CN102899249B - 产生体外血管的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种产生体外血管的装置和方法。一种产生血管的装置，包括：a)与槽入口流体连通的槽通道；b)与源入口流体连通、基本上与槽通道平行的源通道；c)与形成血管的通道入口流体连通的形成血管的通道，其在槽通道和源通道之间设置成与槽通道和源通道的一侧接触，且基本上平行于源通道和槽通道；d)与第一培养通道入口流体连通的第一培养通道，其设置成与槽通道的另一侧接触，且基本上平行于槽通道；和e)与第二培养通道入口流体连通的第二培养通道，其与源通道的另一侧接触，且基本上平行于源通道，其中，多个微结构构造成允许包含在每个通道中的生物化学物质之间相互作用，且以设定的间隔被布置在各个相邻的通道的界面上。

Description

产生体外血管的装置和方法
技术领域
本发明涉及用于产生体外血管的装置和方法。
背景技术
循环系统由血管网络构建，血管网络从细胞和生化传输、营养和氧交换到温度调节起到广泛的作用，同时在生物的整个生存和发育过程中保持一定的塑性。血管的发育、功能和内稳态为多种生理和病理现象的主要构成要素。这样有效的系统的建立基于初级的基础材料，血管内皮细胞(EC)，EC调节经血管输送、血管扩张和血管形成及退化。由于利用如此复杂的任何系统，故障和调节异常可以导致大量疾病。因此，阐明作为血管形成基础的细胞和分子机制对于开发新的治疗干预措施是必要的。
已经开发出大量的体内和体外实验系统来研究血管动力学和血管功能。在2D基体上培养的EC广泛用于屏障功能、内皮的机械敏感响应和包括白细胞与循环肿瘤细胞(CTCs)的血源性细胞的经内皮细胞迁移的研究。然而，这样的2D内皮单层缺少提供信号以诱导细胞类似它们的先天特征的三维环境。此外，没有一种方法已经成功表明，通过整合自然3D形态发生以及通过遍布的血管网络的微循环重组复杂的血管生理机能。体外模型系统可以捕捉在血管形成期间的EC的详细动力学，且可以整合对体内血管的功能特征起作用的重要生理成，该体外模型系统将对血管生物学研究提供了有用的实验平台。此外，就人和动物的生理差别而言，当前体外系统的缺陷预测可能性导致在新药开发过程中的临床试验的失败，反映复杂的血管生理机能的新的体外模型通过提供抗血管原化合物或血管活性化合物的有效的和准确的评估使药剂学受益。
发明内容
技术问题
本发明总体涉及用于体外用3D凝胶产生具有内腔的可灌注的、连接网络状的血管的装置和方法的领域。
技术手段
在本发明的一个示例性实施方式中，一种产生血管的装置，包括：a)槽通道，该槽通道与槽入口流体连通；b)源通道，该源通道与源入口流体连通，该源通道基本上与所述槽通道平行；c)形成血管的通道，该形成血管的通道与形成血管的通道的入口流体连通，该形成血管的通道在槽通道和源通道之间设置成与槽通道的一侧和源通道的一侧接触，该形成血管的通道基本上平行于源通道和槽通道；d)第一培养通道，该第一培养通道与第一培养通道入口流体连通，该第一培养通道设置成与槽通道的另一侧接触，该第一培养通道基本上平行于槽通道；和e)第二培养通道，该第二培养通道与第二培养通道入口流体连通，该第二培养通道设置成与源通道的另一侧接触，该第二培养通道基本上平行于源通道，其中，多个微结构构造成允许包含在每个通道中的生物化学物质之间的相互作用，所述多个微结构以设定的间隔布置在各个相邻的通道的界面上。
本发明的另一示例性实施方式涉及一种产生血管的方法，包括：a)将ECM(细胞外基质)和形成血管的细胞注入产生血管的装置的形成血管的通道中；b)将i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞注入产生血管的装置的第一培养通道和/或第二培养通道中；和c)将血管生成因子和/或细胞培养介质注入产生血管的装置的槽通道和/或源通道中，且培养形成血管的细胞和共培养的细胞。
结合附图和下文的描述将描述本发明的一个或多个实施方式的细节。其它的特征、目的和优点将通过说明书、附图和权利要求书而变得明显。
有益效果
本发明提供了三维地产生体外血管的装置和方法。
附图说明
图1(a)和图1(b)示出产生血管的装置的实施方式。
图2为示出将ECM充入根据实施方式的产生血管的装置的形成血管的通道的机理的示意图。
图3为示出使用根据实施方式的产生血管的装置产生血管的一些方法的示意图。
图4为示出使用根据本发明的用于产生血管的装置和方法的模拟血管生成过程的实验设置和细胞种植配置的示意图。
图5示出通过使用根据本发明的用于产生血管的装置和方法模拟血管生成过程所产生的血管网络的显微图像。
图6为示出使用根据本发明的用于产生血管的装置和方法模拟血管生成过程的实验设置和细胞种植配置的示意图。
图7(a)和图7(b)示出通过使用根据本发明的用于产生血管的装置和方法模拟血管生成过程所产生的另一血管网络和血管生成芽的显微图像。
图8示出产生血管的装置的另一实施方式。
图9示出显示FITC(异硫氰酸荧光素)溶液的荧光显微图像，FITC溶液具有70kDa的分子质量，以及半径为7微米的荧光颗粒，所述溶液被引入通过源通道和槽通道灌注并可直接进入的血管网络。
图10示出通过将调解炎症反应的包括TNF-a和IL-1a的细胞因子引入可灌注的血管网络描述在血管的细胞顶面的ICAM-1表示的增量调节的荧光图像。
图11示出图示了被引入血管网络的癌细胞的荧光图像，该荧光图像模拟了从起始部位散布到血流中的癌细胞，癌细胞粘附并渗入第二转移癌部位的组织中。
具体实施方式
本发明提供了以三维方式产生体外血管的装置和方法。
本发明提供了一种产生血管的装置，包括：a)槽通道，该槽通道与槽入口流体连通；b)源通道，该源通道与源入口流体连通，且基本上与槽通道平行；c)形成血管的通道，该形成血管的通道与形成血管的通道入口流体连通，该形成血管的通道在槽通道和源通道之间设置成与槽通道的一侧和源通道的一侧接触，该形成血管的通道基本上平行于源通道和槽通道；d)第一培养通道，该第一培养通道与第一培养通道入口流体连通，该第一培养通道设置成与槽通道的另一侧接触，该第一培养通道基本上平行于槽通道；和e)第二培养通道，该第二培养通道与第二培养通道入口流体连通，该第二培养通道设置成与源通道的另一侧接触，该第二培养通道基本上平行于源通道，其中，多个微结构构造成允许包含在每个通道中的生物化学物质之间相互作用，这些微结构以设定的间隔被布置在各个相邻的通道的界面上。通过本方法，可以模拟血管生成的过程。
在图1中示出产生血管的装置的实施方式。产生血管的装置400包括与基体160相连的基部145。
基体160包括：与槽通道110相通的槽入口105，槽入口105能够将流体注入槽通道110；和与源通道120相通的源入口115，源入口115能够将流体注入源通道120。另外，基体160包括：与槽通道110相通的槽出口141，槽出口141能够将注入的流体排出槽通道110；和与源通道120相通的源出口142，源出口142能够将注入的流体排出源通道120。图1为示出包括入口和出口的槽通道110和源通道120的示意图。在另一实施方式中，槽通道110和源通道120可以形成一个通道以便互相连通。在该情况下，槽入口105和源入口115可形成一个入口，以及槽出口141和源出口142可形成一个出口。而且，通过槽入口105和源入口115可以注入和排出流体，而不使用分离的槽出口141和源出口142。
此外，基体160包括设置成与槽通道110的一侧和源通道120的一侧接触的形成血管的通道320，形成血管的通道320在槽通道110和源通道120之间，且形成血管的通道320基本上平行于槽通道110和源通道120。另外，基体160包括：设置成与槽通道110的另一侧接触的第一培养通道410，第一培养通道410基本上平行于槽通道110；和设置成与源通道120的另一侧接触的第二培养通道420，第二培养通道420基本上平行于槽通道120。图1为示意图，其示出形成血管的通道320、第一培养通道410和第二培养通道420分别包括入口305、入口405、入口415和出口143、出口441和出口442。然而，可以通过入口注入和排出流体而不使用各自的出口。
槽通道110、源通道120、形成血管的通道320、第一培养通道410和第二培养通道420的相邻界面通过以设定的间隔布置多个微结构450而被分开，使得在每个通道中的生物化学物质可以相互反应。微结构450具有细柱形状，其长度和高度范围在数十至数百微米(μm)之间。多个微结构450可以500μm或小于500μm的间距被布置。根据实验的目的和条件可以适当地确定间距。
产生血管的区域335是通过将i)细胞外基质(ECM)或ii)ECM和形成血管的细胞注入形成血管的通道320而三维地形成的。产生血管的区域335提供了空间，在该空间中形成血管的细胞被三维地增殖和分化以形成血管。由于多个微结构450以设定的间隔被布置在形成血管的通道320与槽通道110和源通道120之间的相邻界面中，当i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞被注入形成血管的通道320时，i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞在形成血管的通道320中形成产生血管的区域325，由于i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞的表面张力，而i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞在微结构450之间没有任何泄漏。同时，由于在每个通道中的各种生物化学物质可以通过多个微结构450之间的间隙流动和扩散，在槽通道110和源通道120中含有的各种血管生成因子和/或营养成分可以被提供至形成血管的通道320。另外，在产生血管的区域335中产生的血管延伸贯穿形成在多个微结构450之间的间隙，以与槽通道110和源通道120连通，由此形成血管的入口/出口且可以使血管灌注有包含在源通道120或槽通道110中的流体。因此，当穿过与多个微结构450之间的间隙连通的槽通道110和源通道120直接传输各种生物化学物质和生物物理物质以及信号进入血管中时，血管的反应可以被实时观测并记录。因此，通过改变设置在形成血管的通道320与槽通道110和源通道120之间的微结构的形状、长度和数量，待产生的血管网络的入口和出口的数量可以被调整。可以理解，例如微结构的形状的各种参数可以被做出改变，而不违背图1中实施方式的范围。因此，其它参数可以在实验的目的和配置的范围内被改变。
图2为示出将i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞注入形成血管的通道的示意图。根据本发明，基体160可以由疏水材料制成。被注入形成血管的通道320的i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞330在多个微结构450之间形成弯月面。在该情况中，当液体弯月面中的压力在一定的压力水平(阈压水平)下时，弯月面由于抵抗的表面张力而没有进入槽通道110的一侧和源通道120的一侧。压力范围受微结构之间的间隙和微结构的高度的影响，在该压力范围中，弯月面可停止在微结构之间而不允许弯月面进入槽通道110的一侧和源通道120的一侧。因此，这两个参数(微结构之间的间隙和微结构的高度)可以被优化以调整阈压力水平。调整阈压力水平的具体方法参见Carlos P.Huang等的文献(Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellularco-cultures，Lab Chip，2009，9，1740-1748)。当i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞被注入形成血管的通道时，弯月面可以通过调整微结构之间的间隙和微结构的高度可以被有效地停留在微结构之间，由此精确地调整i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞注入到没有完全物理上互相分开的通道之间。甚至当i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞被注入第一培养通道和第二培养通道时，这也可以用相同的方式适用。
通过将i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞注入第一培养通道410和第二培养通道420而三维地形成细胞培养区435和细胞培养区445。由于多个微结构450以设定的间隔被布置在第一培养通道410、第二培养通道420与槽通道110和源通道120之间的相邻界面中，当i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞被注入第一培养通道410和第二培养通道420时，由于i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞具有表面张力，故i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞在第一培养通道410和第二培养通道420中形成细胞培养区435和细胞培养区445，而i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞在微结构450之间没有任何泄漏。细胞培养区435和细胞培养区445提供了这样的空间，在该空间中，共培养的细胞可以三维地被培养。该三维多细胞的共培养可更符合生理条件地模拟体内环境，因此可以提高从共培养的细胞生产和分泌的各信号材料。同时，由于在第一培养通道410和第二培养通道420中制得的各信号材料和例如包括在槽通道110和源通道120中的血管生成因子之类的各生物化学物质可以通过多个微结构450之间的间隙扩散，因此可以进行第一培养通道410与槽通道110之间和第二培养通道420与源通道120之间的生物化学物质的活性相互作用。
槽通道110和源通道120提供的通道允许流体的流动。本文中，流体可包括细胞培养介质和各种血管生成因子等。由于槽通道110和源通道120中的每一个被设置在形成血管的通道335与第一培养通道410之间和形成血管的通道335与第二培养通道420之间，因此细胞培养介质和血管生成因子被提供至形成血管的通道335、第一培养通道410和第二培养通道420。以此方式，槽通道110和源通道120提供了这样的通道，通过该通道，在形成血管的通道335、第一培养通道410和第二培养通道420中的两细胞组(形成血管的细胞和共同培养的细胞)可借助旁分泌信号相互作用，以及，形成血管的细胞和共培养的细胞可以被培养较长的一段时间。已知在形成血管的细胞和共培养的细胞之间的旁分泌相互作用用来提高进入血管网络的形成血管的细胞的形态发生。另外，由于形成血管的细胞和共培养的细胞通过槽通道110和源通道120在物理上彼此分开，故形成血管的细胞和共同培养的细胞可以容易地彼此独立地被观测和分析。具体而言，由于槽通道110和源通道120与形成在微结构450之间的间隙处的血管网络的入口/出口连通，因此可以穿过空隙施加多种生物化学物质、生物物理物质和信号进入血管。因此，可以模拟多种生化信号、生物物理信号与血管之间的相互作用，由此实时图像化和量化血管对各种刺激的响应。
当根据本发明的产生血管的装置400用于产生血管时，ECM的种类和特征、形成血管的细胞、细胞培养介质和共培养的细胞与下文所述相同。本发明的一个具体实施方式中，ECM可以为例如选自胶原蛋白凝胶、纤维蛋白凝胶、基质胶、自组装多肽凝胶、聚乙二醇凝胶和藻酸盐凝胶中的至少一种。在该实施方式中使用了纤维蛋白凝胶。ECM可含有选自药品化合物、可溶因子、不可溶因子、生物分子、蛋白质、纳米材料和小干扰核糖核酸(siRNA)中的至少一种，并且量化和评估在血管形成和作用时它们的效果和功效，或估计作为治疗剂时它们的促进血管生成或抗血管生成特征。
在本发明的另一具体实施方式中，形成血管的细胞可以为例如选自内皮细胞、上皮细胞、癌细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞和内皮前驱细胞中的至少一种。形成血管的细胞可以理解成包括突变细胞、其转基因细胞和转染细胞。该实施方式使用了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在本说明书中，术语“形成血管的细胞”指通过包括在细胞培养介质中的诱导血管生成剂或产自共培养的细胞的血管生成因子的相互作用而形成血管的细胞。形成血管的细胞可通过接近地模拟在体内观测到的血管形成过程的血管形成术或血管生成术而形成血管。例如，从各种人体器官分离出的HUVEC、人微血管内皮细胞、人脑微血管内皮细胞和人淋巴内皮细胞之类的血管内皮细胞可以用作形成血管的细胞。不仅从人获取的细胞系，而且从小鼠、大鼠、牛和猪分离出的多种细胞系可以被用作形成血管的细胞。另外，癌细胞可以被用于进行癌生长和转移机制的研究。如上文所述，本领域技术人员可以根据实验的目的适当地选取形成血管的细胞的种类。
在本发明的另一具体实施方式中，本领域中已知的任一细胞培养介质可以被用作细胞培养介质。在该实施方式中使用了EGM-2介质(LONZA)。细胞培养介质可含有选自药物化合物、可溶因子、不可溶因子、生物分子、蛋白质、纳米材料和小干扰核糖核酸(siRNA)中的至少一种，以量化和评估在血管形成和作用时它们的效果和功效，或估计作为治疗剂时它们的促进血管生成或抗血管生成特征。
在本发明的又一具体实施方式中，共培养的细胞可以为通过与形成血管的细胞相互作用而分泌形成血管所需的例如血管生成诱导剂的生物化学物质的细胞。共培养的细胞可以为例如选自星形胶质细胞、胶质细胞、间皮细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞、癌细胞、外膜细胞、神经胶质细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞和与内皮细胞相互作用的细胞中的至少一种。
共培养的细胞可以被理解成包括突变细胞、其转基因细胞和转染细胞。当待产生的血管为在脑中的血管时，共培养的细胞优选为星形胶质细胞、胶质细胞、间皮细胞或纤维母细胞。当待产生的血管为不同于脑中的血管的血管时，共培养的细胞将优选为纤维母细胞或平滑肌细胞。另外，为了进行癌症和血管生成之间关系上的研究，肿瘤细胞可以被用作共培养的细胞。该实施方式使用了人肺成纤维细胞。在该实施方式中，共培养的细胞为人肺成纤维细胞和HUVEC。因此，共培养的细胞类型、组合和其共培养的细胞种植配置在该实验的目的和配置的范围内。
可以执行血管生成因子、细胞培养介质和共培养的细胞的添加以对形成血管的细胞的生长、增殖和形态发生提供合适的环境。血管生成因子、细胞培养介质和共培养的细胞的种类和组成可以由本领域技术人员适当地选取。
本发明还提供了产生血管的方法，包括：a)将ECM和形成血管的细胞注入产生血管的装置的形成血管的通道中；b)将i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞注入产生血管的装置的第一培养通道和/或第二培养通道中；和c)将血管生成因子和/或细胞培养介质注入产生血管的装置的槽通道和/或源通道中，且培养形成血管的细胞和共培养的细胞。通过本方法，可以模拟血管生成的过程。
图3示出使用根据本发明的产生血管的装置400的产生血管的方法。此处，产生血管的方法包括将ECM和形成血管的细胞330注入形成血管的通道320，将i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞230注入第一培养通道410和第二培养通道420，并将含有细胞培养介质和/或各种血管生成因子的流体130注入槽通道110和源通道120。当ECM、细胞、细胞培养介质和各种血管生成因子被注入每个通道时，不需要额外的外部实验装备，且它们可以通过移液管移取而被简单地被注入。另外，形成血管的细胞和共培养的细胞可以与待注入形成血管的通道或第一培养通道和第二培养通道中的ECM混合，并可以通过槽通道或源通道被注入以根据实验目的使它们粘附在形成在微结构之间的ECM的侧壁上。使用形成血管的细胞与ECM混合并被注入形成血管的通道的方法可以模拟血管网络的形成血管化过程，以及，使用附着在ECM上的形成血管的细胞的方法可以模拟血管生成过程，以允许形成血管生成芽和端细胞。
图3的示意图示出将i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞/共培养的细胞顺序注入每个通道和仿形的一个可能的步骤，该步骤在将细胞培养介质或血管生成因子装入源通道和槽通道之后。i)ECM或ii)ECM和形成血管的细胞330被注入形成血管的通道320，并随后将i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞230被注入第一培养通道410和第二培养通道420。然而，注入次序不影响血管的形成。因此，将例如ECM或共培养的细胞的材料注入每个通道的次序可以根据实验者的便利性和实验的特点而改变。根据ECM或共培养的细胞的种类，通过增加的温度、化学反应或光照可以聚合被注入每个通道的ECM或共培养的细胞。在该聚合过程之后，营养成分和血管生成因子可以通过将细胞培养介质注入槽通道和源通道而被提供至形成血管的通道320、第一培养通道410和第二培养通道420。长期的细胞培养和血管形成可以通过诱导旁分泌相互作用和相应通道之间提供的营养因子进行。如果形成血管的细胞需要附着在装在形成血管的通道内的ECM的侧壁上，则悬浮在细胞培养介质中的形成血管的细胞可以通过以90度角倾斜形成血管的装置10分钟至15分钟而被注入源通道或槽通道以使它们附着在期望的位置。
图4图解了根据本发明的实施方式通过以下步骤用于模拟血管化的血管生成的实验配置：将混合物注入形成血管的通道320、第一培养通道410和第二培养通道420中的每个通道，该混合物通过将内皮细胞、HUVEC或纤维母细胞、正常人肺纤维母细胞(NHLF)与纤维蛋白凝胶混合；将细胞培养介质、内皮细胞生长介质-2(EGM-2)注入槽通道110和源通道120。根据细胞培养介质的类型和实验目的，影响细胞响应的血管生成因子或其它因子可以被混入纤维蛋白凝胶或EGM-2以提高或调整形成血管的细胞的细胞培养和形态发生。
图5为根据如图4所示的本发明的实施方式通过血管生成过程形成的血管网络的显微图像。从逐日显微镜的观测可以看出，血管网络从植入在纤维蛋白基质中的HUVEC自发地出现在形成通道的血管内，产生复杂地互相连接的图案。血管延伸贯穿微结构450之间形成的间隙，形成与槽通道110和源通道120中的细胞培养介质流体连通的可灌注的血管腔。因此，可以看出，血管的内部形成与包含在源通道和槽通道中的细胞培养介质的直接流体连接，由此血管腔为可直接进入的并为可灌注的血管网络。
本发明还提供了产生血管的方法，包括：a)将ECM注入产生血管的装置的形成血管的通道中；b)将形成血管的细胞注入产生血管的装置的槽通道和/或源通道中，以及将形成血管的细胞附着在暴露于布置在形成血管的通道的两侧上的微结构之间的ECM上；c)将i)ECM或ii)ECM和共培养的细胞注入产生血管的装置的第一培养通道和/或第二培养通道中；和d)将血管生成因子和/或细胞培养介质注入产生血管的装置的槽通道和/或源通道中，且培养形成血管的细胞和共培养的细胞。通过本方法可以模拟血管生成的方法。为了提供促进血管生成的方向梯度以导引形成血管的细胞的血管生成芽形成，形成血管的细胞所附着的位置、共培养的细胞的注入和血管生成因子的引入源通道和槽通道中可以通过执行本实验的人被容易地控制。
图6图解了用于模拟血管化的血管形成过程的实验配置。在此处，通过将纤维蛋白凝胶装入形成血管的通道320来诱导血管生成芽，以形成血管产生区335；将内皮细胞和HUVEC注入设在形成血管的通道320的左侧处的槽通道110中；以及将HUVEC附着在通过微结构450之间的间隙暴露出的纤维蛋白凝胶上；和在设置在形成血管的通道320的右侧处的第二培养通道420中，注入培养纤维母细胞、NHLF和纤维蛋白凝胶；以及将细胞培养介质、内皮细胞生长介质-2(EGM-2)注入槽通道110和源通道120。根据培养的细胞的类型和实验目的，影响细胞响应的血管生成因子或其它因子可以被混入纤维蛋白凝胶或EGM-2以提高或调整形成血管的细胞的细胞培养和形态发生。在该情况下，可以显示，血管生成芽从附着有HUVEC的血管产生区335的左侧朝向第二培养通道420的方向生长，在第二培养通道420中纤维母细胞NHLF被培养。以及，血管生成芽在穿过血管产生区335之后形成可灌注的血管。
图7(a)描绘了通过使用根据本发明的用于产生血管的装置和方法模拟血管生成过程的生长48小时的血管生成芽的显微图像。图7(b)描绘了通过使用根据本发明的用于产生血管的装置和方法生长后模拟血管生成过程4天产生的另一血管网络的图像。
本发明还提供了产生血管的装置，该装置包括：a)第一培养通道，该第一培养通道与第一培养通道入口流体连通；b)形成血管的通道，该形成血管的通道与第一血管形成通道入口流体连通，该形成血管的通道设置成与第一培养通道的一侧接触，该形成血管的通道基本上平行于第一培养通道；c)槽通道，该槽通道与槽通道入口流体连通，该槽通道设置成与第一培养通道的另一侧接触，该槽通道基本上平行于第一培养通道；和d)源通道，该源通道与源通道入口流体连通，该源通道设置成与形成血管的通道的另一侧接触，该源通道基本上平行于第一培养通道，其中，多个微结构构造成允许包含在每个通道中的生物化学物质之间相互作用，这些微结构以设定的间隔被设置在各个相邻的通道的界面上。
本发明还提供了一种产生血管的方法，包括：
a)将ECM注入产生血管的装置的形成血管的通道中；b)将共培养的细胞注入所述产生血管的装置的第一培养通道中，并将共培养的细胞附着在暴露在所述微结构之间的所述ECM上，所述微结构布置在所述形成血管的通道的一侧上；c)将血管生成因子和/或细胞培养介质注入所述产生血管的装置的所述槽通道和/或所述源通道中，且培养所述共培养的细胞。
在图8中，通道320表示形成血管的通道，通道410表示注入了共培养的细胞的通道，以及通道120或通道110表示注入了细胞培养介质和/或各种血管生成因子的通道。图8为产生血管的装置的主视图，该装置带有作为上述直接接合形成血管的通道的右侧的第一培养通道。在产生血管的装置中模拟血管生成的方法类似于在图6中描述的方法。在形成血管的通道和第一培养通道中，共培养的细胞被三维地植入ECM中，由于形成血管的通道和第一培养通道被直接连通，故该装置具有当实验旨在观测和模拟血管生成芽形成和朝向促进血管生成的定向生长时提供更便利的装置的优点。
血管网络通过源通道和槽通道被灌注和直接进入。本发明还提供一种将流体灌注到根据血管生成术和血管再生术制得的血管中的方法，其中所述血管通过源通道和/或槽通道可进入，由此允许流体流进入血管。
在如上文所述的本发明的一个具体实施方式中，根据本发明的血管产生的装置400可形成各种信号材料的浓度梯度，该信号材料通过培养在分别设置在形成血管的通道320的左侧和右侧上的第一培养通道410和第二培养通道420中培养的共培养的细胞之间的不同种类的细胞或通过调整相对浓度而由共培养的细胞分泌。此外，通过共培养的细胞所分泌的各种信号材料的量可以通过调整在共培养的细胞和形成血管的细胞之间的相对浓度被控制。另外，通过调整分别设置在形成血管的通道320的左侧和右侧上的槽通道110和源通道120之间的生物化学物质的相对流量或种类和浓度，根据本发明的产生血管的装置400还形成各种血管生成因子和营养成分的浓度梯度。
根据本发明的另一具体实施方式，通过调整添加至ECM或细胞培养介质的形成血管的细胞、共培养的细胞和生化因子的种类和来源，血管可以被诱导以具有人体的特定的器官和组织中显现出的血管特征和人体的特定生理和病理学状况。
注射有细胞培养介质和/或ECM的流体可含有选自可溶和不溶因子、生物化学材料、生物力学刺激和细胞中的至少一种。例如，如肿瘤微环境中所观测的，当癌细胞被注射有血管内皮细胞时，为响应各种从癌细胞分泌的血管生成因子和引发炎症因子，可以增大血管网络的通透性。相反，当星形胶质细胞作为共培养的细胞被注入时，通过增强构成血管的细胞之间的细胞与细胞之间的紧密接合可以降低血管网络的通透性。此外，通过所产生的血管的相邻的外部中的共培养的神经胶质细胞，血管网络可以被赋予类似于在脑中的血管的特性。另外，通过共培养的间叶细胞的干细胞或外膜细胞，可以诱导血管外膜细胞的各种相互作用，由此实现细胞的微环境，在该微环境中可以进行大量的研究。在这些情况中，由于血管通过血管发生和血管生成过程形成，上述具体细胞类型可以在ECM中混合以被注入形成通道的血管中，以支持与形成血管的细胞的接触依赖型物理相互作用，或可以被注入第一培养通道和第二培养通道以支持与上述形成血管的细胞的接触依赖型相互作用和扩散依赖型相互作用。
当调节血管网络的通透性时，可以通过引入荧光染料和量化穿过血管壁扩散的染料的荧光强度来测量血管的通透性。另外，通过在血管的顶侧植入电极和在血管的基侧植入其它电极可以测量血管的通透性，电极的植入允许定量测量横穿血管壁的跨上皮电阻(TEER)值。
在本发明的另一具体实施方式中，提供了体外模型，通过诱导通过癌细胞形成血管或将癌细胞设置在血管的内部或外部，该体外模型可以用于理解癌生长和转移机制。为了使从癌细胞分泌的血管生成因子模拟诱导血管内皮细胞的形态发生或定向生长过程，癌细胞可以与ECM混合以被引入第一培养通道和第二培养通道中。而且，通过将癌细胞引入血管的顶侧或基侧，可以模型化癌细胞穿过血管壁的渗出或渗入。此外，在上述具体实施方式中，通过血管壁从血流进入组织或从组织进入血流的可通透的细胞不限于癌细胞。在组织和血流之间来回移动穿过血管壁的其它细胞组的代表性实例包括例如巨噬细胞、中性粒细胞、外膜细胞、干细胞或内皮前驱细胞等的免疫细胞。根据本发明的另一具体实施方式，通过将悬浮有这些免疫细胞的流体引入血管中可以模拟免疫细胞和血管之间的相互作用。
如上文所述，使用根据本发明的产生血管的装置400，在产生血管的区域335中形成的血管可以与通过多个微结构450之间形成的间隙与槽通道110和源通道120连通，如图5和图7中所示。图5和图7中的图像图示了槽通道和源通道之间的相互连接，所述相互连接通过在形成血管的通道中的血管网络的腔而形成，所述形成血管的通道通过模拟血管发生和血管生成而形成。在该情况下，各种生化和生物物理刺激和信号可以被直接发送进入血管，以及血管的响应可以被实时监控和量化。
根据本发明的一具体实施方式，通过调整被注入槽入口105和/或槽出口141、源入口115和/或源出口142的细胞培养介质的体积，可以产生槽通道110和源通道120之间的液体静压。所产生的液体静压差能够使细胞培养介质穿过微结构450之间形成的间隙流入与槽通道110和源通道120连通的血管网络。在该情况下，通过将注入的流体与可以控制血管特性的各种生物化学物质混合可以调节和量化例如直径、长度、通透性、屏障功能、基因和蛋白表达之类的形态和功能特征。另外，根据液体静压的定量差可以控制流过血管的生物化学物质的流量。因此，可以量化和成像由作用在血管壁上的剪切应力导致的生物物理刺激下的三维血管的响应或重建。图9为荧光显微图像，该图像示出可溶/不溶的因子，荧光标记可以被注入连接至槽通道和源通道的血管，其中，可以发现荧光颗粒具有7微米的半径和70kDa的FITC(异硫氰酸荧光素)溶液。图10为描述通过注入导致血管中的炎症的TNF-a/IL-1a细胞因子而在血管的内侧壁上诱发ICAM-1表示的荧光图像。这表明，与对照组相反，利用TNF-a/IL-1a的刺激在管内检测到荧光反应。
此外，通过机械装置引起和控制灌注。为了保持恒定水平的流体流通过血管，注射泵和流体输送管道可以被连接至产生血管的装置，以监控血管的长期响应和它们在生物物理刺激下的重建。此外，使用液体静压或外部的泵通过施加各种级别的流进入血管和血管网络允许在生理和病理条件下观测到的多种流体剪切条件的模拟。此外，在3D ECM环境中的可灌注的血管网络可以充当对在各种生理和病理现象下观测的内皮细胞和血液带有的细胞相互作用的模拟的新的体外模型。图11为荧光图像，其图示了被引入血管网络中的癌细胞的特征。已经迁移经过内皮的细胞示出带有较长的突起部分和有时带有破碎胞浆的伸展形态。位于接近血管处的渗出癌细胞在其形态方面与仍在腔中的圆细胞形成对比。
通过将混合癌细胞的培养介质注入血管内壁，随着血液流动，癌细胞转移附着在血管内壁，通过血管壁向组织渗透。
术语“基本上平行”意味着在平面上的通道相互不交叉且保持相同和/或彼此相对相似的间距。
关于本文中的基本上任何复数和/或单数的使用，本领域的技术人员可以适当地根据上下文和/或应用而将复数翻译成单数和/或单数翻译成复数。为了清楚起见，本文清楚地阐明各种单数/复数的变换。
本领域技术人员将理解，通常，本文中所用的术语，尤其在所附的权利要求(例如所附权利要求的主体)中所用的术语一般作为开放术语(例如，术语“包括”应该理解为“包括但不限于，”术语“具有”应该理解为“具有至少”等)。本领域技术人员还应该理解，如果在权利要求中想要描述特定的数量，这样的意图将在权利要求中清楚地描述，以及如果没有这样的描述，则没有这样的意图。例如，为帮助理解，所附的权利要求可将介绍性词组“至少一个”和“一个或多个”引入权利要求的描述。然而，这样的词语的使用不应该理解成隐含有这样的意思：由不定冠词引入权利要求的描述将包含这些引入的权利要求的描述的任何特定的权利要求限制为仅含有一个这样的描述的实施方式，即使当该权利要求包括介绍性词语“一个或多个”或“至少一个”和例如不定冠词(例如，不定冠词应该理解为“至少一个”或“一个或多个”)时；该权利要求同样适用于用于介绍权利要求的描述中定冠词的使用。此外，即使引入的权利要求描述中的具体数目被清楚地引用，本领域的技术人员将明白，这样的描述应该被理解成至少所描述的数目(例如，仅描述了“两种描述”而没有其它变型，是指至少两种描述，或两种或多种描述)。此外，在这些例子中，使用了类似于“A、B和C等的至少一个”的惯用方式，通常这样的惯用方式旨在使本领域的技术人员应该这样理解该惯用方式(例如“具有A、B和C的至少一个系统”包括但不限于，仅具有A，仅具有B，仅具有C，具有A和B，具有A和C，具有B和C，和/或具有A、B和C，等)。然而，本领域的技术人员还应该理解，无论在说明书还是在权利要求中，实质上表示两个或更多个可选择的术语的任何可分离的单词和/或词语应该理解成可以包括术语的一个，或术语中的任何一个，或术语中的两个。例如，词语“A或B”应理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能。
上文说明的实例对本领域的普通技术人员提供了如何制作和使用本文中所述的装置、系统和方法的实施方式的完整的公开内容和描述，且不旨在限制其各个实施方式的范围。用于执行对本领域的技术人员是明显的装置、系统和方法的上述方式的变型旨在上述权利要求的范围内。对本领域的技术人员指明了在说明书中提到的本发明所涉及的所有专利和出版物。在该公开内容中引用的所有参考文献在一定程度上通过引用并入本文，如同每个参考文献已经以全文单独引用的方式并入本文。
已经描述了装置、系统和方法的多个实施方式。然而，可以理解，可以做出各种变形而不违背上述实施方式的精神和范围。因此，其它的实施方式在上文的权利要求的范围内。

Claims (15)

1.一种产生血管的方法，包括：
a)将细胞外基质ECM和形成血管的细胞注入产生血管的装置的形成血管的通道中，所述产生血管的装置包括：a)槽通道，所述槽通道与槽入口流体连通；b)源通道，所述源通道与源入口流体连通，所述源通道基本上与所述槽通道平行；c)形成血管的通道，所述形成血管的通道与形成血管的通道的入口流体连通，所述形成血管的通道在所述槽通道和所述源通道之间设置成与所述槽通道的一侧和所述源通道的一侧接触，并且所述形成血管的通道基本上平行于所述源通道和所述槽通道；d)第一培养通道，所述第一培养通道与第一培养通道入口流体连通，所述第一培养通道设置成与所述槽通道的另一侧接触，所述第一培养通道基本上平行于所述槽通道；和e)第二培养通道，所述第二培养通道与第二培养通道入口流体连通，所述第二培养通道设置成与所述源通道的另一侧接触，所述第二培养通道基本上平行于所述源通道，其中，多个微结构构造成允许包含在每个通道中的生物化学物质之间的相互作用，所述多个微结构以设定的间隔布置在各个相邻的通道的界面上；且槽通道和源通道中的每一个被设置在形成血管的通道与第一培养通道之间和形成血管的通道与第二培养通道之间；
b)将所述细胞外基质ECM和共培养的细胞注入所述产生血管的装置的第一培养通道和/或第二培养通道中；
c)将血管生成因子和/或细胞培养介质注入所述产生血管的装置的所述槽通道和/或所述源通道中，且培养所述形成血管的细胞和所述共培养的细胞；和
d)借助旁分泌信号，形成血管的细胞与共培养的细胞相互作用。
2.一种产生血管的方法，包括：
a)将细胞外基质ECM注入产生血管的装置的形成血管的通道中，所述产生血管的装置包括：a)槽通道，所述槽通道与槽入口流体连通；b)源通道，所述源通道与源入口流体连通，所述源通道基本上与所述槽通道平行；c)形成血管的通道，所述形成血管的通道与形成血管的通道的入口流体连通，所述形成血管的通道在所述槽通道和所述源通道之间设置成与所述槽通道的一侧和所述源通道的一侧接触，并且所述形成血管的通道基本上平行于所述源通道和所述槽通道；d)第一培养通道，所述第一培养通道与第一培养通道入口流体连通，所述第一培养通道设置成与所述槽通道的另一侧接触，所述第一培养通道基本上平行于所述槽通道；和e)第二培养通道，所述第二培养通道与第二培养通道入口流体连通，所述第二培养通道设置成与所述源通道的另一侧接触，所述第二培养通道基本上平行于所述源通道，其中，多个微结构构造成允许包含在每个通道中的生物化学物质之间的相互作用，所述多个微结构以设定的间隔布置在各个相邻的通道的界面上；且槽通道和源通道中的每一个被设置在形成血管的通道与第一培养通道之间和形成血管的通道与第二培养通道之间；
b)将形成血管的细胞注入所述产生血管的装置的槽通道和/或源通道中，并将形成血管的细胞附在暴露在所述微结构之间的所述细胞外基质ECM上，所述微结构布置在所述形成血管的通道的两侧上；
c)将所述细胞外基质ECM和共培养的细胞注入所述产生血管的装置的第一培养通道和/或第二培养通道中；
d)将血管生成因子和/或细胞培养介质注入所述产生血管的装置的所述槽通道和/或所述源通道中，且培养所述形成血管的细胞和所述共培养的细胞；以及
e)借助旁分泌信号，形成血管的细胞与共培养的细胞相互作用。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述形成血管的细胞为选自内皮细胞、上皮细胞、癌细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞和内皮前驱细胞中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述形成血管的细胞为选自突变细胞、转基因细胞和转染细胞中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞外基质ECM为选自胶原蛋白凝胶、纤维蛋白凝胶、基质胶、自组装多肽凝胶、聚乙二醇凝胶和藻酸盐凝胶中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述共培养的细胞为选自胶质细胞、间皮细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞、癌细胞、外膜细胞、神经胶质细胞、干细胞和干细胞衍生的细胞中的至少一种。
7.根据权利要求6的所述方法，其中，所述共培养的细胞为选自突变细胞、转基因细胞和转染细胞中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞外基质ECM或所述细胞培养介质包含选自药物化合物、可溶因子、不可溶因子、生物分子和纳米材料中的至少一种。
9.一种将流体灌注到根据权利要求1的方法所制得的血管中的方法，其中能通过所述源通道和/所述槽通道进入所述血管，由此允许流体流引入所述血管。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述灌注是通过机械装置引起和控制的。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述流体包含选自可溶因子、不可溶因子、生物化学物质、生物力学刺激和细胞中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，包含在所述流体中的细胞为选自癌细胞、免疫细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、血细胞和内皮前驱细胞中的至少一种。
13.一种量化血管的屏障功能的方法，包括将生物化学物质注入根据权利要求1所述的方法所制得的所述血管中。
14.一种量化血管的通透性的方法，包括将生物化学物质注入根据权利要求1所述的方法所制得的所述血管中。
15.一种量化血管的通透性的方法，包括测量根据权利要求1所述的方法所制得的所述血管的跨上皮电阻TEER的值。
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