KR20090129657A - 간 성장인자 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주(Adult stem cell) 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 간 성장인자(Hepatocyte Growth Factor; HGF) 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기 세포주(Mesencymal stem cell; MSC) 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 성체 줄기 세포주를 포함하는 간 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포, 간 성장인자, 간질환, 간경화

Description

간 성장인자 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주{AN ADULT STEM CELL TRANSFECTED HEPATOCYTE GROWTH FACTOR GENE}

본 발명은 특정 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 간 성장인자(HGF) 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기 세포주(MSC) 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 성체 줄기 세포주를 포함하는 간 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV) 감염과 같은 원인에 의한 간염 증세가 6개월 이상 지속되고, 생화학적 검사와 혈청학적 검사의 개선이 없으면 만성형이라고 부른다. 만성형은 다시 만성 지속성 간염과 만성 활동성 간염으로 구분되는데, 만성 활동성 간염은 간 조직의 손상이 점진적으로 진행되어 간경화, 간기능 부전, 치사에 이르게 된다. 간염 바이러스에 의한 만성 간염은 간경화로 이환되는 비율이 높고 여기에서 더 진전되면 간세포 암으로 발전한다.

B형 간염 바이러스는 (Hepatitis B Virus; 이하 'HBV')는 전 세계적으로 약 3억 명 이상이 감염되어 있는 것으로 알려져 있으며, 궁극적으로 급성 및 만성 감염, 간경변증, 간세포암 등을 일으켜, 만성 질환 이환률 및 사망률을 증가시키는 질환이다. B 형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg) 양성률은 지역마다 큰 차이가 있어서, 미국의 경우 0 내지 3%에 불과한 것으로 조사되었으나, 예방 접종이 본격적으로 시행되기 전 중국 대만과 일본을 포함한 동북아시아에서는 8 내지 10 %에 달했던 것으로 알려져 있다 (Zeng G, et al., Geographic distribution, virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in China. J Viral Hepat. 2005).

국내의 만성 HBV 감염 환자는 1983년부터 적극적인 예방접종 사업이 시작된 이래로 점차 줄어들고 있는 실정이며, 1990년대 이후에 발표된 여러 문헌을 종합해 볼 때, 대략적으로 5.1 내지 7.5 % 정도의 HBsAg 양성률을 보이는 것으로 나타났다 (Lee DH et al., Epidemiological findings of hepatitis B infection based on 1998 National Health and Nutrition Survey in Korea. J Korean Med Sci.2002;17(4):457-62). 그러나, 아직까지 우리나라는 HBV 만연지역으로서, 미국 및 유럽 선진국에 비해 10 배 이상의 높은 유병률을 보이고 있다. 또한 대부분의 감염시기는 성인기에 비해 임상경과가 불량한 5세 미만에 집중되어 있다. 2007년 우리나라에서 바이러스성 간염, 간경변증 및 간암 등의 만성 간질환에 의한 사망률은 전체 사망의 8.5% (남자 12.0%, 여자 4.0%)를 차지하고 있는 실정이다. 따라서 우리나라에서 만성 간질환의 주된 원인인 B 형 간염은 양적, 질적으로 모든 감염 질환 중에서 국민건강에 가장 큰 위해를 주는 질병이라 할 수 있다.

간염 바이러스에 의해 유발되는 만성 간염은 간경화로 이환되는 비율이 높고 여기에서 더 진전되면 간세포암으로 발전하기도 하는데, 간경화의 원인은 다양하며 예를 들면, 바이러스 감염, 기생충, 후천성 매독, 음주, 약물이나 화학물질의 독성, 담관 폐쇄, 울혈, 혈색소증, 윌슨병일 수 있다. 이처럼 여러 가지 원인에 의하여 간경화로 진행되면 간실질 조직세포가 손실되고, 혈관 만곡을 동반하는 망상조직의 허탈과 섬유조직 증식, 그리고 잔류 간세포의 증식과 광범위하게 분포된 결체 조직의 증식과 같은 현상이 일어나며, 점진적으로 간 세포가 위축되게 된다.

간질이 증식하는 한편 실질에는 괴사와 재생이 일어나 간은 정상적인 구조를 잃고 소엽이 결체조직 증식에 의해 분할되거나 합병 등으로 개출되는 간 질환은 개출에 의해 문맥에서 중심 정맥의 혈류로를 방해하게 되어 순환장애를 일으키게 되고, 문맥압 항진증을 유발하여 복수, 방측 순환(식도정맥류 또는 제 정맥의 확장으로 소위 메두사 머리를 형성함), 비종대 등을 일으킨다. HBV 양성의 간경화 결절은 증식 패턴이 긴밀한 세포로 구성되고, 전암 상태라 볼 수 있는 단계에서 이미 클론 같은 세포군이 존재하는 것이 보인다. 그러나 이 상태에서는 암의 시발 (initiation)에 관련되는 유전자의 이상은 없다.

HBV는 간암의 주된 원인체로서, 미국의 경우는 전체 원발성 간암의 약 50% 정도가 HBV에 의해 발생 된다고 알려져 있다. 우리나라의 경우에는, 각 지역 마다 약간의 차이는 보이나, 전반적으로 원발성 간암의 약 75 내지 78%가 HBV에 의해 유발된다고 알려져 있으며, 이는 미국 등의 선진국과 비교하여 매우 높은 비율이다 (Cheon JH et al., The clinical report of 1,078 cases of hepatocellular carcinomas: National Cancer Center experience. Korean J Hepatol. 2004;10(4):288-97).

HBV에 의한 B형 만성간염의 치료에 사용되고 있는 약제에는 작용기전에 따라 항바이러스 제제와 면역 증강제가 있다. 항바이러스 제제에는 Ara-A, Ara-Amp, 아시클로비어(acyclovir), 서라민(suramin) 등이 있다. B형 만성간염에 대한 새로운 치료법으로, 최근 라미뷰딘(1amivudine, 3TC)이 임상시험에 사용되고 있다. 라미뷰딘은 핵산 유도체로서 경구 항바이러스제이고, HIV (후천성 면역 결핍증 바이러스)의 역전사효소 활성을 특이적으로 저해하여 에이즈치료제로서 1995년부터 구미에서 사용되었다. 라미뷰딘은 최초로 디엔스타스(Dienstas) 등에 의해 B형 만성 간염 환자에게 시험적으로 사용되었는데, 투여 중 HBV DNA가 음성화하고, 19%의 환자에서 ALT치의 정상화되어 지속적인 혈중 HBV DNA의 음성화가 인정되었다. 그러나 라미뷰딘은 약물 자체의 독성 때문에 장기간 사용하기 어려운 단점이 있고, 약의 복용을 중지하면 억제되었던 바이러스의 증식이 계속되어 원래의 상태로 되돌아간다. 최근, 6개월-12개월의 장기간의 라미뷰딘 투여에 대한 저항성을 나타낸 환자에서 이 약물에 대해 내성을 나타내는 HBV 변이주가 출현한다는 사실이 밝혀졌다.

면역증강제인 인터페론도 B형 간염 치료에 사용하고 있으나 그 유효성은 극히 적다. 그러나, 3개월 내지 6개월간 투여가 표준으로 되어 있고, 장기투여시 좀더 유용한 결과가 예상되지만 부작용이 크고 약물 투여를 중단하면 바이러스의 증식이 다시 증가되어 원래 상태로 되돌아간다. B형 만성간염의 치료에 있어서, ALT 치의 개선과 동시에 HBe항원의 음성화가 치료의 지표가 된다. 그러나 그 중에는 혈중 HBe항원이 음성임에도 불구하고, 활동성 간염의 상태가 계속 되는 경우도 있다.

상기와 같이 B형 만성간염 치료에는 많은 의약품이 개발되고 있으나 아직까지는 간경화를 효과적으로 치료할 수 있는 의약이 개발되지 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 간경화를 효과적으로 치료할 수 있는 의약을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 간성장인자 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주를 사용할 경우, 간경화를 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 간 성장인자(Hepatocyte growth factor; HGF) 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포주를 포함하는 간 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 간 성장인자(HGF) 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주에 관한 것이다.

간 성장인자(Hepatocyte growth factor; HGF)는 SF(scatter factor; 산란인자)라고도 하며, 중간엽 간세포(mesenchymal cell)에 의해 생산되는 다기능성 이종이량체 (heterodimer) 폴리펩타이드이다. HGF는 N-말단 핑거 도메인 (finger domain) 및 4개의 크링글 도메인(Kringle domain)을 포함하는 69 kDa의 알파-체인, 및 키모트립신-유사 세린 프로테아제의 프로테아제 도메인과 유사성을 갖는 34 kDa 베타-체인을 포함하는 구조로 이루어져 있다(Nakamura et al., 1989; Donate et al., 1994; Rawlings et al., 2002). 인간 HGF는 생물학적으로 비활성인, 단일 체 인 형태의 728개의 아미노산을 갖는 전구체로 합성되고, R494 잔기가 특이적 혈청 세린 프로테아제에 의해 절단되어 생물학적으로 활성인 HGF가 된다. 활성 HGF는 69kDa의 알파-체인과 34kDa의 베타-체인이 이황화결합으로 연결된 이종이량체이다. 본 발명에서는 이러한 간 성장인자를 성체 줄기 세포주에 도입함으로써, 형질전환된 세포주를 수득하였다. 바람직한 간 성장인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 1에 기재되어 있다.

성체 줄기 세포(adult stem cell)는 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 미분화상태의 세포로서, 상기 성체 줄기 세포주는 골수(bone marrow) 유래, 혈액 유래, 제대혈 유래(Umbilical cord blood-derived), 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래 또는 자궁 유래 일 수 있다. 바람직하게 성체 줄기 세포주는 제대혈 유래 성체 줄기 세포주일 수 있고, 더욱 바람직하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 제대혈(탯줄 혈액) 유래 성체 줄기 세포는 조혈모세포를 다량 함유하고 있을 뿐만 아니라 뼈 속의 골수에서 발견되는 골수세포는 혈액 및 임파구를 생산할 수 있는 조혈모세포(Hematopoietic stem cell)를 비롯하여 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC) 등 여러 종류의 성체 줄기세포를 가지고 있으며, 그 중 중간엽 줄기세포는 체외에서 증식이 용이하며 여러 가지 세포형태(지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포)로 분화 가능한 세포로서(Caplan, A.I., J. Orthop. Res., 9:641-650, 1991; Beresford, J. N., et al., J. Cell Sci., 102:341-351, 1992; Pittenger, M.F., et al., Science, 284:143-147, 1999; Patricia, A. Z., et al., Tissue engineering, 7:211-227, 2001), 유전자 치료와 세포치료에 있어서 유용한 타깃(target)으로 이용될 수 있다(Banfi, A., et al., Exp. Hematology, 28:707-715, 2000).

본 발명에서 사용되는 용어인 '간 성장인자 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주'란 상기 서술한 간 성장인자 유전자를 성체 줄기 세포주에 형질전환시킨 세포주를 의미한다.

성체 줄기 세포들은 미분화 상태로서 분화에 대한 잠재능을 갖고 있다. 그러나 중간엽 줄기 세포를 예로 들면, 중간엽 줄기 세포는 중배엽에서 유래된 다양한 세포로 분화할 수 있기 때문에, 투여된 중간엽 줄기 세포가 반드시 간실질 조직세포로 분화한다고 확신할 수 없는 바 중간엽 줄기 세포 자체를 사용하여 간질환을 치료하는 방법에는 한계가 따른다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 간 실질 세포로의 분화 확률을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과, 본 발명자들은 간 성장인자를 암호화하는 유전자를 중간엽 줄기 세포에 도입할 경우, 형질전환된 중간엽 줄기 세포주가 중간엽 줄기 세포 자체보다 훨씬 높은 확률로 간실질 조질 세포로 분화되고, 간실질 세포와 관련된 단백질이 높은 수준으로 발현 및 분비되는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 본 발명의 바람직한 실시예에서는 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 간 성장인자 유전자가 형질전환된 줄기 세포주를 제조하였다.

본 발명의 구체적인 하나의 양태로서, 간 성장 인자 유전자는 벡터에 클로닝 되어 성체 줄기 세포에 형질전환되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 용어, '벡터'란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 간 성장인자 유전자의 도입을 위해 서열목록의 서열 번호 1에 의한 간 성장인자 유전자를 pMEXneo 플라스미드에 클로닝하여 상기 벡터를 성체 줄기 세포주에 형질전환시켰다. 바람직하게 상기 벡터가 삽입된 성체 줄기 세포주는 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포주일 수 있다.

본 발명의 '유전자가 도입된 성체 줄기 세포'에서 유전자 도입은 형질전환 방법을 이용한다. 상기 간 성장인자 유전자를 도입하기 위한 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.

'형질전환'이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전 법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 실시예에서는 네오마이신 (neomycin) 내성을 갖는 pMEXneo에 HGF가 클로닝된 pMEX-HGF 벡터를 리포펙타민2000 (Lipofectamine2000 (Invitrogen))을 이용하여 유전자를 형질전환시켰다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 간 성장 인자 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주의 제조방법에 관한 것이다.

상기 서술한 바와 같이 간 성장인자 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주는 그 종류가 제한되지 않으며, 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 분화능을 가진 세포주이면 어떠한 세포주라도 본 발명의 세포주가 될 수 있다. 바람직하게 성체 줄기 세포주는 골수(bone marrow) 유래, 혈액 유래, 제대혈 유래(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell), 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래 또는 자궁 유래 일 수 있다. 더욱 바람직하게 성체 줄기 세포주는 제대혈 유래 성체 줄기 세포주이다.

특정 유전자를 줄기 세포주에의 도입하는 것은 형질전환의 방법을 이용한다. 상기 서술한 바와 같이 형질 전환의 방법은 당업계에서 통상적으로 이용되는 공지의 방법에 따라 제한 없이 사용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상 기 pMEX-HGF 벡터를 리포펙타민을 이용하여 형질전환된 세포주를 제조하였고, hHGF 유전자 도입시 함께 도입된 GFP (Green fluorescent protein)가 형광 발현하는 것을 형광 현미경으로 관찰하여 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 바람직하게 본 발명에서는 간 성장인자(HGF) 유전자가 도입된 제대혈 유래의 성체 줄기 세포주를 생산하기 위하여 다음과 같은 과정을 거친다.

1. 성체 줄기 세포를 배양하는 단계;

2. 성체 줄기세포에 HGF 유전자를 도입(형질전환)하는 단계;

3. HGF 유전자가 도입된 성체 줄기세포를 선별하는 단계; 및

4. 상기 선별된 성체 줄기세포를 선택적으로 배양하는 단계.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기 성체 줄기 세포 중 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 분리하였으며 상기 분리된 중간엽 줄기세포를 MEM α 배지를 포함하는 배양기에서 배양하며, 7번째 계대 배양된 세포주를 실험에 사용하였다. HGF 유전자로 형질전환하는 단계는 pMEXneo 플라스미드에 HGF가 클로닝된 벡터를 인비트로겐(invitrogen)사의 리포펙타민2000을 이용하여 계대 배양된 세포주에 간 성장 인자를 도입하였다. 간 성장 인자가 성공적으로 도입된 성체줄기 세포주를 선별하기 위하여 RT PreMix Kit(iNtRON)를 이용하여 RT-PCR을 수행 및 역전사 증폭된 cDNA를 수득하여 도입된 간 성장인자의 발현을 유전자 수준에서 확인하였고, 또한 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)사의 ECL를 이용한 웨스턴 블롯(Western blot)을 통하여 HGF 단백질 발현을 확인하였다. 상기 과정을 거쳐 HGF 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포는 줄기 세포 내에 포함된 벡터 상에 네오마이신 (neomycin) 저항성 유전자를 포함하고 있어, 네오마이신이 첨가된 MEM α배지에 키우는 경우 선택적 배양이 가능하게 된다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 간 성장 인자 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주를 포함하는 간질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 목적하는 간질환의 대상은 간 실질 세포의 손상을 가져오는 모든 간 질환을 의미하며, 바람직하게는 만성 및 급성인 A형, B형, C형 간염, 간경화, 간경변, 및 지방간 등이 있다. 더욱 바람직하게 간 질환은 B형 간염 바이러스에 의하여 유래된 간경화 환자의 치료에 효과적일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어인 '치료 또는 예방'이란 간 성장 인자 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주를 이용함으로써 간 질환과 관련된 모든 질병의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, '치료'란 상기 세포주를 사용하여 간 질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 바람직하게 본 발명의 형질전환된 줄기세포를 이용하여 B형 간염 바이러스에 의한 간경화 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 간질환 환자에게 투여하여 간질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 멸균 주사용액의 형태, 연고제 등의 외용제, 좌제 등으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이러한 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 경구, 정맥내, 피하, 피내, 비강내, 복강내, 근육내, 경피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 간 성장 인자를 암호화하는 유전자로 형질전환된 성체 줄기세포를 이용하여, 간경화 증상을 효과적으로 치료할 수 있으므로, 간경화를 비롯한 각종 간질환을 가진 환자에게 효과적인 치료제로 널리 활용될 수 있다.

이하 본 발명에 관해 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 중간엽줄기세포( Mesenchymal Stem Cell ; MSC )의 배양

중간엽줄기세포는 플라스틱 어드히런스(plastic adherence)가 첨가된 밀도 구배 원심 분리를 이용하여 분리된, 사람의 제대혈(human umbrical cord blood; HUCB)에서 유래된 중간엽줄기세포를(HUCB-derived MSCs) 10% 우태혈청(Fetal bovine serum; FBS), 4 nmol/L L-글루타민 (L-glutamine), 100 IU/mL 페니실린(penicillin), 100 mg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin)이 첨가된 MEM α (Minimum Essential Medium Alpha) 배지에서 5% CO₂를 포함하는 37℃ 인큐베이터(incubator) 안에서 배양하였다. 사람의 제대혈 유래 중간엽줄기세포(HUCB-derived MSCs)는 메디포스트(Medipost)에서 구입하여 배양한 후, 6번째 계대 배양으로 저장(stock)하여 사용하였다.

제대혈을 분리하여 원심분리 후, 상층액을 제거하고 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)를 넣고 세포를 풀어준 후, 다시 원심분리하였다. 그 후 ACK buffer로 실온에서 2분간 두고, ACK buffer의 5배 정도의 배지를 넣고 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 LIF buffer를 넣고 1분 후에 배지(media)를 넣고 여과(filtering)하여 원심분리 후 배양하였다.

중간엽 줄기 세포의 배양은 매 2일 마다 새로운 배양액으로 바꾸어 주면서 5일 동안 배양하였다. 세포가 배양용기에 70% 차게 되면 0.25% 트립신(trypsin)과 1 mM EDTA를 이용하여 배양용기에서 떼어낸 후, 새로운 배양용기에 계대 배양하였다. 계대 배양된 세포들이 7번째 계대 배양이 되었을 때 실험에 사용되었으며, 나 머지 세포는 10% DMSO가 포함된 배양액에서 서서히 냉동시킨 후, -150℃에 보관하였다.

실시예 2: 간성장인자 ( HGF ) 유전자의 도입

실험에 사용된 HGF(Hepatocyte growth factor)는 사람에서 유래된 HGF(human HGF; hHGF)를 사용하였으며, 사람의 제대혈로부터 유래한 중간엽줄기세포(HUCB-derived MSCs)의 7번째 계대 배양 세포에 네오마이신(Neomycin)에 내성을 갖는 pMEXneo 플라스미드 및 pMSCV 플라스미드 내 HGF가 클로닝된 pMEX-HGF 및 pMSCV-HGF를 리포펙타민2000 (Lipofectamine2000 (Invitrogen))을 이용하여 유전자를 도입시켰다. HGF 유전자가 도입된 중간엽 줄기 세포를 확인하기 위하여 유전자 도입시 함께 도입된 GFP(Green Fluorescent protein) 단백질이 형광 발현하는 것을 형광현미경으로 관찰하였다.

2-1. pMEX-HGF의 제조방법

pMEXneo 벡터(도 1)의 MCS (multiple cloning site) 내의 제한 부위(restriction site) 중 적절한 부분을 선택하여 제한효소로 자른 후, hHGF 유전자 역시 같은 제한효소로 잘라 벡터에 삽입하였다. 이렇게 hHGF 유전자가 삽입된 벡터를 증폭시킨 후, 제한효소를 처리하여 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동 하여 유전자의 삽입을 확인하였다. 증폭시 발생하는 벡터의 돌연변이 (mutation) 여부를 확인하기 위하여 유전자의 중간에 적당한 부분을 골라 시퀀싱 프라이머(sequencing primer)를 제작하였다. 상기 프라이머를 이용하여 시퀀싱(sequencing) 한 후, 아미노산으로 정렬(alignment)시켜 원 벡터 내에 삽입되어있는 hHGF 유전자와의 동일성 여부를 확인하였다. 최종적으로 클론 DNA(clone DNA)와 DH5a 세포 스톡(cell stock)을 제조하였다.

2-2. pMSCV-HGF의 제조방법

상시 2-1의 pMEXneo 벡터와 동일하게, pMSCV 벡터(도 2)를 플라스미드를 제한효소로 절단하여 hHGF 유전자를 벡터에 삽입한 뒤, 증폭, 아가로스 겔에 전기영동 하여 유전자 도입을 확인하였으며, 돌연변이 여부를 확인하기 위하여 유전자 시퀀싱을 위한 프라이머를 제작하였다. 상기 프라이머를 이용하여 시퀀싱 한 후, hHGF 유전자와의 동일성 여부를 확인하였다.

2-3. 리포펙타민(Lipofectamin)을 이용하여 유전자를 도입시키는 방법

pMEX-HGF 및 pMSCV-HGF 각각에 대해, 4㎍과 리포펙타민 시약(reagent) 12㎕를 각각 Opto-MEM1 (Invitrogen) 500㎕에 희석하여 5분간 배양한 후, 두 개를 혼합하여 20분간 더 배양하였다. 배양 결과, DNA 벡터와 시약이 혼합된 리포플렉스(lipoplex)가 형성되었으며, 이를 무혈청 배지(serum free medium)상의 중간엽 줄기 세포에 6시간 처리한 뒤, 10% FBS가 첨가된 배지로 바꿔준 후, 24시간 후 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.

실시예3 : RT - PCR ( Reverse - Transcription Polymerase Chain Reaction )을 통한 HGF 유전자의 발현 여부 확인

세포로부터 얻어진 총 RNA 시료를 Maxime RT PreMix Kit(iNtRON)를 이용하여 역전사 시켜 cDNA를 얻은 후, HGF (426 bp)에 특이적인 프라이머(primer)를 이용하여 PCR를 수행하였다. 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

5'-ATGATGATGCTCATGGACCCT-3' (forward primer), 서열번호 2

5'-CTGGCAAGCTTCATTAAAACC-3' (reverse primer), 서열번호 3

pMEX-HGF 및 pMSCV-HGF의 벡터 각각에 의해 세포에 HGF를 도입시킨 후, HGF 유전자가 도입되어 발현하는지를 확인하기 위해서 도입시킨 세포로부터 RNA를 수득한 후, RT-PCR을 수행하여 대조군(control)과 비교하였다. 배양한 세포를 PBS로 세척하고 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)로 처리하여 세포를 떼어낸 후, 원심분리하여 세포를 모아 Total RNA Extraction kit(iNtRON)를 이용해 RNA를 추출하였고, 추출한 RNA는 Maxime RT PreMix Kit(iNtRON)을 이용하여 45℃에서 1시간 cDNA 합성 후, 역전사효소(Reverse transcriptase; RTase)의 불활성화를 중단시켜 95℃에서 5분간 RT-PCR을 수행했다.

시료들은 변성(denaturation) (95℃, 30초), 풀림(annealing) (57℃, 30초), 합성(synthesis) (72℃, 30초)의 조건에서 35 사이클(cycle) 증폭시켰으며, RT-PCR로 얻어진 증폭된 cDNA는 저-분자량 DNA 마커(low-molecular weight DNA marker) (100bp, Bioneer)를 사용하여 1.5% 아가로스 겔 (agarose gel) 상에서 확인하였다(도 3).

실시예 4: 웨스턴블롯(Western blot)을 통한 HGF 단백질의 발현 여부 확인

HGF를 처리한 hMSC(human Mesenchymal stem cell)와 HGF를 처리하지 않은 hMSC 세포를 트립신-EDTA를 이용하여 수득한 후 단백질을 확보하였다. 샘플(Sample)은 50㎍의 단백질이 포함되도록 제조하였다. 샘플의 양과 동량으로 2x 샘플 버퍼(sample buffer) [0.125M Tris (pH 6.8), 6% SDS, 20% 글리세롤(glycerol), 0.02% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 1.44mM ß-머캅토에탄올(ß-mercaptoethanol)]을 넣은 뒤 98℃에서 5분간 끓이고 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel)에서 분리하였다. NC membrane (Nitrocellulose membrane, Bio-rad Laboratories)에 옮긴 뒤 TBST [50mM Tris (pH 7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween 20]에 녹인 5% 스킴 밀크(skim milk)에 넣어 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 1차 항체(Primary antibody)를 사용하여 5% 스킴 밀크에 1: 200으로 희석한 뒤 2시간 동안 상온에서 반응시키고, TBST로 10분 동안 4번 세척하였다. 그리고 2차 항체(secondary antibody)를 사용하여 5% 스킴 밀크에 1:10000으로 희석하여 60분 동안 반응시키고, 다시 TBST로 10분 동안 4번 세척하였다. ECL (Amersham Pharmacia)을 사용하여 항원-항체 (Antigen-antibody)의 특이적 반응을 확인하였다(도 4).

실시예 5: HGF 유전자 도입된 중간엽 줄기 세포의 선택적 배양

HGF유전자 도입된 중간엽 줄기 세포는 400 ng/mL의 네오마이신(Neomycin)을 사용하여 10% 우태 혈청(FBS), 4 nmol/L L-글루타민, 100 IU/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신이 첨가된 MEM α 배지에서 5% CO₂를 포함하는 37℃ 인큐베이터(incubator) 안에서 선택적으로 배양하였다.

실시예 6: HGF 유전자 도입된 중간엽 줄기 세포의 HGF 단백질 분비

간 성장인자를 암호화하는 유전자를 중간엽 줄기 세포에 도입할 경우, 형질전환된 중간엽 줄기 세포주가 간실질 세포와 관련된 HGF 단백질이 높은 수준으로 발현 및 분비되는 것을 확인하였다. ELISA 방법에 의하여 HGF 단백질을 측정하였을 때에 Control은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주 자체로서 32 ng/mL. pGFP3은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 pGFP3를 도입한 것이며 35 ng/ml, pMEX-HGF은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 HGF 유전자가 포함된 pMEX-HGF를 도입한 것이고 240 ng/ml, pMSCV-HGF은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 HGF 유전자가 포함된 pMSCV-HGF를 도입한 것으로 290 ng/ml의 HGF 단백질을 분비하였다.

도 1은 네오마이신(neomycin) 저항성을 나타내며 제한효소 부위를 가지는, 간 성장인자 유전자(Hepatocyte growth factor; HGF)를 도입하기 위한 플라스미드 벡터(pMEXneo)를 도시한 것이다.

도 2는 간성장인자 유전자(HGF)를 도입하기 위한 플라스미드 벡터(pMSCV)를 도시한 것이다.

도 3은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 도입된 HGF 유전자를 RT-PCR로 증폭한 뒤, 수득한 cDNA를 저-분자량 DNA 마커(100bp, Bioneer)를 사용하여 1.5% 아가로스 겔 상에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. Control은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주자체이며, pGFP3은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 pGFP3를 도입한 것이며, pMEX-HGF은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 HGF 유전자가 포함된 pMEX-HGF를 도입한 것이고, pMSCV-HGF은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 HGF 유전자가 포함된 pMSCV-HGF를 도입한 것이다. β-actin은 대조군으로서 동량의 RNA로부터 HGF가 발현되었다는 것을 표시하는 것이다.

도 4는 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 도입된 HGF 유전자의 단백질 발현을 보기 위하여 세포주로부터 단백질을 추출한 뒤에 웨스턴 블롯팅으로 HGF 단백질 발현을 측정한 것이다. Control은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주 자체이며, pGFP3은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 pGFP3를 도입한 것이고, pMEX-HGF은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 HGF 유전자가 포함된 pMEX-HGF를 도입한 것이며, pMSCV-HGF은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 HGF 유전자가 포함된 pMSCV-HGF를 도입한 것이다. β-actin은 대조군으로서 동량의 단백질로부터 HGF 단백질이 발현되었다는 것을 표시하는 것이다.

도 5는 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 도입된 HGF 유전자의 단백질 발현을 세포 배양액에 존재하는 분비 단백질의 측정으로 분석한 것이다. ELISA 방법에 의하여 세포주에서 분비되는 HGF 단백질을 측정하였다. Control은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주 자체이며, pGFP3은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 pGFP3를 도입한 것이고, pMEX-HGF은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 HGF 유전자가 포함된 pMEX-HGF를 도입한 것이며, pMSCV-HGF은 제대혈 유래 성체 줄기 세포주에 HGF 유전자가 포함된 pMSCV-HGF를 도입한 것이다.

<110> NAM, Myeong Jin Han Cell <120> AN ADULT STEM CELL TRANSFECTED HEPATOCYTE GROWTH FACTOR GENE <130> PA080195/KR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2820 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(2820) <223> human HGF(Hepatocyte Growth Factor) <400> 1 gggagttcag acctagatct ttccagttaa tcacacaaca aacttagctc atcgcaataa 60 aaagcagctc agagccgact ggctctttta ggcactgact ccgaacagga ttctttcacc 120 caggcatctc ctccagaggg atccgccagc ccgtccagca gcaccatgtg ggtgaccaaa 180 ctcctgccag ccctgctgct gcagcatgtc ctcctgcatc tcctcctgct ccccatcgcc 240 atcccctatg cagagggaca aaggaaaaga agaaatacaa ttcatgaatt caaaaaatca 300 gcaaagacta ccctaatcaa aatagatcca gcactgaaga taaaaaccaa aaaagtgaat 360 actgcagacc aatgtgctaa tagatgtact aggaataaag gacttccatt cacttgcaag 420 gcttttgttt ttgataaagc aagaaaacaa tgcctctggt tccccttcaa tagcatgtca 480 agtggagtga aaaaagaatt tggccatgaa tttgacctct atgaaaacaa agactacatt 540 agaaactgca tcattggtaa aggacgcagc tacaagggaa cagtatctat cactaagagt 600 ggcatcaaat gtcagccctg gagttccatg ataccacacg aacacagctt tttgccttcg 660 agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcctcgagg ggaagaaggg 720 ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag 780 tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat ggggagagtt atcgaggtct catggatcat 840 acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcatcaga caccacaccg gcacaaattc 900 ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt gatgataatt attgccgcaa tcccgatggc 960 cagccgaggc catggtgcta tactcttgac cctcacaccc gctgggagta ctgtgcaatt 1020 aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac aactgaatgc 1080 atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata ccatttggaa tggaattcca 1140 tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca tgactcctga aaatttcaag 1200 tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg ggtctgaatc accctggtgt 1260 tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc aaattccaaa ctgtgatatg 1320 tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt atatgggcaa cttatcccaa 1380 acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg gacaagaaca tggaagactt acatcgtcat 1440 atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt actgccgaaa tccagatgat 1500 gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca ttccttggga ttattgccct 1560 atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca atttagacca tcccgtaata 1620 tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt gtaaatggga ttccaacacg aacaaacata 1680 ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat aaacatatct gcggaggatc attgataaag 1740 gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttcccttctc gagacttgaa agattatgaa 1800 gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga agaggagatg agaaatgcaa acaggttctc 1860 aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggatcagatc tggttttaat gaagcttgcc 1920 aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt tacctaatta tggatgcaca 1980 attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct acactggatt gatcaactat 2040 gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa atgagaaatg cagccagcat 2100 catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg ctggggctga aaagattgga 2160 tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt gtgagcaaca taaaatgaga 2220 atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca ttccaaatcg tcctggtatt 2280 tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg atacacaaaa ttattttaac atataaggta 2340 ccacagtcat agctgaagta agtgtgtctg aagcacccac caatacaact gtcttttaca 2400 tgaagatttc agagaatgtg gaatttaaaa tgtcacttac aacaatccta agacaactac 2460 tggagagtca tgtttgttga aattctcatt aatgtttatg ggtgttttct gttgttttgt 2520 ttgtcagtgt tattttgtca atgttgaagt gaattaaggt acatgcaagt gtaataacat 2580 atctcctgaa gatacttgaa tggattaaaa aaacacacag gtatatttgc tggatgataa 2640 agatttcatg ggaaaaaaaa tcaattaatc tgtctaagct gctttctgat gttggtttct 2700 taataatgag taaaccacaa attaaatgtt attttaacct caccaaaaca atttatacct 2760 tgtgtcccta aattgtagcc ctatattaaa ttatattaca tttcaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 2820 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for hHGF <400> 2 atgatgatgc tcatggaccc t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for hHGF <400> 3 ctggcaagct tcattaaaac c 21

Claims (10)

1. 간 성장인자 유전자(Hepatocyte growth factor, HGF)가 도입된 성체 줄기 세포주.
2. 제1항에 있어서, 상기 성체 줄기 세포주는 골수 유래, 혈액 유래, 제대혈 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래 및 자궁 유래로 구성된 군으로부터 선택된 것인 성체 줄기 세포주.
3. 제1항에 있어서, 상기 간 성장인자 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 성체줄기 세포주.
4. 제1항에 있어서, 간 성장인자 유전자를 포함하는 벡터에 의해 도입된 성체 줄기 세포주.
5. 제4항에 있어서, 상기 벡터는 도 1 또는 도 2의 개열 지도를 가지는 것인 성 체 줄기 세포주.
6. 제1항에 있어서, 상기 성체 줄기 세포주는 중간엽 줄기 세포주인 성체 줄기 세포주.
7. 성체 줄기세포를 배양하는 단계; 성체 줄기세포에 HGF 유전자를 도입하는 단계; HGF 유전자가 도입된 성체 줄기 세포를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 줄기 세포를 선택적으로 배양하는 단계를 포함하는 성체 줄기 세포주의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 성체 줄기 세포주는 골수 유래, 혈액 유래, 제대혈 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래 및 자궁 유래로 구성된 군으로부터 선택된 것인 성체 줄기 세포주의 제조방법.
9. 제1항의 성체 줄기 세포주를 포함하는 간 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
10. 제9항의 조성물을 간질환 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 간질환의 치료 또는 예방 방법.

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