TW202146440A - 經工程化以過度表現細胞訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞及其用途 - Google Patents

經工程化以過度表現細胞訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞及其用途 Download PDF

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金浩彥
王歈
田樁珠
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南韓商韓國免疫技術生物製藥股份有限公司
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Abstract

本發明係關於一種經工程化以過度表現細胞訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞及其用途。作為一特定實例，表現包含嵌合抗原受體及細胞訊號傳遞路徑調節物之融合蛋白質的免疫細胞藉由經由在細胞膜上表現之嵌合抗原受體選擇目標癌細胞來執行免疫反應。在此情況下，該細胞訊號傳遞路徑調節物在細胞質中過度表現，藉此能夠調節免疫細胞之活性。因此，包含嵌合抗原受體及細胞訊號傳遞路徑調節物之該融合蛋白質及經工程化以過度表現本發明之該(該等)細胞訊號傳遞路徑調節物的該免疫細胞可有效地用於治療癌症。

Description

經工程化以過度表現細胞訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞及其用途
發明領域
本發明係關於經工程化以過度表現細胞訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞及其用途。
發明背景
癌症為全球第二大引起發病及死亡的原因。發病率較高的癌症為乳癌、肺及支氣管癌、前列腺癌、大腸直腸癌、膀胱癌、皮膚黑色素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、甲狀腺癌、腎及腎盂癌、子宮內膜癌、白血病及胰臟癌。為了治療癌症，已嘗試各種方法，諸如手術、放射療法及化學療法。然而，由於已報導若干副作用，近年來已研發出使用患者之免疫功能的免疫療法。正積極研究能夠識別特定癌細胞之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體經由病毒載體表現於免疫細胞中，且隨後移植至癌症患者中之治療方法(以CAR-T為主/以TCR T為主之過繼性細胞療法)。
特定言之，嵌合抗原受體由抗體之片段、鉸鏈區、跨膜域及胞內訊號傳遞域構成。表現嵌合抗原受體之免疫細胞，諸如T細胞(CAR-T細胞)或表現嵌合抗原受體之自然殺手細胞(CAR-NK細胞)特異性地識別細胞(癌細胞及其類似細胞)，其中抗體之片段識別表現目標分子之細胞以活化免疫細胞之細胞毒性，藉此誘導目標細胞之細胞死亡。因此，表現嵌合抗原受體之免疫細胞用於經基因工程化的細胞療法中。特定言之，已報導嵌合抗原受體T細胞針對表現CD19之血液癌展現出極高治療作用。
然而，不同於血液癌，在實體癌症之情況下，對於其中引入了基因之免疫細胞，諸如CAR-T細胞而言，要遷移至癌細胞生長之腫瘤組織並不容易。另外，即使免疫細胞浸潤至腫瘤組織中，由於若干類型之免疫檢查點蛋白質及在癌細胞或癌細胞周圍之細胞中表現的各種細胞介素，CAR-T細胞之免疫反應亦會降低，且因此迄今為止未在實體癌症中展現出治療功效。
其中，TGF-β已知為抑制CAR-T細胞之免疫反應的代表性細胞介素。TGF-β之訊號傳遞路徑係藉由二種類型之受體，亦即TGFβR1及TGFβR2介導，該等受體存在於細胞膜上。首先，當TGF-β結合至TGFβR2時，TGFβR1經磷酸化且活化，且經活化TGFβR1使SMAD蛋白質磷酸化。經磷酸化SMAD蛋白質形成三聚體且易位至細胞核，以誘導特定基因之表現(Andres Rojas等人, Biochimica et Biophysica Acta 1793 (2009) 1165-1173)。因此，正在進行許多研究來解決抑制CAR-T細胞之免疫反應的問題且產生具有更好活性之免疫細胞。
發明概要 技術難題
因此，本發明人已研究產生一種方法，該方法不僅可預防其中引入了基因之免疫細胞的活性受到抑制的機制，且亦提高其中引入基因之免疫細胞的細胞活性。在CAR-T細胞上進行實驗，該細胞為其中引入了基因之免疫細胞的代表性實例。因此，設計出一種方法，該方法不僅可預防CAR-T細胞受到抑制的機制，且亦增加CAR-T細胞之細胞活性，且因此本發明人完成本發明。 問題的解決方案
為了解決以上問題，本發明之一個態樣提供一種編碼融合蛋白質之聚核苷酸，該融合蛋白質包括(i)抗原結合域；(ii)跨膜域；(iii)包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域；(iv)自裂解肽；及(v)訊號傳遞路徑調節物。
本發明之另一態樣提供一種聚核苷酸，其包括(i)編碼抗原結合域之聚核苷酸；(ii)編碼跨膜域之聚核苷酸；(iii)編碼包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域的聚核苷酸；(iv)編碼內部核糖體進入位址(Internal Ribosome Entry Site，IRES)之聚核苷酸；及(v)編碼訊號傳遞路徑調節物之聚核苷酸。
本發明之另一態樣提供一種載體，其包括編碼融合蛋白質之聚核苷酸，該融合蛋白質包括(i)抗原結合域；(ii)跨膜域；(iii)包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域；及(iv)訊號傳遞路徑調節物。
本發明之另一態樣提供一種表現嵌合抗原受體之免疫細胞，其特徵在於該免疫細胞表現融合蛋白質，該融合蛋白質包括(i)抗原結合域；(ii)跨膜域；(iii)包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域，且過度表現外部引入之訊號傳遞路徑調節物。
本發明之另一態樣提供一種表現外部引入之訊號傳遞路徑調節物的免疫細胞。 本發明之作用
本發明之經工程化以過度表現嵌合抗原受體及外部引入之訊號傳遞路徑調節物的免疫細胞藉由在細胞膜上表現之嵌合抗原受體特異性地引發針對特定癌細胞之免疫反應。另外，由於外部引入之訊號傳遞路徑調節物過度表現於免疫細胞之細胞質中，因此有可能減弱任何特異性免疫抑制訊號傳遞路徑。另外，有可能藉由調節免疫細胞之活性來逐步提高整體殺死腫瘤細胞之能力。因此，本發明之經工程化以過度表現嵌合抗原受體及外部引入之訊號傳遞路徑調節物的免疫細胞可有效地用於治療癌症。
較佳實施例之詳細說明 用於進行本發明之最佳模式
下文中，將詳細描述本發明。包括自裂解肽之聚核苷酸
本發明之一個態樣提供一種編碼融合蛋白質之聚核苷酸，該融合蛋白質包括(i)抗原結合域；(ii)跨膜域；(iii)包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域；(iv)自裂解肽；及(v)訊號傳遞路徑調節物。
在此情況下，間隔子可另外置於(i)抗原結合域與(ii)跨膜域之間。 在此情況下，聚核苷酸可尤其呈以下形式： (a)聚核苷酸，其包括編碼融合蛋白質之聚核苷酸，該融合蛋白質含有(i)抗原結合域、(ii)間隔子及跨膜域，及(iii)包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域；(iv)編碼自裂解肽之聚核苷酸；及(v)編碼訊號傳遞路徑調節物之聚核苷酸；或
(b)聚核苷酸，其包括(i)編碼抗原結合域之聚核苷酸；(ii)編碼間隔子及跨膜域之聚核苷酸；(iii)編碼包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域的聚核苷酸；(iv)編碼自裂解肽之聚核苷酸；及(v)編碼訊號傳遞路徑調節物之聚核苷酸。
在此情況下，(i)編碼抗原結合域之聚核苷酸；(ii)編碼跨膜域之聚核苷酸；(iii)編碼包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域的聚核苷酸；(iv)編碼自裂解肽之聚核苷酸；及(v)編碼訊號傳遞路徑調節物之聚核苷酸可按5'至3'之次序依序鏈接。然而，只要訊號傳遞路徑調節物可在細胞質中表現，即可適當地調整序列排列。舉例而言，訊號傳遞路徑調節物可位於抗原結合域之上游。在此情況下，自裂解序列可位於訊號傳遞路徑調節物之下游。外部引入之訊號傳遞路徑調節物
此外，訊號傳遞路徑調節物可為選自由以下組成之群的任一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質、b)免疫親和素或其片段、c)參與抗原損失介導之復發的蛋白質、d)位於T細胞刺激訊號傳遞路徑中之蛋白質、e)參與抑制負反饋的蛋白質及f)其組合。
在此情況下，訊號傳遞路徑調節物之特徵在於其在該細胞質中起作用。位於免疫抑制訊號傳遞路徑：TGF- β/SMAD 訊號傳遞路徑中之蛋白質
位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質可為位於TGF-β/SMAD (FKBP12-FK506/雷帕黴素(rapamycin))訊號傳遞路徑中之蛋白質或其片段。特定言之，位於該TGF-β/SMAD (FKBP12-FK506/雷帕黴素)訊號傳遞路徑中之該蛋白質可為選自由以下組成之群的任一者：FKBP12 (FK506-結合蛋白質12，下文中在自裂解肽之後出現的FKBP12被稱為#F，SEQ ID NO: 13)、SMAD4蛋白質之C端MH2域(下文中在自裂解肽之後出現的SMAD4蛋白質之C端MH2域被稱為#M，SEQ ID NO: 20)及SKI蛋白質之N端域(N-SKI，下文中在自裂解肽之後出現的N-SKI被稱為#N，SEQ ID NO: 22)。
如本文所用，術語「轉型生長因子β (TGF-β)」為轉型生長因子β超家族之成員，且係指執行各種細胞功能，包括細胞生長、分化、細胞死亡、發育及其類似功能之細胞介素。
如本文所用，術語「TGF-β/SMAD訊號傳遞路徑」係指由TGF-β活化之訊號傳遞路徑。在TGF-β訊號轉導之過程中，配位體結合促進由TGF-β 1型/2型受體組成之雜四聚體的形成，且TGF-β 1型受體係由TGF-β 2型受體磷酸化而來。一旦TGF-β 1型受體經磷酸化，則存在於細胞質中之訊號轉導蛋白質(SMAD)經磷酸化，藉此實現後續訊號轉導。經磷酸化SMAD經由C端域形成三聚體，且隨後SMAD三聚體易位至細胞核中，其中其結合轉錄因子/輔因子且引起特定目標基因之上調/下調。T細胞中之TGF-β/SMAD訊號傳遞引起細胞介素產生、細胞增殖及多種免疫相關功能的顯著降低。特定言之，位於TGF-β/SMAD訊號傳遞路徑中之蛋白質可為FKBP12、SMAD4蛋白質之C端MH2域及N-SKI，及其類似物。
如本文所用，術語「FKBP12」為FK506結合蛋白質家族中之一者，分子質量為12 kDa，且參與調節各種細胞活性，諸如蛋白質摺疊及細胞遷移及免疫調節。特定言之，FKBP12結合至TGF-β 1型受體，且在空間上阻斷TGF-β 1型受體之TGF-β 2型受體介導的磷酸化，由此阻礙TGF-β介導之訊號傳遞。有趣的是，已知甚至在缺乏TGF-β的情況下，TGF-β 1型受體能夠在一定程度上經由其對於彼此之固有親和力與TGF-β 2型受體形成複合物。因此，不管存在或不存在TGF-β，此類滲漏訊號傳遞可能始終發生。因此，已知可抑制TGF-β 1型受體之磷酸化的FKBP12充當「阻礙TGF-β滲漏訊號傳遞的分子守護者」。另一方面，揭露二種熟知免疫抑制藥物雷帕黴素及FK506結合至FKBP12，以使得其競爭性地干擾FKBP12結合至TGF-β 1型受體。因此，雷帕黴素及FK506促進免疫抑制訊號傳遞，其取決於TGF-β 1型受體之磷酸化。
此外，FKBP12及FK506之複合物，即一種免疫抑制藥物，能夠藉由其結合至鈣調磷酸酶來抑制鈣調磷酸酶之活性。「鈣調磷酸酶」為一種鈣(Ca2+ )依賴型蛋白質磷酸酶，其藉由介導經活化T細胞之核因子(NFAT)的去磷酸化作用來活化發炎性免疫反應。活化T細胞之核因子(NFAT)為一種轉錄因子且在大部分免疫細胞中表現。特定言之，NFAT用於增強T細胞介導之免疫反應，因為其上調T細胞之介白素-2 (IL-2)的轉錄。
FKBP12可衍生自人類，且可包括NCBI參考序列：NP_000792.1或NP_001186715.1中所揭露之胺基酸序列。或者，FKBP12可包括NP_004107 (FKBP12.6)中所揭露之胺基酸序列。
另外，FKBP12可包括由SEQ ID NO: 13或19表示之胺基酸序列。另外，FKBP12可與SEQ ID NO: 13或19之胺基酸序列具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。另外，編碼FKBP12之核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 14表示之核苷酸序列。另外，編碼FKBP12之核苷酸序列可與由SEQ ID NO: 14表示之核苷酸序列具有約95%、97%或99%或更高的同源性。另外，FKBP12之片段可包括SEQ ID NO: 13之胺基酸27至胺基酸100的胺基酸。如圖52中所示，SEQ ID NO: 13之胺基酸27、胺基酸47、胺基酸60、胺基酸100為參與TGF-β受體之結合的胺基酸。
如本文所用，術語「SMAD」為來自TGF-β超家族之受體的關鍵蛋白質轉導訊號，且參與細胞生長、分化、細胞死亡、發育及其類似功能。存在三種類型之SMAD：受體調節之SMAD (R-SMAD)、共同搭配物SMAD (Co-SMAD)及抑制性SMAD (I-SMAD)。二種受體調節之SMAD及共同搭配物SMAD之三聚體充當調節特異性基因之表現的轉錄因子。受體調節之SMAD包括SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5及SMAD8/9，且共同搭配物SMAD包括SMAD4，且抑制性SMAD包括SMAD6及SMAD7。受體調節/共同搭配物SMAD複合物主要存在於細胞質中，但在接收TGF-β訊號之後，其積聚且在細胞核中起作用，且I-SMAD主要存在於細胞核中，且充當轉錄調節因子。
如本文所用，術語「SMAD4」為上文所述之共同搭配物受體，且與受體調節之SMAD形成複合物以支持受體調節之SMAD的作用。另一方面，SMAD4介導T細胞中之c-myc表現的TGF-β依賴性下降、T細胞增殖及T細胞之免疫反應。「c-myc」為一種原癌基因，且為調節細胞增殖及生長之轉錄因子。特定言之，SMAD4可為具有NP_005350中所揭露之胺基酸序列的蛋白質。本發明之一個實施例中所用的SMAD4蛋白質之C端MH2域(SMAD4)的片段為參與「SMAD三聚合」之域。因此，當此片段在免疫細胞中過度表現時，形成由於缺乏DNA結合而不能充當轉錄因子的非功能性SMAD複合物，且因此阻斷免疫抑制TGF-β訊號傳遞，由此增加整體免疫反應性。此SMAD4片段可由SEQ ID NO: 20之胺基酸序列組成。另外，SMAD4片段可與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。
如本文所用，術語「SKI」為一種原癌基因產物，其用作增強細胞核中特異性基因之轉錄的轉錄調節蛋白質。SKI蛋白質之若干已知活性中之一者為藉由抑制功能性SMAD三聚體之形成而阻斷TGF-β訊號。在一個實施例中使用之N-SKI參與阻斷TGF-β訊號之SKI蛋白質的功能。特定言之，SKI蛋白質之N端區直接結合至SMAD且藉由中斷目標基因上的SMAD介導之轉錄調節來抑制TGF-β之作用。在此情況下，結合至SMAD之SKI蛋白質的N端區可稱為N-SKI。此N-SKI結合至SMAD蛋白質之三聚合域且干擾功能性SMAD三聚體之形成。因此，當此片段在免疫細胞中過度表現時，免疫抑制TGF-β訊號傳遞受到阻斷，藉此增加整體免疫反應性。特定言之，SKI可為包括如NP_003027所揭露之胺基酸序列的蛋白質。在一個實施例中所用之N-SKI的片段可為胺基酸序列SEQ ID NO: 22。另外，N-SKI之片段可與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質：位於免疫檢查點路徑中之蛋白質
位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質可為位於抑制性免疫檢查點路徑中之蛋白質或其片段。特定言之，位於抑制性免疫檢查點路徑中之蛋白質可為SHP-1蛋白質之N端SH2 (N-SH2)域(含Src同源性2域之磷酸酶1，下文中在自裂解肽之後出現的SHP-1被稱為#S1，SEQ ID NO: 26)或SHP-2蛋白質之N-SH2域(下文中在自裂解肽之後出現的SHP-2被稱為#S2，SEQ ID NO: 28)。
如本文所用，術語「抑制性免疫檢查點路徑」係指一種胞內訊號傳遞路徑，其誘導免疫耐受或抑制免疫刺激訊號傳遞路徑。參與T細胞中之抑制性免疫檢查點路徑的蛋白質包括細胞程式死亡蛋白質1 (PD-1)、細胞毒性T淋巴球相關抗原4 (CTLA-4)及類似蛋白質。
特定言之，藉由配位體PD-L1或PD-L2之PD-1的結合引起在PD-1之細胞質域中以免疫受體酪胺酸為主之抑制性基序(ITIM)及以免疫受體酪胺酸為主之轉換基序(ITSM)的磷酸化，及SHP-2/SHP-1之後續活化及T細胞中免疫刺激訊號之失活。CTLA-4結合至CD80/86以抑制CD28訊號傳遞，且經由存在於細胞質域中之YVKM基序活化SHP-2以抑制RAS，藉此抑制T細胞中之免疫刺激訊號傳遞。
如本文所用，術語「SHP-1」為蛋白質酪胺酸磷酸酶(PTP)中之一者，且已知為酪胺酸-蛋白質磷酸酶非受體6型(PTPN6)。「PTP」為調節包括細胞生長、分化、有絲分裂週期及致癌基因轉型之各種細胞過程的訊號轉導分子。SHP-1含有參與磷酸酪胺酸結合之二個串聯Src同源性(SH2，N-SH2及C-SH2)域及具有接近C端之蛋白質酪胺酸磷酸酶活性的PTP域(催化域)。N端SH2 (N-SH2)域調節結合至處於非活性狀態下之PTP域且抑制酶活性的SHP-1之活性。然而，當N-SH2域之Tyr殘基經磷酸化時，自PTP域中釋放N-SH2域，且自由PTP域與受質相互作用，由此將SHP-1轉化成具有去磷酸化活性之狀態。因此，當SHP-1蛋白質之N-SH2域在免疫細胞中過度表現時，抑制性免疫檢查點訊號係藉由結合至SHP-1蛋白質之PTP域且維持非活性狀態來阻斷。因此，相應免疫細胞之整體免疫活性得以增加。SHP-1可為包括NP_002822中所揭露之胺基酸序列的蛋白質。在一個實施例中所用之SHP-1的片段可為胺基酸序列SEQ ID NO: 26。另外，SHP-1之片段可與SEQ ID NO: 26之胺基酸序列具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。
如本文所用，術語「SHP-2」為PTP家族中之一者，且亦稱為酪胺酸-蛋白質磷酸酶非受體11型(PTPN11)、蛋白質-酪胺酸磷酸酶1D (PTP-1D)或蛋白質-酪胺酸磷酸酶2C (PTP-2C)。類似於SHP-1，SHP-2亦由用作在N端區處之蛋白質磷酸酪胺酸結合域的二個串聯Src同系物(SH2，N-SH2及C-SH2)域及具有在C端區處之磷酸酶活性的PTP域(催化域)組成。當SHP-2處於不活化狀態下時，N-SH2域封閉SHP-2之PTP域的活性位點，且當N-SH2域結合含磷酸酪胺酸之肽區時，自N-SH2域中釋放PTP域，且變得具有催化活性。因此，當SHP-2蛋白質之N-SH2域在免疫細胞中過度表現時，抑制性免疫檢查點訊號係藉由結合至SHP-2蛋白質之PDP域且維持非活性狀態來阻斷。因此，相應免疫細胞之整體免疫活性因N-SH2域之異位表現而增加。SHP-2可為具有如NP_002825所揭露之胺基酸序列的蛋白質。在一個實施例中所用之SHP-2的片段可為胺基酸序列SEQ ID NO: 28。另外，SHP-2之片段可與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。免疫親和素：FKBP12 及 親環蛋白 A
如本文所用，術語「免疫親和素」係指熟知的免疫抑制劑，諸如FK506、雷帕黴素及環孢素之目標蛋白質。迄今已知的一類免疫親和素為結合至FK506之蛋白質，且存在16種免疫親和素，其中之一為FKBP12。迄今已知的另一類免疫親和素為結合至環孢素之蛋白質，且存在16種免疫親和素，其中之一為親環蛋白A。其通常全部具有肽基脯胺醯基異構酶(PPI)活性。此活性促進肽鍵異構化且介導蛋白質摺疊。此調節各種胞內訊號傳遞路徑。當其結合至免疫抑制劑且其原始功能受到干擾時，誘導免疫抑制。因此，此等免疫親和素蛋白質應理解為對於免疫活性具有重要功能。作為此類免疫相關功能之實例，FKBP12及親環蛋白A (CYPA)執行的已知功能中之一者為調節T細胞黏附及遷移。
已知T細胞中之免疫親和素結合至激酶II之CT10調節蛋白(CrkII)，以促進CrkII之活化。「Crk」為藉由傳輸由對受體之下游蛋白質的外部刺激起反應的T細胞抗原受體(TCR)形成之訊號來介導訊號轉導的轉接蛋白中之一者，且包括CrkI及CrkII。
在T細胞中，「CrkII」結合至ZAP70，一種位於TCR之訊號傳遞路徑下游的蛋白質，且將訊號傳輸至Crk SH3域-結合鳥嘌呤-核苷酸釋放因子(C3G)，藉此誘導Ras相關蛋白質1 (RAP1)之活性。TCR為位於T細胞之表面上的受體，且識別藉由抗原呈遞細胞之主要組織相容複合物(MHC)呈遞的抗原，藉此活化T細胞之免疫反應。
「ZAP70」為TCR之構成蛋白質，且將TCR之活化訊號傳輸至下游蛋白質以誘導T細胞之活性。「RAP1」為較小GTP酶且屬於Ras超家族。GTP酶當結合至GTP時經活化且當結合至GDP時不經活化。此類GTP酶之活性由GTP酶活性蛋白質(GAP)及鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)調節，且GAP促進GDP所結合之GTP酶的形成，且GEF促進GTP所結合之GTP酶的形成。
「C3G」為一類GEF，且增加T細胞中GTP所結合之RAP1，藉此誘導淋巴細胞功能相關抗原1 (LFA-1)之活性，以提高T細胞黏附。「LFA-1」為在T細胞中表現的整合素中之一者，且結合至細胞間黏附分子1 (ICAM-1)，一種在自血液遷移至身體組織中之過程中在目標細胞中表現的配位體，以介導T細胞對目標細胞之黏附。已知諸如FKBP12及CYPA之免疫親和素結合至CrkII且藉由結合至CrkII來增加CrkII及C3G之結合，由此增加C3G之下游訊號傳遞路徑的活性，由此增加由LFA-1調節之T細胞黏附。
在此情況下，FKBP家族之一個實施例可為FKBP12。另外，FKBP12蛋白質及其片段之序列如上文在「位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質」中所述。另外，親環蛋白之一個實施例可為親環蛋白A。位於親環蛋白A-介導之訊號傳遞路徑中之蛋白質可為CYPA (親環蛋白A，下文中在自裂解肽之後出現的所結合之CYPA被稱為#C，SEQ ID NO: 24)。
如本文所用，術語「環孢素A (CsA)」為一種衍生自天然產物之免疫抑制劑。其係口服給予或經由靜脈內注射投與，且用作預防類風濕性關節炎、牛皮癬、克隆氏病、腎病症候群及器官移植排斥之藥物。親環蛋白A為結合至CsA之細胞質結合蛋白質，且CsA/CYPA複合物抑制鈣調磷酸酶之磷酸酶活性，藉此抑制淋巴球之免疫反應。另外，CYPA係參與到經由肽基脯胺醯基異構酶(PPI)之活性的蛋白質摺疊中，且經由此活性，其調節生物過程，諸如胞內訊號傳遞、轉錄、發炎及細胞死亡及其類似過程。除了其胞內作用之外，已知CYPA可回應於發炎性刺激、低氧、感染及氧化應激而分泌，且在病毒感染、牙周病及動脈粥樣硬化中充當化學引誘劑，由此促進發炎反應。特定言之，在一個實施例中所用之親環蛋白A為一種包括如NP_066953所揭露之胺基酸序列的蛋白質。特定言之，親環蛋白A可包括胺基酸序列SEQ ID NO: 24。在此情況下，親環蛋白A可與胺基酸序列SEQ ID NO: 24具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。參與抗原損失介導之復發的蛋白質
參與抗原損失介導之復發的蛋白質可為參與胞啃作用(trogocytosis)的蛋白質或其片段。特定言之，參與胞啃作用之蛋白質可為TC21 (畸胎瘤癌基因21，下文中在自裂解肽之後出現的所結合之TC21被稱為#TC，SEQ ID NO: 32)或RhoG (Ras同源性生長相關，下文中在自裂解肽之後出現的所結合之RhoG被稱為#RG，SEQ ID NO: 34)。
如本文所用，術語「TC21」亦稱為R-Ras2，且為Ras GTP酶超家族中之一者。其結合至細胞膜且介導與細胞增殖相關之訊號轉導。另外，已知結合至TCR且活化磷酸肌醇3-激酶(PI3K)，一種在訊號傳遞路徑上之下游蛋白質，藉此誘導免疫突觸之內化且介導膜分子轉運。TC21可為具有NP_036382中所揭露之胺基酸序列的蛋白質。另外，TC21可為變異體，且在一個實施例中所用之TC21可包括胺基酸序列SEQ ID NO: 32。TC21可與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。
如本文所用，術語「RhoG」為單體GTP結合蛋白質(G蛋白質)，且參與調節細胞移動、轉錄、內飲作用、枝晶生長及其類似功能。此外，亦已知藉由TC21及PI3K活化來介導由TCR誘導之膜分子轉運。RhoG可為具有NP_001656中所揭露之胺基酸序列的蛋白質。另外，RhoG可為變異體，且在一個實施例中所用之RhoG的片段可包括胺基酸序列SEQ ID NO: 34。RhoG之片段可與胺基酸序列SEQ ID NO: 34具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。
如本文所用，術語「膜分子轉運」係指其中T細胞及抗原呈遞細胞經由免疫突觸結合的現象，且在此狀態下，一個細胞之表面分子經分離且轉運至其他細胞。已知係為了調節免疫反應之抑制或擴增而發生的現象。「免疫突觸」為一種在黏附及識別T細胞及抗原呈遞細胞之過程中形成的分子結構。
當TC21及RhoG蛋白質在免疫細胞中過度表現時，在與癌細胞之反應中干擾胞啃作用，且因此可抑制由抗原損失介導之免疫逃脫過程。位於T 細胞 刺激訊號傳遞路徑中之蛋白質 ：TCR/ZAP70 路徑之轉接蛋白
位於T細胞刺激路徑中之蛋白質可為TCR/ZAP70路徑之轉接蛋白或其片段。特定言之，TCR/ZAP70路徑之轉接蛋白可為選自由以下組成之群的任一者：NCK1 (下文中在自裂解肽之後所結合之NCK1被稱為#K)、LAT (T細胞活化之連接子，下文中在自裂解肽之後所結合之LAT被稱為#L)及NEMO (NF-κB基本調節物，下文中在自裂解肽之後所結合之NEMO被稱為#I)。
如本文所用，術語「TCR/ZAP70路徑」為一種當初始T細胞之T細胞抗原受體結合至抗原呈遞細胞之MHC/抗原複合物，且活化T細胞之免疫反應時發生的訊號傳遞路徑。特定言之，當初始T細胞之TCR結合至MHC/抗原複合物時，TCR之輔助蛋白質CD3的伽瑪(γ)、德耳塔(δ)、艾普斯龍(ε)及澤塔(ζ)鏈經磷酸化，且ZAP70結合至磷酸化的CD3ζ鏈。隨後，結合至CD4或CD8之LCK，一種T細胞之輔助受體，使ZAP70磷酸化且活化。
經活化ZAP70使LAT及含SH2域之白細胞蛋白質76 kDa (SLP-76)磷酸化，以誘導諸如核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NF-κB)、激活蛋白1 (AP-1)及NFAT及其類似物之活化轉錄因子的信號反應。NF-κB為一種調節發炎反應調節(inflammatory response regulation)、免疫調節(immune modulation)、細胞死亡、細胞增殖及分化及其類似功能的轉錄因子，且由p50、p52、RelA (p65)、RelB、c-Rel及v-Rel組成。AP-1為一種調節發炎反應調節、細胞死亡、細胞增殖及分化及其類似功能的轉錄因子，且與諸如c-Fos、c-Jun、活化轉錄因子(ATF)及JDP及其類似物之其他轉錄因子形成二聚體，藉此用以調節轉錄。諸如NF-κB、AP-1及NFAT之轉錄因子促進介白素-2之表現，藉此活化T細胞分裂、分化及免疫反應。
如本文所用，術語「NCK1」為一種包括SH2及SH3域的訊號傳遞介導之蛋白質，且介導酪胺酸激酶受體之訊號傳遞。另外，NCK1可藉由結合至WASP/Arp2/3複合物調節細胞骨架重排。「WASP/Arp2/3複合物」為一種誘導肌動蛋白絲(actin filament)形成之蛋白質，其為細胞骨架。在T細胞中，NCK促進由TCR之活性誘導的免疫突觸形成。NCK1可為包括NP_006144中所揭露之胺基酸序列的蛋白質。
如本文所用，術語「LAT」為一種34 kDa跨膜蛋白質，且在活化TCR之訊號傳遞路徑時由ZAP70/Syk (脾相關酪胺酸激酶)磷酸化。參與TCR之訊號傳遞路徑的包括SH2域之轉接蛋白直接/間接結合至磷酸化的LAT，以介導訊號轉導。轉接蛋白可包括磷脂酶C γ1(PLCγ1)、生長因子受體結合蛋白質2 (Grb2)、Shc之Grb2相關轉接蛋白下游(Gads)、Grb2相關轉接蛋白(Grap)、SH3域結合蛋白質2 (SH3BP2)、含SH2域之轉接蛋白B (Shb)、無七之子同系物1 (SOS1)、卡西塔斯B淋巴瘤(c-Cbl)、VAV、含SH2域之白細胞蛋白質76 kDa (SLP-76)及IL-2誘導性T細胞激酶(Itk)及其類似物。LAT可為包括如NP_055202所揭露之胺基酸序列的蛋白質。
如本文所用，術語「NEMO」已知為IκB激酶γ (IKKγ)，且與IKKα/IKKβ形成複合物，以誘導核因子κ-B激酶之抑制劑(IκB)的磷酸化及降解，藉此促進NF-κB之活性。NEMO可為包括如NP_001093326所揭露之胺基酸序列的蛋白質。位於T 細胞 刺激路徑中之蛋白質 ： 位於TNFR/TLR 受體路徑中之蛋白質
位於T細胞刺激路徑中之蛋白質可為位於TNFR/TLR受體(TRAF/NF-kB)路徑中之蛋白質或其片段。特定言之，TNFR/TLR受體(TRAF/NF-kB)路徑蛋白質可為TLR4，且更佳可為TLR4蛋白質之胞內訊號傳遞域(下文中在自裂解肽之後所結合之TLR4蛋白質的胞內訊號傳遞域被稱為#T，SEQ ID NO: 30)。
如本文所用，術語「腫瘤壞死因子受體(TNFR)」為一種腫瘤壞死因子α (TNFα)之受體。TNFα為一種主要產生於活化的巨噬細胞、輔助T細胞、自然殺手細胞及其類似細胞中之發炎性細胞介素，且調節各種生物活性，諸如細胞生長、分化及細胞死亡、發炎反應及其類似功能。
如本文所用，術語「TNFR訊號傳遞路徑」係指一種由TNFR結合至配位體誘導之胞內訊號傳遞路徑。當TNFα結合至TNFR1時，TNF受體相關死亡域(TRADD)、受體相互作用蛋白質激酶1 (RIP1)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)相關因子(TRAF) 2或TRAF5 (TRAF2/5)、細胞凋亡抑制劑1 (cIAP1)及cIAP2形成複合物，以促進TAK1之活化。轉型生長因子-β活化的激酶1 (活化的TAK1)可使IKKβ磷酸化，以誘導IκB之磷酸化及蛋白分解，藉此誘導NF-κB之活性。
如本文所用，術語「鐸樣受體(TLR)」為一種在先天性免疫中起重要作用的蛋白質。TLR為一種嵌入於細胞膜中之非催化性單蛋白質受體，且主要表現於先天性免疫過程中之巨噬細胞、樹突狀細胞及其類似物或黏膜上皮細胞、嗜中性白血球及其類似物的表面上。存在13種類型的TLR：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12及TLR13。其中，TLR11、TLR12及TLR13未表現於人類中。
如本文所用，術語「TLR訊號傳遞路徑」為一種由TLR結合至配位體誘導之胞內訊號傳遞路徑，且TLR之訊號傳遞通常經由髓樣分化因子88 (MyD88)及含鐸/IL-1R域之轉接蛋白誘導IFN-γ (TRIF)活化。MyD88結合至TLR之TIR (鐸/IL-1R)域，以誘導IL-1受體相關激酶4 (IRAK-4)之活性，且活化的IRAK-4使IRAK-1磷酸化以誘導TRAF6之磷酸化。磷酸化的TRAF6活化IKK，以誘導IκB之磷酸化及蛋白分解，藉此誘導NF-κB之活性。
「TLR4」為一種屬於TLR家族之受體，且由識別脂多糖(LPS)而活化。「LPS」亦稱為內毒素，且為由脂質及多醣構成之分子，且為革蘭氏陰性細菌之外膜的組分。TLR4可為具有如NP_003257所揭露之胺基酸序列的蛋白質。在一個實施例中所用之TLR4的片段可為胺基酸序列SEQ ID NO: 30。TLR4之片段可與胺基酸序列SEQ ID NO: 30具有約80%、90%、95%或99%或更高的同源性。位於T 細胞 刺激路徑中之蛋白質 ： 位於細胞介素受體(JAK-STAT) 路徑中之蛋白質
位於T細胞刺激路徑中之蛋白質可為位於細胞介素受體(JAK-STAT)路徑中之蛋白質或其片段。
如本文所用，術語「細胞介素」為一種由活生物體內之若干類型的細胞分泌的多肽或醣蛋白，且參與細胞增殖、分化、活化及其類似功能，且在免疫及發炎反應中起重要作用。如本文所用，術語「細胞介素受體訊號傳遞路徑」係指由細胞介素誘導之胞內訊號傳遞路徑。與存在之各種類型的細胞介素相比，胞內訊號傳遞過程經歷類似路徑。當細胞介素結合至各特定受體時，誘導受體之低聚合，且使位於受體中之下游的JAK激酶(JAK)磷酸化且活化。受體之細胞質域中的酪胺酸殘基藉由活化的JAK結合至訊號轉導及轉錄激活蛋白(STAT)而磷酸化。另外，結合至受體之STAT經由JAK之磷酸化來活化且與受體分離。活化的STAT在細胞質中形成均二聚體或雜二聚體，且隨後易位細胞核以誘導目標基因之表現。位於T 細胞 刺激路徑中之蛋白質 ： 位於MAP 激酶 路徑中之蛋白質
位於T細胞刺激路徑中之蛋白質可為位於促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)路徑中之蛋白質或其片段。特定言之，位於MAP激酶路徑中之蛋白質可為選自由以下組成之群的任一者：生長阻滯及DNA損壞誘導性基因45α (GADD45α，下文中在自裂解肽之後所結合之GADD45α被稱為#A)、細胞分裂循環42 (CDC42，下文中在自裂解肽之後所結合之CDC42被稱為#B)及HRAS (下文中在自裂解肽之後所結合之HRAS被稱為#H)。
如本文所用，術語「MAPK訊號傳遞路徑」係指為一種由諸如生長因子、細胞介素或激素及其類似物之促分裂原活化的訊號傳遞路徑，且參與各種細胞功能，包括細胞增殖、分化及遷移。此路徑包括MAPK在內的多種蛋白質，MAPK被稱為胞外訊號調節之激酶(ERK)，且藉由相鄰蛋白質之磷酸化來傳輸訊號。MAPK訊號傳遞路徑調節細胞反應，諸如發炎、細胞應激反應、細胞分化、細胞分裂、細胞增殖、代謝、移動及細胞死亡及其類似功能。在哺乳動物中，MAPK分成4組：ERK-1/2、jun胺基末端激酶1、2、3 (JNK1/2/3)、p38蛋白質(p38α、β、γ、δ)及ERK5。
如本文所用，術語「GADD45」為一種存在於細胞核中之蛋白質，且存在三種類型：GADD45α、β及γ。其充當環境及生理壓力之感測器，且結合至與細胞週期、細胞存活、細胞死亡、基因體穩定性之維護及DNA修復相關之蛋白質，且調節其活性。GADD45α抑制細胞週期G2/M轉化率，且誘導細胞死亡，且經由DNA去甲基化來使基因體穩定。另外，已知結合至1型輔助T細胞(Th1)及樹突狀細胞中之p38MAPK，以抑制p38MAPK之磷酸化(Tyr323)，藉此抑制T細胞之活性。GADD45可為具有NP_001915中所揭露之胺基酸序列的蛋白質。
如本文所用，術語「CDC42」為一種用以調節細胞形狀、遷移、內飲作用及細胞週期及其類似功能之屬於Rho家族的GTP酶。CDC42之活性促進細胞骨架重排，以誘導細胞黏附及遷移。另外，其由TCR之訊號傳遞蛋白質下游活化，以促進JNK及p38MAPK之活化，藉此誘導發炎性細胞介素之產生及T細胞之增殖。CDC42可為包括如NP_001782所揭露之胺基酸序列的蛋白質。
如本文所用，術語「HRAS」為一種GTP酶，亦稱為轉型蛋白質21，且藉由生長因子調節細胞分裂。活化的HRAS活化訊號傳遞蛋白質，諸如c-Raf及PI3K，其為訊號傳遞路徑上之下游蛋白質。HRAS結合至活性狀態下之GTP，且藉由在核苷酸末端裂解磷酸根以將GTP轉化成GDP來不活化。HRAS可為包括NP_005334中所揭露之胺基酸序列的蛋白質。參與抑制負反饋之蛋白質
另外，參與抑制負反饋之蛋白質可為參與抑制細胞介素訊號傳遞路徑之負反饋的蛋白質或其片段。特定言之，參與抑制細胞介素訊號傳遞路徑之負反饋的訊號調節物可為SOCS1蛋白質之C端域(細胞介素訊號傳遞抑制因子1，下文中在自裂解肽之後所結合之SOCS1蛋白質的C端域被稱為#Q，NP_003736)。
如本文所用，術語「細胞介素訊號傳遞路徑」為針對細胞介素受體訊號傳遞路徑所述。JAK-STAT訊號傳遞路徑包括負反饋調節機制，且其由三種類型之調節蛋白質組製得：活化的STAT之蛋白質抑制劑(PIAS)、PTP及SOCS。PIAS藉由使小泛素樣修飾蛋白(SUMO)結合至STAT或抑制STAT及DNA之結合來抑制STAT之活性。PIAS可為PIAS1、PIAS3、PIASx及PIASγ。「SUMO」為一種與蛋白質共價連接或脫離，且結合至目標蛋白質以調節目標蛋白質之功能的蛋白質。其主要執行細胞核-細胞質轉運、轉錄調節、蛋白質穩定性調節功能。PTP結合至細胞介素受體，JAK及STAT，且移除其磷酸根基，藉此抑制細胞介素訊號傳遞路徑。PTP可為SHP-1、SHP-2及CD45。
如本文所用，術語「SOCS」為一種包括具有在C端處之SH2域及40個胺基酸區的SOCS盒基序的蛋白質家族。該家族包括八種蛋白質：含細胞介素誘導性SH2域的蛋白質(CISH)、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6及SOCS7。SOCS及JAK-結合蛋白質(JAB)、細胞介素誘導性STAT抑制劑(CIS)及STAT誘導之STAT抑制劑(SSI)為相同蛋白質家族。細胞介素引起的JAK-STAT訊號傳遞路徑之活性誘導CISH、SOCS1及SOCS3之表現，且此等蛋白質以藉由結合至受體之磷酸化域來阻斷STAT結合的方式干擾JAK之活化或抑制STAT之活化。特定言之，「SOCS-1」藉由結合至磷酸化JAK來誘導磷酸化JAK的蛋白分解。
SOCS1蛋白質之C端域可結合至Elongin B/C，其與完整SOCS1競爭性地介導泛素連接酶。因此，當SOCS1蛋白質之C端域經過度表現時，即使完整SOCS1蛋白質結合至磷酸化JAK，磷酸化JAK蛋白質亦在不降解之情況下救援，因為其不伴隨泛素化。因此，此機制可增加免疫細胞之免疫活性。參與抑制負反饋之訊號調節物為SOCS1蛋白質之C端域，且可為具有如NP_003736所揭露之胺基酸序列的蛋白質。訊號傳遞路徑調節物之組合
訊號傳遞路徑調節物可包括一或多個訊號傳遞路徑調節物。在此情況下，自裂解肽可包括在各訊號傳遞路徑調節物之間。特定言之，訊號傳遞路徑調節物可包括二個訊號傳遞路徑調節物。另外，訊號傳遞路徑調節物可包括三個訊號傳遞路徑調節物。 二個訊號傳遞路徑調節物之組合 訊號傳遞路徑調節物可具有以下結構式(I)之結構： N'-X-L1-Y-C'   (I) 其中，在該結構式(I)中， N'為融合蛋白質之一N端， C'為融合蛋白質之一C端，及
X及Y中之每一者可為選自由以下組成之群的任一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質或其片段；b)免疫親和素或其片段；c)參與抗原損失介導之復發的蛋白質或其片段；d)位於T細胞刺激路徑中之蛋白質或其片段；及e)參與抑制負反饋的蛋白質或其片段。
L1可為自裂解肽或內部核糖體進入位址(IRES)。
特定言之，X可選自位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質。在一個實施例中，X可為選自由以下組成之群的任一者：FKBP12蛋白質或其片段；SMAD4之C端MH2域或其片段；N-SKI或其片段；SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段；及SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，X可為免疫親和素。在一個實施例中，X可為FKBP12蛋白質或其片段；或親環蛋白A (CYPA)或其片段。另外，X可選自參與抗原損失介導之復發的蛋白質。在一個實施例中，X可為選自由以下組成之群的任一者：TC21或其片段；RHOG或其片段。另外，X可選自位於T細胞刺激路徑中的蛋白質。在一個實施例中，X可為選自由以下組成之群的任一者：NCK1或其片段；LAT或其片段；NEMO或其片段；TLR4胞內域或其片段；GADD45α或其片段；CDC42或其片段；及HRAS或其片段。另外，X可選自參與抑制負反饋的蛋白質。在一個實施例中，X可為SOCS1蛋白質之C端域或其片段。
特定言之，Y可選自位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質。在一個實施例中，Y可為選自由以下組成之群的任一者：FKBP12蛋白質或其片段；SMAD4蛋白質之C端MH2域或其片段；N-SKI或其片段；SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段；及SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，Y可為免疫親和素。在一個實施例中，Y可為FKBP12蛋白質或其片段；或親環蛋白A (CYPA)或其片段。另外，Y可選自參與抗原損失介導之復發的蛋白質。在一個實施例中，Y可為選自由以下組成之群的任一者：TC21或其片段；及RHOG或其片段。另外，Y可選自位於T細胞刺激路徑中之蛋白質。在一個實施例中，Y可為選自由以下組成之群的任一者：NCK1或其片段；LAT或其片段；NEMO或其片段；TLR4之胞內域或其片段；GADD45α或其片段；CDC42或其片段；HRAS或其片段。另外，Y可選自參與抑制負反饋的蛋白質。在一個實施例中，Y可為SOCS1蛋白質之C端域或其片段。
二個訊號傳遞路徑調節物可包括免疫親和素。特定言之，可包括FKBP12蛋白質或其片段；或親環蛋白A。
訊號傳遞路徑調節物二者之組合的具體實例可為FKBP12蛋白質或其片段及親環蛋白A。另外，在一個實施例中，其可為FKBP12蛋白質或其片段，及SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，在一個實施例中，其可為FKBP12蛋白質或其片段，及SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，在一個實施例中，其可為FKBP12蛋白質或其片段，及SOCS1蛋白質之C端域或其片段。另外，在一個實施例中，其可為親環蛋白A及SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，在一個實施例中，其可為親環蛋白A及SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段。三個訊號傳遞路徑調節物之組合
訊號傳遞路徑調節物可具有以下結構式(II)之結構： N'-X-L1-Y-L2-Z-C'   (II) 其中，在該結構式(II)中， N'為融合蛋白質之一N端， C'為融合蛋白質之一C端，及 X、Y及Z中之每一者可為選自由以下組成之群的任一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質或其片段；b)免疫親和素或其片段；c)參與抗原損失介導之復發的蛋白質或其片段；d)位於T細胞刺激路徑中之蛋白質或其片段；及e)參與抑制負反饋的蛋白質或其片段。
L1及L2中之各者可為自裂解肽或IRES。
特定言之，X可選自位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質。在一個實施例中，X可為選自由以下組成之群的任一者：FKBP12蛋白質或其片段；SMAD4之C端MH2域或其片段；N-SKI或其片段；SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段；及SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，X可為免疫親和素。在一個實施例中，X可為FKBP12蛋白質或其片段；或親環蛋白A (CYPA)或其片段。另外，X可選自參與抗原損失介導之復發的蛋白質。在一個實施例中，X可為選自由以下組成之群的任一者：TC21或其片段；及RHOG或其片段。另外，X可選自位於T細胞刺激路徑中的蛋白質。在一個實施例中，X可為選自由以下組成之群的任一者：NCK1或其片段；LAT或其片段；NEMO或其片段；TLR4胞內域或其片段；GADD45α或其片段；CDC42或其片段；HRAS或其片段。另外，X可選自參與抑制負反饋的蛋白質。在一個實施例中，X可為SOCS1蛋白質之C端域或其片段。
特定言之，Y可選自位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質。在一個實施例中，Y可為選自由以下組成之群的任一者：FKBP12蛋白質或其片段；SMAD4蛋白質之C端MH2域或其片段；N-SKI或其片段；SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段；及SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，Y可為免疫親和素。在一個實施例中，Y可為FKBP12蛋白質或其片段；或親環蛋白A (CYPA)或其片段。另外，Y可選自參與抗原損失介導之復發的蛋白質。在一個實施例中，Y可為選自由以下組成之群的任一者：TC21或其片段；及RHOG或其片段。另外，Y可選自位於T細胞刺激路徑中之蛋白質。在一個實施例中，Y可為選自由以下組成之群的任一者：NCK1或其片段；LAT或其片段；NEMO或其片段；TLR4之胞內域或其片段；GADD45α或其片段；CDC42或其片段；HRAS或其片段。另外，Y可選自參與抑制負反饋的蛋白質。在一個實施例中，Y可為SOCS1蛋白質之C端域或其片段。
特定言之，Z可選自位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質。在一個實施例中，Z可為選自由以下組成之群的任一者：FKBP12蛋白質或其片段；SMAD4蛋白質之C端MH2域或其片段；N-SKI或其片段；SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段；及SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，Z可為免疫親和素。在一個實施例中，Z可為FKBP12蛋白質或其片段；或親環蛋白A (CYPA)或其片段。另外，Z可選自參與抗原損失介導之復發的蛋白質。在一個實施例中，Z可為選自由以下組成之群的任一者：TC21或其片段；及RHOG或其片段。另外，Z可選自位於T細胞刺激路徑中的蛋白質。在一個實施例中，Z可為選自由以下組成之群的任一者：NCK1或其片段；LAT或其片段；NEMO或其片段；TLR4之胞內域或其片段；GADD45α或其片段；CDC42或其片段；HRAS或其片段。另外，Z可選自參與抑制負反饋的蛋白質。在一個實施例中，Z可為SOCS1蛋白質之C端域或其片段。
三個訊號傳遞路徑調節物可呈各種組合形式。較佳地，三個訊號傳遞路徑調節物中之至少一者可為免疫親和素。
三個訊號傳遞路徑調節物之組合的具體實例可為FKBP12蛋白質或其片段、親環蛋白A及SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段。另外，在一個實施例中，其可為FKBP12蛋白質或其片段，親環蛋白A及SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段。嵌合抗原受體
本發明中所用之術語「抗原結合域」係指結合至抗原之抗體的位點。抗原結合域可為抗體或其抗原結合片段。較佳地，抗原結合域可為抗原結合片段。另外，抗原結合片段可為藉由二硫鍵將抗體中之一個重鏈及一個輕鏈連接具有一個抗原結合位點的片段。抗原結合片段可為選自由以下組成之群的任一者：scFv、Fab及Fab'。較佳地，抗原結合片段可為scFv。在一個實施例中，scFv係用作抗原結合域。
抗原結合域可特異性結合至選自由以下組成之群的任一抗原：α葉酸受體(目標腫瘤之實例：卵巢癌、胃癌及其類似疾病)、5T4 (腎癌、前列腺癌及其類似疾病)、αvβ6整合素(卵巢癌、胰臟癌及其類似疾病)、BCMA (多發性骨髓瘤)、B7-H3 (腦癌、骨肉瘤及其類似疾病)、B7-H6 (淋巴瘤、黑色素瘤及其類似疾病)、CAIX (腎癌、神經膠母細胞瘤及其類似疾病)、CD16 (IgG-調理化腫瘤)、CD19 (白血病、淋巴瘤)、CD20 (白血病、淋巴瘤)、CD22 (白血病、淋巴瘤)、CD30 (白血病、淋巴瘤)、CD33 (白血病)、CD43 (白血病)、CD44 (肝癌)、CD44v6 (白血病、多發性骨髓瘤、卵巢癌及其類似疾病)、CD44v7/8 (子宮內膜癌)、CD47 (白血病、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌及其類似疾病)、CD70 (白血病、淋巴瘤、神經瘤)、CD79a (白血病、淋巴瘤)、CD79b (白血病、淋巴瘤)、CD123 (白血病)、CD138 (多發性骨髓瘤)、CD171 (神經胚細胞瘤)、CEA (大腸直腸癌、胃癌、肺癌)、CSPG4 (白血病、神經膠母細胞瘤)、EGFR (乳癌、肺癌)、包括ErbB2之EGFR家族(HER2) (神經膠母細胞瘤、肉瘤)、EGFRvIII (神經膠母細胞瘤)、EGP2 (大腸直腸癌)、EGP40 (大腸直腸癌)、EPCAM (大腸直腸癌)、EphA2 (食道癌)、FAP (間皮瘤、肺癌、大腸直腸癌)、胎兒AchR (橫紋肌肉瘤)、FRα (卵巢癌、乳癌)、GD2 (神經胚細胞瘤)、GD3 (黑色素瘤、神經瘤及其類似疾病)、磷脂肌醇蛋白聚醣-3 (glypican-3，GPC3) (肝癌)、HLA-A1+MAGE1 (黑色素瘤)、HLA-A2+MAGE1 (黑色素瘤)、HLA-A3+MAGE1 (黑色素瘤)、HLA-A1+NY-ESO-1 (滑膜肉瘤、黑色素瘤)、HLA-A2+NY-ESO-1 (滑膜肉瘤、黑色素瘤)、HLA-A3+NY-ESO-1 (滑膜肉瘤、黑色素瘤)、IL-11Rα (骨肉瘤)、IL-13Rα2 (神經瘤)、λ、路易斯-Y (Lewis-Y)、κ (淋巴瘤)、間皮素(間皮瘤、胰臟癌及其類似疾病)、Muc1 (乳癌)、Muc16 (卵巢癌)、NCAM (神經胚細胞瘤、肺癌)、NKG2D配位體(白血病、多發性骨髓瘤)、NY-ESO-1 (多發性骨髓瘤)、PRAME (甲狀腺細胞腫瘤)、PSCA (前列腺癌)、PSMA (前列腺癌)、ROR1 (肺癌、乳癌)、SSX (滑膜肉瘤)、存活素(survivin)(肺癌)、TAG72 (卵巢癌)、TEMs、VEGFR2 (黑色素瘤、腎癌)及WT-1 (白血病)。特定言之，抗原結合域可特異性結合至CD19、HER2、PSMA、CD43或CD47。嵌合抗原受體 ：CD19
對CD19具有特異性之抗原結合域可包括特異性結合至CD19之抗體的片段。在本發明之一個實施例中，對CD19具有特異性之抗原結合域可包括輕鏈可變區，其包括L-CDR1 (SEQ ID NO: 73)、L-CDR2 (SEQ ID NO: 74)及L-CDR3 (SEQ ID NO: 75)。另外，對CD19具有特異性之抗原結合域可包括重鏈可變區，其包括H-CDR1 (SEQ ID NO: 76)、H-CDR2 (SEQ ID NO: 77)及H-CDR3 (SEQ ID NO: 78)。另外，對CD19具有特異性之抗原結合域可包括由SEQ ID NO: 3表示之胺基酸序列。另外，編碼對CD19具有特異性之抗原結合域的核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 4表示之核苷酸序列。嵌合抗原受體 ：HER2
對Her2具有特異性之抗原結合域可包括特異性結合至Her2之抗體的片段。在本發明之一個實施例中，對Her2具有特異性之抗原結合域可包括輕鏈可變區，其包括L-CDR1 (SEQ ID NO: 79)、L-CDR2 (SEQ ID NO: 80)及L-CDR3 (SEQ ID NO: 81)。另外，對Her2具有特異性之抗原結合域可包括重鏈可變區，其包括H-CDR1 (SEQ ID NO: 82)、H-CDR2 (SEQ ID NO: 83)及H-CDR3 (SEQ ID NO: 84)。另外，對Her2具有特異性之抗原結合域可包括由SEQ ID NO: 45表示之胺基酸序列。另外，編碼對Her2具有特異性之抗原結合域的核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 46表示之核苷酸序列。嵌合抗原受體 ：PSMA
對PSMA具有特異性之抗原結合域可包括特異性結合至PSMA之抗體的片段。在本發明之一個實施例中，對PSMA具有特異性之抗原結合域可包括輕鏈可變區，其包括L-CDR1 (SEQ ID NO: 85)、L-CDR2 (SEQ ID NO: 86)及L-CDR3 (SEQ ID NO: 87)。另外，對PSMA具有特異性之抗原結合域可包括重鏈可變區，其包括H-CDR1 (SEQ ID NO: 88)、H-CDR2 (SEQ ID NO: 89)及H-CDR3 (SEQ ID NO: 90)。另外，對PSMA具有特異性之抗原結合域可包括由SEQ ID NO: 54表示之胺基酸序列。另外，編碼對PSMA具有特異性之抗原結合域的核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 55表示之核苷酸序列。嵌合抗原受體 ：CD43
對CD43具有特異性之抗原結合域可包括特異性結合至CD43之抗體的片段。在本發明之一個實施例中，對CD43具有特異性之抗原結合域可包括輕鏈可變區，其包括L-CDR1 (SEQ ID NO: 91)、L-CDR2 (SEQ ID NO: 92)及L-CDR3 (SEQ ID NO: 93)。另外，對CD43具有特異性之抗原結合域可包括重鏈可變區，其包括H-CDR1 (SEQ ID NO: 94)、H-CDR2 (SEQ ID NO: 95)及H-CDR3 (SEQ ID NO: 96)。另外，對CD43具有特異性之抗原結合域可包括由SEQ ID NO: 47表示之胺基酸序列。另外，編碼對CD43具有特異性之抗原結合域的核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 48表示之核苷酸序列。嵌合抗原受體 ：CD47
對CD47具有特異性之抗原結合域可包括特異性結合至CD47之抗體的片段。在本發明之一個實施例中，對CD47具有特異性之抗原結合域可包括輕鏈可變區，其包括L-CDR1 (SEQ ID NO: 100)、L-CDR2 (SEQ ID NO: 101)及L-CDR3 (SEQ ID NO: 102)。另外，對CD47具有特異性之抗原結合域可包括重鏈可變區，其包括H-CDR1 (SEQ ID NO: 97)、H-CDR2 (SEQ ID NO: 98)及H-CDR3 (SEQ ID NO: 99)。另外，對CD47具有特異性之抗原結合域可包括由SEQ ID NO: 50表示之胺基酸序列。另外，編碼對CD47具有特異性之抗原結合域的核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 51表示之核苷酸序列。跨膜域
本發明中所用之術語「跨膜域」係指連接抗原所結合之域與在位於細胞膜中之蛋白質的結構中傳輸胞內訊號、區且穿過細胞膜，且使得位於細胞膜中之蛋白質固定在細胞膜上的域的位點。跨膜域可衍生自選自由以下組成之群的任一者：T細胞受體、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、AMN及PD-1。特定言之，跨膜域可衍生自CD8α。
在本發明的一個實施例中，使用由以下組成之間隔子及跨膜域：衍生自CD8α之由SEQ ID NO : 5表示的胺基酸序列。另外，編碼間隔子及跨膜域之核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 6表示之核苷酸序列。間隔子
如上文所述，抗原結合域與跨膜域可經由間隔子連接。間隔子係指連接子，且可為蛋白質或肽。另外，其可由1至1,000個胺基酸構成，且可由10至300個胺基酸構成。另外，其可由15至100個胺基酸構成，且可由15至60個胺基酸構成。另外，間隔子可由15至45個胺基酸構成。另外，連接子可為人體中之蛋白質的片段，諸如Fc區。另外，連接子可衍生自選自由以下組成之群的任一者：CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、AMN及PD-1。另外，間隔子可包括衍生自CD8α之鉸鏈的胺基酸序列。胞內訊號 傳遞域
本發明中所用之術語「胞內訊號傳遞域」係指當存在於細胞表面上之抗原受體(抗原結合域)識別胞外抗原時在細胞內部傳輸訊號以誘導諸如細胞活化、細胞毒性因子釋放、細胞介素產生、增殖及其類似反應之反應的區域。另外，一般而言，由於經由一個抗原受體(抗原結合域)傳輸的訊號不足以活化細胞，需要二級或共刺激訊號。因此，胞內訊號傳遞域可包括初級訊號傳遞域及二級訊號傳遞域及/或共刺激域。特定言之，胞內訊號傳遞域可包括共刺激域及初級訊號傳遞域。
共刺激域可衍生自選自由以下組成之群的至少一個分子：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM及ZAP70。特定言之，共刺激域可衍生自CD137 (4-1BB)。
在本發明的一個實施例中，使用由以下組成之共刺激域：衍生自CD137 (4-1BB)之由SEQ ID NO: 7表示的胺基酸序列。另外，編碼共刺激域之核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 8表示之核苷酸序列。
初級訊號傳遞域可衍生自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。特定言之，T細胞經由CD3之γ、δ、ε、ζ鏈在細胞內部傳輸訊號，且當構築嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)時，CD3之γ、δ、ε、ζ鏈可被用作初級訊號傳遞域。特定言之，初級訊號傳遞域可衍生自CD3ζ。
在本發明的一個實施例中，使用由以下組成之初級訊號傳遞域：衍生自CD3ζ之由SEQ ID NO: 9表示的胺基酸序列。另外，編碼初級訊號傳遞域之核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 10表示之核苷酸序列。
可適當地組合胞內訊號傳遞域。在一個實施例中，胞內訊號傳遞域可包括CD137 (4-1BB)及CD3ζ。自裂解肽
本發明中所用之術語「自裂解肽」係指能夠誘導在細胞中合成之蛋白質的裂解的由10至50、12至42、14至34、16至26或18至22個胺基酸組成之肽。自裂解肽可衍生自病毒基因之2A區域。自裂解肽可衍生自P2A、E2A、F2A或T2A。特定言之，自裂解肽可衍生自P2A。另外，可使用藉由存在於細胞質中之蛋白酶裂解的肽而非自裂解肽。
在本發明的一個實施例中，使用由以下組成之自裂解肽：衍生自P2A之由SEQ ID NO: 11或56表示的胺基酸序列。另外，編碼自裂解肽之核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 12表示之核苷酸序列。融合蛋白質之具體實例
融合蛋白質之具體實例可為如下： (1)  N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(FKBP12或其片段)-C端； (2) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-共刺激域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(親環蛋白A) -C端； (3) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物( SHP-1蛋白質之N-SH2域) -C端； (4) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物( SHP-2蛋白質之N-SH2域) -C端； (5) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物( SMAD4蛋白質之C端MH2域或其片段) -C端； (6) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(N-SKI或其片段) -C端； (7) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(FKBP12或其片段) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(親環蛋白A) -C端； (8) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(FKBP12之片段) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(SHP-2蛋白質之N-SH2域)-C端； (9) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(親環蛋白A) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(SHP-2蛋白質之N-SH2域)-C端； (10) N端-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(FKBP12或其片段) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(親環蛋白A) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(SHP-2蛋白質之N-SH2域) -C端； (11) N端-訊號傳遞路徑調節物(FKBP12或其片段) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-C端； (12) N端-訊號傳遞路徑調節物(親環蛋白A) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-共刺激域-C端； (13) N端-訊號傳遞路徑調節物(SHP-1蛋白質之N-SH2域) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-C端； (14) N端-訊號傳遞路徑調節物(SHP-2蛋白質之N-SH2域) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-C端； (15) N端-訊號傳遞路徑調節物(SMAD4蛋白質之C端MH2域或其片段) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-C端； (16) N端-訊號傳遞路徑調節物(N-SKI或其片段) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-C端； (17) N端-訊號傳遞路徑調節物(N-SKI或其片段) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(親環蛋白A) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-C端； (18) N端-訊號傳遞路徑調節物(FKBP12或其片段) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(SHP-2蛋白質之N-SH2域) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-C端； (19) N端-訊號傳遞路徑調節物(親環蛋白A) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(SHP-2蛋白質之N-SH2域) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域-C端； (20) N端-訊號傳遞路徑調節物(FKBP12或其片段) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(親環蛋白A) -自裂解肽-訊號傳遞路徑調節物(SHP-2蛋白質之N-SH2域) -自裂解肽-訊號肽-抗原結合域-鉸鏈-跨膜域-共刺激域-初級訊號傳遞域- C端。
在此情況下，在以上式(1)至(20)中，抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、共刺激域、初級訊號傳遞域、自裂解肽及訊號傳遞路徑調節物係如上文所述。特定言之，在以上式(1)至(20)中，抗原結合域可為對CD19具有特異性之scFv、對Her2具有特異性之scFv、對PSMA具有特異性之scFv、對CD43具有特異性之scFv、對CD47具有特異性之scFv，且跨膜域可衍生自CD8α，及共刺激域可衍生自CD137 (4-1BB)，及初級訊號傳遞域可衍生自CD3ζ，及自裂解肽可衍生自P2A。
在本發明的一個實施例中，其經設計以包括抗原結合域(CD19 scFv)、跨膜域(CD8α)、胞內訊號傳遞域(4-1BB及CD3ζ)、自裂解肽(P2A)及FKBP12，且其稱為「19bbz#F」。除上文之外，訊號傳遞路徑調節物及標記法如上文所述。編碼融合蛋白質之聚核苷酸
如本文所用，術語「聚核苷酸」係指去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及DNA/RNA混成物。聚核苷酸為單鏈或雙鏈，且可經重組、合成或分離。聚核苷酸包括前體信使RNA (pre-mRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA、基因體RNA (gRNA)、正鏈RNA (RNA (+))、負鏈RNA (RNA (-))、合成RNA、合成mRNA、基因體DNA (gDNA)、PCR-擴增的DNA、互補DNA (cDNA)、合成DNA或重組DNA，但不限於此。
聚核苷酸可經密碼子最佳化。如本文所用，術語「密碼子最佳化」係指取代編碼多肽之聚核苷酸中的密碼子，以便增加多肽之表現、穩定性及/或活性。影響密碼子優化的因子包括：(i)修飾生物體、基因或基因集中之密碼子偏移程度、(ii)系統性修飾密碼子，包括情境、(iii)根據其解碼tRNA修飾密碼子、(iv)根據GC%整體或在三個位置中之一者修飾密碼子、(v)修飾與參考序列，例如天然衍生之序列的類似性程度、(vi)修飾密碼子頻率截止值、(vii)來自DNA序列之經轉錄mRNA的結構特性、(viii)基於密碼子取代集之設計的DNA序列之功能的先驗瞭解、(ix)對各胺基酸之密碼子集的系統性修飾及/或(x)非邏輯轉譯起始位點之分離移除，但不限於此。包括編碼融合蛋白質之聚核苷酸的載體
本發明之另一態樣提供一種載體，其包括聚核苷酸。
聚核苷酸如上文所述。聚核苷酸可使用此項技術中已知且可用的多種所建立技術中之任一者製備、工程化、表現及遞送。為了表現所需融合蛋白質，可將編碼融合蛋白質之聚核苷酸插入至適當的載體中。
載體可用於此項技術中已知之多種載體中，且諸如啟動子、終止子、增強子及其類似物之表現調節序列、用於膜定向或分泌之序列及其類似物可取決於其中產生抗原受體之宿主細胞的類型而恰當地選擇，且根據目的不同地組合。本發明之載體包括質體載體、黏質體載體、噬菌體載體及病毒載體及其類似載體，但不限於此。適合的載體包括表現調節元件，諸如啟動子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、聚腺苷酸化訊號及增強子，以及用於膜定向或分泌之訊號肽或前導序列，且可根據目的不同地製備。
較佳地，載體可為病毒載體，且病毒載體可衍生自反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、痘病毒、桿狀病毒、乳突狀瘤病毒及微小病毒。在本發明的一個實施例中，使用慢病毒載體。
載體可進一步包括編碼訊號肽之序列，以便使抗原結合域暴露至細胞膜外部，且在此情況下，編碼訊號肽之序列可在編碼抗原結合域之序列之前插入。訊號肽可由SEQ ID NO: 1表示之胺基酸序列組成，且編碼該訊號肽之核苷酸序列可為由SEQ ID NO: 2表示之序列。包括編碼融合蛋白質之聚核苷酸的病毒
本發明之另一態樣提供一種病毒，其包括聚核苷酸。在此情況下，聚核苷酸如上文所述。病毒可為反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、痘病毒、桿狀病毒、乳突狀瘤病毒及微小病毒。表現編碼融合蛋白質之聚核苷酸的細胞
本發明之另一態樣提供一種免疫細胞，將載體引入至該細胞中。在此情況下，載體如上文所述。免疫細胞可為T細胞或自然殺手細胞。
將載體引入至免疫細胞中之方法可使用此項技術中已知之方法，且載體可藉由例如以下引入至細胞中：瞬時轉染、顯微注射、轉導、細胞融合、磷酸鈣沈澱、脂質體介導之轉染、DEAE聚葡萄糖介導之轉染、凝聚胺介導之轉染、電穿孔、基因槍或用於將核酸引入至細胞中的其他已知方法(Wu等人，J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992；Wu及Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988)。然而，其不限於此。
在引入載體之後，使經轉導或經傳染免疫細胞活體外增殖。在一個實施例中，經傳染免疫細胞可培養持續至少約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天以增殖，且可較佳培養12天至14天。
用於證實載體是否已很好地引入至免疫細胞中的方法包括例如熟習此項技術者所熟知之分子生物分析，例如南方墨點法及北方墨點法、RT-PCR及PCR；生物化學分析，例如作為一實例，藉由免疫方法(例如ELISA及西方墨點法)偵測存在或不存在特異性肽。
當融合蛋白質表現於免疫細胞中時，歸因於(iv)之自裂解肽，可分離(i)至(iii)中對應於細胞質中之嵌合抗原受體(CAR)的訊號傳遞路徑調節物(例如FKBP12或其片段)，且在嵌合抗原受體之情況下，其可固定於細胞膜上以識別胞外抗原且將訊號傳輸至細胞中。另外，訊號傳遞路徑調節物，例如FKBP12，可藉由結合至TGFβR1來阻斷TGF-β之訊號傳遞路徑。包括IRES 之 聚核 苷酸
本發明之另一態樣提供一種聚核苷酸，其包括(i)編碼抗原結合域之聚核苷酸；(ii)編碼跨膜域之聚核苷酸；(iii)編碼包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域的聚核苷酸；(iv)編碼內部核糖體進入位址之聚核苷酸；及(v)編碼訊號傳遞路徑調節物之聚核苷酸。
在此情況下，編碼間隔子之聚核苷酸可進一步包括在編碼抗原結合域之聚核苷酸與編碼跨膜域之聚核苷酸之間。
抗原結合域、跨膜域、胞內訊號傳遞域及訊號傳遞路徑調節物如上文所述。
如本文所用，術語「IRES」為內部核糖體進入位址之縮寫。IRES為用於同時表現二個基因之核酸。
本發明之另一態樣提供一種表現載體，其包括聚核苷酸。在此情況下，載體及其中所包括之組分如上文所述。
本發明之另一態樣提供一種病毒，其包括聚核苷酸。在此情況下，病毒及其中所包括之組分如上文所述。
本發明之另一態樣提供一種免疫細胞，將聚核苷酸引入至該細胞中。在此情況下，引入免疫細胞及聚核苷酸之方法如上文所述。不包括自裂解序列或IRES 之 聚核 苷酸
本發明之另一態樣提供一種編碼融合蛋白質之聚核苷酸，該融合蛋白質包括(i)抗原結合域；(ii)跨膜域；(iii)包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域；(iv)訊號傳遞路徑調節物。
在此情況下，融合蛋白質可進一步包括在(i)抗原結合域與(ii)跨膜域之間的間隔子。
在此情況下，訊號傳遞路徑調節物可為位於該T細胞刺激路徑中之蛋白質。在此情況下，位於T細胞刺激路徑中之蛋白質可為位於TNFR/TLR受體路徑中之蛋白質或其片段。特定言之，位於TNFR/TLR受體路徑中之蛋白質可為TLR4胞內域(在下文，TLR4胞內域被稱為T)。
在此情況下，位於T細胞刺激路徑中之蛋白質可為位於細胞介素受體(JAK-STAT)路徑中之蛋白質或其片段。特定言之，位於細胞介素受體(JAK-STAT)路徑中之蛋白質可為γc (在下文，γc被稱為γ)。
在此情況下，當未包括自裂解肽時，可調節胞內訊號，而訊號傳遞路徑調節物結合至CAR。
本發明之另一態樣提供一種表現載體，其包括聚核苷酸。表現載體如上文所述。載體可進一步包括編碼訊號肽之序列，以便使抗原結合域暴露至細胞膜外部，且在此情況下，編碼訊號肽之序列可在編碼抗原結合域之序列之前插入。訊號肽如上文所述。
本發明之另一態樣提供一種病毒，其包括聚核苷酸。病毒如上文所述。
本發明之另一態樣提供一種免疫細胞，將聚核苷酸引入至該細胞中。在此情況下，免疫細胞如上文所述。經工程化以過度表現訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞
本發明之另一態樣提供一種經轉型免疫細胞，其特徵在於該經轉型免疫細胞經工程化以過度表現訊號傳遞路徑調節物。
在此情況下，免疫細胞可為T細胞或NK細胞。另外，免疫細胞可為經轉型T細胞或NK細胞。在此情況下，經轉型T細胞可為CAR-T細胞或TCR-T細胞。
訊號傳遞路徑調節物如上文所述。特定言之，訊號傳遞路徑調節物可為選自由以下組成之群的任一者：FKBP12蛋白質或其片段；SMAD4蛋白質之C-MH2域或其片段；N-SKI或其片段；親環蛋白A (CYPA)或其片段；SHP-1蛋白質之N-SH2域或其片段；SHP-2蛋白質之N-SH2域或其片段；TC21或其片段；及RhoG或其片段；NCK1或其片段；LAT或其片段；NEMO或其片段；TLR4胞內域或其片段；GADD45α或其片段；CDC42或其片段；HRAS或其片段；及SOCS1蛋白質之C端域或其片段。
在此情況下，訊號傳遞路徑調節物之特徵在於其在該細胞質中起作用。另外，編碼訊號傳遞路徑調節物之聚核苷酸係在細胞質中表現，且訊號傳遞路徑調節物未分泌於細胞外部。因此，訊號傳遞路徑調節物可位於免疫細胞中，且其可調節胞內訊號傳遞路徑。
另外，其可表現二個或三個訊號傳遞路徑調節物。CAR-T 免疫細胞
嵌合抗原受體(CAR)係基於識別在癌細胞之表面上表現的特徵抗原的單株抗體之單鏈可變片段(scFv)核苷酸序列製得。因此，表現該嵌合抗原受體之T細胞特異性結合至腫瘤抗原，且因此僅可移除腫瘤細胞。CAR之結構係由以下組成：結合至腫瘤抗原之受體區；在受體結合至抗原之後活化T細胞的共刺激域；及連接二個區域的間隔子及跨膜域。
在此情況下，CAR-T細胞之特徵可在於CAR-T細胞表現包括以下之融合蛋白質：(i)抗原結合域；(ii)跨膜域；及(iii)包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域。
在一個實施例中，經轉型CAR-T免疫細胞可藉由轉導包括如上文所述之以下聚核苷酸製備：(i)編碼抗原結合域之聚核苷酸；(ii)編碼間隔子及跨膜域之聚核苷酸；(iii)編碼包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域的聚核苷酸；(iv)編碼自裂解肽之聚核苷酸；及(v)編碼訊號傳遞路徑調節物之聚核苷酸。
另外，經轉型免疫細胞可以轉導包括以下之第一聚核苷酸的方式製備：(i)抗原結合域；(ii)間隔子及跨膜域；(iii)分別包括至少一個共刺激域之胞內訊號傳遞域及包括訊號傳遞路徑調節物之第二聚核苷酸。在此情況下，第一聚核苷酸及第二聚核苷酸可經由一個病毒引入，但亦可經由不同病毒引入至免疫細胞中。
在此情況下，訊號傳遞路徑調節物可為選自由以下組成之群的任一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質、b)免疫親和素、c)參與抗原損失介導之復發的蛋白質、d)位於T細胞刺激路徑中之蛋白質、e)參與抑制負反饋的蛋白質及f)其組合。關於訊號傳遞路徑調節物及其組合之細節如上文所述。
在一個實施例中，免疫細胞可為過度表現免疫親和素之細胞。較佳地，其可為過度表現FKBP12或其片段及/或親環蛋白A之CAR-T細胞。
在此情況下，聚核苷酸如上文所述。另外，可使用上文所述之各種方法引入負載有聚核苷酸之載體。TCR-T 免疫細胞
TCR-T細胞係指經T細胞受體工程化的T細胞(TCR-T)。TCR-T為一種藉由以下製備之免疫細胞療法：引入經由MHC分子識別在腫瘤細胞表面上呈遞之腫瘤特異性抗原肽的T細胞受體之基因，藉此允許經表現TCR識別特異性腫瘤抗原且選擇攻擊目標。TCR-T在其活體外擴增之後投與身體。
TCR通常包括二個多肽鏈，例如TCR之α鏈、TCR之β鏈、TCR之γ鏈、TCR之δ鏈或其組合。TCR之上述多肽鏈為此項技術中已知的。特定言之，TCR-T可為表現抗原可識別α鏈及β鏈的TCR-T。
舉例而言，α鏈及β鏈可包括任何胺基酸序列，只要其可特異性結合至疾病相關抗原或其抗原決定基以免疫學上識別該抗原或其抗原決定基。另外，病毒載體可用作將TCR基因引入至T細胞中的方法。在此情況下，病毒載體如上文所述。
在一個實施例中，經轉型TCR-T免疫細胞可藉由轉導包括如上文所述之以下聚核苷酸製備：(i)編碼TCR之α鏈的聚核苷酸；(ii)編碼自裂解肽之聚核苷酸；(iii)編碼TCR之β鏈的聚核苷酸；(iv)編碼自裂解肽之聚核苷酸；及(v)編碼訊號傳遞路徑調節物之聚核苷酸。
另外，經轉型免疫細胞可以轉導包括以下之第一聚核苷酸的方式製備：(i)編碼TCR之α鏈的聚核苷酸；(ii)編碼自裂解肽之聚核苷酸；(iii)分別編碼TCR之β鏈的聚核苷酸及包括訊號傳遞路徑調節物之第二聚核苷酸。在此情況下，第一聚核苷酸及第二聚核苷酸可經由不同病毒引入至免疫細胞中。
在此情況下，訊號傳遞路徑調節物可為選自由以下組成之群的任一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之蛋白質、b)免疫親和素、c)參與抗原損失介導之復發的蛋白質、d)位於T細胞刺激路徑中之蛋白質、e)參與抑制負反饋的蛋白質及f)其組合。關於訊號傳遞路徑調節物及其組合之細節如上文所述。
在一個實施例中，免疫細胞可為過度表現免疫親和素之細胞。較佳地，其可為過度表現FKBP12或其片段及/或親環蛋白A之TCR-T細胞。
在此情況下，轉導聚核苷酸之方法可藉由使用上文所述之各種方法引入負載有上文所述之聚核苷酸的載體。包括經工程化以過度表現訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞的醫藥組合物
本發明之另一態樣提供一種用於治療癌症之醫藥組合物，其包括經工程化以過度表現訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞作為活性成分。
在此情況下，免疫細胞可為T細胞、NK細胞，且較佳為CD8+ T細胞或CD4+ T細胞，或其以某一比率混合之細胞。另外，免疫細胞可藉由轉導包括外部引入之上述訊號傳遞路徑調節物的載體製備。
在此情況下，該癌症可為選自由以下組成之群的任一者：胃癌、肝癌、肺癌、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、白血病、急性骨髓性白血病、腦瘤、神經胚細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌、淋巴瘤、腎癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、腦癌、骨肉瘤、神經膠母細胞瘤、IgG-調理化腫瘤、淋巴瘤、神經瘤、間皮瘤及食道癌。
癌變類型可取決於抗原結合域來確定。在一個實施例中，CD19特異性免疫細胞可用於治療血液癌。較佳地，血液癌可為白血病。
當抗原結合域特異性結合至在癌症中特異地過度表現之蛋白質時，可靶向癌症。特定言之，當特異地識別到特異地過度表現於實體癌症中之蛋白質時，其可應用於治療各種實體癌症。在一個實施例中，Her2特異性CAR-T細胞可用於治療Her2過度表現型癌症，且特定言之，可有效用於Her2 (+)乳癌。另外，PSMA特異性CAR-T細胞可有效用於治療前列腺癌。
用於本文所述之人類患者中之免疫療法的「醫藥組合物」包括免疫細胞。除細胞之外，可進一步改善免疫反應的其他醫藥學上可接受之鹽、載劑、賦形劑、媒劑及其他添加劑及其類似物可添加至醫藥組合物中。
「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換地使用，且係指可有效達成特定生物結果的本文所述之化合物、製劑、材料或組合物，諸如免疫細胞的量。在一個實施例中，CAR-T細胞可包括在投與一次時1×102 至1×1010 、1×103 至1×108 及1×104 至1×106 個細胞，但不限於此。
本發明之細胞療法組合物可經由經直腸、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、胸骨內、經皮、局部、顱內、眼內或皮內途徑以習知方式投與。藉由使用表現外部引入之訊號傳遞路徑調節物的免疫細胞來治療或預防癌症的方法
本發明之另一態樣提供一種用於治療或預防癌症之方法，其包括向個體投與經工程化以過度表現訊號傳遞路徑調節物之免疫細胞的步驟。
在此情況下，訊號傳遞路徑調節物如上文所述。另外，免疫細胞如上文所述。特定言之，免疫細胞可包括CAR-T細胞及TCR-T細胞。表現外部引入之訊號傳遞路徑調節物的免疫細胞之用途
本發明之另一態樣提供過度表現外部引入之訊號傳遞路徑調節物的免疫細胞之用途，其用於治療或預防癌症。
在此情況下，訊號傳遞路徑調節物如上文所述。另外，免疫細胞如上文所述。特定言之，免疫細胞可包括CAR-T細胞及TCR-T細胞。
在下文中，將詳細描述在一個實施例中製備的經工程化以過度表現訊號傳遞路徑調節物之CAR-T細胞的特徵。製備表現訊號傳遞路徑調節物之CD19 特異性CAR-T 細胞( 圖2 及54)
一般而言，製備表示習知第2代CAR-T細胞的「CD19特異性CAR-T (19bbz)」且用於實驗中，已證實該CAR-T細胞適用於臨床實踐且為當前最常用的。另外，預測當在CAR-T細胞中過度表現時能夠增強CAR-T細胞之抗癌功能的免疫調節細胞質小型蛋白質(在下文中，訊號傳遞路徑調節物)係經由慢病毒與CAR基因一起表現。作為一特定實例，分別製備二種類型之CAR-T細胞(19bbz#F及19bbz#C)，該等細胞分別表現二種免疫親和素：FKBP12 (12kDa)及親環蛋白A (18kDa)。
本發明人設計出一種能夠抑制各種抑制性免疫檢查點分子之訊號傳遞路徑的訊號傳遞路徑調節物，其充當有用的小型免疫調節物。在一個實施例中，設計一種小蛋白質，其經預測以有效地抑制極早出現且常見於各種抑制性免疫檢查點分子之訊號傳遞路徑中的pTyr之去磷酸化作用。特定言之，製備過度表現SHP-2之N端SH2域(12kDa)的CAR-T細胞(19bbz#S2)，作為CAT-T細胞之細胞質中的小型調節物。
含Src同源性2域之蛋白質酪胺酸磷酸酶2 (SHP2蛋白質)與SHP1蛋白質一起作為介導約100種各種抑制性免疫檢查點訊號之共同因素發揮出極重要作用。根據1998已公開的SHP2蛋白質之晶體結構資料，注意到作為酪胺酸去磷酸化酶的SHP2蛋白質之N端SH2域實際上發揮「一種阻止催化活性位點之可接近性的蓋」的作用，本發明人製備在細胞質中過度表現小型N端SH2域的CAR-T細胞(19bbz#S2)。
另外，已證實，當製備同時過度表現具有此等其他免疫活化機制之小型訊號傳遞路徑調節物的CAR-T細胞(19bbz#FCS2)時，有可能製備能夠經由此等其他訊號傳遞路徑調節物之互補協同作用甚至在免疫抑制環境中發揮抗癌活性的超裝甲車(Super-armed) CAR-T細胞。
如FACS分析中所示，當經由在慢病毒轉導之後第4天時FITC標記之重組CD19蛋白質結合至CAR-T細胞來證實細胞表面上之CAR表現時，證實CAR可如所預期在所有CAR-T細胞中製得。一般而言，已知經由慢病毒載體之基因體傳輸的效率隨著待傳輸之轉殖基因的尺寸增加而降低。因此，在傳輸三種類型之訊號傳遞路徑調節物基因連同CAR基因的慢病毒轉導之情況下，觀測到與傳輸一種類型的調節物連同CAR基因之轉導相比，表現出轉導速率之相對較低的比率。然而，隨後歷經細胞培養，在19bbz#FCS2之情況下，觀測到CAR(+)-T細胞之比率達到40-50%之位準。
如在此實例中所觀測，為了校正製備各CAR-T細胞中轉導速率的差異，緊接在進行活體外功能分析(亦即，在不經僅慢病毒處理之情況下經由相同培養方法得到的CAR (-)-T細胞作為衍生自相同供體之末梢血液細胞的T細胞)之前，適當添加未轉導的T細胞(未轉導的模擬物T細胞)，且在所有CAR-T細胞樣品中，均等地調整「T細胞之數目」及「T細胞之總數目」，且隨後進行與癌細胞之反應。活體內評定的CD19 特異性CAR-T 細胞(II) 之 抗腫瘤效能( 圖7)
評估CAR-T細胞_19bbz#F、CAR-T細胞_19bbz#C、CAR-T細胞_19bbz#M、CAR-T細胞_19bbz#N、CAR-T細胞_19bbz#S1、CAR-T細胞_19bbz#S2、CAR-T細胞_19bbz#TC、CAR-T細胞_19bbz#RG及CAR-T細胞_19bbzT之抗腫瘤效能。
因此，如圖7中所示，發現經習知第2代CAR-T細胞(19bbz)處理之對照組未有效抑制腫瘤生長，使得在此對照CAR T組之所有三名個體中觀測到快速腫瘤生長。
另一方面，觀測到經過度表現FKBP12，免疫親和素之CAR-T細胞(19bbz#F)處理的組，及經過度表現親環蛋白A，另一免疫親和素之CAR-T細胞(19bbz#C)處理的組表現出在抑制腫瘤進展方面之極佳功效。此等結果指示，過度表現免疫親和素為一種極適用於增加免疫細胞之抗癌活性的技術。
另外，亦在以下中觀測到抑制腫瘤進展之極佳功效：經過度表現FKBP12的CAR-T細胞(19bbz#F)處理之組、經過度表現SMAD4蛋白質之C端MH2域的CAR-T細胞(19bbz#M)處理的組及經過度表現N-SKI的CAR-T細胞(19bbz#N)處理之組，其中FKBP12、SMAD4蛋白質之C端MH2域及N-SKI作為能夠抑制TGF-β訊號傳遞之細胞質免疫調節物。因此，此等結果指示，過度表現能夠阻斷免疫抑制細胞介素之訊號傳遞路徑的調節物為一種極適用於增加免疫細胞之抗癌活性的技術。
亦在以下中觀測到抑制腫瘤進展之極佳功效：經過度表現SHP1蛋白質之N-SH2域的CAR-T細胞(19bbz#S1)處理之組及經過度表現SHP2蛋白質之N-SH2域的CAR-T細胞(19bbz#S2)處理之組，其中SHP1蛋白質之N-SH2域及SHP2蛋白質之N-SH2域作為能夠阻斷各種免疫抑制檢查點訊號傳遞路徑之細胞質免疫調節物。因此，此等結果指示，過度表現能夠阻礙參與各種免疫抑制檢查點訊號路徑中之pTyr磷酸酶的活性的此類特異性調節物為一種極適用於增加免疫細胞之抗癌活性的技術。
亦在以下中觀測到抑制腫瘤進展之極佳功效：經過度表現TC21的CAR-T細胞(19bbz#TC)處理之組及經過度表現RG的CAR-T細胞(19bbz#RG)處理之組，其中TC21及RG作為能夠抑制作為引起癌細胞中之目標抗原損失的過程之胞啃作用的細胞質免疫調節物。因此，此等結果指示，過度表現能夠抑制胞啃作用之此類特定調節物為一種適用於增加免疫細胞之抗癌活性的技術。
亦在以下中觀測到抑制腫瘤進展之極佳功效：經過度表現作為屬於免疫增強訊號傳遞系統之特定調節物的實例之具有TIR域(鐸/IL-1受體同源性域)的TLR4蛋白質之胞內域的CAR-T細胞(19bbzT)處理之組。因此，此等結果指示，過度表現介導免疫增強訊號傳遞之調節物的技術為一種極適用於增加免疫細胞之抗癌活性的技術。活體內評定的CD19 特異性CAR-T 細胞(I) 之 抗腫瘤效能( 圖49 及50)
在指定多個劑量(1×106 、3×106 及1×107 )下評估CAR-T細胞_19bbz及CAR-T細胞_19bbz#F之抗腫瘤效能。
因此，如圖50中所示，發現經習知第2代CAR-T細胞(19bbz)處理之對照組未有效抑制腫瘤生長，使得觀測到快速腫瘤生長。在另一方面，在經過度表現作為細胞質免疫調節物之FKBP12，即免疫親和素的CAR-T細胞(19bbz#F)處理之組中觀測到CAR-T劑量依賴性抗癌作用。特定言之，在較高劑量(1×107 )下經CAR-T細胞(19bbz#F)處理之組展現出快速控制侵襲性腫瘤生長之突出的抗癌作用。因此，此等結果指示，過度表現免疫親和素，FKBP12為一種極適用於增加免疫細胞之抗癌活性的技術。結合至TGF-β 受體之FKBP12 ( 圖51 至53)
圖51展示分別針對三個TGF-β 1型受體所揭露之結合至FKBP12的TGF-β 1型受體激酶域的共晶結構。該圖係基於以下蛋白質資料庫資料：TGFβR1 (PDB ID：1b6c)、ACVR1A (PDB ID：3h9r)及BMPR1B (PDB ID：3mdy)。灰色表面結構表示TGF-β 1型受體之激酶域，且紅色帶狀骨架結構對應於FKBP12蛋白質。如圖51中所示，在此等三個TGF-β 1型受體蛋白質中結合至FKBP12之位點在結構上極好地守恆。此實際上與其中對於迄今為止識別的七種TGF-β 1型受體，TGF-β訊號傳遞受FKBP12結合不利地影響的作用機制良好地協調。該等結構一致地表明以下事實：FKBP12結合在空間上阻斷該位點藉由TGF-β 2型受體磷酸化。
圖52展示FKBP12之四芳族胺基酸(芳族殘基)，其以樞轉方式參與FKBP12結合至TGF-β 1型受體，如在三個TGF-β 1型受體之共晶體結構中所揭露。FKBP12之芳族胺基酸，其在結合中被視為關鍵的，為第27酪胺酸、第47苯丙胺酸、第60色胺酸及第100苯丙胺酸，且該等位置在三維結構中極好地守恆。
圖53展示FKBP12蛋白質之胺基酸序列上以樞轉方式參與其TGF-β 1型受體結合之芳族胺基酸(第27酪胺酸、第47苯丙胺酸、第60色胺酸及第100苯丙胺酸)的位置。藉由免疫螢光顯微術揭露之CD19 特異性CAR-T 細胞中的 表面CAR 表現之 特徵( 圖55)
在CAR-T之情況下，CAR T篩選出特定目標腫瘤細胞的功能取決於CAR分子之「表面表現位準」。然而，當在適當的位準之上誘導過量CAR表現時，「甚至在不存在抗原(Ag)之情況下異常的CAR聚集」通常藉由聚集內在地誘導。在此類情況下，CAR分子可能不在細胞表面上展示均勻分佈，但表現出分佈的不連續性重複聚結及缺失(點狀表現型)。據報導，此現象與非抗原依賴性T細胞訊號傳遞相關，引起在缺失抗腫瘤功效所需的效應子功能之情況下耗竭的T細胞表現型。
在此實例中，其旨在檢驗使用慢病毒之預期及強制表現CAR連同細胞質免疫調節物是否引起「在不存在抗原之情況下過量CAR聚集」的任何不良表現型，及分佈不連續的異常CAR分佈(點狀表現型)。出於此目的，使用Cy3標記的山羊抗小鼠IgG抗體，使CAR-T細胞經受免疫螢光分析，以標記CD19特異性CAR。在初始刺激之後第7天對在培養物中所得之CAR-T細胞進行染色。如結果中所示，證實在假定處於足以表現CAR之代表性分佈的穩定的CAR表現之狀態的此等CAR T細胞中，CAR分子均勻地分佈在細胞表面上。藉由免疫螢光分析證實之CAR-T 細胞與 目標腫瘤細胞之間的CAR 介 導之相互作用( 圖56)
在此實例中，為了證實所製備之CAR-T是否直接經由在CAR-T細胞之表面上的CAR分子與CD19陽性癌細胞相互作用，將CAR-T細胞與表現eGFP之Daudi細胞共培育1小時，以展現出綠色螢光。其後，在載玻片上進行使用Cy3標記的山羊抗小鼠IgG抗體之CAR分子的免疫染色，且使用螢光顯微鏡觀測。
如圖中所示，證實由eGFP螢光所指示，用花青3 (紅色)標記之CAR分子實際上介導CAR-T與目標癌細胞(綠色)之間的緊密接觸。另外，經歷與CAR-T細胞之密切相互作用的Daudi細胞之綠色螢光與無相互作用的Daudi細胞之綠色螢光相比似乎在亮度方面略微降低。對CAR-T 細胞之T 細胞 亞群分析( 圖57)
近期，將CAR-T細胞臨床應用於患者及許多非臨床動物模型研究揭露，過繼性CAR-T細胞療法應設計以確保抗癌免疫之持久性，以預防腫瘤復發。出於此原因，已進行許多研究來揭露CAR-T細胞亞群對臨床結果之潛在影響，且最終強調使T細胞富含相對較高T細胞幹細胞特性(stemness)，諸如幹細胞樣記憶T細胞(Tscm，CD45RA+ CCR7+ )及中央記憶T細胞(CD45RA- CCR7+ )，以使細胞在活體內高度增殖且持續更長時間的優勢。因此，在製備用於抗癌處理的CAR-T細胞之領域中，愈發關注用於誘導具有較高幹細胞特性之細胞的技術，諸如使用IL-7、IL-15、IL-21或其類似物而非IL-2的方法。
根據近期文獻，在經工程化以對目標抗原具有更高親和力之GD2特異性CAR-T細胞(HA-28z)的表徵中，表現型T細胞分析揭露了誘導T細胞耗竭，且伴隨具有較高T細胞幹細胞特性之T細胞的顯著降低。
因此，其旨在檢查在一個實施例中製備的CAR-T細胞是否可很好地維持T細胞幹細胞特性，其對於抗癌免疫之長期持久性為至關重要的，同時經由細胞質免疫調節蛋白之過度表現達到較高效應T細胞活性。為此目的，進行功能性分析，諸如所製備的CAR-T細胞之腫瘤細胞殺傷活性及細胞介素釋放活性、T細胞移動及其類似功能，且為了證實T細胞幹細胞特性，與之並行地進行表現型分析。
對於此等分析中之用途，作為陰性對照細胞之未經轉導的對照T細胞(NTD)衍生自相同供體之細胞，且經由以免疫珠為主之刺激及T細胞擴增的相同程序與CAR-T培養並行地培養，而不進行慢病毒轉導。當使陰性對照T細胞經受T細胞亞群分析時，表明具有最小幹細胞特性(更新潛能)之對應於經分化細胞的效應T細胞群體為約一半(49%)，且Tscm亞群為約47%。
在另一方面，在表現僅習知第2代CAR的對照CAR-T (19bbz)之情況下，Tscm為約70%，發現其維持比NTD高20%或更高。在過度表現SHP2之N端SH2域的CAR-T細胞(19bbz#S2)之情況下，表現出具有與表現僅第2代CAR之對照CAR-T細胞(19bbz)最類似的T細胞群體。
在另一方面，在過度表現諸如FKBP12或親環蛋白A之免疫親和素蛋白質的CAR-T細胞(19bbz#F，19bbz#C)之情況下，Tscm亞群之比例為約76%，發現其維持比第2代對照CAR-T細胞(19bbz)高約6%。另外，在同時表現二種類型之免疫親和素及SHP2之N端SH2域的CAR-T細胞(19bbz#FCS2)之情況下，Tscm亞群之比例為約80%，發現其維持比第2代對照CAR-T高約10%或更高。因此，CAR-T細胞(19bbz#FCS2)似乎在所測試細胞中具有最高幹細胞特性。
因此，指示過度表現在本發明中引入之細胞訊號傳遞路徑調節物不可能引起T細胞之幹細胞特性的下降，該幹細胞特性為CAR-T細胞之抗癌功效的所需特性。對目標腫瘤細胞之CD19 表現的分析( 圖58)
對於在評定所製備的CD19特異性CAR-T細胞之活體外腫瘤細胞殺傷能力及細胞介素釋放活性中之用途，培養表現CD19之腫瘤細胞。另外，藉由使用APC標記的小鼠抗CD19抗體及流動式細胞測量術分析CD19之表現位準。
根據藉由流動式細胞測量術得到的平均螢光單位，顯示Daudi細胞中的CD19之表現位準比Nalm6中的表現位準高約二倍。另外，發現Nalm 6中的CD19之表現比K562-CD19中的表現高約三倍(CD19表現位準：Daudi＞Nalm6＞K562-CD19)。
特定言之，穩定表現鮮綠色螢光蛋白(eGFP)基因之Daudi細胞用作螢光顯微鏡分析中之目標細胞。另外，由於Daudi細胞亦表現螢火蟲螢光素酶(Fluc)基因，因此藉由生物發光量測將該等細胞用於活體外腫瘤細胞殺傷活性分析。另外，Daudi-Fluc-Puro細胞用作在使用惡性血液病之動物模型進行的活體內CAR-T功效之先前評估中的目標細胞。
作為缺乏CD19表現之陰性對照，K562細胞用於CD19特異性CAR-T細胞之其他活體外功能性分析中。另外，K562-CD19細胞亦用作因具有較大細胞尺寸而可易於與T細胞區分開的目標細胞，尤其用於使用顯微鏡及流動式細胞測量術之實驗。CAR-T 中之FKBP12 、 親環蛋白 A 及SHP2 蛋白質之N 端SH2 域的 表現位準( 圖59 及60)
所製備的CAR-T之編碼經由慢病毒載體轉導引入至細胞中之特定免疫調節蛋白的外源基因之過度表現的程度係藉由將其與相關胞內蛋白質之內部位準進行比較來證實。特定言之，藉由使用抗體之qRT-PCR分析及免疫墨點分析進行評定。
如圖60中所指示，根據公開的T淋巴球之蛋白質體資料(Hukelmann等人, Nature Immunology, 2015)，相關胞內蛋白質之內部位準分別揭露為對於FKBP12之1,623,586個複本/細胞、對於親環蛋白A之28,065,984個複本/細胞及對於SHP2之23,530個複本/細胞。此等資料指示，蛋白質之內部位準按蛋白質複本數之次序為親環蛋白A＞＞FKBP12＞＞SHP2，且轉導各種抑制性免疫檢查點之訊號的SHP2蛋白質在其中以實際上顯著較少的量存在。
因此，儘管所有此等訊號傳遞路徑調節物係經由與CAR基因相同的啟動子表現，但訊號傳遞路徑調節物之間的過度表現倍數明顯相當不同。特定言之，在過度表現FKBP12的CAR-T細胞(19bbz#F)之情況下，FKBP12之增強的過度表現比內源性表現多約六倍。另外，在過度表現親環蛋白A的CAR-T細胞(19bbz#C)之情況下，親環蛋白A之增強的過度表現比內源性表現多約二倍。在另一方面，在過度表現SHP2之N端SH2域的CAR-T細胞(19bbz#S2)之情況下，SHP2之N端SH2域的增強的過度表現經證實比SHP2蛋白質之內源性位準多約38倍。
如上文所提及，內源性蛋白質位準相當不同。在此分析之所有CAR T樣品中，CAR陽性細胞之比例為約40%。如免疫墨點影像中所示，當相對於內源性位準評定時，所達成之過度表現的程度變得相當不同。亦即，在過度表現SHP2之N端SH2域的CAR-T細胞(19bbz#S2)之情況下，所觀測到的過度表現相當明顯(比SHP2之內源性位準多至少30倍)。另外，在過度表現FKBP12的CAR-T細胞(19bbz#F)之情況下，所觀測到的過度表現位準低於上述，且在比FKBP12之內源性位準多2至7倍的範圍內。在過度表現親環蛋白A的CAR-T細胞(19bbz#C)之情況下，由於內源性蛋白質位準過高，發現過度表現所造成的差異通常落入通用墨點分析之誤差範圍內，使得定量不太可靠。
在同時表現三種類型之訊號傳遞路徑調節物的CAR-T細胞(19bbz#FCS2)之情況下，觀測到FKBP12過度表現之位準與CAR-T細胞(19bbz#F)中之位準類似。然而，觀測到SHP2之N端SH2域的過度表現位準，其可受需要在三個P2A上成功地施加三個連續自裂解事件的限制，處於在CAR-T細胞(19bbz#S2)中所觀測之表現位準的1/3位準下，其中SHP2之N端SH2域的過度表現取決於一個P2A上之一個自裂解活性事件。在抗原性刺激時自CAR-T 細胞 分泌的IFNγ 、TNFα 及IL-2 的 量測( 圖61 至63)
一般而言，已知CAR-T之抗癌作用可來源於：i)取決於在CAR-T與抗原陽性目標腫瘤細胞形成免疫突觸之後分泌的穿孔素/顆粒酶顆粒之腫瘤細胞殺傷活性、ii)取決於具有在活化的CAR-T細胞之表面上增加的表現之Fas配位體的腫瘤細胞殺傷及旁觀者殺傷活性及iii)基於細胞介素介導之間接機制(輔助機構)的腫瘤細胞殺傷活性。
自活化的CAR-T分泌的關鍵細胞介素中之一者的IFNγ表現出以下作用。i)藉由增加在基質細胞之表面上的IFNγ受體表現，其誘導諸如IP10 (CXCL10)、MIC (CXCL9)及其類似物之趨化介素的分泌增加，以產生增加使諸如T細胞、NK細胞、DC、單核細胞/巨噬細胞及其類似物之免疫細胞滲透至腫瘤組織中的作用。另外，ii)其亦可直接引起腫瘤基質細胞毀壞。另外，iii)已知其藉由作用於腫瘤細胞而直接呈現生長抑制作用(細胞生長抑制作用)。另外，iv)其誘導腫瘤相關巨噬細胞及腫瘤駐留性T細胞之極化，以使其脫離免疫抑制狀態。因此，已知間接賦予能夠殺傷腫瘤細胞之抗癌活性且經由此發揮出輔助抗癌作用。
作為自活化的CAR-T分泌的另一重要細胞介素之腫瘤壞死因子α (TNFα) i)藉由經由在腫瘤細胞之表面上表現的TNFα受體訊號傳遞而直接誘導腫瘤細胞死亡。另外，ii) TNFα藉由阻斷調節性T細胞活化效應T細胞及NK細胞。另外，iii) TNFα作用於內皮細胞上以誘導腫瘤微血管破裂及血管新生之斷裂。另外，iv) TNFα具有誘導不具有抗癌活性之M2巨噬細胞極化至具有抗癌活性之M1巨噬細胞的活性。另外，v) TNFα用以吸引且活化嗜中性白血球及單核細胞至腫瘤部位處，以具有抗癌活性。最後，vi)已知TNFα下調癌症組織中嗜酸性粒細胞樣細胞之IL-13表現，藉此干擾單核細胞分化成免疫抑制細胞。
作為自活化的CAR-T分泌的另一重要細胞介素之介白素-2 (IL-2)已成功地用於抗癌免疫療法中。因而，除刺激T細胞增殖之熟知活性之外，亦熟知經由大大增強NK細胞及淋巴激素活化的殺手細胞之細胞溶解活性的作用，促成抗癌免疫性。
因此，在此實例中，並行地比較藉由本發明製備的CAR-T (19bbz#F)、CAR-T (19bbz#C)、CAR-T (19bbz#S2)及CAR-T (19bbz#FCS2)之細胞介素釋放活性，以測試本發明CAR T是否優於習知第2代CAR-T。
如圖中所示，當評估三種類型之細胞介素(IFNγ (圖61)、TNFα (圖62)、IL-2 (圖63))的分泌時，在24小時之後在CAR-T與缺乏目標CD19表現之K562細胞的所有共培養物中，未偵測到顯著位準之細胞介素分泌。
在另一方面，在24小時之後在CAR-T與經工程化以表現CD19之K562-CD19細胞的所有共培養物中偵測到相當多數量的細胞介素。
如根據設計概念所預期，過度表現已知參與T細胞之基礎免疫活性的免疫親和素或過度表現能夠阻斷免疫檢查點訊號對pTyr去磷酸化作用的SHP2之N端SH2域的三種類型之CAR-T，CAR-T細胞(19bbz#F)、CAR-T細胞(19bbz#C)及CAR-T細胞(19bbz#S2)似乎表現出分別與習知對照CAR-T細胞(19bbz)相比略微增加之細胞介素分泌。
有趣的是，在目標腫瘤細胞刺激時，同時過度表現此等三種類型之訊號傳遞路徑調節物的CAR-T細胞(19bbz#FCS2)與習知對照CAR-T細胞(19bbz)相比表現出顯著增強之細胞介素分泌位準。
根據迄今為止人類中之CAR-T的臨床經歷，對於CAR-T進入腫瘤部位，已知實體癌症比惡性血液病更具挑戰性。即使CAR-T到達腫瘤部位，其作用亦受免疫抑制性腫瘤微環境(TME)中預先建立的若干機制阻礙。因此，存在對設計出一種甚至可在存在於此類TME中之免疫抑制訊號下耐受的超裝甲車CAR-T之需求。
根據此實例之結果，預期CAR-T (19bbz#FCS2)可甚至在免疫抑制環境中分泌相當多數量的細胞介素。因此，藉由分泌大量細胞介素，其可將腫瘤微環境自免疫抑制環境轉化成更免疫友好的環境，可能發揮出可觀的抗癌功效。在TGF-β1 存在下在抗原性時自CAR-T 細胞 分泌的IFNγ 及TNFα 之 量測( 圖64 及65)
一般而言，已知腫瘤組織中之較高濃度的TGF-β可藉由經由在T細胞之表面上表現的TGFβ受體(TGFβRI、TGFβRII)觸發免疫抑制訊號而大大抑制正常T細胞功能，諸如T細胞活化、增殖及分化。
然而，經由小鼠模型研究，已知中斷初始T細胞中之TGF-β訊號可誘導自體免疫疾病。因此，儘管需要研發出一種抑制TGF-β訊號以致力於增加CAR-T細胞之抗癌功效的方式，但考慮到自體免疫之潛在風險，不必要設計出一種新穎裝置以完全停止所用之T細胞中的TGF-β訊號傳遞。
在用於此實例之TGF-β1的濃度範圍之情況下，認為活體內濃度依賴性地發生顯著反應之半最大效應濃度(EC50)為0.04-0.2 ng/ml。另外，測試濃度範圍設定成充分超過可在病理性環境中積聚之較高濃度的上限。
另外，認為腫瘤細胞之微異質性常常出現在腫瘤發展及進展期間。因此，為了表示此類情形，測試在「CD19之表現位準、目標抗原」及「細胞尺寸」方面不同的三種類型之癌細胞的CAR-T活性(按細胞尺寸之次序為：K562-CD19＞＞ Nalm6，Daudi；按Ag表現位準之次序為：Daudi＞ Nalm6＞ K562-CD19)。
作為評估方法，吾人嘗試評估CAR-T之抗癌免疫機制中關鍵的細胞介素之分泌活性。因此，表明CAR-T細胞受TGFβ1之濃度影響的程度似乎略微不同，此取決於目標細胞及分泌的細胞介素。
然而，在整個廣泛範圍的TGFβ1濃度中(0 ng/mL-5 ng/mL)，在所有三種類型之目標細胞反應中共同觀測到過度表現FKBP12之CAR-T細胞(19bbz#F)表現出比習知第2代CAR-T細胞(19bbz)之活性更高或相等的活性。
FKBP12過度表現所引起的CAR-T活性之差異在因為抗原表現之量相對較低，預測CAR-T細胞之抗原刺激不太易於出現且略微出現的與Nalm6或K562-CD19反應中顯然比在歸因於在目標表面上之較高位準的抗原表現，可易於且有力地保證CAR-T細胞之抗原刺激的與Daudi反應之情況下更明顯。
通常，熟知抗原之位準降低為在腫瘤進展期間待由癌細胞利用之免疫逃逸機制中之一者。綜合考慮此資訊及結果，諸如FKBP12之小型調節物的過度表現將有利於調節CAR-T細胞以維持對抗可暗中推動腫瘤生長之Ag較低腫瘤細胞的能力。
認為T細胞之基礎活性因主訊號傳遞(非TGFβ依賴性二聚合介導之訊號傳遞)而保持較低，其中甚至在不存在TGFβ之情況下保持活性的TGFβRII結合至TGFβRI，以誘導TGFβ訊號傳遞。然而，當過度表現作為受體雜四聚合之競爭性抑制劑的FKBP12時，此類T細胞之基礎活性在一定程度上可處於非下降(less depressed)狀態。因此，預期甚至在與其中抗原表現之量較低的癌細胞反應中，T細胞活化相對易於達成。CAR-T 細胞之 遷移能力的證實( 圖66 及67)
對於CAR-T細胞之過繼性轉移，活體內有效遷移至腫瘤部位的能力為CAR-T之整體功效設計中重要的考慮點。
一般而言，T細胞遷移至腫瘤微環境(TME)係經由若干連續步驟之嚴格控制的過程實現。在T細胞遷移之連續步驟期間，尤其引起T細胞遷移之整合素介導的T細胞黏附及下游事件已知敏感地受諸如FKBP12及親環蛋白A之免疫親和素影響。
在此實例中，為了比較CAR-T之活體外遷移活性，在培養期間使用抗CD3/CD28戴諾磁珠來活化CAR-T，且隨後收集且洗滌去珠化(debeaded)細胞，且懸浮於添加0.25%人類血清白蛋白之無血清培養基中，且進行傳斯維爾(Transwell)遷移。一般而言，動物細胞在變形蟲狀運動下穿過生物基質之孔。
如底部圖式中所示，CAR(+) T細胞之遷移能力係藉由評定遷移至下部腔室1小時之細胞的CAR(+)百分比來比較。儘管在遷移之前所有測試的CAR-T之總T細胞及CAR(+)T細胞的濃度調整至相同，但特異性CAR-T (19bbz#FCS2)與其他CAR-T相比顯示出顯著更高的遷移能力。
另外，在EGF存在下評定T細胞遷移，該EGF為一種已知干擾T細胞滲透的細胞介素，其中該細胞介素添加至上部腔室中。即使在此情況下，如中間圖式中所示，當比較遷移至下部腔室的CAR(+)細胞之數目時，發現特異性CAR-T (19bbz#FCS2)表現出與其他CAR-T相比顯著更優的遷移能力。
在另一方面，如頂部圖式中所示，發現CAR-T (19bbz#FCS2)樣品之CAR (-)細胞未表現出優良的遷移能力。因此，證實在此等CAR-T (19bbz#FCS2)樣品中所見之較高遷移能力為一種限於過度表現三種類型之細胞質調節物的CAR(+)細胞之活性。
亦清楚地觀測到，在96孔盤上與目標細胞共培養48小時之後拍攝的像片中，同時過度表現三種類型之細胞質調節物的CAR-T (19bbz#FCS2)表現出顯著優良的內部移動(圖60)。
如像片中所示，發現相應的CAR-T細胞之移動在與能夠藉由表現表面上之抗原CD19來刺激T細胞的K562-CD19細胞之共培養物中活性最強。CD19 特異性CAR-T 細胞 之活體外腫瘤細胞殺傷活性( 圖68)
在此實例中，為了評估CAR-T細胞之腫瘤細胞殺傷活性，如下使用二種不同方法。
在使用K562-CD19細胞之評估中，作為觀測腫瘤細胞溶解之方法，使用經由時差式螢光測定法(TRF)定量藉由細胞溶解分泌於培養基中之TDA (2,2':6',2"-聯三吡啶-6,6"-二甲酸)的方法。
因此，如圖之底部圖式中所示，發現評估CAR(+)-T細胞對腫瘤細胞殺傷活性的結果與上文所述之評估細胞介素分泌活性的結果略微一致。
過度表現已知參與T細胞之基礎免疫活性的免疫親和素或過度表現能夠抑制免疫檢查點訊號對pTyr去磷酸化作用的SHP2之N端SH2域的三種類型之CAR-T，CAR-T細胞(19bbz#F)、CAR-T細胞(19bbz#C)及CAR-T細胞(19bbz#S2)似乎具有分別與習知對照CAR-T細胞(19bbz)相比相對略微更高的腫瘤細胞殺傷活性。
在另一方面，證實同時過度表現此等三種類型之小型細胞質免疫調節物的CAR-T細胞(19bbz#FCS2)展現出與習知對照CAR-T細胞(19bbz)相比顯著更高的活性。
在另一組中，量測CAR-T細胞針對表現螢光素酶之Daudi細胞的腫瘤細胞殺傷活性。藉由CAR(+)-T細胞之腫瘤細胞溶解係藉由生物發光之減小程度進行比較。如頂部圖式中所示，發現該等結果類似於藉由Eu-TDA釋放之評估的結果。
過度表現免疫親和素或SHP2之N端SH2域的三種類型之CAR-T，CAR-T細胞(19bbz#F)、CAR-T細胞(19bbz#C)、CAR-T細胞(19bbz#S2)表現出分別與習知對照CAR-T細胞(19bbz)相比略微更高的腫瘤細胞殺傷活性。特定言之，證實CAR-T細胞(19bbz#FCS2)表現出在E:T比率之整個測試範圍內的最高活性。製備Her2 特異性CAR-T 細胞( 圖3 及69)
作為本發明之另一實例，製備作為靶向Her2陽性癌細胞之CAR-T，表示習知第2代CAR-T的「Her2特異性CAR-T細胞(Hbbz)」。另外，分別製備二種類型之CAR-T細胞(Hbbz#F及Hbbz#C)，該等CAR-T細胞分別表現預測能夠增強CAR-T細胞之抗癌功能的二種已知免疫親和素，FKBP12 (12 kDa)及親環蛋白A (18 kDa)。
另外，亦製備過度表現可抑制免疫檢查點訊號對pTyr去磷酸化作用的SHP2之N端SH2域的CAR-T細胞(Hbbz#S2)。另外，亦製備同時過度表現此等三種類型之訊號傳遞路徑調節物的CAR-T細胞(Hbbz#FCS2)。在慢病毒轉導之後第4天所量測之CAR表現如圖69中所示。其後，經由以下擴增培養，觀測到CAR-T (Hbbz#FCS2)中之CAR(+)細胞的比例達至40-50%之位準。藉由免疫螢光顯微術揭露之Her2 特異性CAR-T 細胞中的 表面CAR 表現之 特徵( 圖70)
可以自結果看出，當在所製備之CAR-T細胞中表現時，CAR分子均勻地分佈在細胞表面上。在抗原刺激時來自Her2 特異性CAR-T 細胞 分泌的IFNγ 、TNFα 及IL-2 的 量測( 圖71 至73)
在此實例中，並行地比較藉由本發明製備的CAR-T (Hbbz#F)、CAR-T (Hbbz#C)、CAR-T (Hbbz#S2)及CAR-T (Hbbz#FCS2)之細胞介素釋放活性，以測試本發明CAR T是否優於習知第2代CAR-T。
如圖中所示，當評估三種類型之細胞介素(IFNγ、TNFα及IL-2)的分泌時，在24小時之後在CAR-T與缺乏目標Her2表現之Daudi細胞的所有共培養物中，幾乎未偵測到顯著位準之TNFα及IL-2細胞介素分泌。然而，在IFNγ之情況下，不同於TNFα及IL-2細胞介素，偵測到IFNγ之分泌對應於在與表現目標抗原Her2之SKBR3細胞的培養物中分泌的細胞介素之量的1/3內。咸信此原因在於Daudi不表現Her2，但表現一些共刺激分子作為B淋巴細胞。藉此，充當源於不同人員的潛在抗原呈遞細胞之Daudi細胞可能能夠在一些T細胞中誘導T細胞活化，在該等T細胞中TCR對特異性組織相容抗原作出反應。
在另一方面，在24小時之後在CAR-T與表現Her2之SKBR3細胞的所有共培養物中偵測到相當多數量的細胞介素。
因此，三種類型之CAR-T，CAR-T細胞(Hbbz#F)、CAR-T細胞(Hbbz#C)及CAR-T細胞(Hbbz#S2)展現出分別與習知第2代對照CAR-T細胞(Hbbz)相比幾乎相同或略微增加之細胞介素分泌。
特定言之，在目標腫瘤細胞刺激時，CAR-T細胞(Hbbz#FCS2)表現出與習知第2代對照CAR-T細胞(Hbbz)相比顯著增強之細胞介素分泌位準。Her2 特異性CAR-T 之 活體外遷移( 圖74)
在此實例中，為了比較Her2特異性CAR-T細胞之活體外遷移活性，在培養期間使用抗CD3/CD28戴諾磁珠來活化CAR-T，且隨後收集且洗滌去珠化細胞，且懸浮於添加0.25%人類血清白蛋白之無血清培養基中，且進行傳斯維爾遷移。
因此，儘管在遷移之前所有測試的CAR-T之總T細胞及CAR(+)T細胞的濃度調整至相同，但特異性CAR-T (Hbbz#FCS2)與其他CAR-T相比表現出顯著更高的遷移能力。Her2 特異性CAR-T 細胞 之活體外腫瘤細胞殺傷活性( 圖75)
證實所有三種類型之CAR-T，CAR-T細胞(Hbbz#F)、CAR-T細胞(Hbbz#C)及CAR-T細胞(Hbbz#S2)展現出分別與習知第2代對照CAR-T細胞(Hbbz)相比略微更高的腫瘤細胞殺傷活性。
在另一方面，證實同時過度表現此等三種類型之調節物的CAR-T細胞(Hbbz#FCS2)表現出在E:T比率之整個測試範圍內的顯著較高活性。活體內評定的Her2 特異性CAR-T 細胞之 抗腫瘤效能( 圖76)
在實體癌症模型中測試在本發明中引入之CAR-T細胞技術的有用性。將SKBR3-Luc細胞(2×106 個細胞每名個體)注入免疫不全NSGA小鼠持續14天，以誘導腹膜內異種移植腫瘤。向各組中之10名個體靜脈內投與相同量之各指示CAR-T細胞(1×106 個CAR(+)-T細胞)。其後，腫瘤負荷藉由使用IVIS設備之生物發光成像以每週一次時間間隔來監測。
因此，如圖中所示，發現經習知第2代對照CAR-T細胞(Hbbz)處理之組未有效抑制在腹腔中建立的腫瘤生長。在另一方面，在以下中快速且清楚地觀測到抑制及根除在腹腔中實體癌症生長的作用：經過度表現作為訊號傳遞路徑調節物之免疫親和素FKBP12的CAR-T細胞(Hbbz#F)處理之組及投與同時過度表現三種類型之訊號傳遞路徑調節物的CAR-T細胞(Hbbz#FCS2)之組。
另外，該等結果與在如其他實例進行之評估若干活體外CAR-T活性(細胞介素分泌、活體外遷移及活體外腫瘤細胞殺傷能力)中所觀測到的結果一致，且亦證實同時過度表現三種類型之訊號傳遞路徑調節物的CAR-T細胞(Hbbz#FCS2)展現出針對在動物模型研究中建立的實體癌症之抗腫瘤效能的顯著優良的活體內效能。
另外，該等結果與在如其他實例進行的評估惡性血液病模型中之抗腫瘤效能中所觀測到的結果一致，且亦證實甚至在實體癌症動物模型中評估的抗腫瘤效能中，經過度表現僅FKBP12，免疫親和素的CAR-T細胞(Hbbz#F)處理之組展現出與習知第2代對照CAR-T細胞(Hbbz)相比極佳的抗癌活性。
另外，在此實例之實體癌症模型結果中，指示同時過度表現三種類型之訊號傳遞路徑調節物的CAR-T細胞(Hbbz#FCS2)展現出顯著優良的活體內抗癌功效，其歸因於基於不同機制的多個訊號傳遞路徑調節物介導之增強的預期協同作用。製備PSMA 特異性CAR-T 細胞( 圖6 及77)
作為本發明之另一實例，製備作為靶向Her2陽性癌細胞之CAR-T，表示習知第2代CAR-T細胞的「PSMA-特異性CAR-T細胞(Pbbz)」。另外，分別製備二種類型之CAR-T細胞(Pbbz#F及Pbbz#C)，該等CAR-T細胞分別表現預測能夠增強CAR-T細胞之抗癌功能的二種免疫親和素：FKBP12 (12 kDa)及親環蛋白A (18 kDa)。
另外，亦製備過度表現可抑制免疫檢查點訊號對pTyr去磷酸化作用的SHP2之N端SH2域的CAR-T細胞(Pbbz#S2)。另外，亦製備同時過度表現此等三種類型之訊號傳遞路徑調節物的CAR-T細胞(Pbbz#FCS2)。在慢病毒轉導之後第4天所量測之CAR表現比率如圖77中所示。其後，經由以下擴增培養，觀測到CAR-T (Pbbz#FCS2)中之CAR(+)細胞的比例達至40-50%之位準。藉由免疫螢光顯微術揭露之PSMA 特異性CAR-T 細胞中的 表面CAR 表現之 特徵( 圖78)
如圖中所示，當在所製備之CAR-T細胞中表現時，CAR分子均勻地分佈在細胞表面上。對PSMA 特異性CAR(+)-T 細胞 之T 細胞 亞群分析( 圖79)
在未經轉導的對照T細胞(NTD)之情況下，發現對應於具有最小幹細胞特性(更新潛能)之經分化細胞的效應T細胞群體為幾乎一半(47%)，且Tscm亞群為約45%。相比之下，在表現僅習知第2代CAR的對照CAR-T細胞(Pbbz)之情況下，Tscm比率為約53%，發現其比NTD之比率高約8%。
發現過度表現SHP2之N端SH2域的CAR-T細胞(Pbbz#S2)具有與表現僅習知第2代CAR之對照CAR-T細胞(Pbbz)相對最類似的T細胞群體。
在另一方面，在過度表現諸如FKBP12或親環蛋白A的免疫親和素蛋白質之CAR-T細胞(Pbbz#F，Pbbz##C)的情況下，Tscm亞群之比例分別為63%及64%，且發現維持比第2代對照CAR-T細胞(Pbbz)高約10%，且在同時表現二種類型之免疫親和素及SHP2之N端SH2域的CAR-T細胞(Pbbz#FCS2)之情況下，Tscm亞群之比例為約66%，且發現維持比第2代對照CAR-T細胞高至少10%，此證實了其具有最高幹細胞特性。
根據對此實例之T細胞亞群分析的結果，甚至當經由過度表現細胞訊號傳遞路徑調節物增加CAR-T細胞的功能活性時，發現作為治療性CAR-T細胞之較佳特性的T細胞幹細胞特性未減弱且仍很好地維持。T 細胞耗竭之 表現型分析( 圖80)
作為使用特異性抗體之流動式細胞量測分析的結果，揭露對於在CAR(+)細胞之圈選內的CAR-T細胞，PD-1陽性細胞之比例均在10 +/- 3%範圍內，LAG-3陽性細胞之比例均低於3%，TIGIT陽性細胞之比例均在12 +/- 3%範圍內，且CTLA-4陽性細胞之比例均為約2-3%之位準。一般而言，此等T細胞耗竭標記物之表現位準不視為極高的。因此，指示過度表現在本發明中引入之細胞訊號傳遞路徑調節物不可能伴隨CAR-T細胞耗竭。PSMA 特異性CAR-T 之 活體外遷移( 圖81)
如底部圖式中所示，量測遷移至下部腔室1小時之細胞的總數目及遷移細胞之CAR(+)%，以比較CAR(+)-T細胞之移動。儘管在遷移之前所有測試的CAR-T之總T細胞及CAR(+)T細胞的濃度調整至相同，但特異性CAR-T (Pbbz#FCS2)與其他CAR-T相比顯示出顯著更高的遷移能力。
在另一方面，關於在相同時間期間遷移至下部腔室之CAR (-)-T細胞的數目，發現在CAR-T樣品(頂部)之間未表現出顯著差異。此表明，在此等CAR-T (Pbbz#FCS2)樣品中所見之較高遷移能力受限於過度表現三種類型之訊號傳遞路徑調節物的CAR(+)細胞。PSMA 特異性CAR-T 細胞 之活體外腫瘤細胞殺傷活性( 圖82 及83)
如在反應之2小時時間點(圖82)及3小時時間點(圖83)時的評估結果中所示，所有三種類型之CAR-T，CAR-T細胞(Pbbz#F)及CAR-T細胞(Pbbz#C)、CAR-T細胞(Pbbz#S2)分別顯示目標腫瘤細胞殺傷活性顯著高於習知第2代對照CAR-T細胞(Pbbz)。
在另一方面，證實同時過度表現此等三種類型之小型細胞質免疫調節物的CAR-T細胞(Pbbz#FCS2)表現出在E:T比率之整個測試範圍內的顯著增加之活性。 用於實施本發明之模式
在下文中，呈現較佳實例以輔助對本發明的理解。然而，提供以下實例僅為更易於理解本發明，且本發明之內容不受以下實例限制。I. 製備其中引入了訊號傳遞路徑調節物之CAR-T 實例1. 融合蛋白質之構築體的設計 實例1.1.  FKBP12 之 構築體的設計
包括嵌合抗原受體及FKBP12之融合蛋白質的構築體經設計以包括訊號肽、抗原結合域、鉸鏈及跨膜域、胞內訊號傳遞域、自裂解肽及FKBP12。 作為實例，如圖1中所示，其經設計以包括訊號肽(ss)、抗原結合域(CD19 scFv)、鉸鏈及跨膜域(H+TM)、胞內訊號傳遞域(4-1BB及CD3Z)、自裂解肽(P2A)及FKBP12之基因，其整個構築體稱為「19bbz#F」。相比之下，包括訊號肽(ss)、抗原結合域(CD19 scFv)、鉸鏈及跨膜域(H+TM)及胞內訊號傳遞域(4-1BB及CD3ζ)之嵌合抗原受體稱為「19bbz」。
特定言之，CD19特異性CAR係藉由以下方式構築：連接i)衍生自CD8訊號肽之核苷酸序列(Uniprot：P01732-1，1-21 aa，SEQ ID NO: 1)與ii)衍生自CD19特異性FMC63抗體的scFv之片段的核苷酸序列(Nichoison等人，1997) (SEQ ID NO: 3)，且隨後連接衍生自以下之核苷酸序列：iii) CD8鉸鏈-跨膜域(Uniprot：P01732-1，138-206 aa，SEQ ID NO: 5)，iv)人類4-1BB共刺激因子域細胞質區(Uniprot：Q07011，214-255 aa，SEQ ID NO: 7)，及v)人類CD3ζ胞內域(GenBank：NP 000725.1，52-163 aa，SEQ ID NO: 9)。實例1.2. 包 括其他訊號傳遞路徑調節物之載體構築體的設計
以與實例1.1中相同之方式，其經設計以包括親環蛋白A (#C)、SMAD4蛋白質之C端MH2域(#M)、N-SKI (#N)、SHP-1蛋白質之N端SH2域(#S1)、SHP-2蛋白質之N端NH2域(#S2)、TC21 (#TC)、RhoG (#RG)、FKBP12/親環蛋白A/SHP-2蛋白質之N端SH2域(#F#C#S2，或簡言之#FCS2)，但不包括FKBP12。此等分別稱為「19bbz#C」、「19bbz#M」、「19bbz#N」、「19bbz#S1」、「19bbz#S2」、「19bbz#TC」、「19bbz#RG」及「19bbz#FCS2」。另外，以與實例1.1中相同的方式製得構築體，不同之處在於FKBP12經替換為TLR4胞內域(T)而不具有自裂解序列，且稱為「19bbzT」 (圖1至2)。實例2. 編碼融合蛋白質之載體的構築 實例2.1. 包 括FKBP12 之 載體的構築 作為載體，使用pPVLV5載體，其為一種包括人類延長因子α (EF1α：531 bp或212 bp)啟動子之第3代自無活性慢病毒載體。將編碼包括訊號肽(ss)、特異性結合至CD19之單鏈可變片段(CD19 scFv)、人類CD8之鉸鏈及跨膜域(H+TM)及胞內訊號傳遞域(4-1BB及CD3ζ)及自裂解肽(P2A)及FKBP12的嵌合抗原受體之基因插入至pPVLV5載體中，且稱為「p_19bbz#F」。 另外，將編碼包括訊號肽(ss)、特異性結合至CD19之單鏈可變片段(CD19 scFv)、人類CD8之鉸鏈及跨膜域(H+TM)及胞內訊號傳遞域(4-1BB及CD3ζ)的嵌合抗原受體之基因插入至pPVLV5載體中，且稱為「p_19bbz」。
實驗中所用之嵌合抗原受體的胺基酸序列及核苷酸序列展示於下表1中，且FKBP12 (#F)之胺基酸及核苷酸序列展示於下表2中。 [表1]
CD19-CAK 基因名稱 序列 SEQ ID NO
AA SEQ CDS 訊號序列
Figure 02_image001
 1
CD19 scFv VL
Figure 02_image003
 3
(G4S)3 連接子
Figure 02_image005
VH
Figure 02_image007
CD8 TM 鉸鏈 (H)
Figure 02_image009
 5
TM
Figure 02_image011
4-188 訊號傳遞域
Figure 02_image013
 7
CD3 ζ( 訊號傳遞域
Figure 02_image015
 9
NTSEQ CD8 訊號序列
Figure 02_image017
 2
CD19 scFv VL
Figure 02_image019
 4
(G4S)3 連接子
Figure 02_image021
VH
Figure 02_image023
CD8 TM 鉸鏈 (H)
Figure 02_image025
 6
TM
Figure 02_image027
4-188 訊號傳遞域
Figure 02_image029
 8
CD3ζ 訊號傳遞域
Figure 02_image031
 10
[表2]
FKBP12 (FKBP1A) 序列
AA SEQ (108 aa) (SEQ ID NO:13)
Figure 02_image033
NT SEQ (324 bp) (SEQ ID NO:14)
Figure 02_image035
作為載體，使用經pLenti-EF1a-骨幹(NG) (Addgene，#27963)修飾之第3代慢病毒載體，且藉由使用DNA組件主混合物(NEB，#E2621)將編碼CAR之基因裝載到載體上。
另外，為了在細胞質中表現免疫調節蛋白質，將編碼免疫調節蛋白質之核苷酸序列插入至CAR序列之下游。免疫調節蛋白質為FKBP12 (#F，SEQ ID NO: 14)。實例2.2. 編碼CAR 及其他訊號傳遞路徑調節物之基因的載體之構築 以與實例2.1中相同之方式，使用慢病毒載體，載體經構築以包括親環蛋白A (#C，SEQ ID NO: 25)、SMAD4蛋白質之C端MH2域(#M，SEQ ID NO: 21)、N-SKI (#N，SEQ ID NO: 23)、SHP-1蛋白質之N-SH2域(#S1，SEQ ID NO: 27)、SHP-2蛋白質之N-SH2域(#S2，SEQ ID NO: 29)、TC21 (#TC，SEQ ID NO: 33)、RhoG (#RG，SEQ ID NO: 35)，或FKBP12/親環蛋白A/SHP2蛋白質之N-SH2域(#FCS2，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 25，SEQ ID NO: 29)。此等分別稱為「p_19bbz#F」、「p_19bbz#C」、「p_19bbz#M」、「p_19bbz#N」、「p_19bbz#S1」、「p_19bbz#S2」、「p_19bbz#TC」、「p_19bbz#RG」及「p_19bbz#F#CS#2」。另外，以與實例2.1中相同之方式，載體經構築以包括TLR4細胞質域(T，SEQ ID NO: 31)，但不包括FKBP12，及不具有自裂解序列，且該載體稱為「p_19bbzT」。
用於製備p_19bbz#C、p_19bbz#M、p_19bbz#N、p_19bbz#S1、p_19bbz#S2、「p_19bbz#TC」、p_19bbz#RG、p_19bbz#F#C#S2及p_19bbzT載體之對應於蛋白質或其片段的胺基酸序列及核苷酸序列展示於下表3至10中。另外，各質體之結構圖展示於圖8至18中。 [表3]
SMAD4之MH2域 序列
AA SEQ (234 aa) (SEQ ID NO:20)
Figure 02_image037
NT SEQ (702 bp) (SEQ ID NO:21)
Figure 02_image039
[表4]
SKI之N端域 序列
AA SEQ (315 aa) (SEQ ID NO:22)
Figure 02_image041
NT SEQ (945 bp) (SEQ ID NO:23)
Figure 02_image043
[表5]
CypA (PPIA) 序列
AA SEQ(165 aa) (SEQ ID NO:24)
Figure 02_image045
NT SEQ (495 bp) (SEQ ID NO:25)
Figure 02_image047
[表6]
SHP-1之N端SH2域(PTPN6) 序列
AA SEQ (107 aa) (SEQ ID NO:26)
Figure 02_image049
NT SEQ (321 bp) (SEQ ID NO:27)
Figure 02_image051
[表7]
SHP-2之N端SH2域(PTPN11) 序列
AA SEQ(107 aa) (SEQ ID NO:28)
Figure 02_image053
NT SEQ(321 bp) (SEQ ID NO:29)
Figure 02_image055
[表8]
TLR4之內部細胞質域 序列
AA SEQ (187 aa) (SEQ ID NO:30)
Figure 02_image057
NT SEQ (561 bp) (SEQ ID NO:31)
Figure 02_image059
[表9]
TC21之G23V 突變體 (RRAS2) 序列
AA SEQ (204 aa) (SEQ ID NO:32)
Figure 02_image061
NT SEQ (612 bp) GGC-＞GTC (SEQ ID NO:33)
Figure 02_image063
[表10]
RhoG 之 Q61V 突變體 序列
AA SEQ (191 aa) (SEQ ID NO:34)
Figure 02_image065
NT SEQ(573 bp) CAG-＞GTG (SEQ ID NO:35)
Figure 02_image067
實例3. 慢病毒之產生 實例3.1. 含有CAR 及FKBP12 之 基因的慢病毒之產生
為了產生各慢病毒批次，使用經最佳化慢病毒產生套組，LV-MAX慢病毒產生系統(Gibco，#A35684)。以上構築之第3代慢病毒轉移質體係用於用經修飾慢病毒包裏質體及封裝質體共轉染pMD2.G (Addgene，#12259)、pMDLg/pRRE (Addgene，#12251)及pRSV-Rev (Addgene，#12253)，製備出慢病毒。在將載體轉導至適用於無血清培養基之HEK293F細胞中且培養50至54小時後，收集包括病毒之培養基且使用Lenti -X濃縮器(Takara，#631232)進行濃縮。將濃縮的病毒儲存在-80℃下，直至使用。所產生之慢病毒稱為「Lenti_19bbz#F」。實例3.2. 含有CAR 及其他訊號傳遞路徑調節物之基因的慢病毒之產生
以與實例3.1中相同之方式，在實例2.2中製備的p_19bbz#C、p_19bbz#M、p_19bbz#N、p_19bbz#S1、p_19bbz#S2、p_19bbz#TC、p_19bbz#RG、「p_19bbz#F#CS#2」及p_19bbzT慢病毒轉移質體用於產生慢病毒，且此等分別稱為「Lenti_19bbz#C」、「Lenti_19bbz#M」、「Lenti_19bbz#N」、「Lenti_19bbz#S1」、「Lenti_19bbz#S2」、「Lenti_19bbz#TC」、「Lenti_19bbz#RG」、「Lenti_19bbz#F#C#S2」及「Lenti_19bbzT」。實例4.  CAR-T 細胞之 構築 實例4.1. 其中引入了FKBP12 之CAR-T 細胞的 構築
使用健康供體外周血液單核細胞(PBMC)構築CAR-T細胞。自PBMC移除黏附細胞，且隨後在X-VIVO 15培養基(Lonza)，包括200 IU/mL rhIL-2 (BMI Korea)及抗CD3/CD28戴諾磁珠(Life Technologies)之培養基中培養，以誘導T細胞之活化(珠粒:CD3+T細胞=1:1)。 二天後，分別用活化T細胞處理實例3.1中所產生之二種類型的慢病毒(Lenti_19bbz#F及Lenti_19bbz)。次日，進行離心以移除包括慢病毒之上清液。將T細胞以3×105 個細胞/mL再懸浮於含有200 IU/mL rhIL-2之X-VIVO 15培養基中且培養3天。其後，移除抗CD3/CD28戴諾磁珠且培養，且T細胞藉由每2或3天更換包括rhIL-2之新培養基來增殖。在此情況下，使用Lenti_19bbz#F製備之CAR-T細胞稱為「CAR-T細胞_19bbz#F」且使用Lenti_19bbz製備之CAR-T細胞稱為「CAR-T細胞_19bbz」。實例4.2. 其中引入了其他訊號傳遞路徑調節物 之CAR-T 細胞的 構築
以與實例4.1中相同之方式，實例3.2中所產生之「Lenti_19bbz#C」、「Lenti_19bbz#M」、「Lenti_19bbz#N」、「Lenti_19bbz#S1」、「Lenti_19bbz#S2」、「Lenti_19bbz#TC」、「Lenti_19bbz#RG」、「Lenti_19bbz#F#C#S2」及「Lenti_19bbzT」慢病毒用於使CAR-T細胞轉換且構築CAR-T細胞，且此等慢病毒分別稱為「CAR-T細胞_19bbz#C」、「CAR-T細胞_19bbz#M」、「CAR-T細胞_19bbz#N」、「CAR-T細胞_19bbz#S1」、「CAR-T細胞_19bbz#S2」、「CAR-T細胞_19bbz#TC」、「CAR-T細胞_19bbz#RG」、「CAR-T細胞_19bbz#FCS2」及「CAR-T細胞_19bbzT」。實例5. 製備Her2 特異性CAR-T
以與實例1至4中相同的方式製備Her2特異性CAR-T，不同之處在於抗原結合CD19 scFv域經替換為Her2 scFv。
特定言之，Her2特異性CAR係藉由連接i)衍生自CD8訊號肽之核苷酸序列(Uniprot：P01732-1，1-21 aa，SEQ ID NO: 1)及ii)衍生自Her2特異性抗體，曲妥珠單抗(IMGT資料庫) (SEQ ID NO: 46)的scFv之片段的核苷酸序列(SEQ ID NO: 45)，且隨後連接iii) CD8鉸鏈-跨膜域(SEQ ID NO: 5)、iv)人類4-1BB共刺激因子域細胞質區(SEQ ID NO: 7)及v)衍生自人類CD3ζ胞內域之核苷酸序列(SEQ ID NO: 9) (表11)而構築。
另外，亦製備與Her2特異性CAR一起表現之各種訊號傳遞路徑調節物。特定言之，製備分別表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2之Her2特異性CAR-T。另外，製備其中表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2中之所有者的CAR-T。在此情況下使用之載體如圖19至23中所示。 [表11]
Hbbz 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image069
 1
scFV VL
Figure 02_image071
 45
連接子
Figure 02_image073
scEV VH
Figure 02_image075
鉸鏈
Figure 02_image077
 5
TM
Figure 02_image079
4-18B訊號傳遞
Figure 02_image081
 7
CD3ζ訊號傳遞
Figure 02_image083
 9
NT 訊號
Figure 02_image085
 2
scFV VL
Figure 02_image087
 46
連接子
Figure 02_image089
scFV VH
Figure 02_image091
鉸鏈
Figure 02_image093
 6
TM
Figure 02_image095
4-18B訊號傳遞
Figure 02_image097
 8
CD3ζ訊號傳遞
Figure 02_image099
 10
實例6. 製備PSMA 特異性CAR-T
以與實例1至4中相同之方式，製備PSMA特異性CAR-T，不同之處在於抗原結合CD19 scFv域經替換為PSMA-scFv。
特定言之，PSMA特異性CAR係藉由連接i)衍生自訊號肽之核苷酸序列(GenBank AAA51634.1，1-19 aa，SEQ ID NO: 52)，該訊號肽衍生自Ig重鏈，及ii)衍生自PSMA特異性J591抗體的scFv之片段的核苷酸序列(SEQ ID NO: 55)(WO2002/098897A2)，且隨後連接iii) CD8鉸鏈-跨膜域(SEQ ID NO: 5)、iv)人類4-1BB共刺激因子域細胞質區(SEQ ID NO: 7)及v)衍生自人類CD3ζ胞內域之核苷酸序列(SEQ ID NO: 9) (表12)而構築。
另外，亦製備與PSMA特異性CAR一起表現之各種訊號傳遞路徑調節物。特定言之，製備分別表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2之PSMA特異性CAR-T。另外，製備其中表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2中之所有者的CAR-T。在此情況下使用之載體如圖34至38中所示。 [表12]
Pbbz 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image101
 52
scFv VL
Figure 02_image103
 54
連接子
Figure 02_image105
scFv VH
Figure 02_image107
鉸鏈
Figure 02_image109
 5
TM
Figure 02_image111
4-18B訊號傳遞
Figure 02_image113
 7
CD3ζ訊號傳遞
Figure 02_image115
 9
NT 訊號
Figure 02_image117
 53
scFv VL
Figure 02_image119
 55
連接子
Figure 02_image121
scFv VH
Figure 02_image123
鉸鏈
Figure 02_image125
 6
TM
Figure 02_image127
4-18B訊號傳遞
Figure 02_image129
 8
CD3ζ訊號傳遞
Figure 02_image131
 10
實例7. 製備CD43 特異性CAR-T
以與實例1至4中相同的方式製備CD43特異性CAR-T，不同之處在於抗原結合CD19 scFv域經替換為CD43 scFv。此時使用之序列展示於下表13中。另外，亦製備與CD43特異性CAR一起表現之各種訊號傳遞路徑調節物。特定言之，製備分別表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2之CD43特異性CAR-T。另外，製備其中表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2中之所有者的CAR-T。在此情況下使用之載體如圖24至28中所示。 [表13]
43bbz 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image133
 1
scFv VL
Figure 02_image135
 47
連接子
Figure 02_image137
scFV VH
Figure 02_image139
鉸鏈
Figure 02_image141
 5
TM
Figure 02_image143
4-188 訊號傳遞
Figure 02_image145
 7
CD3ζ 訊號傳遞
Figure 02_image147
 9
NT 訊號
Figure 02_image149
 2
scFV VL
Figure 02_image151
 48
連接子
Figure 02_image153
scFV VH
Figure 02_image155
鉸鏈TM
Figure 02_image157
Figure 02_image159
 6
4-18B訊號傳遞
Figure 02_image161
 8
CD3ζ 訊號傳遞
Figure 02_image163
 10
實例8. 製備CD47- 特異性CAR-T
以與實例1至4中相同的方式製備CD47特異性CAR-T，不同之處在於抗原結合CD19 scFv域經替換為CD47 scFv。在此情況下使用之序列展示於下表14中。另外，亦製備與CD47特異性CAR一起表現之各種訊號傳遞路徑調節物。特定言之，製備分別表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2之CD47特異性CAR-T。另外，製備其中表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2中之所有者的CAR-T。在此情況下使用之載體如圖29至33中所示。 [表14]
47bbz 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image165
 1
scFv VH
Figure 02_image167
 50
連接子
Figure 02_image169
scFv VL
Figure 02_image171
鉸鏈
Figure 02_image173
 5
TM
Figure 02_image175
4-18B訊號傳遞
Figure 02_image177
 7
CD3ζ訊號傳遞
Figure 02_image179
 9
NT 訊號
Figure 02_image181
 40
scFV VH
Figure 02_image183
 51
連接子
Figure 02_image185
scFv VL
Figure 02_image187
鉸鏈
Figure 02_image189
 6
TM
Figure 02_image191
4-188訊號傳遞
Figure 02_image193
 8
CD3ζ 訊號傳遞
Figure 02_image195
 10
實例9. 製備HERV-E TCR-T
以與實例1至4中相同的方式製備表現HLA-A11-特異性HERV-E表位之靶向癌細胞的HERV-E-特異性TCR-T，不同之處在於CAR區經替換為HERV-E-特異性TCR。亦製備與HERV-E-特異性TCR一起表現之各種訊號傳遞路徑調節物。特定言之，製備分別表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2之HERV-E-特異性TCR-T。另外，製備其中表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2中之所有者的TCR-T。在此情況下使用之序列展示於下表15至24中。在此情況下使用之載體如圖39至43中所示。 [表15]
hvet 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image197
 57
TCRα
Figure 02_image199
 59
P2A
Figure 02_image201
 11
訊號
Figure 02_image203
 61
TCRβ
Figure 02_image205
 63
[表16]
hvet 名稱 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image207
 58
TCRα
Figure 02_image209
 60
P2A
Figure 02_image211
 12
訊號
Figure 02_image213
 62
TCRβ
Figure 02_image215
 64
[表17]
hvet #F 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image217
 57
TCRα
Figure 02_image219
 59
P2A
Figure 02_image221
 11
訊號
Figure 02_image223
 61
TCRβ
Figure 02_image225
 63
P2A
Figure 02_image227
 11
FKBP12
Figure 02_image229
 13
[表18]
hvet #F 名稱 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image231
 58
TCRα
Figure 02_image233
 60
P2A
Figure 02_image235
 12
訊號
Figure 02_image237
 62
TCR β
Figure 02_image239
 64
P2A
Figure 02_image241
 12
FKBP12
Figure 02_image243
 14
[表19]
hvet #C 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image245
 57
TCRα
Figure 02_image247
 59
P2A
Figure 02_image249
 11
訊號
Figure 02_image251
 61
TCRβ
Figure 02_image253
 63
P2A
Figure 02_image255
 11
CyPA
Figure 02_image257
 24
[表20]
hvet#C 名稱 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image259
 58
TCRα
Figure 02_image261
 60
P2A
Figure 02_image263
 12
訊號
Figure 02_image265
 62
TCRβ
Figure 02_image267
 64
P2A
Figure 02_image269
 12
CyPA
Figure 02_image271
 25
[表21]
hvet#s2 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image273
 57
TCRα
Figure 02_image275
 59
P2A
Figure 02_image277
 11
訊號
Figure 02_image279
 61
TCRβ
Figure 02_image281
 63
P2A
Figure 02_image283
 11
SHP2-nSH2
Figure 02_image285
 28
[表22]
hvet #s2 名稱 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image287
 58
TCRα
Figure 02_image289
 60
P2A
Figure 02_image291
 12
訊號
Figure 02_image293
 62
TCRβ
Figure 02_image295
 64
P2A
Figure 02_image297
 12
SHP2-nSH2
Figure 02_image299
 29
[表23]
hvet #F #C#S2 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image301
 57
TCRα
Figure 02_image303
 59
P2A
Figure 02_image305
 11
訊號
Figure 02_image307
 61
TCRβ
Figure 02_image309
 63
P2A
Figure 02_image311
 11
FKBP12
Figure 02_image313
 13
P2A
Figure 02_image315
 11
CyPA
Figure 02_image317
 24
P2A
Figure 02_image319
 11
SHP2-nSH2
Figure 02_image321
 28
[表24]
hvet#F #C#S2 Naae 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image323
 58
TCRα
Figure 02_image325
 60
P2A
Figure 02_image327
 12
訊號
Figure 02_image329
 62
TCRβ
Figure 02_image331
 64
P2A
Figure 02_image333
 12
KKBP12
Figure 02_image335
 14
P2A
Figure 02_image337
 12
CyPA
Figure 02_image339
 25
P2A
Figure 02_image341
 12
SHP2-nSH2
Figure 02_image343
 29
實例10. 製備NY-ESO-1- 特異性TCR-T
以與實例1至4中相同的方式製備表現HLA-A2-特異性NY-ESO-1表位之靶向癌細胞的NY-ESO-1-特異性TCR-T，不同之處在於CAR區經替換為NY-ESO-1-特異性TCR。亦製備與NY-ESO-1-特異性TCR一起表現之各種訊號傳遞路徑調節物。特定言之，製備分別表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2之NY-ESO-1-特異性TCR-T。另外，製備其中表現FKBP12蛋白質、親環蛋白A及SHP2-nSH2中之所有者的TCR-T。在此情況下使用之序列展示於下表25至34中。在此情況下使用之載體如圖44至48中所示。 [表25]
nelt 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image345
 65
TCRα
Figure 02_image347
 67
P2A
Figure 02_image349
 11
訊號
Figure 02_image351
 69
TCRβ
Figure 02_image353
 71
[表26]
nelt 名稱 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image355
 66
TCRα
Figure 02_image357
 68
P2A
Figure 02_image359
 12
訊號
Figure 02_image361
 70
TCRβ
Figure 02_image363
 72
[表27]
nelt #F 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image365
 65
TCRα
Figure 02_image367
 67
P2A
Figure 02_image369
 11
訊號
Figure 02_image371
 69
TCRβ
Figure 02_image373
 71
P2A
Figure 02_image375
 11
FKBP12
Figure 02_image377
 13
[表28]
nelt#F 名稱 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image379
 66
TCRα
Figure 02_image381
 68
P2A
Figure 02_image383
 12
訊號
Figure 02_image385
 70
TCRβ
Figure 02_image387
 72
P2A
Figure 02_image389
 12
FKBP12
Figure 02_image391
 14
[表29]
ne1t#C 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image393
 65
TCRα
Figure 02_image395
 67
P2A
Figure 02_image397
 11
訊號
Figure 02_image399
 69
TCRβ
Figure 02_image401
 71
P2A
Figure 02_image403
 11
CyPA
Figure 02_image405
 24
[表30]
nelt#C 名稱 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image407
 66
TCRα
Figure 02_image409
 68
P2A
Figure 02_image411
 12
訊號
Figure 02_image413
 70
TCRβ
Figure 02_image415
 72
P2A
Figure 02_image417
 12
CyPA
Figure 02_image419
 25
[表31]
nelt #S2 名稱 序列 SEQ IDNO
AA 訊號
Figure 02_image421
 65
TCRα
Figure 02_image423
 67
P2A
Figure 02_image425
 11
訊號
Figure 02_image427
 69
TCRβ
Figure 02_image429
 71
P2A
Figure 02_image431
 11
SHP2-nSH2
Figure 02_image433
 28
[表32]
nelt #S2 名稱 序列 SEQ ID NO
NT 訊號
Figure 02_image435
 66
TCRα
Figure 02_image437
 68
P2A
Figure 02_image439
 12
訊號
Figure 02_image441
 70
TCRβ
Figure 02_image443
 72
P2A
Figure 02_image445
 12
SHP2-nSH2
Figure 02_image447
 29
[表33]
nelt#F #C#S2 名稱 序列 SEQ ID NO
AA 訊號
Figure 02_image449
 65
TCRα
Figure 02_image451
 67
P2A
Figure 02_image453
 11
訊號
Figure 02_image455
 69
TCR β
Figure 02_image457
 71
P2A
Figure 02_image459
 11
FKBP12
Figure 02_image461
 13
P2A
Figure 02_image463
 11
CyPA
Figure 02_image465
 24
P2A
Figure 02_image467
 11
SHP2-nSH2
Figure 02_image469
 28
[表34]
nelt#F #C#S2 名稱 序列 SEQ IDNO
NT 訊號
Figure 02_image471
 66
TCR α
Figure 02_image473
 68
P2A
Figure 02_image475
 12
訊號
Figure 02_image477
 70
TCRβ
Figure 02_image479
 72
P2A
Figure 02_image481
 12
FKBP12
Figure 02_image483
 14
P2A
Figure 02_image485
 12
CyPA
Figure 02_image487
 25
P2A
Figure 02_image489
 12
SHP2-nSH2
Figure 02_image491
 29
II. 其中引入了訊號傳遞路徑調節物之CAR-T 的活性之 證實 ： 活體外 實驗實例1. CAR-T 細胞 中之抗原受體表現的證實 實驗實例1.1. 經由流動式細胞測量術評估CAR 表現
為了證實在CAR-T細胞中表現之細胞表面上的CAR之表現及目標腫瘤細胞之抗原表現，在病毒感染之後4天收集CAR-T細胞，且用FITC標記的重組人類CD19 (Acro，#CD9-HF2H2)染色，以分析CD19特異性CAR之表現(圖54)。另外，Her2特異性CAR之表現亦藉由用Alexa-Fluor 488標記的AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人類IgG (H+L)抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-546-003)染色證實(圖69)。
此外，PSMA-特異性CAR之表現藉由用生物素標記的AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗小鼠IgG抗體(F(ab')2 片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch，#115-066-006)及PE標記的卵白素(streptavidin)(BD Pharmingen，#554061)染色證實(圖77)。
在目標腫瘤細胞之情況下，CD19之表現藉由用APC標記的抗人類CD19抗體(BD Pharmingen，#555415)染色證實(圖58)。使用CytoFLEX S (Beckman Coulter)流式細胞儀(FACS)來量測經染色細胞之表面中的此等蛋白質之表現位準，且使用CytExpert軟體分析。實驗實例1.2. 使用免疫螢光染色評估CAR 表現
在刺激開始之後八天，將實例4中構築之CD19特異性CAR-T細胞用花青3標記的山羊抗小鼠IgG抗體(Invitrogen，#A10521)染色(圖55)，且將實例5中構築之Her特異性CAR-T細胞用Alexa-Fluor 488標記的AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人類IgG (H+L)抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-546-003)染色(圖70)。另外，將實例6中構築之PSMA-特異性CAR-T細胞用花青3標記的山羊抗小鼠IgG抗體(Invitrogen，#A10521)染色(圖78)。使CAR染色的細胞固定於eBioscience溶液(eBioscience，#00-5123)中20分鐘且透化。其後，安裝好樣品，且細胞核用含DAPI之ProLong Gold Antifade Mountant溶液(Invitrogen，#P36931)染色。
在另一實例中，在刺激開始之後9天，將CD19特異性CAR-T細胞與Daudi-Fluc-eGFP細胞以1:1比率共培養持續1小時，且隨後使用花青3標記的山羊抗小鼠IgG抗體及DAPI染色。使用配備有Optinity HDMI 4K C-Mount攝像機KCX-80之Optinity KI-2000顯微鏡在400X倍比率下拍攝細胞影像(圖56)。Daudi-Fluc-EGFP細胞觀測到具有在細胞質中之綠色EGFP螢光。實驗實例2.  T 細胞 亞群之分析
在刺激開始之後八天，使用流式細胞儀分析實例8中構築之CAR-T細胞的T細胞亞群：根據存在或不存在CD45RA及CCR7之表現，將該等CAR-T細胞分類為幹細胞樣記憶T細胞(T記憶幹細胞，CD45RA+ CCR7+ )、中央記憶T細胞(CD45RA- CCR7+ )、效應記憶T細胞(CD45RA- CCR7- )及效應T細胞(CD45RA+ CCR7- )。當分析CD19特異性CAR(+)細胞時，將FITC標記的重組人類CD19蛋白質(Acro，#CD9-HF2H2)用於染色CAR。另外，當分析PSMA-特異性CAR(+)細胞時，將FITC標記的重組人類PSMA蛋白質(Acro，#PSA-HF244)用於染色CAR。在二種情況下，在染色之後使用如下表35中所指示之特異性抗體分析共同T細胞亞群(圖57)。 [表35]
目標蛋白質 製造商，#目錄號 螢光染料 物種
CD45RA BD Pharmingen，# 554061 Alexa Fluor 700 小鼠
CCR7 BD Pharmingen，# 566743 BV421 小鼠
實驗實例3. 訊號傳遞路徑調節物之表現的證實 實驗實例3.1. 經由西方墨點法評估蛋白質表現
為了證實在以上實例中構築之CAR-T細胞的蛋白質表現，使用含有蛋白酶抑制劑之PROPREP蛋白質提取溶液(iNtRON Biotechnology，#17081)裂解CAR-T細胞。使用BCA蛋白質分析套組(Pierce)定量蛋白質濃度。
在使用SDS-PAGE在相同量下電泳蛋白質之後，經由XCell SureLock Mini-Cell電泳系統及XCell II Blot模組(Invitrogen)將該等蛋白質轉移至PVDF膜。其後，用阻斷溶液(5%粉末狀脫脂牛奶溶液)阻斷膜，且藉由依次用初級抗體及二級抗體培育來證實蛋白質表現。山羊抗小鼠IgG HRP (Invitrogen，#62-6520)或山羊抗兔IgG HRP (Abcam，#ab6721)用作二級抗體。
使用Azure C400 Gel成像系統拍攝蛋白質表現之影像，且用AzureSpot分析軟體(Azure Biosystems)分析(圖59)。用於實驗之初級抗體如下表36中所示。 [表36]
初級抗體(目標蛋白質) 製造商，#目錄號 物種
人類FKBP12 Santa Cruz #sc-133067 小鼠
人類親環蛋白A Sino Biological # 106317-T36 兔
人類SHP2域之N端SH2 MyBioSource #MBS1751917 小鼠
人類GAPDH Santa Cruz #sc-32233 小鼠
實驗實例3.2. 經由即時聚合酶鏈反應之mRNA 表現的評估
為了證實在以上實例中構築之CAR-T細胞中mRNA之表現，在刺激之後8天使用ISOLATEII RNA Mini套組(Bioline，#52072)自CAR-T細胞分離RNA，且使用Nanodrop 1000分光光度計(Thermo Scientific)進行定量。在使用0.5 μg或1 μg RNA合成cDNA之後，使用SensiFAST探針Hi-ROX單步套組(Bioline，#77001)進行即時定量PCR (Q-PCR)。
GAPDH基因用作內部參考。所有實驗重複二次。藉由ΔΔCt方法分析基因表現(圖60)。用於Q-PCR中之引物及TaqMan探針展示於下表37中。 [表37]
寡核苷酸 NTSEQ 修飾 SEQ ID NO
FK8P12 正向
Figure 02_image493
 - 36
FK8P12 反向
Figure 02_image495
 - 37
FK8P12TaqMan 探針
Figure 02_image497
 FAM- MG8MFQ 38
親環蛋白A正向
Figure 02_image499
 - 39
親環蛋白A反向
Figure 02_image501
 - 40
親環蛋白ATaqMan 探針
Figure 02_image503
 FAM -MGBMFQ 41
SHP2之N端SH2域：正向
Figure 02_image505
 - 42
SHP2之N端SH2域：反向
Figure 02_image507
 - 43
SHP2之N端SH2域：探針
Figure 02_image509
 FAM- WGBMFQ 44
GAPDH引物及 TaqMan 探針 Taqman™ GAPDH對照試劑 (Applied Biosystems，#402369)
實驗實例4.  CAR-T 細胞 之活性的證實 實驗實例4.1. 目標腫瘤細胞株及其培養物
對於CD19特異性CAR-T細胞之活體外功能分析，藉由使用慢病毒載體在人類骨髓白血病K562細胞(ATCC，#CCL-243)中穩定表現人類CD19蛋白質來建立目標腫瘤細胞株(K562-CD19)。K562親本細胞株用作陰性對照。
此外，穩定表現螢火蟲螢光素酶及翡翠綠螢光蛋白質之人類B淋巴母細胞Daudi細胞(GFP，Imanis，#CL158)亦用於CD19特異性CAR-T細胞之活體外功能分析。另外，穩定表現螢火蟲螢光素酶之人類B淋巴母細胞Daudi細胞用於CD19特異性CAR-T細胞之活體內抗癌功效分析。另外，人類B細胞前驅物白血病細胞株Nalm6 (ATCC，#CCL-3273)用於CD19特異性CAR-T細胞之活體外功能分析。
穩定表現螢火蟲螢光素酶之人類乳癌細胞株SKBR3 (JCRB，#1627.1)用於Her2特異性CAR-T細胞之活體外功能分析及活體內抗癌功效分析。穩定表現螢火蟲螢光素酶之人類前列腺癌細胞株LNCaP (ATCC，#CRL-1740-LUC2)用於PSMA-特異性CAT-T細胞之活體外功能分析。
K562、K562-CD19、Nalm6及Daudi-Fluc-eGFP目標腫瘤細胞株之各細胞株在含有10% FBS (胎牛血清)及抗生素-抗細菌劑(Gibco，#15240096)之RPMI-1640培養基(Gibco，#11875-085)中培養。SKBR3-Luc細胞在含有10% FBS及抗生素-抗細菌劑的McCoy之5a培養基(Gibco，#16600-082)中培養。LnCap-Luc細胞在含有10% FBS、抗生素-抗細菌劑及2 μg/mL殺稻瘟菌素(Gibco，#A1113903)之RPMI-1640培養基中培養。實驗實例4.2.  CAR-T 細胞 分泌細胞介素之能力的評估
將在以上實例中構築之CAR-T細胞(4×104 )與目標腫瘤細胞以1:1比率共培養24小時。其後，收集培養基，且使用ELISA (R&D系統)方法來量測在培養基中諸如IFNγ、TNFα及IL-2之各種細胞介素的濃度。結果顯示為在二次重複實驗之後的平均值(圖61至63 /圖71至73)。
另外，當評估在TGF-β1存在下細胞介素之釋放能力時，使用在指定濃度下(0 ng/mL至5 ng/mL)含有TGF-β1之培養基，將CAR-T細胞(1×105 )與目標腫瘤細胞以1:1比率共培養24小時。結果顯示為在二次重複實驗之後的平均值(圖64及65)。
為了校正CAR-T細胞之轉導效率的差異，使用未經轉導的T細胞調整經轉導CAR-T細胞之數目及T細胞之總數目。實驗實例5.  CAR-T 細胞 之細胞殺傷活性的證實 實驗實例5.1. 基於EuTDA 之 CAR-T 細胞的細胞殺傷活性的量測
藉由使用DELFIA細胞毒性量測套組(珀金埃爾默，#AD0116)量測釋放4小時的EuTDA來評估針對在以上實例中構築之CD19特異性CAR-T細胞的目標腫瘤細胞之殺傷活性。特定言之，使目標腫瘤細胞與DELFIA BATDA試劑在37℃下反應15分鐘，且隨後用RPMI 1640培養基洗滌三次。其後，將目標腫瘤細胞再懸浮於培養基中，得到5×104 個細胞/mL。以預定比率在96孔V底盤中將CAR-T細胞與目標腫瘤細胞(5×103 )共培養。其後，使培養基(20 µL)轉移至白色底盤，與銪溶液(200 µL)混合，且在輕微攪拌下反應15分鐘。
藉由使用SpectraMax iD5多模式微量盤讀取器(分子裝置)量測螢光來評估釋放至培養基中的TDA。各實驗一式三份地進行，且使用螢光量測經由以下等式計算溶解度：＜ 數學等式1＞ 溶解度%= { (實驗組的釋放值-背景釋放值) / (最大釋放值-背景釋放值)} ×100； 其中，基礎釋放值為在目標腫瘤細胞之自發釋放中量測的值，且最大釋放值為在用DELFIA溶解緩衝液完全溶解目標腫瘤細胞之後量測的值。實驗實例5.2. 基於螢光素酶 之 CAR-T 細胞的細胞殺傷活性的量測
以預定比率在96孔U底盤中將在以上實例中構築之CAR-T細胞與表現螢火蟲螢光素酶之目標腫瘤細胞(3×104 )共培養。各實驗重複二次。特定言之，添加75 μg/mL D-螢光素鉀鹽(PerkinElmer，#122799)，且在37℃下培養各目標腫瘤細胞之最佳化時間。其後，使用SpectraMax iD5多模式微量盤讀取器(分子裝置)來量測活細胞之螢光素酶活性。CAR(+)-T細胞溶解目標腫瘤細胞之能力係藉由比較在各E:T (效應子(CAR-T細胞):目標(目標腫瘤細胞))比率下CAR-T細胞與未經轉導的T細胞之間經誘導螢光素酶活性值之差異來評估。結果顯示為二次重複實驗的平均值(圖68 (頂部)，圖75)。在各實驗中，為了校正轉導效率之差異，使用未經轉導的T細胞調整經轉導CAR-T細胞之數目及T細胞之總數目。實驗實例6. 細胞遷移之量測
使用配備有8 μm孔的膜插件之傳斯維爾(24孔，Corning，#3422)來量測在以上實例中構築之CAR-T細胞的遷移能力。自先前與抗CD3/抗CD28戴諾磁珠反應之CAR-T細胞中移除珠粒，且將不含珠粒的CAR-T細胞再懸浮於無血清RPMI1640培養基(含有0.25%人類血清白蛋白(GreenCross))中，其含有0.2 μg/mL重組人類EGF (Sino Biological，#10605-HNAE)。將CAR-T細胞裝載到傳斯維爾之上部腔室上，而下部腔室用含有0.25%人類血清白蛋白(GreenCross)之RPMI1640培養基填充。在培育1小時之後，使用流動式細胞測量術及錐蟲藍染色方法來量測遷移至下部腔室的細胞數目(圖66，圖74)。
另外，為了比較及評估在抗原刺激之後CAR-T細胞的內部移動，將CAR-T細胞與目標腫瘤細胞以1:1比率在37℃下培養48小時(使用96孔U底盤)，且隨後拍攝細胞影像。在此情況下，使用單獨CAR-T培養的實驗組用作陰性對照(圖67)。
為了校正轉導效率之差異，在使用未經轉導的T細胞調整經轉導CAR-T細胞(CAR(+)-T細胞)之數目及T細胞之總數目之後進行實驗。細胞介素不在培養基1及培養基2中處理，且培養基1及培養基2之血清組合物彼此不同。II. 其中引入了訊號傳遞路徑調節物之CAR-T 的活性之 證實 ： 活體內 實驗實例7. 使用血液癌細胞模型(I) 評估其中引入了訊號傳遞路徑調節物之CAR-T 細胞的 抗癌功效
經由以下方法，比較CAR-T細胞_19bbz及CAR-T細胞_19bbz#F之抗癌功效，且藉由劑量(1×106 、3×106 及1×107 )評估。其中引入了螢火蟲螢光素酶基因(Daudi-Fluc)之Daudi癌細胞株用作血液癌細胞模型。
為了誘導血液癌，將以100 µL製備之1×106 個Daudi-Fluc細胞注入已經歷一定時期的環境適應之健康NPG (NOD-Prkdcscid IL2rgnull ) (Vital Star，中國)雌性小鼠(7週齡)之左側及右側尾部靜脈中。在移植Daudi-Fluc癌細胞株之後，在第10天時將D-螢光素(美國珀金埃爾默)溶液腹膜內注射，且10分鐘後使用IVIS成像設備(美國珀金埃爾默)進行拍攝。隨後，在使用IVIS Lumina Series軟體量測各名個體之螢光素酶表現位準之後，藉由計算平均值來分組。為了評估各CAR-T細胞之抗癌功效，使用1 mL注射器(BD REF328820，31G)向小鼠之左側及右側尾部靜脈投與指定劑量(1×106 、3×106 及1×107 )的100 µL CAR-T細胞。在注射癌細胞之後，分別在第14天、第21天、第28天、第35天及第42天以與上文所述相同之方式腹膜內注射D-螢光素溶液，且經由IVIS成像監測腫瘤生長(圖50)。CAR-T細胞_19bbz設定為對照。
因此，如圖50中所示，證實當在最高劑量下投與CAR-T細胞時，僅在經CAR-T_19bbz#F處理之組中腫瘤抑制顯著增加。實驗實例8. 使用血液癌細胞模型(II) 評估其中引入了訊號傳遞路徑調節物之CAR-T 細胞的 抗癌功效
經由以下方法，評估CAR-T細胞_19bbz#F、CAR-T細胞_19bbz#C、CAR-T細胞_19bbz#M、CAR-T細胞_19bbz#N、CAR-T細胞_19bbz#S1、CAR-T細胞_19bbz#S2、CAR-T細胞_19bbz#TC、CAR-T細胞_19bbz#RG及CAR-T細胞_19bbzT之抗癌功效。其中引入了螢火蟲螢光素酶基因(Daudi-Fluc)之Daudi癌細胞株用作血液癌細胞模型。
為了誘導血液癌，將以100 µL製備之1×106 個Daudi-Fluc細胞注入已經歷一定時期的環境適應之健康NPG (NOD-Prkdcscid IL2rgnull ) (Vital Star，中國)雌性小鼠(7週齡)之左側及右側尾部靜脈中。在移植Daudi-Fluc癌細胞株之後，在第10天時將D-螢光素(美國珀金埃爾默)溶液腹膜內注射，且10分鐘後使用IVIS成像設備(美國珀金埃爾默)進行拍攝。隨後，在使用IVIS Lumina Series軟體量測各名個體之螢光素酶表現位準之後，藉由計算平均值來分組。
為了評估在分組後各CAR-T細胞之抗癌功效，使用1 mL注射器(BD REF328820，31G)向小鼠之左側及右側尾部靜脈投與以100 µL製備之1×107 個CAR-T細胞。在注射癌細胞之後，分別在第14天、第17天、第21天、第28天及第35天以與上文所述相同之方式腹膜內注射D-螢光素溶液，且經由IVIS成像監測腫瘤生長(圖7)。CAR-T細胞_19bbz設定為對照。因此，證實過度表現細胞訊號因子中之一者的CAR-T之抗癌作用優於對照之抗癌作用。實驗實例9. 使用實體癌症模型評估其中引入了訊號傳遞路徑調節物之CAR-T 細胞的 抗癌功效
經由以下方法，評估CAR-T細胞_Hbbz、CAR-T細胞_Hbbz#F及CAR-T細胞_Hbbz#FCS2之抗癌功效。向其中引入螢火蟲螢光素酶基因之SKBR3癌細胞株(SKBR3-Luc)用作表現Her2之實體癌症細胞模型。
將以200 µL製備之2×106 個SKBR3-Luc細胞注入已經歷一定時期的環境適應之健康NSGA (NOD-Prkdcscid IL2rgnull ) (JA Bio，韓國)雌性小鼠(7週齡)之腹腔中。在移植SKBR3-Luc癌細胞株之後，在第14天時將D-螢光素(美國珀金埃爾默)溶液腹膜內注射，且10分鐘後使用IVIS成像設備(美國珀金埃爾默)進行拍攝。隨後，在使用IVIS Lumina Series軟體量測各名個體之螢光素酶表現位準之後，藉由計算平均值來分組。
為了評估在分組後各CAR-T細胞之抗癌功效，使用1 mL注射器(BD REF328820，31G)向小鼠之左側及右側尾部靜脈投與以100 µL製備之CAR T細胞(劑量：1×106 個CAR(+)-T細胞)。在注射癌細胞之後，分別在第21天(CAR T注射後1週)、第28天(CAR T注射後2週)、第35天(CAR T注射後3週)以與上文所述相同之方式腹膜內注射D-螢光素溶液，且經由IVIS成像監測腫瘤生長。經由Lumina Series軟體得到定量影像資料。PBS投與組設定為對照組。
結果展示於圖76中。如圖中所示，證實在一個實施例中製備之CAR-T細胞表現出甚至對處理實體癌症的極佳功效。
(無)
圖1為展示在一個實施例中構築之19bbz CAR實驗組的域結構的視圖。
圖2為展示在一個實施例中構築之19bbz CAR實驗組的域結構的視圖。
圖3為展示在一個實施例中構築之Hbbz CAR實驗組的域結構的視圖。
圖4為展示在一個實施例中構築之43bbz CAR實驗組的域結構的視圖。
圖5為展示在一個實施例中構築之47bbz CAR實驗組的域結構的視圖。
圖6為展示在一個實施例中構築之Pbbz CAR實驗組的域結構的視圖。
圖7為比較在一個實施例中構築之CAR-T細胞實驗組的抗腫瘤效能以評估惡性血液病(II)之動物模型中的抗腫瘤治療功效的影像。
圖8為展示在一個實施例中使用的表現19bbz之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖9為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#F之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖10為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#M之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖11為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#N之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖12為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#C之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖13為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#S1之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖14為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#S2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖15為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#TC之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖16為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#RG之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖17為展示在一個實施例中使用的表現19bbzT之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖18為展示在一個實施例中使用的表現19bbz#FCS2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖19為展示在一個實施例中使用的表現Hbbz之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖20為展示在一個實施例中使用的表現Hbbz#F之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖21為展示在一個實施例中使用的表現Hbbz#C之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖22為展示在一個實施例中使用的表現Hbbz#S2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖23為展示在一個實施例中使用的表現Hbbz#FCS2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖24為展示在一個實施例中使用的表現43bbz之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖25為展示在一個實施例中使用的表現43bbz#F之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖26為展示在一個實施例中使用的表現43bbz#C之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖27為展示在一個實施例中使用的表現43bbz#S2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖28為展示在一個實施例中使用的表現43bbz#FCS2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖29為展示在一個實施例中使用的表現47bbz之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖30為展示在一個實施例中使用的表現47bbz#F之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖31為展示在一個實施例中使用的表現47bbz#C之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖32為展示在一個實施例中使用的表現47bbz#S2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖33為展示在一個實施例中使用的表現47bbz#FCS2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖34為展示在一個實施例中使用的表現Pbbz之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖35為展示在一個實施例中使用的表現Pbbz#F之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖36為展示在一個實施例中使用的表現Pbbz#C之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖37為展示在一個實施例中使用的表現Pbbz#S2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖38為展示在一個實施例中使用的表現Pbbz#FCS2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖39為展示在一個實施例中使用的表現HERV-E特異性TCR之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖40為展示在一個實施例中使用的表現HERV-E特異性TCR#F之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖41為展示在一個實施例中使用的表現HERV-E特異性TCR#C之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖42為展示在一個實施例中使用的表現HERV-E特異性TCR#S2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖43為展示在一個實施例中使用的表現HERV-E特異性TCR#FCS2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖44為展示在一個實施例中使用的表現NY-ESO-1特異性TCR之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖45為展示在一個實施例中使用的表現NY-ESO-1特異性TCR#F之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖46為展示在一個實施例中使用的表現NY-ESO-1特異性TCR#C之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖47為展示在一個實施例中使用的表現NY-ESO-1特異性TCR#S2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖48為展示在一個實施例中使用的表現NY-ESO-1特異性TCR#FCS2之慢病毒載體之圖譜的視圖。
圖49為概述在一個實施例中使用之CAR-T實驗組以評估惡性血液病(I)之動物模型中的抗腫瘤治療功效的圖。
圖50為比較在一個實施例中構築之CAR-T細胞實驗組的抗腫瘤效能以評估惡性血液病(I)之動物模型中的抗腫瘤治療功效的影像。
圖51為展示結合至FKBP12之TGF-β 1型受體激酶域之共晶結構的視圖。
圖52為展示FKBP12之四芳族胺基酸(芳族殘基)的視圖，該等胺基酸以樞轉方式參與FKBP12結合至TGF-β 1型受體中。
圖53為指示樞轉地參與FKBP12結合至TGF-β 1型受體中的FKBP12之芳族胺基酸的視圖。
圖54為用以證實在一個實施例中構築之CAR-T細胞中CD19特異性CAR之表現的流動式細胞量測分析的視圖。
圖55為用以揭露在一個實施例中構築之CD19特異性CAR-T細胞中表面CAR表現之特徵的免疫螢光顯微法之影像。
圖56為用以展示在一個實施例中CAR T細胞與目標腫瘤細胞之CAR介導之配對的免疫螢光顯微法之影像。
圖57為用於評估在一個實施例中活體外擴增之CD19特異性CAR-T細胞的T細胞亞群的CAR陽性細胞圈選(gate)中之流動式細胞量測分析的視圖。
圖58為對K562、K562-CD19及Daudi細胞中之CD19表現的流動式細胞量測分析之視圖。
圖59為展示在一個實施例中構築之CAR-T細胞中FKBP12、親環蛋白A及SHP2蛋白質的N端SH2域之蛋白質表現的墨點影像。
圖60為用以展示在一個實施例中構築之CAR-T細胞中FKBP12、親環蛋白A及SHP2蛋白質的N端SH2域之RNA表現的表。RNA表現藉由即時聚合酶鏈反應使用衍生自相同量之總RNA的cDNA定量。
圖61為用以展示在抗原性刺激時由CD19特異性CAR-T細胞釋放之IFNγ的量的圖式。
圖62為用以展示在抗原刺激時由CD19特異性CAR-T細胞釋放之TNFα的量的圖式。
圖63為用以展示在抗原性刺激時由CD19特異性CAR-T細胞釋放之IL-2的量的圖式。
圖64為用以展示在一個實施例中在TGF-β1存在下當抗原性刺激時由CD19特異性CAR-T細胞釋放之IFNγ的量的圖式。
圖65為用以展示在一個實施例中在TGF-β1存在下當抗原性刺激時由CD19特異性CAR-T細胞釋放之TNFα的量的圖式。
圖66為用以展示在用抗CD3/抗CD28珠粒活化CD19特異性CAR-T細胞之後執行的活體外細胞遷移分析之結果的圖式。
圖67為用以展示在一個實施例中在抗原性刺激存在下培養之CAR-T細胞之內在移動的影像。
圖68為用以展示針對分別作為CD19特異性CAR-T細胞之目標細胞的K562-CD19細胞(底部)及Daui Fluc-eGFP細胞(頂部)所量測之CAR T介導的腫瘤細胞溶解之分析結果的圖式。
圖69為用以證實在一個實施例中構築之Her2特異性CAR-T細胞中CAR之表現的流動式細胞量測分析的視圖。特定言之，藉由流動式細胞測量術分析分別用Hbbz、Hbbz#F、Hbbz#C、Hbbz#S2或Hbbz#FCS2慢病毒轉導之T細胞的Her2特異性CAR之表現。
圖70為用以揭露在一個實施例中構築之Her2特異性CAR-T細胞中表面CAR表現之特徵的免疫螢光顯微法之影像。
圖71為用以展示在抗原性刺激時由Her2特異性CAR-T細胞釋放之IFNγ的量的圖式。
圖72為用以展示在抗原性刺激時由Her2特異性CAR-T細胞釋放之TNFα的量的圖式。
圖73為用以展示在抗原性刺激時由Her2特異性CAR-T細胞釋放之IL-2的量的圖式。
圖74為用以展示在用抗CD3/抗CD28珠粒活化Her2特異性CAR-T細胞之後執行的活體外細胞遷移分析之結果的圖式。
圖75為用以展示針對作為Her2特異性CAR-T細胞之目標細胞的SKBR3-Luc細胞所量測之CAR T介導的腫瘤細胞溶解之分析結果的圖式。
圖76為用以比較在一個實施例中使用之Her2特異性CAR-T細胞的抗腫瘤效能的影像。
圖77為用以證實在一個實施例中構築之CAR-T細胞中PSMA特異性CAR之表現的流動式細胞量測分析的視圖。
圖78為用以揭露在一個實施例中構築之PSMA特異性CAR-T細胞中表面CAR表現之特徵的免疫螢光顯微法之影像。
圖79為用於評估活體外擴增之PSMA特異性CAR-T細胞的T細胞亞群的CAR陽性細胞圈選中之流動式細胞量測分析的視圖。
圖80為用於評估活體外擴增之PSMA特異性CAR-T細胞的T細胞耗竭的CAR陽性細胞圈選中之流動式細胞量測分析的視圖。
圖81為用以展示在用抗CD3/抗CD28珠粒活化PSMA特異性CAR-T細胞之後執行的活體外細胞遷移分析之結果的圖式。
圖82及圖83為用以展示針對PSMA特異性CAR-T細胞之目標腫瘤細胞所量測之CAR T介導的腫瘤細胞溶解之分析結果的圖式。
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(無)

Claims (71)

  1. 一種編碼一融合蛋白質的聚核苷酸，該融合蛋白質包含以下(i)至(v)： (i)一抗原結合域； (ii)一跨膜域； (iii)包含至少一個共刺激域的一胞內訊號傳遞域； (iv)一自裂解肽；及 (v)一訊號傳遞路徑調節物。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其中一間隔子進一步置於(i)該抗原結合域與(ii)該跨膜域之間。
  3. 如請求項1之聚核苷酸，其中該訊號傳遞路徑調節物係選自由以下組成之群的任一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之一蛋白質、b)一免疫親和素、c)參與抗原損失介導之復發的一蛋白質、d)位於T細胞刺激路徑中之一蛋白質、e)參與抑制負反饋的一蛋白質及f)其一組合。
  4. 如請求項1之聚核苷酸，其中該訊號傳遞路徑調節物在細胞質中起作用。
  5. 如請求項3之聚核苷酸，其中位於該免疫抑制訊號傳遞路徑中之該蛋白質為位於TGF-β/SMAD (FKBP12-FK506/雷帕黴素(rapamycin))訊號傳遞路徑中之一蛋白質或其一片段。
  6. 如請求項5之聚核苷酸，其中位於該TGF-β/SMAD (FKBP12-FK506/雷帕黴素)訊號傳遞路徑中之該蛋白質為選自由以下組成之群的任一者：FKBP12、在一SMAD4蛋白質之一C端處的一MH2域及N-SKI。
  7. 如請求項3之聚核苷酸，其中位於該免疫抑制訊號傳遞路徑中之該蛋白質為位於抑制性免疫檢查點路徑中之一蛋白質或其一片段。
  8. 如請求項7之聚核苷酸，其中位於該抑制性免疫檢查點路徑中之該蛋白質為一SHP-1蛋白質之一N-SH2域或其一片段，或一SHP-2蛋白質之一N-SH2域或其一片段。
  9. 如請求項3之聚核苷酸，其中該免疫親和素為FKBP12或其一片段，或親環蛋白A或其一片段。
  10. 如請求項3之聚核苷酸，其中參與該抗原損失介導之復發的該蛋白質為參與胞啃作用(trogocytosis)的一蛋白質或其一片段。
  11. 如請求項3之聚核苷酸，其中參與胞啃作用的該蛋白質為TC21或RhoG。
  12. 如請求項3之聚核苷酸，其中位於該T細胞刺激路徑中之該蛋白質為TCR/Zap70路徑之一轉接蛋白或其一片段。
  13. 如請求項12之聚核苷酸，其中該TCR/Zap70路徑之該轉接蛋白為選自由以下組成之群的任一者：NCK1、LAT及NEMO。
  14. 如請求項3之聚核苷酸，其中位於該T細胞刺激路徑中之該蛋白質為位於TNFR/TLR受體(TRAF/NF-kB)路徑中之一蛋白質或其一片段。
  15. 如請求項3之聚核苷酸，其中位於該T細胞刺激路徑中之該蛋白質為位於細胞介素受體(JAK-STAT)路徑中之一蛋白質或其一片段。
  16. 如請求項3之聚核苷酸，其中位於該T細胞刺激路徑中之該蛋白質為位於MAP激酶路徑中之一蛋白質或其一片段。
  17. 如請求項16之聚核苷酸，其中位於該MAP激酶路徑中之該蛋白質為選自由以下組成之群的任一者：GADD45α、CDC42及HRAS。
  18. 如請求項3之聚核苷酸，其中參與抑制負反饋的該蛋白質為參與抑制細胞介素訊號傳遞路徑之負反饋的一蛋白質或其一片段。
  19. 如請求項18之聚核苷酸，其中參與抑制細胞介素訊號傳遞路徑之負反饋的該蛋白質為一SOCS1蛋白質之一C端域。
  20. 如請求項1之聚核苷酸，其中該訊號傳遞路徑調節物具有以下結構式(I)： N'-X-L1-Y-C'   (I) 其中，在該結構式(I)中， N'為一融合蛋白質之一N端， C'為一融合蛋白質之一C端， L1為一自裂解肽，及 X及Y中之每一者可為選自由以下組成之群的任一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之一蛋白質或其一片段；b)一免疫親和素或其一片段；c)參與抗原損失介導之復發的一蛋白質或其一片段；d)位於T細胞刺激路徑中之一蛋白質或其一片段；及e)參與抑制負反饋的一蛋白質或其一片段。
  21. 如請求項1之聚核苷酸，其中該訊號傳遞路徑調節物具有以下結構式(II)： N'-X-L1-Y-L2-Z-C'   (II) 其中，在該結構式(II)中， N'為一融合蛋白質之一N端， C'為一融合蛋白質之一C端， L1為一自裂解肽，及 X、Y及Z中之每一者可為選自由以下組成之群的任一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之一蛋白質或其一片段；b)一免疫親和素或其一片段；c)參與抗原損失介導之復發的一蛋白質或其一片段；d)位於T細胞刺激路徑中之一蛋白質或其一片段；及e)參與抑制負反饋的一蛋白質或其一片段。
  22. 如請求項1之聚核苷酸，其中該訊號傳遞路徑調節物包括一FKBP12蛋白質或其一片段、親環蛋白A及一SHP2蛋白質之一N端SH2域或其一片段。
  23. 如請求項1之聚核苷酸，其中該抗原結合域特異性結合至選自由以下組成之群的任一抗原：α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、包括EGFR及ErbB2 (HER2)之EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂肌醇蛋白聚醣-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、路易斯-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配位體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活素、TAG72、TEMs、VEGFR2及WT-1。
  24. 如請求項1之聚核苷酸，其中該抗原結合域特異性結合至CD19。
  25. 如請求項1之聚核苷酸，其中該抗原結合域係由SEQ ID NO: 3所表示之胺基酸序列組成。
  26. 如請求項1之聚核苷酸，其中該跨膜域衍生自選自由以下組成之群的任一者：T細胞受體、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、AMN及PD-1。
  27. 如請求項1之聚核苷酸，其中該跨膜域衍生自CD8α。
  28. 如請求項1之聚核苷酸，其中該跨膜域由SEQ ID NO: 5所表示之胺基酸序列組成。
  29. 如請求項1之聚核苷酸，其中該胞內訊號傳遞域包括一共刺激域及一初級訊號傳遞域。
  30. 如請求項29之聚核苷酸，其中該共刺激域衍生自選自由以下組成之群的至少一個分子：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM及ZAP70。
  31. 如請求項24之聚核苷酸，其中該共刺激域衍生自CD137 (4-1BB)。
  32. 如請求項29之聚核苷酸，其中該共刺激域由SEQ ID NO: 7所表示之胺基酸序列組成。
  33. 如請求項29之聚核苷酸，其中該初級訊號傳遞域衍生自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。
  34. 如請求項33之聚核苷酸，其中該初級訊號傳遞域衍生自CD3ζ。
  35. 如請求項29之聚核苷酸，其中該初級訊號傳遞域由SEQ ID NO: 9所表示之胺基酸序列組成。
  36. 如請求項1之聚核苷酸，其中該自裂解肽衍生自P2A、E2A、F2A或T2A。
  37. 如請求項1之聚核苷酸，其中該自裂解肽為P2A。
  38. 一種表現載體，其包含如請求項1至37中任一項之聚核苷酸。
  39. 如請求項38之載體，其中該載體進一步包含編碼一訊號肽之一序列。
  40. 如請求項39之載體，其中編碼一訊號肽之該序列係在編碼一抗原結合域之一序列之前插入。
  41. 一種病毒，其包含如請求項1至37中任一項之聚核苷酸。
  42. 一種免疫細胞，該免疫細胞中引入如請求項1至37中任一項之聚核苷酸。
  43. 如請求項42之免疫細胞，其中該免疫細胞為一T細胞或一自然殺手細胞。
  44. 一種聚核苷酸，其包括以下(i)至(v)： (i)編碼一抗原結合域之一聚核苷酸； (ii)編碼一跨膜域之一聚核苷酸； (iii)編碼包括至少一個共刺激域之一胞內訊號傳遞域的一聚核苷酸； (iv)編碼一內部核糖體進入位址(Internal Ribosome Entry Site，IRES)之一聚核苷酸；及 (v)編碼一訊號傳遞路徑調節物之一聚核苷酸。
  45. 一種表現載體，其包含如請求項44之聚核苷酸。
  46. 一種病毒，其包含如請求項44之聚核苷酸。
  47. 一種免疫細胞，該免疫細胞中引入如請求項44之聚核苷酸。
  48. 一種編碼一融合蛋白質的聚核苷酸，該融合蛋白質包含以下(i)至(iv)： (i)一抗原結合域； (ii)一跨膜域； (iii)包括至少一個共刺激域之一胞內訊號傳遞域；及 (iv)一訊號傳遞路徑調節物。
  49. 如請求項48之聚核苷酸，其中一間隔子進一步包含於(i)該抗原結合域與(ii)該跨膜域之間。
  50. 如請求項48之聚核苷酸，其中該訊號傳遞路徑調節物為位於T細胞刺激路徑中之一蛋白質。
  51. 如請求項50之聚核苷酸，其中位於該T細胞刺激路徑中之該蛋白質為位於TNFR/TLR受體路徑中之一蛋白質或其一片段。
  52. 如請求項51之聚核苷酸，其中位於該TNFR/TLR受體路徑中之該蛋白質為一TLR4胞內域。
  53. 如請求項50之聚核苷酸，其中位於該T細胞刺激路徑中之該蛋白質為位於細胞介素受體(JAK-STAT)路徑中之一蛋白質或其一片段。
  54. 如請求項51之聚核苷酸，其中位於該細胞介素受體(JAK-STAT)路徑中之該蛋白質為γc。
  55. 一種表現載體，其包含如請求項48至54中任一項之聚核苷酸。
  56. 如請求項55之載體，其進一步包含編碼一訊號肽之一序列。
  57. 如請求項54之載體，其中編碼一訊號肽之該序列係在編碼一抗原結合域之一序列之前插入。
  58. 一種病毒，其包含如請求項48至54中任一項之聚核苷酸。
  59. 一種免疫細胞，該免疫細胞中引入如請求項48至54中任一項之聚核苷酸。
  60. 如請求項59之免疫細胞，其中該免疫細胞為一T細胞或一自然殺手細胞。
  61. 一種經轉型免疫細胞，其特徵在於該經轉型免疫細胞表現外部引入的一訊號傳遞路徑調節物。
  62. 如請求項61之經轉型免疫細胞，其中該免疫細胞為一T細胞或一NK細胞。
  63. 如請求項61之經轉型免疫細胞，其中該免疫細胞為一CAR-T細胞或一TCR T細胞。
  64. 如請求項61之經轉型免疫細胞，其中該訊號傳遞路徑調節物係選自由以下組成之群的至少一者：a)位於免疫抑制訊號傳遞路徑中之一蛋白質、b)參與抗原損失介導之復發的一蛋白質、c)位於T細胞刺激路徑中之一蛋白質、d)參與抑制負反饋的一蛋白質及e)其一組合。
  65. 如請求項64之經轉型免疫細胞，其中該訊號傳遞路徑調節物為選自由以下組成之群的任一者：一FKBP12蛋白質或其一片段；一SMAD4蛋白質之C端處的一MH2域或其一片段；N-SKI或其一片段；親環蛋白A (CYPA)或其一片段；一SHP-1蛋白質之N端處的一SH2域或其一片段；一SHP-2蛋白質之N端處的一SH2域或其一片段；TC21或其一片段；RhoG或其一片段；NCK1或其一片段；LAT或其一片段；NEMO或其一片段；一TLR4細胞域或其一片段；GADD45α或其一片段；CDC42或其一片段；HRAS或其一片段；及SOCS1之一C端域或其一片段。
  66. 如請求項63之經轉型免疫細胞，其特徵在於該CAR-T細胞表現包含以下之一融合蛋白質：(i)一抗原結合域；(ii)一跨膜域；及(iii)包含至少一個共刺激域的一胞內訊號傳遞域。
  67. 如請求項61之經轉型免疫細胞，其中該訊號傳遞路徑調節物在該細胞質中起作用。
  68. 一種用於治療或預防癌症之醫藥組合物，其包含如請求項42之經轉型免疫細胞或如請求項61之經轉型免疫細胞作為一活性成分。
  69. 如請求項68之醫藥組合物，其中該癌症為選自由以下組成之群的任一者：胃癌、肝癌、肺癌、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、白血病、急性骨髓性白血病、腦瘤、神經胚細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌、淋巴瘤、腎癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、腦癌、骨肉瘤、神經膠母細胞瘤、IgG-調理化腫瘤、淋巴瘤、神經瘤、間皮瘤及食道癌。
  70. 一種用於治療或預防癌症之方法，其包含： 向一個體投與如請求項42之經轉型免疫細胞或如請求項61之經轉型免疫細胞。
  71. 一種如請求項42之經轉型免疫細胞或如請求項61之經轉型免疫細胞的用途，其用於治療癌症。
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