JP7276859B6 - Lrig‐1タンパク質に特異的な結合分子およびその用途 - Google Patents
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Description
配列番号5、13、21および29からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1;配列番号6、14、22および30からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2;配列番号7、15、23および31からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3;を含む重鎖可変領域と、
配列番号8、16、24および32からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1;配列番号9、17、25および33からなる群から選択されるアミノ酸配列で表される軽鎖CDR2;配列番号10、18、26および34からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子であってもよい。
(a)配列番号5で表される重鎖CDR1、配列番号6で表される重鎖CDR2、および配列番号7で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域;
(b)配列番号13で表される重鎖CDR1、配列番号14で表される重鎖CDR2、および配列番号15で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域;
(c)配列番号21で表される重鎖CDR1、配列番号22で表される重鎖CDR2、および配列番号23で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域;
(d)配列番号29で表される重鎖CDR1、配列番号30で表される重鎖CDR2、および配列番号31で表される重鎖CDR3を含む重鎖領域;からなる群から選択される重鎖可変領域と、
(e)配列番号8で表される軽鎖CDR1、配列番号9で表される軽鎖CDR2、および配列番号10で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
(f)配列番号16で表される軽鎖CDR1、配列番号17で表される軽鎖CDR2、および配列番号18で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
(g)配列番号24で表される軽鎖CDR1、配列番号25で表される軽鎖CDR2、および配列番号26で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
(h)配列番号32で表される軽鎖CDR1、配列番号33で表される軽鎖CDR2、および配列番号34で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;からなる群から選択される軽鎖可変領域とを含む結合分子であってもよい。
(1)配列番号5で表される重鎖CDR1、配列番号6で表される重鎖CDR2、および配列番号7で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号8で表される軽鎖CDR1、配列番号9で表される軽鎖CDR2、および配列番号10で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子;
(2)配列番号13で表される重鎖CDR1、配列番号14で表される重鎖CDR2、および配列番号15で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号16で表される軽鎖CDR1、配列番号17で表される軽鎖CDR2、および配列番号18で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子;
(3)配列番号21で表される重鎖CDR1、配列番号22で表される重鎖CDR2、および配列番号23で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号24で表される軽鎖CDR1、配列番号25で表される軽鎖CDR2、および配列番号26で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子;
(4)配列番号29で表される重鎖CDR1、配列番号30で表される重鎖CDR2、および配列番号31で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号32で表される軽鎖CDR1、配列番号33で表される軽鎖CDR2、および配列番号34で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子;からなる群から選択される結合分子であってもよい。
配列番号11、19、27および35からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
配列番号12、20、28および36からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む結合分子であってもよい。
配列番号11で表される重鎖可変領域と、配列番号12で表される軽鎖可変領域とを含む結合分子;
配列番号19で表される重鎖可変領域と、配列番号20で表される軽鎖可変領域とを含む結合分子;
配列番号27で表される重鎖可変領域と、配列番号28で表される軽鎖可変領域とを含む結合分子;および
配列番号35で表される重鎖可変領域と、配列番号36で表される軽鎖可変領域とを含む結合分子;からなる群から選択される結合分子であってもよい。
配列番号37で表されるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域と、
配列番号38で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域とをさらに含むことができる。
配列番号39、41、42または43で表されるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域と、
配列番号40で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域とをさらに含むことができる。
配列番号44で表されるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域をさらに含むことができる。
配列番号45で表される重鎖と、配列番号46で表される軽鎖とを含む結合分子;
配列番号47で表される重鎖と、配列番号48で表される軽鎖とを含む結合分子;
配列番号49で表される重鎖と、配列番号50で表される軽鎖とを含む結合分子;および
配列番号51で表される重鎖と、配列番号52で表される軽鎖とを含む結合分子;からなる群から選択される結合分子であってもよい。
前記結合分子は、配列番号5、13、21および29からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1;配列番号6、14、22および30からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2;配列番号7、15、23および31からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3;を含む重鎖可変領域と、
配列番号8、16、24および32からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1;配列番号9、17、25および33からなる群から選択されるアミノ酸配列で表される軽鎖CDR2;配列番号10、18、26および34からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;を含む軽鎖可変領域とを含む、結合分子を提供する。
[準備例1]T細胞亜型細胞の培養
制御性T細胞(Treg)でのみLrig‐1タンパク質が発現するか確認するために、T細胞の亜型(subset)であるTh0、Th1、Th2、Th17およびiTregを準備した。前記iTregは、自然に分離したnTregとは異なり、下記の組成を含む培地で分化を人工的に誘導した細胞を意味する。
制御性T細胞の表面タンパク質であるLrig‐1タンパク質に特異的な抗体を作製するために、Lrig‐1タンパク質の細胞外ドメインの三次元立体構造を予測した。
前記塩基配列の予測は、Lrig‐1タンパク質の構造をベースとする抗原決定基予測ソフトウェア(epitope prediction software)であるElliproサーバ(http://tools.iedb.org/ellipro/)を用いた。前記Ellipro検索エンジンは、現存する抗原決定基を予測するアルゴリズムのうち最も信頼度が高いと知られた検索エンジンに相当したためこれを用いた。
本発明に係るLrig‐1タンパク質に特異的な抗体を作製した。本抗体は、特定の抗原決定基を定めて産生せず、Lrig‐1タンパク質にいかなる部位でも結合することができる抗体を産生した。
Lrig‐1タンパク質が制御性T細胞に特異的なバイオマーカー(biomarker)として作用することができるか検証した。
Lrig‐1 mRNAから発現したLrig‐1タンパク質が、制御性T細胞でのみ特異的に発現するか確認した。
Lrig‐1タンパク質が細胞治療の標的になるためには、制御性T細胞の表面に発現したときに、より効果的に標的治療を行うことができるため、Lrig‐1タンパク質が表面で発現するか否かを確認した。
前記製造例1~8で作製された本発明に係るモノクローナル抗体がLrig‐1をよく認識するかを確認するために、Lrig‐1を安定して発現するL細胞に、前記製造例1~8の抗体それぞれを結合した後、マウス抗体を認識でき、且つeFlour 670がコンジュゲート(conjugation)された二次抗体(secondary antibody)を入れた後、FACSを用いて、前記モノクローナル抗体のLrig‐1タンパク質に対する結合力を分析し、その結果を図11に示した。
前記製造例1~8で作製された本発明に係るモノクローナル抗体が、Lrig‐1タンパク質によりTreg細胞内のシグナル伝達経路に如何なる影響を及ぼすかを分析するために、前記製造例1~4の抗体をTreg細胞に処理して、前記Treg細胞の表面に存在するLrig‐1を刺激した後、ホスホチロシン免疫ブロット(phosphotyrosine immunoblot)により刺激を受けたTreg細胞内に存在するStat3タンパク質のチロシンリン酸化(tyrosine phosphorylation)程度を分析し、その結果を図12に示した。
前記製造例5~8で作製された本発明に係るモノクローナル抗体(A8、B8、D9およびH6)の固形癌に対する治療効果を確認するために、図13に示されているように、B16F10メラノーマ細胞(melanoma cell)を、マウスの背部に、3×105細胞の量で皮下注射(subcutaneous injection)した後、4日目、8日目、12日目に前記製造例5~8の抗体を200μgの量で腹腔内注射した。前記メラノーマ細胞の移植後、時間の経過に伴う腫瘍の体積変化を測定し、その結果を図14に示した。
Claims (19)
- Lrig‐1(leucine‐rich and immunoglobulin‐like domains 1)タンパク質に特異的に結合する、結合分子であって、
前記合分子が以下の(1)~(4)からなる群から選択される、結合分子:
(1)配列番号5で表される重鎖CDR1、配列番号6で表される重鎖CDR2、および配列番号7で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号8で表される軽鎖CDR1、配列番号9で表される軽鎖CDR2、および配列番号10で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子;
(2)配列番号13で表される重鎖CDR1、配列番号14で表される重鎖CDR2、および配列番号15で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号16で表される軽鎖CDR1、配列番号17で表される軽鎖CDR2、および配列番号18で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子;
(3)配列番号21で表される重鎖CDR1、配列番号22で表される重鎖CDR2、および配列番号23で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号24で表される軽鎖CDR1、配列番号25で表される軽鎖CDR2、および配列番号26で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子;および、
(4)配列番号29で表される重鎖CDR1、配列番号30で表される重鎖CDR2、および配列番号31で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号32で表される軽鎖CDR1、配列番号33で表される軽鎖CDR2、および配列番号34で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子。 - 請求項1に記載の結合分子であって、
前記結合分子は、以下のものからなる群から選択される結合分子:
配列番号11で表される重鎖可変領域と、配列番号12で表される軽鎖可変領域とを含む結合分子;
配列番号19で表される重鎖可変領域と、配列番号20で表される軽鎖可変領域とを含む結合分子;
配列番号27で表される重鎖可変領域と、配列番号28で表される軽鎖可変領域とを含む結合分子;
配列番号35で表される重鎖可変領域と、配列番号36で表される軽鎖可変領域とを含む結合分子。 - 前記結合分子は、Fc領域または定常領域(constant region)をさらに含む、請求項1に記載の結合分子。
- 前記Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体のFc領域、またはハイブリッドFc(hybrid Fc)領域である、請求項3に記載の結合分子。
- 前記結合分子は、配列番号37、39、41、42、43および44からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域をさらに含む、請求項1に記載の結合分子。
- 前記結合分子は、配列番号38または40で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域をさらに含む、請求項1に記載の結合分子。
- 前記結合分子は、
配列番号37で表されるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域と、
配列番号38で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域とをさらに含む、請求項1に記載の結合分子。 - 前記結合分子は、
配列番号39、41、42または43で表されるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域と、
配列番号40で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域とをさらに含む、請求項1に記載の結合分子。 - 前記結合分子は、配列番号44で表されるアミノ酸配列からなる重鎖定常領域をさらに含む、請求項1に記載の結合分子。
- 請求項1に記載の結合分子であって、
前記結合分子は、以下のものからなる群から選択される結合分子:
配列番号45で表される重鎖と、配列番号46で表される軽鎖とを含む結合分子;
配列番号47で表される重鎖と、配列番号48で表される軽鎖とを含む結合分子;
配列番号49で表される重鎖と、配列番号50で表される軽鎖とを含む結合分子;および
配列番号51で表される重鎖と、配列番号52で表される軽鎖とを含む結合分子。 - 前記結合分子は、抗体またはその断片である、請求項1に記載の結合分子。
- 前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体(humanized antibody)、二価(bivalent)、両特異性分子、ミニボディ(minibody)、ドメイン抗体、二重特異性抗体(bispecific antibody)、抗体模倣物、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)またはその断片である、請求項11に記載の結合分子。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載の結合分子をコードする、核酸分子。
- 請求項13に記載の核酸分子が挿入されている、発現ベクター。
- 請求項14に記載の発現ベクターがトランスフェクトされている、宿主細胞株。
- Lrig‐1(leucine‐rich and immunoglobulin‐like domains 1)タンパク質に特異的に結合する、抗体を含む、抗体‐薬物複合体であって、
前記抗体は、以下の(1)~(4)からなる群から選択される、抗体‐薬物複合体:
(1)配列番号5で表される重鎖CDR1、配列番号6で表される重鎖CDR2、および配列番号7で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号8で表される軽鎖CDR1、配列番号9で表される軽鎖CDR2、および配列番号10で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む抗体;
(2)配列番号13で表される重鎖CDR1、配列番号14で表される重鎖CDR2、および配列番号15で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号16で表される軽鎖CDR1、配列番号17で表される軽鎖CDR2、および配列番号18で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む抗体;
(3)配列番号21で表される重鎖CDR1、配列番号22で表される重鎖CDR2、および配列番号23で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号24で表される軽鎖CDR1、配列番号25で表される軽鎖CDR2、および配列番号26で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む抗体;および、
(4)配列番号29で表される重鎖CDR1、配列番号30で表される重鎖CDR2、および配列番号31で表される重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号32で表される軽鎖CDR1、配列番号33で表される軽鎖CDR2、および配列番号34で表される軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。 - 請求項1から12のいずれか一項に記載の結合分子を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
- 前記癌は、固形癌である、請求項17に記載の薬学組成物。
- 前記癌は、胃癌、肝癌、膠細胞腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、メラノーマまたは肺癌である、請求項17に記載の薬学組成物。
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