
알라닌 스캐닝 돌연변이 광견병 G 단백질의 아미노산 1-505 각각 → Ala(A) 치환
광견병 G 단백질의 마이노산 1-505 내 Ala(A) → Ser(S) 치환		 505
맞춤형 돌연변이 광견병 G 단백질의 아미노산 34 Gly(G) → Val(V) 치환 7
광견병 G 단백질의 아미노산 34 Gly(G) → Glu(E) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 34 Gly(G) → Arg(R) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 210 Val(V) → Glu(E) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 331 Ser(S) → Leu(L) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 336 Asn(N) → Lys(K) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 413 Glu(E) → Asp(D) 치환
총 수 512
*상기 아미노산 위치는 광견병 바이러스 G 단백질의 신호 펩티드를 제외하고 넘버링한 위치임
실시예 1-3: 항체의 에피토프 확인
실시예 1-3-1: 알라닌 스캐닝 돌연변이를 이용한 항체의 에피토프 확인
항체 1 및 항체 2의 에피토프를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제작한 알라닌 스캐닝 돌연변이 라이브러리를 이용하여 항체 1 및 항체 2와의 결합능력을 분석하였다.
상기 실시예 1-2에서 제작한 알라닌 스캐닝 돌연변이 라이브러리와 항체 1 및 항체 2의 결합 확인을 위해 면역 형광 FACS 분석을 수행하였고, 2번 반복으로 돌연변이를 선별하였다.
에피토프 분석을 위한 실험에 항체 1 및 항체 2의 전체 항체 몸체를 그대로 사용했을 시 해당 분석에 변별력이 떨어져 이를 극복하고자, 항체 1 및 항체 2에 파파인(papin)을 처리하여 항체의 Fc 부분을 제거하고 Fab 부분만 남은 항체 1의 Fab 및 항체 2의 Fab를 사용하기로 결정하였다. Fc 부분이 제거된 Fab를 이용하여 실험하였기 때문에 분석 검출하기 위한 2차 항체는 Fab-특이적 AlexaFluor488 접합 2차 항체(Jackson Immunoresearch Alexafluor488 Goat anti-human F(ab')2 fragment)를 사용하였다.
또한, 에피토프 분석을 위한 실험에 항체 1의 Fab 최적 농도는 0.33 ug/ml, 항체 2의 Fab 최적 농도는 0.33 ug/ml으로 하여 분석을 수행하였다. 대조군 항체로는 Abcam 1C5(Abcam Inc.)와 QED 20501(QED Bioscience Inc.) 항체를 사용하였고, 대조군 항체 Abcam 1C5의 최적 농도는 0.25 ug/ml, 대조군 항체 QED 20501의 최적 농도는 0.5 ug/ml로 하여 분석을 수행하였다.
라이브러리 선별에서 상기 실시예 1-1의 양성 대조군에 대한 결합 반응성에 대비하여, 대조군 항체 Abcam 1C5 또는 QED 20501의 80% 초과 발현이면서 동시에 항체 1의 Fab 또는 항체 2의 Fab의 15% 미만 발현된 알라닌 스캐닝 돌연변이를 선별하였다.
돌연변이 결합 반응성(% WT)
항체 1 Fab 항체 2 Fab Abcam 1C5 Mab QED 20501 MAb
E33A 1.3 59.3 81.2 93.4
G34A -0.3 95.9 98.2 91.7
C35A 3.9 83.7 101.6 94.9
L38A 5.4 130.2 127.6 113.8
A200S 10.5 102.9 109.1 87.6
K202A 4.2 132 113 105.5
L215A 6.6 100.1 101.7 100.0
R333A 68.6 5.4 103.1 109.1
그 결과, [표 2]에 나타낸 바와 같이, 항체 1의 경우 총 7 알라닌 스캐닝 돌연변이를 선별하였고, 상기 선별된 돌연변이를 통해 항체 1의 에피토프 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번 위치임을 확인하였다.
또한 항체 2의 경우 총 1 알라닌 스캐닝 돌연변이를 선별하였고, 기 선별된 돌연변이를 통해 항체 2의 에피토프 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 333번 위치임을 확인하였다.
실시예 1-3-2: 맞춤형 돌연변이를 이용한 항체의 에피토프 확인
항체 1 및 항체 2의 에피토프를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 제작한 맞춤형 돌연변이 라이브러리를 이용하여 항체 1 및 항체 2와의 결합능력을 분석하였다.
상기 실시예 1-2에서 제작한 맞춤형 돌연변이 라이브러리와 항체 1 및 항체 2의 결합 확인을 위해 상기 실시예 1-3-1과 같이 면역 형광 FACS 분석을 수행하여 돌연변이를 선별하였고, 선별 결과를 하기 [표 3]에 나타내었다. Anti-V5 의 경우 발현 백터가 올바르게 광견병 바이러스 G 단백질의 발현 여부를 확인하는 분석 대조군으로 사용되었다.
돌연변이 결합 반응성(% WT)
항체 1 Fab 항체 2 Fab Abcam 1C5 MAb QED 20501 MAb Anti-V5
G34V 2.1 108 101 74.6 91.9
G34E 1.4 138 167 124 75.2
G34R 1.4 76.6 120 56.7 72.3
V210E 23.9 8.3 1.6 -1 85.9
S331L 60.5 -0.1 82.3 50.4 111
N336K 85.3 101 84.4 59 96.1
E413D 78.6 77.7 115 40.7 80.4
그 결과, [표 3]에 나타낸 바와 같이, 항체 1의 경우 3 맞춤형 돌연변이를 선별하였고, 상기 선별된 돌연변이를 통해 항체 1의 에피토프 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 34번 위치임을 확인하였다.
또한, 항체 2의 경우 1 맞춤형 돌연변이를 선별하였고, 상기 선별된 돌연변이를 통해 항체 2의 에피토프 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 331번 위치임을 확인하였다.
실시예 1-3-3: 항체의 에피토프 확인 결과
상기 실시예 1-3-1 및 1-3-2의 결과를 통해 하기 [표 4]와 같이 항체 1의 에피토프가 광견병 바이러스 G 단백질(서열번호 2)의 아미노산 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번 위치임을 확인하였고, 항체 2의 에피토프가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 331 및 333번 위치임을 확인하였다.
광견병 바이러스 결합 부위는 광견병 바이러스의 표면 당단백질의 항원성 부위로 표시되며, 각 부위에 대해서는 광견병 당단백질의 항원성 구조는 Lafon et al.(J. Gen.Virol. 64:843-8451 1983)에 의해 최초로 정의되었다. 현재 확인된 광견병 바이러스 결합 부위는 각각 항원성 부위(antigenic site) I, II, III, IV, a로 분류되어 Marissen et al.(J Virol. 2005 Apr;79(8):4672-8.)에 의해 정의되었다.
항체 ID 아미노산 잔기 광견병 바이러스 결합 부위
No. 아미노산 변이 아미노산 위치*
항체 1 1 Glu(E)-->Ala(A) 33 알려진바 없음
2 Gly(G)-->Ala(A) 34 항원성 부위 II
3 Cys(C)-->Ala(A) 35 항원성 부위 II
4 Leu(L)-->Ala(A) 38 항원성 부위 II
5 Ala(A)-->Ser(S) 200 항원성 부위 II
6 Lys(K)-->Ala(A) 202 알려진 바 없음
7 Leu(L)-->Ala(A) 215 알려진 바 없음
항체 2 1 Ser(S)-->Leu(L) 331 항원성 부위 III
2 Arg(R)-->Ala(A) 333 항원성 부위 III
*상기 아미노산 위치는 광견병 바이러스 G 단백질의 신호 펩티드를 제외하고 넘버링한 위치임
실시예 2: 표면 플라스몬 공명 기술을 이용한 항원-항체 결합친화도 결정
표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 검정(Biocore Inc.)은 정반응 속도 상수 및 역반응 속도 상수의 역학적 측정에 의해 항체의 결합친화도를 결정하였다. 따라서, 표면 플라스몬 공명 기술을 이용하여 항체 1 및 항체 2의 항원-항체 결합친화도를 결정하였다.
구체적으로, 정제된 광견병 바이러스 G 단백질과 항체 1 및 항체 2의 결합친화도는 25℃에서 분석 완충액 HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)을 사용하는 Biacore T200 (GE Healthcare) 장비로 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정되었다. 10 mM 아세트산나트륨 (Sodium Acetate, pH 5.0) 중에 희석된 광견병 바이러스 G 단백질 50 ㎍/ml를 제조사의 지침 및 절차에 따라 아민 커플링 키트(Amine coupling kit)를 사용하여 CM5 연구용 바이오센서 칩에 약 500 RU만큼 직접적으로 고정시켰다. 바이오센서 표면에서 반응하지 않은 부분을 에탄올아민(ethanolamine)으로 차단하였다. 반응 분석을 위해 Biacore T200 콘트롤 소프트웨어, Biacore T200 이벨루에이션 소프트웨어를 사용하였다. 항체 1 및 항체 2는 HBS-EP 완충액에 희석하였다. 검정 동안에, 모든 측정은 고정된 광견병 바이러스 G 단백질이 없는 바이오센서 표면을 대조군으로 사용하였다. 결합 및 분리 속도 상수 Ka(M-1s-1) 및 Kd(s-1)은 30 ㎕/분의 유속에서 결정하였다. 속도 상수는 3배의 연속희석으로서 2.46 - 200 nM 범위의 항체 농도에서 반응 결합 측정을 실시하고 완충액을 대조군으로 사용함으로써 획득하였다. 이어서, 항체와 표적 항원 사이의 반응에 대한 평형 해리 상수 KD (M)를 반응 속도 상수로부터 다음의 등식에 의해 계산하였다: KD = Kd/Ka. 결합은 시간과 반응 속도 상수의 함수를 계산하여 기록하였다.
그 결과, [표 5]에 나타낸 바와 같이, 정제된 광견병 바이러스 G 단백질에 대하여 항체 1 및 항체 2의 결합친화도를 결정하였다. 항체 1 및 항체 2 모두 광견병 바이러스 G 단백질에 대하여 높은 친화도를 나타냄을 확인하였다.
광견병 바이러스 G 단백질을 이용한 결합친화도 측정
샘플 ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) KD AVR KD
항체 1 2.52E+05 9.39E-04 3.73E-09 4.54E-09
2.14E+05 1.15E-03 5.36E-09
항체 2 2.11E+06 0.0005743 2.72E-10 2.24E-10
1.54E+06 2.70E-04 1.75E-10
실시예 3: CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인
실시예 3-1: CR4098 항체에 대한 탈출바이러스 생성
CR4098 항체(Crucell)에 대한 DNA 서열은 특허(US7579446 참조)와 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이타베이스(database)로부터 확보하였고 엔지노믹스(Enzynomics Co.Ltd, 대전시 유성구 소재)에서 합성하여 pCT146 발현 벡터(대한민국 특허 출원번호 10-2014-0178030 참조)에 클로닝 후 셀트리온(Celltrion Inc.)으로 전달되었다. 합성된 부분의 서열은 제한효소 절단 분석과 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하였다. CR4098 항체는 F2N78 세포주에서 일시적 형질도입 방법으로 생산하였다.
세포 내 일시적 형질도입을 위하여 양이온성 폴리머(cationic polymer)인 FreeStyleTM Max(Invitrogen, 16447-100)를 사용하였으며, 제조사의 사용설명서에 따라 형질도입을 수행하였다. 형질도입 전날, EX-CELL 293 무혈청 배지(Sigma, 14571C: 이하 "EX-CELL 293 배지"라 기재함)에서 자라는 F2N78 세포(한국등록특허 제10-1005967호 참조, 특허권자: ㈜셀트리온)를 원심 분리하여, FreeStyle293 무혈청 배지(Gibco, 12338)로 배지를 교체하였으며, ㎖ 당 0.8×106 개의 세포 농도로 250 ㎖ shaker flask 두 개를 이용하여 50 ㎖씩(총 100 ㎖) 접종하였다. 형질도입 당일 날, 항체 유전자를 포함하는 pCT178 DNA 125 ㎍과 FreeStyleTM Max 시약 125 ㎕를 각각 OptiPRO SFM II(Invitrogen, 12309) 배지를 이용하여 2 ㎖ volume으로 희석한 후, 가볍게 섞어 주었다. 즉시 희석된 FreeStyleTM Max 시약 용액을 DNA가 희석되어 있는 용액에 섞은 다음, 상온에서 17분 반응하였다. 상온에서 17분 반응하는 동안, 형질도입에 사용할 접종된 F2N 세포의 수를 측정하고, 그 FreeStyle293 배지를 이용하여, 세포 농도를 1.0×106 개가 되도록 희석하였다. 17분 후, DNA와 FreeStyleTM Max 시약 혼합 용액을 F2N 세포에 처리함으로써 형질도입을 진행하였다. 형질도입 다음날, 동량의 EX-CELL 293 배지를 형질도입된 세포에 첨가하여 7일 동안 배양함으로써 CR4098 항체를 생산하였다.
이후 CR4098을 이용하여 해당 항체에 대한 탈출 돌연변이 바이러스(escape mutant virus)를 생성하는 실험을 진행하였다.
ml당 106의 감염성을 가지는 광견병 바이러스 CVS-11 주를 96 웰 세포 배양 플레이트에 연속적으로 1.5배씩 희석한 후 10~40 IU/ml의 CR4098 항체와 37℃에서 1시간 동안 반응시켜준다. 1시간 반응 후에 2x105 cells/ml의 BHK 세포를 넣어주고 3일을 배양하였다. 3일 후에 바이러스는 얻고, 세포를 고정시키고 상기 CVS-11 주가 감염되었는지 광견병 뉴클레오캡시드 단백질(Rabies Nucleocapsid protein)의 발현을 염색하여 확인하였다(Jenobiotech, 9061). 두 번째 계대(passage)에서는 첫 번째 계대에서 얻은 바이러스에 CR4098 항체의 양을 늘려 상기와 동일한 실험을 반복하였다. 첫 번째 혹은 두 번째 계대에서는 광견병 바이러스 CVS-11 주가 감염되지 않거나 소량으로 감염된 것으로 확인된 곳에서 얻은 바이러스가 CR4098 항체를 점차적으로 늘렸음에도 감염이 일어나거나 감염 정도가 증가된 것으로 확인된 바이러스 4~5 클론은 증폭(amplification)한 후 QIAamp Viral RNA Mini kit(QIAGEN, 52904)을 이용하여서 RNA를 분리하였다.
RNA를 주형(template)으로 하여 SuperScriptIII First-strand Synthesis system for RT-PCR(Invitrogen, 18080-051)를 이용하여 cDNA를 합성한 후에, Takara ExTaq(Takara, RR001A)으로 증폭한 후에 시퀀싱을 진행하였다. 시퀀싱 결과 CR4098 항체에 대한 탈출 돌연변이 바이러스의 변화된 시퀀스는 N336K에서 보였다.
실시예 3-2: CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인
상기 실시예 3-1에서 CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스(N336K)에 대하여, 항체 1 및 항체 2가 중화 능력이 있는지 확인하였다.
중화 능력 실험은 FAVNT 방법으로 진행하였다. Fluorescent Antibody Virus-Neutralizing Test (FAVNT)는 세포 배양 방법을 통해 인간이나 동물의 혈청에서 광견병 바이러스 항체의 수준을 결정짓기 위한 시험법이다.
FAVNT의 실험방법은 희석 시험 항체(또는 HRIG) 와 일정한 양의 광견병 바이러스 [100 TCID50 /0.1 ml] 와 함께 96 웰 플레이트에 넣어 60분간 반응시킨 후, 새끼 햄스터 신장 세포를 10% 우혈청이 포함된 배양배지 (Eagle's minimum essential medium)와 함께 넣고 36~48 시간 배양하였다. 배양 후에는 고정시킨 후, anti-Rabies 항체, ABC kit (VECTASTAIN)과 DAB kit (VECTASTAIN)를 사용하여 광견병 바이러스에 감염된 세포를 염색하였. 마지막으로, 염색된 웰의 숫자를 세어 정확한 중화 능력을 알고 있는 HRIG 대비 시험 항체의 중화 능력을 계산하였다.
그 결과, [표 6]에 나타낸 바와 같이, 항체 1 및 항체 2 모두는 CR4098 항체 탈출바이러스(N336K)에 중화 능력을 보였으며, 오직 CR4098 항체만 중화 능력이 없음을 확인하였다.
CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인 결과
바이러스 항체 IU /mg
CR4098 항체탈출바이러스(N336K) CR4098 모두 감염
항체 1 1352
항체 2 3081
실시예 4: 다양한 종류의 광견병 바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인
전세계에 만연한 약 50여개의 광견병 바이러스를 대상으로 항체 1 및 항체 2의 in vitro 중화 능력 실험을 수행하였으며, 이는 RFFIT를 통해 수행되었다. 그 결과는 하기 [표 7]에 나타내었다.
중화 능력 실험으로 Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT)는 광견병 바이러스 항원에 의해 노출된 항체를 측정한다. 이 중화 항체는 바이러스 겉 표면의 글라이코 단백질에 의해 유도된다. 질병관리본부는 RFFIT 방법이 신속하고 경제적이며 민감하고 재현성이 있어서 이 방법을 채택해 오고 있다.
RFFIT는 FAVNT와 마찬가지로 세포 배양 방법을 통해 인간이나 동물의 혈청에서 광견병 바이러스 항체의 수준을 결정짓기 위한 시험법이다. 면역형광염색은 바이러스 증식의 척도로 사용되며 약 20시간이 소요가 된다.
RFFIT는 혼합된 희석 시험 혈청과 일정한 양의 광견병 바이러스 [50-50% Fluorescing Foci Doses(50 FFD50)/0.1 ml] 와 함께 다중 웰이 고안된 슬라이드에서 수행되었다. 상기 혼합된 형태의 슬라이드에는 신경아세포종과 배양배지 (Eagle's minimum essential medium)와 10% 우혈청이 포함된 상태로 37℃ 이산화탄소 배양기에서 90분간 배양되었다. 전체적으로 혈청-바이러스-세포의 형태로 37℃ 이산화탄소 배양기에서 20시간 배양되었다. 이후에는 배양과 세척, 고정 그리고 광견병 바이러스 접합체(rabies conjugate)와 표식으로 염색한 뒤 형광 현미경 (fluorescence microscope)을 이용하여 관찰하였다.
다양한 종류의 광견병 바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인 결과
No. 바이러스 ID 항체 1 항체 2
Working conc.(ug/ml) 0.20
1 Mongoose RSA
Mongoose, South Africa		 Titer 270 320
IU/mL 7.7 9.1
IU/mg 7714 9143
2 Dog Tun
Dog, Tunisia		 Titer 230 270
IU/mL 2.3 2.7
IU/mg 2300 2700
3 Dog thai
Dog, Thailand		 Titer 320 1300
IU/mL 2.3 9.3
IU/mg 2286 9286
4 Dog son
Dog, Mexico		 Titer 340 1100
IU/mL 2.7 8.8
IU/mg 2720 8800
5 Phi 002 (231)
Human/dog, Philippines		 Titer 250 250
IU/mL 2.5 2.5
IU/mg 2500 2500
6 DR MX
Bat, Mexico		 Titer 250 180
IU/mL 2.4 1.7
IU/mg 2381 1714
7 DR Brazil
Bat, Brazil		 Titer 56 45
IU/mL 2.2 1.8
IU/mg 2240 1800
8 WA Bat
Bat, Washington, USA		 Titer 270 250
IU/mL 2.2 2.0
IU/mg 2160 2000
9 rv61
Human (ex, dog),UK(ex, India)		 Titer 200 280
IU/mL 1.7 2.4
IU/mg 1739 2435
10 AL Bat
Bat, California, USA		 Titer 1100 1100
IU/mL 7.6 7.6
IU/mg 7586 7586
11 AZ Bat
Bat , Arizona		 Titer 125 1300
IU/mL 1.1 11.3
IU/mg 1087 11304
12 phi dog
Human/dog, Philippines		 Titer 75 280
IU/mL 0.28 1.04
IU/mg 1389 5185
13 Rv342 China
Cow/dog, China		 Titer 280 1300
IU/mL 0.5 2.4
IU/mg 2545 11818
14 TX SK 4384
Skunk, Texas, USA		 Titer 75 250
IU/mL 0.21 0.71
IU/mg 1071 3571
15 AK FX
Arctic Fox, Alaska, USA Failed		 Titer 60 270
IU/mL 0.44 2.00
IU/mg 2222 10000
16 Gray FX-AZ (AZ fox)
Gray Fox, Arizona, USA		 Titer 16 170
IU/mL 0.53 5.67
IU/mg 2667 28333
17 323R
Dog / Coyote, Texas, USA		 Titer 60 625
IU/mL 0.33 3.47
IU/mg 1667 17361
18 RVHN
Human (ex, wolf), Russia, Arctic		 Titer 54 42
IU/mL 0.40 0.31
IU/mg 2000 1556
19 TN-269
Bat, Tennessee, USA		 Titer 145 390
IU/mL 1.16 3.12
IU/mg 5800 15600
20 China dog 2005
Dog, China		 Titer 12 13
IU/mL 0.43 0.46
IU/mg 2143 2321
21 TN410
Bat, Tennessee, USA		 Titer 19 200
IU/mL 0.51 5.33
IU/mg 2533 26667
22 Dog Arg
Dog, Argentina		 Titer 145 170
IU/mL 0.36 0.43
IU/mg 1813 2125
23 TX SK 4380
Skunk, Texas, USA		 Titer 50 70
IU/mL 0.40 0.56
IU/mg 2000 2800
24 RAC
Raccoon, Georgia, USA		 Titer 95 145
IU/mL 0.70 1.07
IU/mg 3519 5370
25 TX Coyote
Coyote, Texas, USA		 Titer 56 170
IU/mL 0.33 1.00
IU/mg 1647 5000
26 Mongoose PR
Mongoose, Puerto-Rico		 Titer 54 56
IU/mL 0.39 0.40
IU/mg 1929 2000
27 I-151
Dog, India		 Titer 125 320
IU/mL 0.74 1.88
IU/mg 3676 9412
28 Sri Lanka
Cow, Sri Lanka		 Titer 54 50
IU/mL 0.43 0.40
IU/mg 2160 2000
29 Wu ABLV
Australian bat lyssa, Genotype 7		 Titer 250 440
IU/mL 0.38 0.68
IU/mg 1923 3385
30 ABV (SM 4476)
Australian bat lyssa, Genotype 7		 Titer 54 210
IU/mL 0.40 1.56
IU/mg 2000 7778
31 3860 CA Bat
Bat, California, USA		 Titer 56 210
IU/mL 0.40 1.50
IU/mg 2000 7500
32 Gabon dog
Dog, Gabon		 Titer 65 170
IU/mL 0.41 1.06
IU/mg 2031 5313
33 CVS-11 Titer 70 250
IU/mL 0.41 1.47
IU/mg 2059 7353
34 EBLV 1 A09-3484
Genotype 5		 Titer 56 540
IU/mL 0.56 5.40
IU/mg 2800 27000
35 EBLV 2 A03-4659
Genotype 6		 Titer 54 280
IU/mL 0.60 3.11
IU/mg 3000 15556
36 Duvenhage
Genotype 4		 Titer 13 180
IU/mL 0.44 7.20
IU/mg 2200 36000
37 EBLV 1 A09-3485
Genotype 5		 Titer 50 180
IU/mL 1.85 6.67
IU/mg 9259 33333
38 EBLV 2 A09-3483
Genotype 6		 Titer 50 125
IU/mL 2.22 5.56
IU/mg 11111 27778
39 CASK
Skunk, California, USA		 Titer 50 54
IU/mL 0.40 0.43
IU/mg 2000 2160
40 Bat Ef
Bat, Pennsylvania, USA		 Titer 50 50
IU/mL 1.05 1.05
IU/mg 5263 5263
41 C1434
Bat, Alabama, USA		 Titer 19 36
IU/mL 0.51 0.96
IU/mg 2533 4800
42 VA 399
Bat, Virginia, USA		 Titer 10 50
IU/mL 0.56 2.78
IU/mg 2778 13889
43 TN 132
Bat, Tennessee, USA		 Titer 56 280
IU/mL 2.00 10.00
IU/mg 10000 50000
44 TXFX
Gray fox, TX		 Titer 56 250
IU/mL 0.41 1.85
IU/mg 2074 9259
45 I-148
Dog, India		 Titer 13 10
IU/mL 0.52 0.40
IU/mg 2600 2000
46 LC NY
Bat, New York, USA		 Titer 11 45
IU/mL 0.52 2.14
IU/mg 2619 10714
47 857r
Raccoon dog, Russia, Far East		 Titer 56 54
IU/mL 2.80 2.70
IU/mg 2800 2700
48 NC SK
Skunk, Wisconsin, USA		 Titer 280 270
IU/mL 2.24 2.16
IU/mg 2240 2160
49 MI1625
Bat, Tennessee, USA		 Titer 11 70
IU/mL 0.39 2.50
IU/mg 1964 12500
50 Myotis
Bat, Washington, USA		 Titer 230 280
IU/mL 1.64 2.00
IU/mg 8214 10000
51 ERA Titer 50 250
IU/mL 0.36 1.79
IU/mg 1786 8929
실시예 5: 인도에서 분리한 광견병 바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인
실시예 5-1: in-vitro 실험
항체 1, 항체 2 및 칵테일(항체 1 + 항체 2)을 이용하여 인도에서 창궐한 하기 [표 8]의 야생형 바이러스에 대하여 상기 실시예 4와 같이 RFFIT를 수행하였다. 실험 진행은 인도신경과학센터 (National Institute Mental Health and Science: NIMHANS) 에서 수행하였다. 각 항체는 약 1 ug의 농도로, 하기 [표 8]의 각 바이러스의 100 FFD50 로 Neuro 2 a 세포에서 실험을 진행하였다. RFFIT 결과는 세 가지 항체 모두에서 각 바이러스에 대해 중화 능력을 보였다.
인도에서 분리한 광견병 바이러스
바이러스 약칭 바이러스가 분리된 동물 바이러스가 분리된 지역
SV1 Dog Kerala, India
SV2 Dog Kerala, India
SV3 Human Karnataka, India
SV4 Human Karnataka, India
SV5 Dog Chennai, Tamilnadu ,India
SV6 Dog Chennai, Tamilnadu, India
실시예 5-2: in- vivo 실험
상기 실시예 5-1의 in-vitro 실험에 이어서 마우스에서 in-vivo 실험을 진행하였고, 하기 [표 9]에 나타낸 바와 같이 각 동물실험군에서 모든 항체는 높은 중화 능력을 나타내었다. 각 동물실험군에는 마우스 10마리씩 사용이 되었으며, 사용된 바이러스는 100 LD50(in 0.1 mL)이 사용되었다. 바이러스 접종 후 (근육 주사) 3시간 뒤에 각 항체(약 1 ug)를 동일한 곳(근육 주사)에 접종을 하였으며, 이 후 생존율은 30일까지 관찰하였다. 도 1은 동물실험에서 총 여섯 가지 바이러스(SV1~SV6) 중 SV2 바이러스에 대한 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
본 동물실험에서 SV1~SV6 바이러스의 각각에 해당되는 생존율은 [표 9]와 같다.
동물실험을 통한 인도 분리 광견병 바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인 결과
SV1 SV2 SV3 SV4 SV5 SV6
항체 1 100 100 100 100 100 100
항체 2 80 90 90 80 90 90
항체 1 +
항체 2		 100 100 100 100 100 100
대조군 0 0 0 0 0 0
실시예 6: 항체 1 및 항체 2 칵테일 간섭 효과 확인
실시예 6-1: 야생형 광견병 바이러스와 광견병 바이러스 CVS -11 주에 대한 중화 능력 확인 실험을 이용한 항체 1 및 항체 2 칵테일의 간섭 효과 확인
항체 1, 항체 2 및 칵테일(항체 1 + 항체 2)를 이용하여 12개의 야생형 광견병 바이러스와 광견병 바이러스 CVS-11 주에 대하여 상기 실시예 4와 같이 RFFIT를 수행하였다.
하기 [표 10]에 나타낸 바와 같이, 12개 야생형 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 항체 1, 항체 2 및 각각을 동일 비율로 혼합한 칵테일 모두 우수한 중화 능력을 나타내었고, 이를 통해 상기 칵테일 내 항체 1 및 항체 2가 생물학적인 중화 능력 평가에서 간섭효과가 없음을 확인하였다.
다양한 종류의 광견병 바이러스에 대한 칵테일의 중화 능력 확인 결과
No. 바이러스 항체 1
(IU/mg)		 항체 2
(IU/mg)		 칵테일(1:1)
(IU/mg)
1 LC NY Bat, New York, USA 2619 10714 8571
2 Bat Ef Bat, Pennsyl-vania, USA 5263 5263 4421
3 TX Coyote Coyote, Texas, USA 1647 5000 2500
4 I-151 Dog, India 3676 9412 5000
5 Gabon dog Dog, Gabon 2031 5313 4531
6 Sri Lanka Cow, Sri Lanka 2160 2000 2000
7 NC SK Skunk, Wisconsin, USA 2240 2160 2240
8 China dog 2005 Dog, China 2143 2321 1964
9 Dog thai Dog, Thailand 2286 9286 7857
10 phi dog Human/dog, Philippines 1389 5185 4630
11 Mongoose RSA Mongoose, South Africa 7714 9143 9143
12 Myotis Bat, Washington, USA 8214 10000 8929
13 CVS-11 2059 7353 6765
실시예 6-2: 몰 과량(Molar excess) 실험을 이용한 항체 1 및 항체 2 칵테일의 간섭 효과 확인
추가적으로 항체 1 및 항체 2가 간섭 효과가 있는지 몰 과량(Molar excess) 실험을 이용하여 확인하였다. 이를 위해 상기 실시예 6-1에서 실험한 광견병 바이러스 CVS-11 주를 대상으로 두 항체의 농도 비율을 1/9의 적은 양부터 9배 과량으로 혼합하고, 실시예 4와 같이 REFIT를 수행하여 값을 3회 측정하였다. 그 결과를 하기 [표 11] 및 [표 12]에 나타내었다.
또한 상기 항체 1 및 항체 2의 농도 비율을 달리한 시험을 통하여, 항체 1 및 항체 2의 비율을 1:9 내지 9:1로 조절하였을 경우에도 항체 1 및 항체 2 각각과 이 둘을 혼합한 칵테일 항체 모두 광견병 바이러스 중화 능력을 나타냄을 상기 [표 11] 및 [표 12]를 통해 확인하였다.
광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 칵테일의 중화 능력 확인
실험 결과 (IU/mg)(항체 1을 기준으로 측정)
구분 항체 1(%) 항체 2(%) 1 2 3 평균 표준편차
A 0 100 N/A N/A N/A N/A N/A
B 10 90 45000 34185 102556 60581 36752
C 25 75 41023 18000 23688 27570 11992
D 50 50 6837 3948 11844 7543 3995
E 75 25 2000 1519 3464 2328 1013
F 90 10 962 731 1667 1120 487
G 100 0 380 380 658 473 161
광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 칵테일의 중화 능력 확인
실험 결과 (IU/mg)(항체 2를 기준으로 측정)
구분 항체 1(%) 항체 2(%) 1 2 3 평균 표준편차
A 0 100 7793 4500 10256 7516 2888
B 10 90 5000 3798 11395 6731 4084
C 25 75 13674 6000 7896 9190 3997
D 50 50 6837 3948 11844 7543 3995
E 75 25 6000 4558 10391 6983 3038
F 90 10 8659 6580 15000 10080 4386
G 100 0 N/A N/A N/A N/A N/A
간섭 효과 확인을 위한 통계분석 방법으로 시험군과 대조군 간의 중화 능력 차이의 유의성을 평가하기 위해 다중비교 시험 방법 중의 하나인 던넷분석(Dunnett's test)을 사용하였다. 구체적으로 던넷분석에서 보정된 p-값(Adj. p-value)이 유의적 수준(significant level)인 0.05보다 크면 유의하지 않아(not significant), 비교하는 그룹간의 차이가 없음을 나타낸다. 반대로 보정된 p-값이 0.05이 보다 작으면 유의(significant)하여 비교하는 그룹간의 차이가 있음을 나타낸다. 상기 [표 11]와 [표 12]를 바탕으로 던넷분석을 수행한 결과를 각각 [표 13]과 [표 14]로 나타내었다.
하기 [표 13] 및 [표 14]에서 나타낸 바와 같이, 표 [13]에서 항체 1의 비율을 90% 이상 가져갔을 때에만 보정된 p-값이 0.05이 이하를 나타내어 항체 1의 비율 90%를 제외하고 간섭 효과가 없음을 확인하였다. 다만, 항체 1의 비율을 90% 이상인 경우 통계적으로 간섭 효과가 존재할 수 있으나, 이는 항체 1이 매우 강한 중화 능력을 가지고 있는 것에 기인한 것이지 간섭 효과에 의한 영향이라 볼 수 없다. [표 14]에서 항체 2의 비율을 높여도 모두 보정된 p-값이 0.05이 이상을 나타내어 간섭 효과가 없음을 확인하였다. 따라서, 모든 농도에서 두 항체 서로 간에 간섭 효과가 없는 것으로 판단할 수 있다.
항체 1 농도 기준 광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 다중비교시험 결과
최소제곱평균 차이
다중비교 시험 추정치 표준 오차 자유도 t 값 확률 > |t| 보정된
p-값 		결과
B vs G 60108 12961 12 4.64 0.0006 0.0024 유의함
C vs G 27098 12961 12 2.09 0.0585 0.1958 유의하지 않음
D vs G 7070.4 12961 12 0.55 0.5954 0.9718 유의하지 않음
E vs G 1855.1 12961 12 0.14 0.8886 0.9999 유의하지 않음
F vs G 647.41 12961 12 0.05 0.961 1 유의하지 않음
항체 2 농도 기준 광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 다중비교시험 결과
최소제곱평균 차이
다중비교 시험 추정치 표준 오차 자유도 t 값 확률 > |t| 보정된
p-값		 결과
B vs A -785.08 3080.8 12 -0.25 0.8032 0.9991 유의하지 않음
C vs A 1673.77 3080.8 12 0.54 0.5969 0.9723 유의하지 않음
D vs A 26.7002 3080.8 12 0.01 0.9932 1 유의하지 않음
E vs A -533.29 3080.8 12 -0.17 0.8655 0.9999 유의하지 않음
F vs A 2563.39 3080.8 12 0.83 0.4216 0.8691 유의하지 않음
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며, 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구범위의 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CELLTRION INC. <120> Epitopes of rabies virus glycoprotein and a binding molecule able to neutralize rabies virus specifically binding to epitopes thereof <130> CPD2016011KR <150> 2015/0082284 <151> 2015-06-10 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CVS-11 strain G protein <400> 1 Met Val Pro Gln Val Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Gly Phe Ser Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro 20 25 30 Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val 35 40 45 Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu 50 55 60 Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys 65 70 75 80 Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr 85 90 95 Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala 100 105 110 Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 115 120 125 Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val 130 135 140 Arg Thr Thr Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp 145 150 155 160 Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly 165 170 175 Lys Cys Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His 180 185 190 Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys 195 200 205 Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asn Lys 210 215 220 Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly 225 230 235 240 Ala Cys Arg Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp 245 250 255 Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro 260 265 270 Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu 275 280 285 His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp 290 295 300 Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu 305 310 315 320 Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile 325 330 335 Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg 340 345 350 Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly 355 360 365 Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu 370 375 380 Gly Pro Asp Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu 385 390 395 400 Gln Gln His Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His 405 410 415 Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu 420 425 430 Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly 435 440 445 Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Met Thr Ala 450 455 460 Gly Ala Met Ile Gly Leu Val Leu Ile Phe Ser Leu Met Thr Trp Cys 465 470 475 480 Arg Arg Ala Asn Arg Pro Glu Ser Lys Gln Arg Ser Phe Gly Gly Thr 485 490 495 Gly Arg Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys Val Ile Pro Ser 500 505 510 Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Ile Arg Leu 515 520 <210> 2 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CVS-11 strain G protein <400> 2 Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser 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Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp 225 230 235 240 Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln 245 250 255 Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val 260 265 270 Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu 275 280 285 Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu 290 295 300 Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys 305 310 315 320 Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn 325 330 335 Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly Arg Cys His 340 345 350 Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp 355 360 365 Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His 370 375 380 Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala 385 390 395 400 Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val 405 410 415 Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu 420 425 430 Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Met Thr Ala Gly Ala Met 435 440 445 Ile Gly Leu Val Leu Ile Phe Ser Leu Met Thr Trp Cys Arg Arg Ala 450 455 460 Asn Arg Pro Glu Ser Lys Gln Arg Ser Phe Gly Gly Thr Gly Arg Asn 465 470 475 480 Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys Val Ile Pro Ser Trp Glu Ser 485 490 495 Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Ile Arg Leu 500 505 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain CDR1 <400> 3 Arg Arg Arg Asp Tyr Trp Gly 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain CDR2 <400> 4 Ser Phe Phe His Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain CDR3 <400> 5 His Pro Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Leu Leu Leu Pro Asp Ala Phe 1 5 10 15 Asp Ser <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 light chain CDR1 <400> 6 Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 7 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light chain CDR2 <400> 13 Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 light chain CDR3 <400> 14 Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 15 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain variable region <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser 1 5 10 15 Glu Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg 20 25 30 Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Ser Phe Phe His Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Leu Glu Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Pro Ser Lys Asn Gln 65 70 75 80 Phe Ser Leu His Leu Ser Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Leu Leu Leu 100 105 110 Pro Asp Ala Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 light 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70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Lys Ser His Pro Phe Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Tyr Tyr 100 105 110 Val Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 light chain variable region <400> 18 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser 1 5 10 15 Glu Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg 20 25 30 Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Ser Phe Phe His Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Leu Glu Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Pro Ser Lys Asn Gln 65 70 75 80 Phe Ser Leu His Leu Ser Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Leu Leu Leu 100 105 110 Pro Asp Ala Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135 140 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 145 150 155 160 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 165 170 175 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 195 200 205 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 210 215 220 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 225 230 235 240 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 245 250 255 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 260 265 270 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 275 280 285 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 290 295 300 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 325 330 335 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 340 345 350 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 420 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 20 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 light chain <400> 20 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 21 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 heavy chain <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Lys Gly Asn Thr Asn Phe Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Lys Ser His Pro Phe Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Tyr Tyr 100 105 110 Val Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 195 200 205 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 22 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 light chain <400> 22 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain CDR1 <400> 23 cggcggagag actactgggg c 21 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain CDR2 <400> 24 agcttcttcc accggggcag cacctactac aaccccagcc tggaaagc 48 <210> 25 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain CDR3 <400> 25 caccccagca cccccttcgc cgagtacctg ctgctgcccg acgccttcga tagc 54 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 light chain CDR1 <400> 26 agagccagcc agagcgtgcg gagcagcctg gcc 33 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 light chain CDR2 <400> 27 ggcgccagca ccagagccac c 21 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 light chain CDR3 <400> 28 cagcagtaca gcgactggcc cctgacc 27 <210> 29 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 heavy chain CDR1 <400> 29 agctatgata tcagc 15 <210> 30 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 heavy chain CDR2 <400> 30 tggatcagca cttacaaggg taacacaaac tttgcacaaa agttccagga c 51 <210> 31 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 heavy chain CDR3 <400> 31 gccaaatccc acccgtttta cgatttttgg agtgcttact atgtccccgg tgcttttgat 60 atc 63 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 light chain CDR1 <400> 32 caggcgagtc aggacattag caactattta aat 33 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 light chain CDR2 <400> 33 gatgcatcca atttggaaac a 21 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 light chain CDR3 <400> 34 caacagtatg ataatctccc ccttact 27 <210> 35 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain variable region <400> 35 gaagtgcagc tgctgcagga aagcggccct ggcctggcca agcccagcga gacactgagc 60 ctgatctgca ccgtgtccgg cggcagcatc agccggcgga gagactactg gggctggatc 120 agacagcccc ctggcagagg cctggaatgg atcggcagct tcttccaccg gggcagcacc 180 tactacaacc ccagcctgga aagccgggtg tccatcagcg tggaccccag caagaaccag 240 ttcagcctgc acctgagcag cgtgaccgtg gccgacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 caccccagca cccccttcgc cgagtacctg ctgctgcccg acgccttcga tagctggggc 360 cagggcaccc tggtgacagt gtccagc 387 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 light chain variable region <400> 36 gacatcgtga tgacccagag ccccgccacc ctgagcgtgt ccccaggcga gagagccacc 60 ctgtcctgca gagccagcca gagcgtgcgg agcagcctgg cctggtatca gcagaggcca 120 ggccaggccc ccagactgct gatcagcggc gccagcacca gagccaccga catccctgcc 180 agactgagcg gcagcggctc cggcaccgag ttcaccctga cagtgtccag cctgcagagc 240 gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tacagcgact ggcccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 37 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 heavy chain variable region <400> 37 gaggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatgata tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaagggtaa cacaaacttt 180 gcacaaaagt tccaggacag agtcaccctt accacagaca catccacgac cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgac atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagccaaa 300 tcccacccgt tttacgattt ttggagtgct tactatgtcc ccggtgcttt tgatatctgg 360 ggccaaggga cagtggtcac cgtctcttca 390 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 light chain variable region <400> 38 gagctcgtga tgacgcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tcccccttac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321 <210> 39 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 heavy chain <400> 39 gaagtgcagc tgctgcagga aagcggccct ggcctggcca agcccagcga gacactgagc 60 ctgatctgca ccgtgtccgg cggcagcatc agccggcgga gagactactg gggctggatc 120 agacagcccc ctggcagagg cctggaatgg atcggcagct tcttccaccg gggcagcacc 180 tactacaacc ccagcctgga aagccgggtg tccatcagcg tggaccccag caagaaccag 240 ttcagcctgc acctgagcag cgtgaccgtg gccgacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 caccccagca cccccttcgc cgagtacctg ctgctgcccg acgccttcga tagctggggc 360 cagggcaccc tggtgacagt gtccagcgcc agcaccaagg gccccagcgt gttccctctg 420 gcccccagca gcaagagcac atctggcgga acagccgccc tgggctgcct ggtgaaagac 480 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 540 accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 600 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 660 accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 720 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 780 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 840 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 900 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc 960 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1020 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1080 tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1140 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1200 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1260 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1320 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1380 1380 <210> 40 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 1 light chain <400> 40 gacatcgtga tgacccagag ccccgccacc ctgagcgtgt ccccaggcga gagagccacc 60 ctgtcctgca gagccagcca gagcgtgcgg agcagcctgg cctggtatca gcagaggcca 120 ggccaggccc ccagactgct gatcagcggc gccagcacca gagccaccga catccctgcc 180 agactgagcg gcagcggctc cggcaccgag ttcaccctga cagtgtccag cctgcagagc 240 gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tacagcgact ggcccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccca gcgtgttcat cttcccaccc 360 agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480 gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctga 645 <210> 41 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 heavy chain <400> 41 gaggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatgata tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaagggtaa cacaaacttt 180 gcacaaaagt tccaggacag agtcaccctt accacagaca catccacgac cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgac atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagccaaa 300 tcccacccgt tttacgattt ttggagtgct tactatgtcc ccggtgcttt tgatatctgg 360 ggccaaggga cagtggtcac cgtctcttca gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc 420 ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag 480 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 540 cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 600 gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 660 aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 720 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 780 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 840 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 900 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 960 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1020 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1080 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1140 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1380 tga 1383 <210> 42 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 2 light chain <400> 42 gagctcgtga tgacgcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tcccccttac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

Claims (21)

  1. 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프임을 특징으로 하는 결합 분자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임을 특징으로 하는 결합 분자.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 결합 분자는 1X10-8 M 미만의 결합친화도(KD)를 가짐을 특징으로 하는 결합 분자.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 결합 분자는
    a) 서열번호 3의 CDR1 영역, 서열번호 4의 CDR2 영역, 및 서열번호 5의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 또는
    b) 서열번호 6의 CDR1 영역, 서열번호 7의 CDR2 영역, 및 서열번호 8의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
    을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프임을 특징으로 하는 결합 분자.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임을 특징으로 하는 결합 분자.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도(KD)를 가짐을 특징으로 하는 결합 분자.
  9. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 결합 분자는
    a) 서열번호 9의 CDR1 영역, 서열번호 10의 CDR2 영역, 및 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 또는
    b) 서열번호 12의 CDR1 영역, 서열번호 13의 CDR2 영역, 및 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
    을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 항체 또는 그의 단편인 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  12. a) 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 제 1 결합 분자; 및
    b) 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 제 2 결합 분자
    를 포함하고, 상기 제 1 결합 분자 와 제 2 결합 분자는 서로 다른 것인, 2 이상의 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 a) 제 1 결합 분자 : b) 제 2 결합 분자의 농도 비율이 1:9 내지 9:1임을 특징으로 하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  14. a) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시 투여;
    b) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 2 결합 분자를 순차 투여; 또는
    c) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자를 순차 투여
    하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  15. (1) 치료적 유효량의 제 12항의 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료하는 의약 조성물; 및
    (2) a) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시 투여함;
    b) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 2 결합 분자를 순차 투여함; 또는
    c) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자를 순차 투여함을 지시하는 패키지 삽입물(package insert)
    을 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 키트.
  16. 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  18. 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  20. 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드에 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 스크리닝하는 방법.
  21. 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 광견병 바이러스 백신 조성물.
KR1020160071948A 2015-06-10 2016-06-09 광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자 KR101969626B1 (ko)

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