CN110945024A

CN110945024A - Lrig-1蛋白特异性结合分子及其用途

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Publication number: CN110945024A
Application number: CN201880025780.1A
Authority: CN
Inventors: 金廷镐; 金范锡
Original assignee: Goodall T Cell Co Ltd
Current assignee: Goodall T Cell Co Ltd
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2038-04-18
Also published as: CN110945024B; JP2020517241A; WO2018194381A1; EP3613771A4; KR20180117067A; JP7276858B6; JP2020517248A; EP3613772A2; US20200048343A1; US20200131261A1; EP3613771A1; WO2018194380A2; CA3064852A1; EP3613772A4; JP7276858B2; AU2018256237A1; CN110799534A; US20220251189A1; JP7276859B2; WO2018194380A3

Abstract

本发明涉及能够与Lrig‑1蛋白特异性结合的结合分子，该蛋白位于调节性T细胞的表面。本发明提供的结合分子可以抑制调节性T细胞的功能，以有效预防、改善或治疗癌症，特别是实体瘤。与先前可商品化购得的抗Lrig‑1抗体相比，所述的结合分子具有更有效地靶向Lrig‑1蛋白的优点，且还能与之非常好的结合。

Description

LRIG-1蛋白特异性结合分子及其用途

技术领域

本发明涉及能够特异性结合富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(Lrig-1)蛋白的结合分子及其用途，所述蛋白是存在于调节性T细胞(Treg细胞)表面的蛋白。

背景技术

普遍认为，癌细胞表达多种免疫原性抗原，所述的免疫原性抗原能够诱导针对肿瘤形成的有效免疫应答。此外，肿瘤微环境中富含可以触发TLR信号转导以激活抗肿瘤反应的成分(参见Standiford TJ,Keshamouni VG(2012)打破对肿瘤的耐受性:针对TLR信号的负调节剂.肿瘤免疫学1:340-345)。这意味着在疾病的早期阶段，癌细胞可能被免疫系统识别和排斥，其中免疫系统针对发展中的肿瘤既发挥宿主保护作用又发挥肿瘤建模作用。尽管如此，癌细胞也具有多种逃避免疫监视的负调节机制，例如下调MHC分子或抗原的加工和呈递机制，所述负调节机制增加抑制性细胞因子的分泌并表达抑制性分子，从而诱导对癌细胞的免疫耐受性。因此，癌症患者通常被认为免疫力较差。因此，仍然需要开发用于逆转癌症相关免疫抑制的药剂或疗法。

同时，与常规药物相比，基于抗体的癌症疗法具有潜在的高特异性和低副作用的特征。这是因为抗体可以精确区分正常细胞与肿瘤细胞，且抗体的作用方式依赖于毒性较小的免疫抗肿瘤机制，例如细胞毒性免疫细胞的涌入和补体激活。

基于抗体的疗法的靶标必须具有特殊的特性，这些特性构成适当区分正常细胞与肿瘤细胞的基础。不待说，在开发有效且安全的抗体疗法中，理想的靶标将仅限于肿瘤细胞，或在正常组织上根本检测不到。在另一方面，高表达可能是治疗窗口的基础，而通过基因扩增证实的2型人类表皮生长因子受体(HER-2)的低副作用使得HER-2成为曲妥珠单抗(赫赛汀)的优异靶标。

已经批准用于肿瘤治疗或在临床开发中的抗体的其他靶标具有不同的特性，所述特性不是基于肿瘤细胞的靶标分子在数量上的过表达。在蛋白聚糖MUC-1抗体的情况下，在肿瘤细胞中所述靶标主链中的肽重复表位糖基化不足因而不同于其正常对应物。在CD20抗体(利妥昔单抗)、CD52抗体(坎帕斯-1H)和CD22抗体(依帕珠单抗)的情况下，抗体靶标在肿瘤细胞和正常淋巴细胞上的表达水平相当。对此，由于靶标阴性的干细胞能修复正常淋巴细胞库，因此所述抗体清除正常细胞是可以耐受的。抗体靶标的不同可及性的其他示例是癌胚抗原(CEA)和碳酸酐酶IX(CA9)。这两种抗原分别在结肠和肾脏的正常上皮细胞中表达。但是，放射性标记的成像抗体确实可以很好地区分肿瘤和正常组织，因此细胞毒性抗体具有良好的耐受性。这可能是因为CA9和CEA的表达仅限于正常上皮组织的管腔侧，而IgG抗体无法接近所述管腔侧。抗原上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)也属于这一类。作为上皮细胞的同型细胞粘附分子，它位于细胞间的空间。有趣的是，高亲和力的抗Ep-CAM抗体具有很高的毒性，而中亲和力的抗体具有良好的耐受性。这表明，不仅Ep-CAM靶向正常细胞的可及性，抗体结合的动力学也可能会打开新的治疗窗口。

已有八种抗体被批准用于治疗与肿瘤组织相关的疾病，但大多数针对淋巴瘤和白血病(Adams,G.P.和Weiner,L.M.(2005)Nat.Biotechnol.23,1147-1157)。只有三种单克隆抗体，即赫赛汀、阿瓦斯汀和爱必妥，可用于治疗实体瘤类，所述实体瘤类导致90％以上的癌症诱发的死亡率。批准的具有基本剩余医疗要求和显著临床益处的单克隆抗体已经出现，且其显著的商业成功也为开发新的创新方法提供了动力，所述创新方法中，对于不同患者群体，基于抗体的疗法的开发与增强其功效之间取得了良好的平衡(Brekke,OH和Sandlie,I.(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2,52-62；Carter,P.(2001)Nat.Rev.Cancer 1,118-129)。

升级换代的基于抗体的癌症治疗方法的出现需要解决的挑战之一是选择合适的靶分子，靶分子是产生有利的毒性/功效特征的关键因素。

由于抗体分子靶标在正常组织上的表达，目前可用于治疗实体瘤的抗体不能完全发挥其固有作用方式的累积作用。例如，Her2/neu(赫赛汀的靶标)在许多正常人体组织(包括心肌)中表达(Crone,S.A,Zhao,Y.Y,Fan,L.,Gu,Y.,Minamisawa,S.,Liu,Y.,Peterson,K.L,Chen,J.,Kahn,R.,Condorelli,G.等(2002)Nat.Med.8,459-465)。因此，赫赛汀被设计为减弱的免疫活力，因而不能以最大有效量给药，否则会产生不能承受的毒性。这样，“对可能锋利的刀片的钝化措施”限制了赫赛汀的治疗功效。

除了避免在正常组织中与毒性相关的表达外，理想抗体靶标的可取特征还在于在肿瘤细胞表面上表现出强大且高水平的表达，同时展现出促进肿瘤的功能(Houshmand,P.和Zlotnik,A.(2003)Curr.Opin.Cell Biol.15,640-644)。

技术问题

本发明的目的是提供一种结合分子，特异性针对存在于调节性T细胞(Treg细胞)的表面上的Lrig-1蛋白。

本发明的另一目的是提供一种编码本发明结合分子的核酸分子。

本发明的又一目的是提供一种插入有本发明核酸分子的表达载体。

本发明的又一目的是提供一株转染有本发明表达载体的宿主细胞系。

本发明的又一目的是提供一种本发明的抗体-药物偶联物。

本发明的又一目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含本发明结合分子。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员将从以下描述中清楚地理解未提及的其他问题。

解决问题的技术方案

本发明人发现了特异性存在于调节性T细胞表面上的Lrig-1蛋白，选择了该蛋白的表位，并产生了能够特异性结合Lrig-1蛋白的单克隆抗体，从而完成了本发明。

本发明的一个实施方案提供了一种特异性结合富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(Lrig-1)蛋白的结合分子。

如本文所用，术语“结合分子”是指包含完整免疫球蛋白的可变结构域，所述完整免疫球蛋白包括单克隆抗体(例如嵌合的、人源化的、或人的单克隆抗体)，或与抗原结合的免疫球蛋白，例如与完整的免疫球蛋白竞争结合甲型流感病毒的单体HA或三聚HA的免疫球蛋白片段。无论结构为何，抗原结合片段与完整免疫球蛋白识别的相同抗原结合。所述抗原结合片段可以包括肽或多肽，其含有结合分子的氨基酸序列中的两个或更多个连续氨基酸残基、20个或更多个连续氨基酸残基、25个或更多个连续氨基酸的氨基酸残基、30个或更多个连续氨基酸残基，35个或更多个连续氨基酸残基、40个或更多个连续氨基酸残基、50个或更多个连续氨基酸残基、60个或更多个连续氨基酸残基、70个或更多个连续氨基酸残基、80个或更多个连续氨基酸残基、90个或更多个连续氨基酸残基、100个或更多个连续氨基酸残基、125个或更多个连续氨基酸残基、150个或更多个连续氨基酸残基、175个或更多个连续氨基酸残基、200个或更多连续的氨基酸残基、或250个或更多个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。术语“抗原结合片段”具体包括：Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体、三抗体、四抗体、包含足以使特定抗原结合至多肽的至少一个免疫球蛋白片段的多肽，等等。所述片段可以通过合成、或通过完整免疫球蛋白的酶学或化学消化来产生，或者可以采用重组DNA技术通过基因工程方法产生。生产方法是本领域熟知的。

在本发明中，Lrig-1蛋白是由存在于调节性T细胞表面的由1091个氨基酸组成的跨膜蛋白，由位于细胞外或管腔侧的富含亮氨酸的重复序列(LRR)和三个免疫球蛋白样结构域、细胞跨膜序列、以及胞质尾部构成。LRIG基因家族包括LRIG1、LRIG2和LRIG3，并且其间的氨基酸高度保守。LRIG1基因在正常皮肤中高表达，并且可以在基底和毛囊细胞中表达，以调节表皮干细胞的增殖。因此，LRIG1基因在维持表皮稳态中起重要作用，而其缺失可能发展为牛皮癣或皮肤癌。据报道，一旦LRIG1所在的染色体3p14.3部分被切除，细胞有可能发展为癌细胞。实际上，已证实在肾细胞癌和皮肤鳞状细胞癌中LRIG1的表达大大降低。最近，还发现Lrig-1仅在约20％至30％的癌症中表达。另一方面，出于本发明的目的，Lrig-1蛋白可以是但不限于人或小鼠中存在的蛋白。

在本发明中，Lrig-1蛋白可以是但不限于由SEQ ID NO：1所示的人源多肽或由SEQID NO：3所示的鼠源多肽。

此外，在本发明中，由SEQ ID NO：1所示的Lrig-1蛋白可以由SEQ ID NO：2所示的多核苷酸编码，但不限于此。

此外，在本发明中，由SEQ ID NO：3所示的Lrig-1蛋白可以由SEQ ID NO：4所示的多核苷酸编码，但不限于此。

在本发明中，所述的结合分子可以是包含以下的结合分子：

重链可变区，其含有由选自SEQ ID NOs：5、13、21或29的氨基酸序列构成的重链CDR1,由选自SEQ ID NOs：6、14、22或30的氨基酸序列构成的重链CDR2,由选自SEQ ID NOs：7、15、23或31的氨基酸序列构成的重链CDR3；和

轻链可变区，其含有由选自SEQ ID NOs：8、16、24或32的氨基酸序列构成的轻链CDR1，由选自SEQ ID NOs：9、17、25或33的氨基酸序列代表的轻链CDR2，由选自SEQ ID NO：10、18、26或34的氨基酸序列组成轻链CDR3。

在本发明中，所述的结合分子可以是包含以下成分的结合分子：

选自以下(a)-(d)构成的组的重链可变区：

(a)重链可变区，其含有由SEQ ID NO：5所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：6所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：7所示的重链CDR3；

(b)重链可变区，其含有由SEQ ID NO：13所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：14所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：15所示的重链CDR3；

(c)重链可变区，其含有由SEQ ID NO：21所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：22所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：23所示的重链CDR3；和

(d)重链可变区，其含有由SEQ ID NO：29所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：30所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：31所示的重链CDR3；以及

选自以下(e)-(h)构成的组的轻链可变区：

(e)轻链可变区，其含有由SEQ ID NO：8所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：9所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：10所示的轻链CDR3；

(f)轻链可变区，其含有由SEQ ID NO：16所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：17所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：18所示的轻链CDR3；

(g)轻链可变区，其含有由SEQ ID NO：24所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：25所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：26所示的轻链CDR3；

(h)轻链可变区，其含有由SEQ ID NO：32所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：33所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：34所示的轻链CDR3。

在本发明中，所述的结合分子可以是选自下组(1)至(4)的结合分子：

(1)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ IDNO：5所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：6所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：7所示的重链CDR3；所述轻链可变区含有由SEQ ID NO：8所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：9所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：10所示的轻链CDR3；

(2)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ IDNO：13所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：14所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：15所示的重链CDR3；所述轻链可变区含有由SEQ ID NO：16所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：17所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：18所示的轻链CDR3；

(3)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ IDNO：21所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：22所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：23所示的重链CDR3；所述轻链可变区含有由SEQ ID NO：24所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：25所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：26所示的轻链CDR3；

(4)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ IDNO：29所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：30所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：31所示的重链CDR3；所述轻链可变区含有由SEQ ID NO：32所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：33所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：34所示的轻链CDR3。

在本发明中，所述的结合分子可以是包含以下的结合分子：

由选自下组的任一氨基酸序列构成的重链可变区：SEQ ID NO:11、19、27和35；和

由选自下组的任一氨基酸序列构成的轻链可变区：SEQ ID NO:12、20、28和36。

在本发明中，所述的结合分子可以是选自以下结合分子构成的组的结合分子：

含有由SEQ ID NO：11所示的重链可变区和由SEQ ID NO：12所示的轻链可变区的结合分子；

含有由SEQ ID NO：19所示的重链可变区和由SEQ ID NO：20所示的轻链可变区的结合分子；

含有由SEQ ID NO：27所示的重链可变区和由SEQ ID NO：28所示的轻链可变区的结合分子；以及

含有由SEQ ID NO：35所示的重链可变区和由SEQ ID NO：36所示的轻链可变区的结合分子。

在本发明中，所述的结合分子还可以包含片段结晶(Fc)区或恒定区。在此，所述Fc区可以是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体的Fc区，或可自其衍生。任选地，所述的Fc区可以是混合Fc区。

在本发明中，所述的Fc区可以是哺乳动物来源的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体的Fc区，并且优选人来源的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体的Fc区。

在本发明中，所述的Fc区可以是哺乳动物来源的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体的Fc区，并且优选人来源的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体的Fc区。然而，所述的Fc区不限于此。

作为本发明的一个实例，所述的Fc区可以是由SEQ ID NO：37所示的小鼠来源的IgG2a Fc区，但不限于此。

作为本发明的一个实例，所述的Fc区可以是由SEQ ID NO：38所示的小鼠来源的免疫球蛋白κ恒定区，但不限于此。

作为本发明的一个实例，所述的Fc区可以是由SEQ ID NO：39所示的人来源IgG1Fc区，但不限于此。

作为本发明的一个实例，所述的Fc区可以是由SEQ ID NO：40所示的人来源IgG2Fc区，但不限于此。

作为本发明的一个实例，所述的Fc区可以是由SEQ ID NO：41所示的人来源IgG3Fc区，但不限于此。

作为本发明的一个例子，所述的Fc区可以是由SEQ ID NO：42所示的人来源IgG4Fc区，但不限于此。

作为本发明的一个实例，所述的Fc区可以是由SEQ ID NO：43所示的人来源免疫球蛋白kappa恒定区，但不限于此。

作为本发明的一个实例，所述的Fc区可以是人来源的免疫球蛋白lambda恒定区，但不限于此。

在本发明中，“混合Fc”可以衍生自人IgG亚类的组合、或人IgD和IgG的组合。在混合Fc结合于生物活性分子、多肽等的情况下，所述混合Fc不仅具有增加生物活性分子的血清半衰期的作用，在编码Fc-多肽融合蛋白的核苷酸序列表达之时还具有提高该多肽的表达水平的作用。

作为本发明的一个实例，所述混合Fc区可以由SEQ ID NO：44表示，但不限于此。

在本发明的结合分子中，Fc或恒定区可以通过接头连接于可变区。在此，所述接头可以与Fc的C末端连接，而本发明的结合分子的N末端可以与接头连接。然而，本发明不限于此。

在本发明中，“接头”可以包含一段可以被在具有目标疾病的组织或细胞中过表达的酶切割的序列。如果接头可能被上述过表达的酶切割，则可以有效地防止多肽的活性由于Fc部分而降低。在本发明中，接头的实例可以优选是由位于在血液中含量最高的人白蛋白的第282至314位的33个氨基酸构成的肽接头，而更优选是由位于人白蛋白的第292至304部分的13个氨基酸构成的肽接头。这些部分是在三维结构中大部分暴露于外部的部分，因此在体内引起免疫反应的可能性最小。但是，接头不限于此。

本发明的结合分子还可以包含由选自下组的氨基酸序列构成的重链恒定区：SEQID NO:37、39、41、42、43和44。

本发明的结合分子还可以包含由SEQ ID NO：38或40所示的氨基酸序列构成的轻链恒定区。

本发明的结合分子还可以包括：

由SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列构成的重链恒定区,和

由SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列构成的轻链恒定区。

本发明的结合分子还可以包括：

由SEQ ID NO：39、41、42或43所示的氨基酸序列构成的重链恒定区；和

由SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列构成的轻链恒定区。

本发明的结合分子还可以包括：

由SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列构成的重链恒定区。

本发明的结合分子可以是选自以下结合分子构成的组：

包含由SEQ ID NO：45所示重链和由SEQ ID NO：46所示轻链的结合分子,

包含由SEQ ID NO：47所示重链和由SEQ ID NO：48所示轻链的结合分子,

包含由SEQ ID NO：49所示重链和由SEQ ID NO：50所示轻链的结合分子,和

包含由SEQ ID NO：51所示重链和由SEQ ID NO：52所示轻链的结合分子。

本发明的结合分子的特征在于作为一种抗体，但不限于此。所述抗体包括所有单克隆抗体、全长抗体、或抗体片段，所述抗体片段作为抗体的一部分、具有与Lrig-1蛋白结合的能力并与本发明的结合分子竞争结合于Lrig-1上的表位。

如本文所用，术语“抗体”是指用作特异性识别抗原的受体的蛋白分子，包括与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子。出于本发明的目的，所述抗原可以是调节性T细胞表面上存在的Lrig-1蛋白。所述抗体优选可以特异性识别Lrig-1蛋白的富含亮氨酸区或免疫球蛋白样结构域，但不限于此。

在本发明中，“免疫球蛋白”具有重链和轻链，且重链和轻链均包含恒定区和可变区。所述的轻链和重链的可变区均包含3个被称为互补决定区(以下称为“CDR”)的高变区和4个构架区。CDR主要用于结合抗原上的表位。各链的CDR从N端开始通常依次被称为CDR1、CDR2和CDR3，并且通过具体CDR所在的链加以区分。

此外，如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子，其从基本上相同的抗体群中分离，并且对特定的表位表现出单一的结合特异性和亲和力。

在本发明中，“全长抗体”具有含两条全长轻链和两条全长重链的结构，其中各轻链通过二硫键与重链连接，且全长抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM、和IgG。IgG包括IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4亚型。

此外，如本文所用，术语“抗原片段”是指保留抗原结合功能的片段，包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等。Fab具有含轻链和重链的可变区、轻链恒定区、和重链第一恒定区(CH1结构域)的结构，并具有一个抗原结合位点。此外，Fab'与Fab的不同之处在于，Fab'在重链CH1结构域的C末端具有包含至少一个半胱氨酸残基的铰链区。Fab'的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键，从而产生F(ab')₂抗体。Fv(可变片段)是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链Fv(dsFv)配置为使得重链可变区和轻链可变区通过二硫键相互连接，单链Fv(scFv)配置为使得重链可变区和轻链可变区(通常通过肽接头)相互共价连接。在使用蛋白水解酶(如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)的情况下，得到的抗体片段可以是Fab或F(ab')₂片段，也可以通过基因重组技术产生。

此外，在本发明中，所述的抗体可以是但不限于嵌合抗体、人源化抗体、二价/双特异性分子、小抗体、结构域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、双抗体、三抗体、或四抗体，或其片段。

在本发明中，“嵌合抗体”是通过将小鼠抗体的可变区和人抗体的恒定区重组而获得的抗体，且与小鼠抗体相比，其免疫应答大大提高。

此外，如本文所用，术语“人源化抗体”是指通过修饰非人物种的抗体的蛋白序列而获得的抗体，使得该蛋白序列与人类天然产生的抗体变体相似。例如，可以如下制备人源化抗体。小鼠来源的CDR可以与人抗体来源的FR重组以制备人源化可变区，而所述的人源化可变区可以与优选的人抗体的恒定区重组以制备人源化抗体。

在本发明中，提供的结合分子可以是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段，能够与Lrig-1蛋白结合又与另一种蛋白结合。

在本发明中，所述的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以包含本发明的结合分子。作为本发明的实例，所述的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含能够结合Lrig-1蛋白的抗原结合结构域，其中能够结合Lrig-1的抗原结合结构域可以包含本发明的结合分子或由本发明的结合分子组成。

本发明提供的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包含：抗原结合结构域，所述的抗原结合结构域是能够结合本发明的Lrig-1蛋白的结合分子；和能够结合另一种靶蛋白的抗原结合结构域。在此，能够结合其他靶蛋白的抗原结合结构域可以是能够结合Lrig-1蛋白以外的蛋白(如，PD-1或细胞表面受体)的抗原结合结构域。然而，抗原结合结构域不限于此。

本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以采用任何合适的形式，例如，在Kontermann MAbs 2012,4(2):182-197中所述，通过引用将全文并入本文。例如，所述的双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是双特异性抗体偶联物(如，IgG2、F(ab')2、或CovX体)、双特异性IgG或IgG样分子(如，IgG、scFv4-Ig、IgG-scFv、scFv-IgG、DVD-Ig、IgG-sVD、sVD-IgG、或2合1-IgG、mAb2、或双抗共有LC(Tandemab common LC))、不对称双特异性IgG或IgG样分子(如，kih IgG、kih IgG共有LC(kih IgG common LC)、CrossMab、kihIgG-scFab、mAb-Fv、电荷对、或SEED体)、小型双特异性抗体分子(如，双抗体(Db)、dsDb、DART、scDb、tandAb、串联scFv(taFv)、串联dAb/VHH、三体、三头抗体(triple head)、Fab-scFv、或F(ab')2-scFv2)、双特异性Fc和CH3融合蛋白(如，taFv-Fc、双-双抗体、scDb-CH3、scFv-Fc-scFv、HCAb-VHH、scFv-kih-Fc、或scFv-kih-CH3)、或双特异性融合蛋白(如，scFv2-白蛋白、scDb-白蛋白、taFv毒素、DNL-Fab3、DNL-Fab4-IgG、DNL-Fab4-IgG-细胞因子2)。具体参见Kontermann MAbs 2012,4(2):182-19中图2。本发明的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以由本领域技术人员设计和制备。

在本发明中产生双特异性抗体的方法包括形成还原性二硫键或非还原性硫醚键、以及抗体或抗体片段的化学交联，例如在Segal和Bast,2001.“双特异性抗体的产生”(Production of Bispecific Antibodies).《最新免疫学方案》(Current Protocols inImmunology).14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16中所述，该文献通过引用全文纳入本文。例如，可以使用N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)，通过例如铰链区的SH-基化学交联Fab片段，以生成二硫键连接的双特异性F(ab)2异二聚体。

此外，本发明中产生双特异性抗体的另一方法包括将产生抗体的杂交瘤与如聚乙二醇融合，以产生能够分泌双特异性抗体的四价杂交瘤细胞，例如在D.M.和Bast,B.J.2001.“双特异性抗体的产生”.《最新免疫学方案》.14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16中所述。

本发明所述的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段也可以例如通过从编码抗原结合分子多肽的核酸构建物中表达而重组产生，如在《抗体工程改造：方法和方案》(Antibody Engineering:Methods and Protocols),第二版(胡马纳出版社-HumanaPress,2012),第40章:“双特异性抗体的产生：二抗体和串联scFv”(Production ofBispecific Antibodies:Diabodies and Tandem scFv)(Hornig和Farber-Schwarz)，或French,“如何制备双特异性抗体”(How to make bispecific antibodies),MethodsMol.Med.2000；40:333-339中所述，二者全部内容通过引用整体并入本文。

例如，DNA构建物可通过分子克隆技术制备，所述DNA构建物包含：编码两个抗原结合域的轻链和重链可变域(即，能结合PD-1的抗原结合域的轻链和重链可变域，以及能够结合另一靶蛋白的抗原结合域的轻链和重链可变域)的序列，以及编码抗原结合结构域之间的合适接头或二聚结构域的序列。随后，可以通过在合适的宿主细胞(如，哺乳动物宿主细胞)中表达所述的构建物(如，体外)来产生重组双特异性抗体，然后可以任选地纯化表达的所述的重组双特异性抗体。

抗体的产生可以通过亲和力成熟过程，其中与未修饰的亲本抗体相比，经修饰抗体对抗原的亲和力有所改善。亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的方法来产生，例如，在Marks等,Rio/Technology 10:779-783(1992)；Barbas等Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等,Gene 169:147-155(1995)；Yelton等,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-159(1995)；以及Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)中所述。

此外，本发明提供的结合分子可以包括所述的氨基酸序列的变体，只要该变体可以特异性结合Lrig-1蛋白。例如，为改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性，可以对抗体的氨基酸序列进行修饰。此类修饰包括：如，抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入、和/或取代。

此类氨基酸变化基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、和大小。根据对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析，可以看出：精氨酸、赖氨酸和组氨酸均为带正电荷的残基，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小相似，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的形状相似。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以视作生物功能等效物。

在引入变化时，可以考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)。根据其疏水性和电荷，为各氨基酸指定了亲疏水性指数：异亮氨酸(+4.5)，缬氨酸(+4.2)，亮氨酸(+3.8)，苯丙氨酸(+2.8)，半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)，蛋氨酸(+1.9)，丙氨酸(+1.8)，甘氨酸(-0.4)，苏氨酸(-0.7)，丝氨酸(-0.8)，色氨酸(-0.9)，酪氨酸(-1.3)，脯氨酸(-1.6)，组氨酸(-3.2)，谷氨酸(-3.5)，谷氨酰胺(-3.5)，天冬氨酸(-3.5)，天冬酰胺(-3.5)，赖氨酸(-3.9)，和精氨酸(-4.5)。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中非常重要。已知，用具有相近亲疏水性指数的氨基酸取代，可以使蛋白质保持相似的生物学活性。在参照亲疏水性指数引入变化的情况下，在表现出亲疏水性指数差值优选在±2之内，更优选在±1之内，甚至更优选在±0.5之内的氨基酸之间进行取代。

同时，众所周知的是，具有相近亲水性值的氨基酸之间的取代，产生具有相当生物活性的蛋白质。如美国专利No.4,554,101中所述，各氨基酸残基已被赋予以下亲水性值：精氨酸(+3.0)，赖氨酸(+3.0)，天冬氨酸(+3.0±1)，谷氨酸(+3.0±1)，丝氨酸(+0.3)，天冬酰胺(+0.2)，谷氨酰胺(+0.2)，甘氨酸(0)，苏氨酸(-0.4)，脯氨酸(-0.5±1)，丙氨酸(-0.5)，组氨酸(-0.5)，半胱氨酸(-1.0)，甲硫氨酸(-1.3)，缬氨酸(-1.5)，亮氨酸(-1.8)，异亮氨酸(-1.8)，酪氨酸(-2.3)，苯丙氨酸(-2.5)，色氨酸(-3.4)。在参照亲水性值引入变化的情况下，可以在表现出亲水性值差值优选在±2之内，更优选在±1之内，甚至更优选在±0.5之内的氨基酸之间进行取代。

本领域已知，蛋白中的氨基酸交换不完全改变分子活性(H.Neurath,R.L.Hill,《蛋白》(The Proteins),学术出版社,纽约(1979))。最常见的交换是以下氨基酸残基之间的交换：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Gln/Glu。

考虑到具有生物学等效活性的上述变化，可以理解，本发明的结合分子还包括与序列表中列出的序列具有实质同一性的序列。

如本文所用，术语“实质同一性”是指当本发明的序列与任何其他序列比对时，在最大程度上彼此匹配，并且通过使用本领域通常使用的算法来分析比对的序列，显示为至少61％同源性，更优选70％同源性，甚至更优选80％同源性，最优选90％同源性的序列。用于比较序列的比对方法是本领域已知的。用于比对的各种方法和算法，公开于Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman和Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson和Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins和Sharp,Gene 73:237-44(1988)；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)；Corpet等.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang等.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)；和Pearson等.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等.，J.Mol.Biol.215:403-10(1990))可从国家生物信息中心(NBCI)等获得，并可与互联网上的测序程序联用(如blastp、blasm、blastx、tblastn、和tblastx等)。BLSAT可已从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/访问。可以在线识别使用此程序的序列同源性比较方法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html)。

在本发明中，所述的结合分子(优选为抗体)，可以通过产生抗体的常规方法产生，还可以通过亲和力成熟产生。

如本文所用，术语“亲和力成熟”是指在免疫应答过程中由活化的B细胞产生对抗原的亲和力增加的抗体的过程。出于本发明的目的，在天然发生的相同过程中，由于基于突变和选择原理，亲和力成熟能够产生抗体或抗体片段。

本发明提供的结合分子(优选为抗体)，可以抑制免疫细胞中尤其是调节性T免疫细胞(Treg细胞)的功能，从而有效地预防、改善或治疗癌症。

在本发明中，术语“癌症”是指或表示一种生理状态，其以哺乳动物的细胞生长没有以典型的方式调节为特征。在本发明中待预防、改善或治疗的癌症可以是由实体器官中细胞异常生长引起的团块形成的实体瘤，取决于实体器官的位置，可以是但不限于胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移性癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌等，其中首选黑素瘤。

根据本发明的另一个实施方案，提供了一种编码本发明提供的结合分子的核酸分子。

如本领域技术人员已知的，本发明的核酸分子包括通过将本发明提供的结合分子的氨基酸序列转化为多核苷酸序列而获得的所有核酸分子。因此，可以通过开放阅读框(ORF)来制备各种多核苷酸序列，而所有这些多核苷酸序列也都包括在本发明的核酸分子中。

根据本发明的又一个实施方案，提供了一种插入有本发明提供的分离的核酸分子的表达载体。

在本发明中，“载体”是能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，质粒是指可以接入其他DNA区段的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。还有一类载体是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到所述病毒的基因组中。某些载体能够在导进的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体是附加型哺乳动物载体(episomal mammalian vector))。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。可用于重组DNA技术的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。

本发明中表达载体的具体实例可以选自但不限于下组：商业上广泛使用的pCDNA载体、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体，如λ噬菌体、人字形噬菌体、M13、Mu、p1 P22、Qμμ、T-even、T2、T3、T7噬菌体；植物病毒。作为表达载体，本领域技术人员已知的任何表达载体，均可用于本发明，并根据靶宿主细胞的性质选择表达载体。可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、或电穿孔将载体导入宿主细胞。然而，本发明不限于此，本领域技术人员可以采取和使用适合于所用表达载体和宿主细胞的导入方法。所述的载体可优选包含至少一种选择标记。然而，本发明不限于此，可以使用不包筛选标记的载体来进行筛选，这取决于是否产生产物。筛选标记取决于靶宿主细胞，这可以采用本领域技术人员已知的方法完成，因此本发明对此没有限制。

为了便于本发明核酸分子的纯化，可以将标签序列插入表达载体中并与之融合。标签包括但不限于：六组氨酸标签、血凝素标签、myc标签、或flag标签，本领域技术人员已知的便于纯化的任何标签均可以用于本发明。

根据本发明的又一个实施方案，提供了一株用本发明提供的表达载体转染的宿主细胞系。

在本发明中，“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，所述单个细胞或细胞培养物可以或已经是一个或多个掺入多肽插入物的载体的受体。所述的宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变，后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组DNA互补上)。所述的宿主细胞包括用本文的一种或多种多核苷酸体内转染的细胞。

在本发明中，所述的宿主细胞可以包括哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细胞来源的细胞，例如，细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，如酵母细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)和斜纹夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人淋巴母细胞、COS、NSO(小鼠骨髓瘤)、293T、Bowes鲍斯黑色素瘤细胞、HT-1080、幼仓鼠肾(BHK)细胞、人类胚胎肾(HEK)细胞、或PERC.6(人类视网膜细胞)；或植物细胞。然而，宿主细胞不限于此，本领域技术人员已知的可以用作宿主细胞系的任何细胞都是可用的。

根据本发明的又一个实施方案，提供了一种包含本发明中提供的抗体和药物的抗体-药物偶联物(ADC)。

如本文所用，术语“抗体-药物偶联物(ADC)”是指药物和抗体彼此化学连接而不降低抗体和药物的生物学活性的形式。在本发明中，所述的抗体-药物偶联物是指药物与抗体的重链和/或轻链的N-末端的氨基酸残基结合的形式，具体地，是药物与抗体的重链和/或轻链N-末端的α-胺基结合的形式。

如本文所用，术语“药物”可以表示对细胞具有一定生物学活性的任何物质，包括DNA、RNA、或肽的概念。所述的药物可以是含有能够与α-胺基反应和交联的反应基团的形式，也包括含有能够与α-胺基反应和交联并接头连接的反应基团的形式。

在本发明中，能够与α-胺基反应并交联的反应基团的实例在类型方面没有特别限制，只要该反应基团可以与抗体的重链或轻链的N-末端的α-胺基反应并交联。所述的反应性基团包括本领域已知的与胺基反应的所有类型的基团。所述的反应性基团可以是，例如异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰基叠氮化基、NHS酯基、磺酰氯基、醛基、乙二醛基、环氧化基、环氧乙烷基、碳酸酯基、芳基卤化基、酰亚胺酯基、碳二亚胺基、酸酐和氟苯基酯基中的任何一种，但不限于此。在本发明中，所述的药物是能够治疗的癌症(一种Lrig-1抗体靶向的疾病)的药物，并且可能是抗癌剂。

在本发明中，抗癌剂可以选自但不限于：氮芥子碱、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、纳拉替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼洛替尼、塞马克尼布、波舒替尼、阿昔替尼、西地尼单抗、来他替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、白檞寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基卡巴脲、达沙替尼、阿司匹马汀、奥格他新、丙卡巴肼、前列地尔、钬硝酸壳聚糖(holmium nitrate chitosan)、吉西他滨、多西氟啶、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉西、奥他拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、依卡他汀、氟哌丁胺、卡西他滨、卡巴他汀、氟哌啶、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛特坎、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春碱、伊达柔比星、丝裂霉素、博来霉素、放线菌素、吡柔比星、阿克拉霉素、倍洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、阿司他汀、达卡巴嗪、硫替巴、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、维甲酸、依西美坦、氨鲁米特、阿那格雷、奥拉帕尼、奈韦宾、法得唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾丸内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏洛唑、比卡鲁胺、洛莫司汀、5FU、伏立诺他、恩替司他、和卡莫斯汀。

根据本发明的又一个实施方案，提供了一种预防或治疗癌症的药物组合物，所述的药物组合物包含本发明提供的结合分子或抗体-药物偶联物(ADC)作为活性成分。

在本发明中，术语“癌症”是指或表示一种生理状态，以哺乳动物的细胞生长没有以典型的方式调节为特征。在本发明中待预防、改善或治疗的癌症可以是由实体器官中细胞异常生长引起的团块形成的实体瘤，取决于实体器官的位置，可以是但不限于胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移性癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌等，其中首选黑素瘤。另一方面，在本发明中，“预防”可包括但不限于，使用本发明的药物组合物来阻断疾病症状、或抑制/延迟症状的任何行为。

此外，在本发明中，“治疗”可以包括但不限于使用本发明的药物组合物来减轻或改善疾病症状的任何行为。

在本发明中，所述的药物组合物可以为胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、软膏剂、粉剂或冲剂形式，并且所述的药物组合物可以靶向人。

在本发明中，所述的药物组合物可以按照常规方法分别制成口服制剂，如散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂和水性混悬剂，外用制剂，栓剂，和无菌注射溶液剂的形式，并被使用。但是，药物组合物不限于此。本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、色素、调味剂等可以用于口服给药，缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等可以用作注射剂，基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等可以用于局部给药。本发明的药物组合物可以通过与上述的药学上可接受的载体混合以各种方式制备。例如，对于口服给药，可以将药物组合物制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式。对于注射，可以将药物组合物配制成单位剂量安瓿或多剂量的形式。或者，可以将药物组合物配制成溶液、悬浮液、片剂、胶囊、缓释制剂等。

同时，作为适合于制备制剂的载体、稀释剂或赋形剂的实例，可以使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。此外，还可以包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。

本发明药物组合物的给药途径包括但不限于：口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下、或直肠途径。优选，口服或肠胃外给药。

在本发明中，“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、囊内(intrabursal)、胸骨内、硬膜内、病变内、和颅内注射或输注技术。本发明的药物组合物也可以采用栓剂形式直肠给药。

本发明的药物组合物可根据多种因素而变化，包括所用某种化合物的活性、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合以及要预防或治疗的特定疾病的严重性。所述的药物组合物的剂量可以根据患者的状况、体重、疾病的严重程度、药物形式、给药途径和持续时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。所述的药物组合物可以每天0.0001-50mg/kg或0.001-50mg/kg的量施用。给药可以一天一次或一天几次。所述的剂量无意以任何方式限制本发明的范围。本发明的药物组合物可以配制成丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、或混悬剂的形式。

发明的有益效果

本发明的Lrig-1蛋白的特异性结合分子(优选为抗体)可以抑制调节性T细胞的功能，以有效地预防、改善或治疗癌症，尤其是实体瘤。

此外，与先前的可商购的Lrig-1的抗体相比，本发明的Lrig-1蛋白的特异性结合分子(优选为抗体)具有更有效地靶向Lrig-1蛋白的优点，也能非常好的与之结合。

附图说明

图1说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1蛋白的结构。

图2说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1蛋白的结构。

图3说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1蛋白的表位的预测结果。

图4说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1蛋白的表位的预测结果。

图5说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1mRNA的表达水平。

图6说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1mRNA的表达水平。

图7说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1mRNA的表达水平。

图8说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1、Lrig-2和Lrig-3mRNA的表达水平。

图9说明了根据本发明的一个实施方案通过比较调节性T细胞和非调节性T细胞中Lrig-1蛋白的表达水平获得的结果。

图10说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1蛋白在调节性T细胞的表面的表达。

图11说明了根据本发明的一个实施方案，通过分析Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(A8、B8、D9和H6)与Lrig-1蛋白的结合能力获得的结果。

图12说明了根据本发明的一个实施方案，通过分析Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(A8、B8、D9和H6)在调节性T细胞中调节Lrig-1蛋白诱导Stat3磷酸化的机制而获得的结果。

图13说明了根据本发明的一个实施方案的Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(A8、B8、D9和H6)对癌症的治疗作用的实验设计。

图14说明了根据本发明的一个实施方案的通过分析Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(A8、B8、D9和H6)对癌症的治疗作用获得的结果。

发明详述：

根据本发明的一个实施方案，提供了一种特异性结合富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(Lrig-1)蛋白的结合分子，所述结合分子包括：

重链可变区，其含有由选自SEQ ID NO：5、13、21或29的氨基酸序列构成的重链CDR1，由选自SEQ ID NO：6、14、22或30的氨基酸序列构成的重链CDR2，由选自SEQ ID NO：7、15、23或31的氨基酸序列构成的重链CDR3；以及

轻链可变区，其含有由选自SEQ ID NO：8、16、24或32的氨基酸序列构成的轻链CDR1，由选自SEQ ID NO：9、17、25或33的氨基酸序列构成的轻链CDR2，由选自SEQ ID NO：10、18、26或34的氨基酸序列组成轻链CDR3。

下面，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更详细地描述本发明，并且本领域技术人员会明白，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例

[制备例1]T细胞亚群细胞培养

为了确定Lrig-1蛋白是否仅在调节性T细胞(Treg)中表达，制备了T细胞的亚群Th0、Th1、Th2、Th17和iTreg。与天然分离的nTreg不同，iTreg指的是在含有以下成分的培养基中人工诱导分化的细胞。

首先分离从小鼠脾脏获得的初始T细胞，使得含有10％胎牛血清(FBS；HyClone,洛根,犹他州)的RPMI1640(Invitrogen Gibco,格兰德岛，纽约州)营养培养基还包含下表1的各个成分，并在37℃，5％CO₂的培养箱中进行72小时培养，从而诱导T细胞亚群分化为相应的细胞。

[表1]

分化后细胞	成分
		Th0	抗CD3，抗CD28
Th1	IL-12，抗IL-4抗体
		Th2	IL-4，抗IFNββ
Th17	IL-6，TGFββ，抗IFNββ，抗IL-4
		iTreg	IL-2，TGFββ

[实施例1]Lrig-1的结构分析

Lrig-1蛋白的胞外域的三维空间结构预测会产生对Lrig-1蛋白(一种调节性T细胞的表面蛋白)的特异性抗体。

首先，为了预测表位的碱基序列(表位)，利用工具Uniprot(http://www.uniprot.org)和RCSB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)，来预测Lrig-1蛋白的胞外域(ECD)的三维空间结构，以确定ECD的结构。然后，结果示于图1和2。

如图1所示，在Lrig-1蛋白的胞外域的Lrig-LRR结构域(第41至494位的氨基酸序列)中总共存在15个富含亮氨酸的区域LRR1至LRR15。每个LRR结构域由23至27个氨基酸构成，其中存在3至5个亮氨酸。

此外，如图2所示，在Lrig-1蛋白的胞外域的Lrig-1蛋白的第494至781位的氨基酸序列中存在三个免疫球蛋白样结构域。

[实施例2]Lrig-1表位氨基酸序列的预测

使用Ellipro服务器(http://tools.iedb.org/ellipro/)进行上述碱基序列的预测，该服务器是一种基于Lrig-1蛋白结构的表位预测软件。利用Ellipro搜索引擎，因为它相当于已有的预测表位算法中已知的最可靠的搜索引擎。

将实施例1中分析的胞外域输入到表位预测软件中，预测表位的预测连续或不连续氨基酸序列，见图3和4。

如图3和4所示，预测了总共22个连续表位氨基酸序列，以及总共8个不连续表位氨基酸序列。

[生产例1-8]Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体的产生

产生了根据本发明的Lrig-1蛋白特异性抗体。本发明的抗体不是通过特定表位产生的，而是作为能够结合Lrig-1蛋白上任何位点的抗体产生的。

为了产生所述的抗体，产生了表达Lrig-1蛋白的细胞。更具体地，用切割酶切割对应于SEQ ID NO：2的DNA片段和pcDNA(hygro)，在37℃下温育，连接，以产生插入了Lrig-1蛋白的DNA序列的pcDNA。通过转染将如此产生的插入了SEQ ID NO：2的pcDNA导入L细胞中，从而使Lrig-1蛋白在L细胞的表面上表达。

从人scFv文库选择能够结合在细胞表面表达的Lrig-1的轻链和重链氨基酸序列，选择了总共八个重链和轻链。

将所选的重链和轻链氨基酸序列与mlgG2a Fc区融合，以产生单克隆抗体。单克隆抗体的序列显示在下表2中。

[表2]

[实施例3]Lrig-1 mRNA在调节性T细胞中的特异性表达的鉴定

验证了Lrig-1蛋白是否可以作为调节性T细胞的生物标志物。

为了进行验证，采用磁激活细胞分选法(MACS)，通过CD4珠，从大鼠脾脏中分离出CD4⁺T细胞。随后，使用CD25抗体采用荧光激活细胞分选法(FACS)分离调节性T(CD4⁺CD25⁺T)细胞和非调节性T(CD4⁺CD25^-T)细胞。对于各个细胞和在制备例1中分化的细胞，按照制造商提供的方案，使用Trizol提取mRNA，并使用gDNA提取试剂盒(Qiagen)从基因组RNA中去除gDNA。使用BDsprint cDNA合成试剂盒(Clonetech)，将去除gDNA的mRNA合成为cDNA。

进行实时聚合酶链反应(RT PCR)，以定量鉴定cDNA中Lrig-1mRNA的表达水平。

按照制造商提供的方案，使用SYBR Green(Molecular Probes分子探针公司)，利用下表3中所示的引物，在95℃3分钟、61℃15秒、72℃30秒，40个循环的条件下进行实时聚合酶链反应，使用ΔΔCT方法计算相对基因表达水平，并使用HPRT法将其标准化。结果在图5至8中示出。

[表3]

如图5所示，Lrig-1在调节性T(CD4⁺CD25⁺T)细胞中的表达比非调节性T(CD4⁺CD25^-T)细胞高18.1倍。这比以前已知的调节性T细胞标记Lag3和Ikzf4的表达水平高约10倍。此外，如图6和7所示，与其他类型的免疫细胞相比，Lrig-1mRNA在调节性T细胞中的表达显著较高，特别是与诱导型调节性T细胞(iTreg细胞)相比，在自然分离的调节性T细胞(nTreg)中显著较高。

此外，如图8所示，在对应于Lrig家族的Lrig-1、Lrig-2和Lrig-3中，Lrig-1的表达量最高。

从以上结果可以看出，根据本发明的Lrig-1蛋白特异性表达于调节性T细胞中，特别是天然存在的调节性T细胞。

[实施例4]Lrig-1蛋白在调节性T细胞中的特异性表达的鉴定

确定了从Lrig-1mRNA表达的Lrig-1蛋白是否仅在调节性T细胞中特异性表达。

使用FOXP3-RFP-敲入小鼠，所述的FOXP3-RFP通过将红色荧光蛋白(RFP)与FOXP3启动子(调节性T细胞特异的转录因子)偶联获得，采用磁激活细胞分选法(MACS)，利用CD4珠子，从所述的小鼠脾脏中分离出CD4⁺T细胞。随后，使用RFP蛋白，通过荧光激活细胞分选仪(FACS)进行分离，从而获得了调节性T(CD4⁺RFP⁺T)细胞和非调节性T(CD4⁺RFP^-T)细胞。用购买的Lrig-1抗体染色各细胞，用同型匹配的对照抗体染色阴性对照，以用荧光激活细胞分选仪测量Lrig-1的表达水平。结果在图9中示出。

如图9所示，虚线所示的非调节性T细胞显示出与阴性对照几乎相同的Lrig-1表达水平，而在调节性T细胞中存在大量具有高表达Lrig-1的细胞。

从以上结果可以看出，根据本发明的Lrig-1蛋白在调节性T细胞中特异性表达。

[实施例5]Lrig-1蛋白在调节性T细胞表面上的特异性表达的鉴定

出于以下观点，即为了成为细胞疗法的靶标，必须在调节性T细胞的表面表达Lrig-1蛋白，以实现更有效地进行靶标治疗。确定了Lrig-1蛋白是否在调节性T细胞表面表达。

制备例1的各个分化的T细胞亚群使用抗CD4-APC和抗Lrig-1-PE抗体进行染色，并使用荧光激活细胞分选法(FACS)测定在各细胞表面Lrig-1的表达水平。结果在图10中示出。

如图10所示，Lrig-1在活化T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和幼稚T细胞中的表达量为0.77至15.3，而Lrig-1在分化诱导T细胞(iTreg细胞)中的表达量高达83.9。

从以上结果可以看出，根据本发明的Lrig-1蛋白不仅在调节性T(Treg)细胞中特异性表达，而且特别是在Treg细胞表面上以较高水平表达。

[实施例6]本发明的抗体与Lrig-1蛋白的结合能力的评价

为了鉴定在生产例1-8中产生的根据本发明的单克隆抗体是否很好地识别Lrig-1，将生产例1-8中的每种抗体与稳定表达Lrig-1的L细胞结合。然后，向其中添加与eFlour670偶联并能够识别小鼠抗体的第二抗体，然后使用FACS分析单克隆抗体与Lrig-1蛋白的结合能力。结果在图11中示出。

如图11所示，发现了根据本发明的所有Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(A8、B8、D9和H6)有效识别并结合存在于L细胞表面的Lrig-1蛋白。

[实施例7]根据本发明的抗体调节Treg细胞中的信号转导途径

为了分析在生产例1-8中产生的根据本发明的单克隆抗体如何通过Lrig-1蛋白影响Treg细胞中的信号转导途径，通过用在生产例1-4的抗体处理Treg细胞以刺激存在于Treg细胞表面的Lrig-1，然后通过磷酸酪氨酸免疫印迹法分析刺激后的Treg细胞中存在的Stat3蛋白的酪氨酸磷酸化水平。结果在图12中示出。

如图12所示，发现了根据本发明的Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(A8、B8、D9和H6)连续维持和减少Stat3的磷酸化，其水平与iTreg细胞相同。

[实施例8]根据本发明的抗体对癌症的疗效

为了鉴定在生产例5-8中产生的根据本发明的单克隆抗体(A8、B8、D9和H6)对实体瘤的治疗作用，如图13所示，将3×10⁵个细胞量的B16F10黑素瘤细胞皮下注射到小鼠的背部区域中，然后在第4、8和12天，腹膜内注射200ug量的生产例5-8中产生的抗体。移植黑素瘤细胞后，测量肿瘤体积随时间的变化，结果示于图14。

如图14可知，发现了与未进行抗体治疗的阴性对照相比，在用本发明的Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(A8、B8、D9和H6)治疗的情况下，观察到肿瘤的大小明显缩小。

由此可见，根据本发明的Lrig-1蛋白特异性单克隆抗体可以抑制各种实体瘤细胞的生长，从而有效地预防、改善或治疗实体瘤。

尽管上面已经详细描述了本发明，但是本发明的范围不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离权利要求中描述的本发明的技术精神的情况下，可以进行各种修改和改变。

工业实用性

本发明涉及一种能够与富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(Lrig-1)蛋白特异性结合的结合分子及其应用，尤其是用于癌症的预防或治疗，Lrig-1蛋白是一种存在于调节性T细胞(Treg细胞)表面的蛋白。

序列表

<110> 古德T细胞有限公司

<120> LRIG-1蛋白的特异性结合分子及其用途

<130> DPB172433.k01

<150> KR 10-2017-0049854

<151> 2017-04-18

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 759

<212> PRT

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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

20 25 30

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

35 40 45

Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

85 90 95

Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp

100 105 110

Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu

130

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

Asn Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

Gly Ile Ser Pro Gly Asp Ser Ser Thr

1 5

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

Lys Gly Leu Tyr Ser Asn Pro Asn Glu Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 17

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

Asp Asp Ser Gln

1

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Asn Gly

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Pro Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Leu Tyr Ser Asn Pro Asn Glu Pro Phe

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

20 25 30

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn

35 40 45

Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

85 90 95

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp

100 105 110

Asp Tyr Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu

130

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

Ser Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

Gly Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Ile

1 5

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<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

Lys Val Gly Leu Arg Cys Arg Tyr Glu Ala Cys Ser Tyr Ala Tyr Gly

1 5 10 15

Met Asp Val

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser

1 5 10

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<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

Ser Asp Ser His

1

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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Ala Thr Trp Asp Ser Ser Leu Asn Gly

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Gly Leu Arg Cys Arg Tyr Glu Ala Cys

115 120 125

Ser Tyr Ala Tyr Gly Met Asp Val

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<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

20 25 30

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

35 40 45

Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

85 90 95

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

100 105 110

Asp Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu

130

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

Asn Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ile

1 5

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

Lys Asp Leu Asp Ala Phe Trp Arg Pro Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asn Val Asn

1 5 10

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

Ser Asp Ser His

1

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala

1 5

<210> 35

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Asn Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Asp Ala Phe Trp Arg Pro Ser Phe

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 36

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

20 25 30

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn

35 40 45

Ile Gly Asn Asn Asn Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

85 90 95

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp

100 105 110

Asp Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu

130

<210> 37

<211> 328

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 37

Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr

1 5 10 15

Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

20 25 30

Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val

35 40 45

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser

50 55 60

Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys

65 70 75 80

Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu

85 90 95

Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala

100 105 110

Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile

115 120 125

Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val

130 135 140

Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val

145 150 155 160

Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp

165 170 175

Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln

180 185 190

Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp

195 200 205

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val

210 215 220

Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr

225 230 235 240

Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu

245 250 255

Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr

260 265 270

Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr

275 280 285

Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr

290 295 300

Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys

305 310 315 320

Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

325

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 38

Arg Thr Val Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 39

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 40

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 41

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 41

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 42

<211> 377

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

165 170 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

340 345 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

355 360 365

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 43

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 43

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 44

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 44

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 45

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 45

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gly Leu Ser Trp Ala Gly Ala Phe

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Ala

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Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser

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Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val

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Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

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385 390 395 400

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405 410 415

Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser

435 440 445

Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser

450 455 460

Arg Thr Pro Gly Lys

465

<210> 46

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 46

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

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Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

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Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

35 40 45

Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp

100 105 110

Asp Tyr Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

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Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser

165 170 175

Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys

180 185 190

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Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

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65 70 75 80

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

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Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

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Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr

275 280 285

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290 295 300

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Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile

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Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

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Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

35 40 45

Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

85 90 95

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

100 105 110

Asp Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

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Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser

165 170 175

Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys

180 185 190

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Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser

210 215 220

Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

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<211> 469

<212> PRT

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Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

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Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr

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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Ala

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145 150 155 160

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275 280 285

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325 330 335

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370 375 380

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405 410 415

Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu

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Arg Thr Pro Gly Lys

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<210> 52

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 52

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

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Ile Gly Asn Asn Asn Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

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165 170 175

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180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu

195 200 205

Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser

210 215 220

Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

Claims

1.一种特异性结合Lrig-1(富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1)蛋白的结合分子，该结合分子包括：

重链可变区，其含有由选自SEQ ID NO：5、13、21或29的氨基酸序列构成的重链CDR1；由选自SEQ ID NO：6、14、22或30的氨基酸序列构成的重链CDR2；由选自SEQ ID NO：7、15、23或31的氨基酸序列构成的重链CDR3；以及

轻链可变区，其含有由选自SEQ ID NO：8、16、24或32的氨基酸序列构成的轻链CDR1；由选自SEQ ID NO：9、17、25或33的氨基酸序列代表的轻链CDR2；由选自SEQ ID NO：10、18、26或34的氨基酸序列组成轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述Lrig-1蛋白由SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述Lrig-1蛋白由SEQ ID NO：2或4所示的多核苷酸编码。

4.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：

选自以下(a)-(d)构成的组的重链可变区：

(d)重链可变区，其含有由SEQ ID NO：29所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：30所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：31所示的重链CDR3；

和

选自以下(e)-(h)构成的组的轻链可变区：

5.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子选自以下(1)至(4)构成的组：

(1)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：5所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：6所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：7所示的重链CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：8所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：9所示的轻链CDR2，和由SEQID NO：10所示的轻链CDR3；

(2)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：13所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：14所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：15所示的重链CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：16所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：17所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：18所示的轻链CDR3；

(3)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：21所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：22所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：23所示的重链CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：24所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：25所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：26所示的轻链CDR3；

(4)结合分子，其含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：29所示的重链CDR1，由SEQ ID NO：30所示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：31所示的重链CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：32所示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：33所示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：34所示的轻链CDR3。

6.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：

7.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子选自以下结合分子构成的组：

包含SEQ ID NO:11所示重链可变区和SEQ ID NO:12所示轻链可变区的结合分子；

包含SEQ ID NO:19所示重链可变区和SEQ ID NO:20所示轻链可变区的结合分子；

包含SEQ ID NO:27所示重链可变区和SEQ ID NO:28所示轻链可变区的结合分子；和

包含SEQ ID NO:35所示重链可变区和SEQ ID NO:36所示轻链可变区的结合分子。

8.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子还包含Fc区或恒定区。

9.如权利要求8所述的结合分子，其特征在于，所述Fc区是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体的Fc区、或混合Fc区。

10.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子还包括由选自下组的氨基酸序列构成的重链恒定区：SEQ ID NO:37、39、41、42、43和44。

11.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子还包括：由SEQ ID NO：38或40所示的氨基酸序列构成的轻链恒定区。

12.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子还包括：

由SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列构成的重链恒定区；和

由SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列构成的轻链恒定区。

13.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子还包括：

由SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列构成的轻链恒定区。

14.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子还包括：

由SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列构成的重链恒定区。

15.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子选自以下结合分子构成的组：

包含由SEQ ID NO：45所示的重链和由SEQ ID NO：46所示的轻链的结合分子；

包含由SEQ ID NO：47所示的重链和SEQ ID NO：48所示的轻链的结合分子；

包含由SEQ ID NO：49所示的重链和SEQ ID NO：50所示的轻链的结合分子；和

包含由SEQ ID NO：51所示的重链和SEQ ID NO：52所示的轻链的结合分子。

16.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子是抗体或其片段。

17.如权利要求16所述的结合分子，其特征在于，所述所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、二价/双特异性分子、小抗体、结构域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、双抗体、三抗体、或四抗体，或其片段。

18.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1至17中任一项所述的结合分子。

19.一种表达载体，所述表达载体插入有权利要求18所述的核酸分子。

20.一株宿主细胞系，所述宿主细胞系转染有权利要求19的表达载体。

21.一种抗体-药物偶联物，包括：

抗体；和

药物，

其中所述抗体包含：

重链可变区，其含有由选自SEQ ID NOs：5、13、21或29的氨基酸序列构成的重链CDR1；由选自SEQ ID NOs：6、14、22或30的氨基酸序列构成的重链CDR2；由选自SEQ ID NOs：7、15、23或31的氨基酸序列构成的重链CDR3；以及

轻链可变区，其含有由选自SEQ ID NOs：8、16、24或32的氨基酸序列构成的轻链CDR1；由选自SEQ ID NOs：9、17、25或33的氨基酸序列代表的轻链CDR2；由选自SEQ ID NO：10、18、26或34的氨基酸序列组成轻链CDR3。

22.一种预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1至17中任一项所述的结合分子作为活性成分。

23.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症是实体瘤。

24.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症是胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、或肺癌。

25.一种预防或治疗免疫相关疾病的方法，包括：

将权利要求1至17中任一项所述结合分子给予需要治疗的对象，以预防或治疗癌症。