KR102403774B1 - 자궁 내막을 모사하기 위한 3차원 생체 모사 칩 및 이를 이용한 자궁 내막 모사 방법 - Google Patents

자궁 내막을 모사하기 위한 3차원 생체 모사 칩 및 이를 이용한 자궁 내막 모사 방법 Download PDF

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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells

Abstract

본 발명은 자궁 내막을 3차원으로 모사하는 생체 모사 칩 및 이를 이용한 자궁 내막 모사 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩은 플레이트와, 복수 개의 챔버와, 상기 복수 개의 챔버 사이에 배치되는 복수 개의 포스트를 포함하는 자궁 내막을 모사하는 3차원 생체 모사 칩으로서, 상기 복수 개의 챔버는 내부에 서로 다른 세포가 배양되는 채널을 구비하며, 상기 플레이트 상에 일 방향으로 나란히 배치되고, 적어도 일부 구간이 연통하도록 서로 인접하여 배치된다.

Description

자궁 내막을 모사하기 위한 3차원 생체 모사 칩 및 이를 이용한 자궁 내막 모사 방법{3D BIOMIMETIC CHIP FOR REPLICATING ENDOMETRIUM AND METHOD FOR REPLICATING ENDOMETRIUM USING THE 3D BIOMIMETIC CHIP}
본 발명의 실시예들은 생체 모사 칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로 자궁 내막을 3차원으로 모사할 수 있는 생체 모사 칩과 이를 이용하여 자궁 내막을 모사하는 방법에 관한 것이다.
생체 장기 모사 칩(organ-on-a-chip)은 심장, 폐, 간 등 생체 장기를 모방하여 만든 마이크로 칩의 일종으로, 장기를 구성하는 세포와 그 주변 환경을 재현함으로써 실제 장기가 작동하는 시스템을 구현할 수 있다. 생체 장기 모사 칩은 모사된 생체 장기에 약물을 투여함으로써 약물의 안정성과 약물 전달 과정에서 일어나는 현상을 효과적으로 파악할 수 있어 기존의 전임상 신약 스크리닝(screening)에 비교했을 때 실제 장기가 작동하는 생리 환경을 효과적으로 반영할 수 있다. 또한, 생체 장기 모사 칩은 동물 실험에서 발생하는 윤리적 문제와 과도한 시간 및 비용, 그리고 부정확한 결과를 해결할 수 있어 최근 주목 받고 있다.
한편, 대표적인 자궁 난치성 질환 중 하나인 자궁내막증의 경우, 환자가 2013년 8만 명에서 2017년 12만 명으로 35% 이상 증가했고, 난임 환자도 10년 사이에 2.5배 증가하는 등 자궁 관련 질환이 최근 문제되고 있다. 이에 따라, 자궁과 관련된 질병 원인을 연구할 수 있는 자궁 전임상 플랫폼이 요구된다. 그러나 종래의 생체 장기 모사 칩은 세포 배양을 2차원으로 구현하거나, 특정 세포만을 고려하기 때문에 실제 자궁의 생물학적 구성과 기능을 모사하기에는 부족하다.
전술한 배경 기술은 발명자가 본 발명의 도출을 위해 보유하고 있었거나, 본 발명의 도출 과정에서 습득한 기술 정보로서, 반드시 본 발명의 출원 전에 일반 공중에게 공개된 공지 기술이라 할 수는 없다.
본 발명은 실제 자궁 조직의 형태를 물리적 및 화학적으로 구현하여, 실제 자궁과 생체 유사성이 높은 생체 모사 칩을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 특정 세포에 제한되지 않고, 복수 종의 세포를 생체 모사 칩 장치로 배양함으로써 자궁 조직의 생리적 기능을 구현할 수 있는 생체 모사 칩을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 다층화된 배양 채널을 통해 세포가 스스로 조직을 조립하는 환경을 구현하여, 실제 자궁 내 환경과 생리적 유사성을 높임으로써 실제 자궁의 유기적 특성을 모사할 수 있는 생체 모사 칩을 제공할 수 있다.
다만, 이는 일 예로서, 본 발명의 목적은 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩은 플레이트와, 복수 개의 챔버와, 상기 복수 개의 챔버 사이에 배치되는 복수 개의 포스트를 포함하는 자궁 내막을 모사하는 3차원 생체 모사 칩으로서, 상기 복수 개의 챔버는 내부에 서로 다른 세포가 배양되는 채널을 구비하며, 상기 플레이트 상에 일 방향으로 나란히 배치되고, 적어도 일부 구간이 연통하도록 서로 인접하여 배치된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치에 있어서, 상기 복수 개의 챔버는 제1 배양 채널을 구비하고, 제1 세포가 배양되는 제1 세포 배양 챔버, 상기 제1 세포 배양 챔버의 일측에 배치되고, 상기 제1 배양 채널과 연통하는 제2 배양 채널을 구비하며, 제2 세포가 배양되는 제2 세포 배양 챔버 및 상기 제2 세포 배양 챔버의 일측에 배치되고, 상기 제2 배양 채널과 연통하는 제1 배양액 채널을 구비하며, 배양액이 주입되는 제1 배양액 챔버를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치에 있어서, 상기 제1 배양 채널과, 상기 제2 배양 채널과, 상기 제1 배양액 채널은 하나의 바디로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치에 있어서, 상기 제2 세포 배양 챔버와 대향하도록 상기 제1 배양액 챔버의 타측에 배치되고, 상기 제1 배양액 채널과 연통하는 제3 배양 채널을 구비하며, 상기 제2 세포가 배양되는 제3 세포 배양 챔버를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치에 있어서, 상기 제1 배양액 챔버와 대향하도록 상기 제1 세포 배양 챔버의 타측에 배치되며, 상기 제1 배양 채널과 연통하는 제2 배양액 채널을 구비하고, 배양액이 주입되는 제2 배양액 챔버를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치에 있어서, 상기 제1 배양액 챔버는 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포가 각각 상기 제1 세포 배양 챔버 및 상기 제2 세포 배양 챔버에 주입되고 제1 기간이 지난 후에 제3 세포가 주입될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치에 있어서, 상기 복수 개의 포스트는 상기 제1 배양 채널과 상기 제2 배양 채널의 경계를 따라 제1 간격으로 배치되는 복수 개의 제1 포스트 및 상기 제2 배양 채널과 상기 제1 배양액 채널의 경계를 따라 제2 간격으로 배치되는 복수 개의 제2 포스트를 포함하고, 상기 제2 간격은 상기 제1 간격보다 클 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치에 있어서, 상기 복수 개의 포스트는 일면이 볼록한 곡면을 갖는 다각 기둥 형상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치에 있어서, 상기 세포는 자궁 내막의 특이적 세포인 자궁 내막 상피 세포, 자궁 내막 섬유아세포 및 자궁 혈관 내피 세포 중 적어도 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 자궁 내막 모사 방법은 일 방향으로 나란히 배치되며 서로 연통하는 복수 개의 챔버에 서로 다른 세포를 배양하여, 자궁 내막을 3차원으로 모사하는 방법으로서, 제1 세포 배양 챔버에 제1 세포를 배양하는 단계, 제2 세포 배양 챔버에 제2 세포를 배양하는 단계, 제1 배양액 챔버에 배양액을 주입하는 단계 및 제1 기간 후에, 상기 제1 배양액 챔버에 제3 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 자궁 내막 모사 방법에 있어서, 상기 배양액을 주입하는 단계 전에, 제3 세포 배양 챔버에 상기 제2 세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 자궁 내막 모사 방법에 있어서, 상기 제1 세포는 자궁 혈관 내피세포이고, 상기 제2 세포는 자궁 내막 섬유아세포이고, 상기 제3 세포는 자궁 내막 상피세포일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 자궁 내막 모사 방법에 있어서, 상기 제1 기간은 상기 제2 세포가 상기 제2 세포 배양 챔버에서 자가 조립(self-assembly)하여, 혈관이 상기 제1 세포 배양 챔버에서 생성되는 기간일 수 있다.
전술한 것 외의 다른 측면, 특징, 이점은 이하의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 청구범위 및 도면으로부터 명확해질 것이다.
본 발명에 따른 3차원 생체 모사 칩 및 자궁 내막 모사 방법은 다층 구조를 이루는 복수 개의 챔버에 서로 다른 세포를 배양하여 자궁 내막을 3차원으로 모사할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 3차원 생체 모사 칩 및 자궁 내막 모사 방법은 자궁 내막 특이적 세포(예를 들어, 자궁 내막 섬유아세포, 자궁 내막 상피세포, 자궁 혈관 내피세포)를 이용하여 자궁 내막과 생체 유사성이 높은 생체 모사 칩을 제공할 수 있다.
또한, 3차원 생체 모사 칩 및 자궁 내막 모사 방법은 각종 자궁 질환을 치료하기 위한 약물 실험에 사용되거나, 환자 맞춤형 치료에 사용될 수 있는 생체 모사 칩을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 생체 모사 칩을 나타낸다.
도 2는 도 1의 Ⅱ-Ⅱ를 따라 취한 횡단면을 나타낸다.
도 3은 도 2의 Ⅲ를 확대하여 나타낸다.
도 4a는 제1 세포를 제1 배양 채널에 투입한 상태를 나타낸다.
도 4b는 제2 세포를 제2 배양 채널에 투입한 상태를 나타낸다.
도 4c는 제2 세포를 제3 배양 채널에 투입한 상태를 나타낸다.
도 4d는 제1 세포가 제2 세포를 향해 혈관을 생성하기 시작한 상태를 나타낸다.
도 4e는 제1 세포가 생성한 혈관이 제2 배양 채널에서 성장하고, 제1 배양액 채널에 제3 세포가 투입된 상태를 나타낸다.
도 5는 제1 세포가 혈관을 생성하는 상태를 나타낸다.
도 6은 제1 세포 배양 챔버와, 제2 세포 배양 챔버와, 제3 세포 배양 챔버의 조합에 다른 제1 세포의 상태를 나타낸다.
도 7a는 도 6에 따른 제1 세포 배양 챔버의 혈관 면적을 나타낸다.
도 7b는 도 6에 따른 제2 세포 배양 챔버의 혈관 면적을 나타낸다.
도 8은 혈관 생성 인자에 따른 혈관 생성 상태를 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩을 이용한 세포 생존도 실험과 혈관의 regression 실험 결과를 나타낸다.
도 10a는 자궁 내막 상피 세포의 투과도 테스트를 나타내는 비교예이다.
도 10b는 자궁 내막 상피 세포의 투과도 테스트를 나타내는 발명예이다.
도 11a는 비교예와 발명예의 자궁 내막 상피 세포의 두께를 나타낸다.
도 11b는 발명예의 투과도를 나타낸다.
도 12는 약물 처리에 따른 형광 물질의 투과 상태를 나타낸다.
도 13은 본 발명을 이용한 배아 착상 테스트를 나타낸다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 발명의 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시예로 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 다른 실시예에 도시되어 있다 하더라도, 동일한 구성요소에 대하여서는 동일한 식별부호를 사용한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성요소들은 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 첨부된 도면들에 도시된 본 발명에 관한 실시예들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자궁 내막을 모사하기 위한 생체 모사 칩(10)을 나타내고, 도 2는 도 1의 Ⅱ-Ⅱ를 따라 취한 횡단면을 나타내고, 도 3은 도 2의 Ⅲ를 확대하여 나타낸다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 플레이트(100)와, 제1 세포 배양 챔버(200)와, 제2 세포 배양 챔버(300)와, 제1 배양액 챔버(400)를 포함할 수 있다.
플레이트(100)는 후술하는 챔버들이 배치되는 영역을 구비한다. 플레이트(100)의 형상은 특별히 한정하지 않으며, 평탄한 형상을 가지면 충분하다. 일 실시예로, 플레이트(100)는 PDMS(폴리디메틸실록산; polydimethylsiloxane)으로 이루어지며, 사각 평판 형상을 가질 수 있다.
제1 세포 배양 챔버(200)는 내부에 세포가 배양되는 부재이며, 플레이트(100) 상에 배치된다.
제1 세포 배양 챔버(200)는 제1 배양 채널(210)과, 제1 배양 브릿지(220)와, 제1 세포 주입구(230)를 포함할 수 있다.
제1 배양 채널(210)은 플레이트(100) 상에서 일 방향(예를 들어, 도 1의 X축 방향)으로 배치될 수 있다. 제1 배양 채널(210)의 높이는 특별히 한정하지 않으나, 후술하는 바와 같이 안정적인 배아의 착상을 위해 250 μm 내지 300 μm일 수 있다. 제1 배양 채널(210)의 내부에는 제1 세포(C1)가 배양될 수 있다. 이에 대해서는 후술한다.
제1 배양 브릿지(220)는 제1 배양 채널(210)의 단부에서 소정의 방향으로 연장된다. 일 실시예로, 제1 배양 브릿지(220)는 제1 배양 채널(210)의 양단에서 연장된다. 제1 배양 브릿지(220)가 연장되는 방향은 특별히 한정하지 않으나, 제1 세포 배양 챔버(200)와 인접하도록 배치되는 제2 세포 배양 챔버(300) 등으로부터 충분히 이격되는 것이 바람직하다.
일 실시예로, 제1 배양 브릿지(220)의 폭은 제1 배양 채널(210)의 폭보다 좁을 수 있다.
제1 세포 주입구(230)는 제1 배양 브릿지(220)의 단부와 연결된다. 일 실시예로, 제1 세포 주입구(230)는 각각의 제1 배양 브릿지(220)와 연결되도록 제1 배양 채널(210)의 일단과 타단에 배치되며, 제1 세포(C1)가 주입되는 관통공(미도시)을 구비할 수 있다. 주입된 제1 세포(C1)는 제1 배양 브릿지(220)를 거쳐 제1 배양 채널(210)의 내부로 이동할 수 있다.
제1 세포 주입구(230)의 형상은 특별히 한정하지 않는다. 일 실시예로, 제1 세포 주입구(230)는 제1 배양 채널(210)보다 높은 높이를 갖는 원기둥 형상일 수 있다.
제2 세포 배양 챔버(300)는 내부에 세포가 배양되는 부재이며, 플레이트(100) 상에 제1 세포 배양 챔버(200)와 평행하도록 제1 세포 배양 챔버(200)의 일측에 배치될 수 있다. 일 실시예로, 제2 세포 배양 챔버(300)는 제1 세포 배양 챔버(200)와 인접하되, 그로부터 +Y축 방향으로 배치될 수 있다.
제2 세포 배양 챔버(300)는 제2 배양 채널(310)과, 제2 배양 브릿지(320)와, 제2 세포 주입구(330)를 포함할 수 있다.
제2 배양 채널(310)은 플레이트(100) 상에서 일 방향(예를 들어, 도 1의 X축 방향)으로 배치될 수 있다. 제2 배양 채널(310)의 높이는 특별히 한정하지 않으나, 제1 배양 채널(210)과 동일한 높이를 가질 수 있다. 제2 배양 채널(310)의 내부에는 제2 세포(C2)가 배양될 수 있다. 일 실시예로, 제2 세포(C2)는 혈관 신생 촉진 인자를 생성할 수 있다. 이에 대해서는 후술한다.
제2 배양 채널(310)은 제1 배양 채널(210)과 연통할 수 있다. 일 실시예로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제1 배양 채널(210)과 제2 배양 채널(310)의 경계는 개방되어 있으며, 경계를 따라 후술하는 제1 포스트(510)가 복수 개 배치될 수 있다.
제2 배양 브릿지(320)는 제2 배양 채널(310)의 단부에서 소정의 방향으로 연장될 수 있다. 제2 세포 주입구(330)는 제2 배양 브릿지(320)와 연결되며, 제2 세포(C2)가 주입될 수 있다. 주입된 제2 세포(C2)는 제2 배양 브릿지(320)를 거쳐 제2 배양 채널(310)의 내부로 이동할 수 있다.
제2 배양 브릿지(320)와 제2 세포 주입구(330)의 나머지 구성은 제1 배양 브릿지(220) 및 제1 세포 주입구(230)의 구성과 동일할 수 있으며, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
제1 배양액 챔버(400)는 배양액이 주입되는 부재이며, 플레이트(100) 상에 제1 세포 배양 챔버(200) 및/또는 제2 세포 배양 챔버(300)와 평행하도록 제2 세포 배양 챔버(300)의 일측에 배치될 수 있다. 일 실시예로, 제1 배양액 챔버(400)는 제2 세포 배양 챔버(300)와 인접하되, 그로부터 +Y축 방향으로 배치될 수 있다.
제1 배양액 챔버(400)는 제1 배양액 채널(410)과, 제1 배양액 브릿지(420)와, 제1 배양액 주입구(430)를 포함할 수 있다.
제1 배양액 채널(410)은 플레이트(100) 상에서 일 방향(예를 들어, 도 1의 X축 방향)으로 배치될 수 있다. 제1 배양액 채널(410)의 높이는 특별히 한정하지 않으나, 제1 배양 채널(210)과 동일한 높이를 가질 수 있다. 제1 배양액 채널(410)의 내부에는 제3 세포(C3)가 배양될 수 있다. 이에 대해서는 후술한다.
제1 배양액 채널(410)은 제2 배양 채널(310)과 연통할 수 있다. 일 실시예로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제2 배양 채널(310)과 제1 배양액 채널(410)의 경계는 개방되어 있으며, 경계를 따라 후술하는 제2 포스트(520)가 복수 개 배치될 수 있다.
제1 배양액 브릿지(420)는 제1 배양액 채널(410)의 단부에서 소정의 방향으로 연장될 수 있다. 제1 배양액 주입구(430)는 제1 배양액 브릿지(420)와 연결되며, 제1 배양액 채널(410)의 양단에 각각 배치될 수 있다. 제1 배양액 주입구(430)로 주입된 배양액은 제1 배양액 브릿지(420)를 거쳐 제1 배양액 채널(410)의 내부로 이동할 수 있다.
일 실시예로, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)은 서로 인접하도록 배치되되, 일 방향으로 나란히 배치될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 각각 서로 다른 세포가 배양되는 채널(챔버)이 일 방향으로 다층 구조를 형성함으로써, 신체, 특히 자궁 내막을 생체 적합하게 모사할 수 있다.
일 실시예로, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)은 공통된 연통 영역을 형성할 수 있다. 보다 구체적으로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)은 적어도 일부 구간을 공유하도록 채널 사이의 경계가 개방될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 각각의 채널(챔버) 내에 배양되는 서로 다른 세포가 서로 연결될 수 있어, 세포 네크워크를 구현할 수 있다. 따라서 종래의 2차원 생체 모사 장치에 비해 생체 적합성이 향상되고, 3차원으로 자궁 내막을 모사할 수 있는 생체 모사 칩을 제공할 수 있다.
일 실시예로, 제1 세포 배양 챔버(200)와, 제2 세포 배양 챔버(300)와, 제1 배양액 챔버(400)는 하나의 바디를 이룰 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)은 일체의 바디로 형성되며, 상기 바디로부터 제1 배양 브릿지(220)와, 제2 배양 브릿지(320)와, 제1 배양액 브릿지(420)가 소정의 방향으로 분기될 수 있다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 포스트(500)를 더 포함할 수 있다.
포스트(500)는 챔버 사이의 경계를 따라 복수 개 배치될 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 세포 배양 챔버(200)와 제2 세포 배양 챔버(300)의 사이 및/또는 제2 세포 배양 챔버(300)와 제1 배양액 챔버(400)의 사이에 소정의 간격으로 배치될 수 있다. 포스트(500)는 챔버와 챔버 사이의 경계를 구획하면서, 소정의 간격으로 배치됨으로써 챔버에서 배양되는 세포의 간격 또는 패턴을 설정할 수 있다.
일 실시예로, 포스트(500) 사이에는 세포외 기질(extracellular matrix)이 배치될 수 있다. 미세한 형상의 포스트(500)의 외주면은 일종의 소수성 패턴을 형성하기 때문에, 세포외 기질은 포스트(500) 사이에서 구 형상으로 존재할 수 있다. 일 실시예로, 세포외 기질로서 하이드로겔(hydrogel)이 이용될 수 있다.
포스트(500)는 제1 포스트(510)와, 제2 포스트(520)를 포함할 수 있다.
제1 포스트(510)는 제1 세포 배양 챔버(200)와 제2 세포 배양 챔버(300)의 경계를 따라 일 방향(예를 들어, 도 2의 X축 방향)으로 복수 개 배치될 수 있다. 제1 포스트(510)의 형상은 특별히 한정하지 않으며, 다각 기둥 또는 원 기둥의 형상을 가질 수 있다. 일 실시예로, 제1 포스트(510)의 형상은 도 3의 확대도에 나타낸 바와 같이, 일면이 볼록한 곡면인 다각 기둥 형상일 수 있다.
이에 따라, 세포가 제2 세포 배양 챔버(300)로 주입되고, 생체 모사 칩(10)을 틸팅했을 때, 세포가 제1 포스트(510)의 곡면 상을 롤링(rolling)하면서 자연스럽게 제1 포스트(510) 사이에 배치될 수 있다.
제1 포스트(510)의 크기는 특별히 한정하지 않는다. 일 실시예로, 제1 포스트(510)의 높이 L1은 제1 세포 배양 챔버(200) 및 제2 세포 배양 챔버(300)의 높이와 동일할 수 있으며, 250 μm 내지 300 μm일 수 있다. 또한, 제1 포스트(510)의 상면 또는 하면의 최대 길이 L2는 180 μm 내지 200 μm일 수 있다.
제1 포스트(510)의 간격 d1은 특별히 한정하지 않으며, 일 실시예로 간격 d1은 길이 L2와 동일할 수 있다.
제2 포스트(520)는 제2 세포 배양 챔버(300)와 제1 배양액 챔버(400)의 경계를 따라 일 방향(예를 들어, 도 2의 X축 방향)으로 복수 개 배치될 수 있다. 제2 포스트(520)의 크기와 형상은 제1 포스트(510)의 형상과 동일하거나 상이할 수 있다.
이에 따라, 후술하는 바와 같이 제1 배양액 챔버(400)를 통해 배아(embryo)가 주입되고, 생체 모사 칩(10)을 틸팅했을 때, 배아가 제2 포스트(520)의 곡면 상을 롤링하면서 자연스럽게 제2 포스트(520) 사이에 배치될 수 있다.
일 실시예로, 제2 포스트(520)의 간격 d2는 제1 포스트(510)의 간격 d1보다 클 수 있다. 보다 구체적으로, 제2 포스트(520)의 간격 d2는 180 μm 내지 200 μm일 수 있다. 후술하는 바와 같이, 제2 포스트(520)의 간격을 보다 넓게 확보함으로써 배아를 제2 포스트(520)의 사이에 보다 안정적으로 착상시킬 수 있다.
다시 도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 제3 세포 배양 챔버(600)와, 제2 배양액 챔버(700)를 더 포함할 수 있다.
제3 세포 배양 챔버(600)는 내부에 세포가 배양되는 부재이며, 플레이트(100) 상에 제1 배양액 챔버(400)와 평행하도록 제1 배양액 챔버(400)의 일측에 배치될 수 있다. 일 실시예로, 제3 세포 배양 챔버(600)는 제1 배양액 챔버(400)를 사이에 두고 제2 세포 배양 챔버(300)와 대향하도록 제1 배양액 챔버(400)와 인접하되, 그로부터 +Y축 방향으로 배치될 수 있다.
보다 구체적으로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제3 세포 배양 챔버(600)는 제1 배양액 챔버(400)에 의해 감싸지도록 배치될 수 있다.
제3 세포 배양 챔버(600)는 제3 배양 채널(610)과, 제3 배양 브릿지(620)와, 제3 세포 주입구(630)를 포함할 수 있다.
제3 배양 채널(610)은 플레이트(100) 상에서 일 방향(예를 들어, 도 1의 X축 방향)으로 배치될 수 있다. 제3 배양 채널(610)의 높이는 특별히 한정하지 않으나, 제1 배양 채널(210)과 동일한 높이를 가질 수 있다. 제3 배양 채널(610)의 내부에는 제1 세포(C1)가 배양될 수 있다. 이에 대해서는 후술한다.
제3 배양 채널(610)은 제1 배양액 채널(410)과 연통할 수 있다. 일 실시예로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제1 배양액 채널(410)과 제3 배양 채널(610)의 경계는 개방되어 있으며, 후술하는 제3 포스트(530)가 경계를 따라 복수 개 배치될 수 있다.
제3 배양 브릿지(620)는 제3 배양 채널(610)의 단부에서 소정의 방향으로 연장될 수 있다. 제3 세포 주입구(630)는 제3 배양 브릿지(620)와 연결되며, 제1 세포(C1)가 주입될 수 있다. 주입된 제1 세포(C1)는 제3 배양 브릿지(620)를 거쳐 제3 배양 채널(610)의 내부로 이동할 수 있다.
제3 배양 브릿지(620)와 제3 세포 주입구(630)의 나머지 구성은 제1 배양 브릿지(220) 및 제1 세포 주입구(230)의 구성과 동일할 수 있으며, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
제2 배양액 챔버(700)는 배양액이 주입되는 부재이며, 플레이트(100) 상에 제1 세포 배양 챔버(200) 및/또는 제2 세포 배양 챔버(300)와 평행하도록 제1 세포 배양 챔버(200)의 타측에 배치될 수 있다. 제2 배양액 챔버(700)에 주입되는 배양액은 제1 배양액 챔버(400)에 주입되는 배양액과 동일할 수 있다. 일 실시예로, 제2 배양액 챔버(700)는 제1 세포 배양 챔버(200)와 인접하되, 그로부터 -Y축 방향으로 배치될 수 있다.
제2 배양액 챔버(700)는 제2 배양액 채널(710)과, 제2 배양액 브릿지(720)와, 제2 배양액 주입구(730)를 포함할 수 있다.
제2 배양액 채널(710)은 플레이트(100) 상에서 일 방향(예를 들어, 도 1의 X축 방향)으로 배치될 수 있다. 제2 배양액 채널(710)의 높이는 특별히 한정하지 않으나, 제1 배양 채널(210)과 동일한 높이를 가질 수 있다.
제2 배양액 채널(710)은 제1 배양 채널(210)과 연통할 수 있다. 일 실시예로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제1 배양 채널(210)과 제2 배양액 채널(710)의 경계는 개방되어 있으며, 경계를 따라 후술하는 제4 포스트(540)가 복수 개 배치될 수 있다.
제2 배양액 브릿지(720)는 제2 배양액 채널(710)의 단부에서 소정의 방향으로 연장될 수 있다. 제2 배양액 주입구(730)는 제2 배양액 브릿지(720)와 연결되며, 제2 배양액 채널(710)의 양단에 각각 배치될 수 있다. 제2 배양액 주입구(730)로 주입된 배양액은 제2 배양액 브릿지(720)를 거쳐 제2 배양액 채널(710)의 내부로 이동할 수 있다.
일 실시예로, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)과, 제3 배양 채널(610)과, 제2 배양액 채널(710)은 일 방향으로 평행하도록 배치될 수 있다.
일 실시예로, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)과, 제3 배양 채널(610)과, 제2 배양액 채널(710)은 공통된 연통 영역을 형성할 수 있다. 보다 구체적으로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)과, 제3 배양 채널(610)과, 제2 배양액 채널(710)은 적어도 일부 구간을 공유하도록 채널 사이의 경계가 개방될 수 있다.
일 실시예로, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)과, 제3 배양 채널(610)과, 제2 배양액 채널(710)은 하나의 바디를 이룰 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 배양 채널(210)과, 제2 배양 채널(310)과, 제1 배양액 채널(410)과, 제3 배양 채널(610)과, 제2 배양액 채널(710)은 일체의 바디로 형성되고, PDMS로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 바디로부터 제1 배양 브릿지(220)와, 제2 배양 브릿지(320)와, 제1 배양액 브릿지(420)와, 제3 배양 브릿지(620)와, 제2 배양액 브릿지(720)가 각각 소정의 방향으로 분기될 수 있다.
일 실시예로, 제1 세포(C1)와, 제2 세포(C2)와, 제3 세포(C3)는 각각 자궁 내막의 특이적 세포일 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 세포(C1)는 자궁 혈관 내피 세포(endothelial cell), 제2 세포(C2)는 자궁 내막 섬유아세포(endometrial stromal fibroblast) 그리고 제3 세포(C3)는 자궁 내막 상피 세포(endometrial epithelial cell)일 수 있다.
제2 세포 배양 챔버(300)에서 배양되는 자궁 내막 섬유아세포인 제2 세포(C2)는 혈관 신생 촉진 인자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 제2 세포(C2)는 혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)를 생성할 수 있다. 생성된 혈관 내피 세포 성장 인자에 의해 제1 세포 배양 챔버(200)에서 배양되는 자궁 혈관 내피 세포인 제1 세포(C1)가 자극을 받아 자가 조립(self-assembly)을 하면서 혈관을 생성할 수 있다. 그 외에도 다른 혈관 신생 촉진 인자로서 내피 세포를 직접 자극하는 직접 혈관 신생 인자(direct angiogenic factor; DAF)와 혈관 주위 세포를 자극하여 DAF의 생성을 통해 혈관 신생을 유발하는 간접 혈관 신생 인자(indirect angiogenic factor; IAF)를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 제1 세포 배양 챔버(200)와 제2 세포 배양 챔버(300)는 일 방향으로 나란히 배치된다. 즉, 제1 세포 배양 챔버(200)와 제2 세포 배양 챔버(300)는 일 방향으로 다층 구조를 이룰 수 있다. 이에 따라, 제1 세포 배양 챔버(200)에서 배양되는 제1 세포(C1)는 제2 세포(C2)가 있는 제2 세포 배양 챔버(300)를 향해 혈관을 생성한다.
따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 자궁 내막의 특이적 세포를 다층 구조로 배양함으로써, 자궁 내막과 생체적으로 유사한 생체 모사 칩을 구현할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 제3 세포 배양 챔버(600)에서 자궁 혈관 내피 세포인 제1 세포(C1)를 추가로 배양함으로써, 혈관의 생성 방향을 보다 확실하게 유도할 수 있다. 보다 구체적으로, 제2 세포 배양 챔버(300)뿐만 아니라 제3 세포 배양 챔버(600)에서 배양되는 제1 세포(C1)로부터도 혈관 내피 세포 성장 인자가 생성된다. 따라서 제1 세포(C1)에 의해 생성되는 혈관이 +Y축 방향을 향하도록 배향을 보다 확실하게 제어할 수 있다.
일 실시예로, 자궁 내막 상피 세포인 제3 세포(C3)는 제1 배양액 챔버(400)에서 배양될 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 세포(C1)와 제2 세포(C2)가 배양된 다음, 제1 기간이 지난 후에 제3 세포(C3)가 제1 배양액 챔버(400)에 주입될 수 있다. 제3 세포(C3)는 제2 포스트(520) 또는 제2 포스트(520)의 사이에 배치된 하이드로겔 상에 배치될 수 있다. 이때, 제1 기간은 제1 세포(C1)가 자가 조립하여, 혈관이 혈관망(vascular network)를 형성하고, 형성된 혈관망이 제1 배양 채널(210)과 제2 배양 채널(310)의 경계를 지나, 제2 배양 채널(310)에서 성장하는 기간일 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 자궁 혈관 내피 세포, 자궁 내막 섬유아세포 및 자궁 내막 상피 세포와 같이 자궁 내막의 특이적 세포를 이용하여, 자궁 내막을 다층적으로 모사할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 이와 같이 생체 적합성이 높은 자궁 내막을 모사함으로써, 자궁 내막 상피 세포 상에 배아를 용이하고 효율적으로 착상시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)은 다층 구조를 이루는 복수 개의 채널(챔버)과, 특정한 포스트의 형상을 이용함으로써 별도의 동력 없이도 자궁 내막의 혈관이 소정의 방향으로 생성되도록 할 수 있으며, 중력을 이용한 자연적인 유동을 형성할 수 있다.
일 실시예로, 본 발명에 따른 생체 모사 칩(10)은 제3 포스트(530)와 제4 포스트(540)를 더 포함할 수 있다.
제3 포스트(530)는 제1 배양액 챔버(400)와 제3 세포 배양 챔버(600)의 경계를 따라 소정의 간격(d3)만큼 이격되어 복수 개 배치될 수 있다. 또한, 제4 포스트(540)는 제1 세포 배양 챔버(200)와 제2 배양액 챔버(700)의 경계를 따라 소정의 간격(d4)만큼 이격되어 복수 개 배치될 수 있다.
일 실시예로, 도 3에 나타낸 바와 같이 제3 포스트(530)는 곡면이 제2 포스트(520)의 곡면과 대향하도록 배치될 수 있다. 이에 따라, 후술하는 바와 같이, 제1 배양액 챔버(400)로 배아가 주입되었을 때, 제2 포스트(520)와 제3 포스트(530)의 곡면 상에서 롤링하며 제2 포스트(520) 사이의 공간에 안착될 수 있다.
다음, 도면을 참조하여 본 발명의 다른 실시예에 따른 자궁 내막 모사 방법에 대해 설명한다.
도 4a는 제1 세포(C1)를 제1 배양 채널(210)에 투입한 상태를 나타내고, 도 4b는 제2 세포(C2)를 제2 배양 채널(310)에 투입한 상태를 나타내고, 도 4c는 제2 세포(C2)를 제3 배양 채널(610)에 투입한 상태를 나타내고, 도 4d는 제1 세포(C1)가 제2 세포(C2)를 향해 혈관을 생성하기 시작한 상태를 나타내고, 도 4e는 제1 세포(C1)가 생성한 혈관이 제2 배양 채널(310)에서 성장하고, 제1 배양액 채널(410)에 제3 세포(C3)가 투입된 상태를 나타낸다.
본 발명에 따른 자궁 내막 모사 방법은 생체 모사 칩(10)을 이용해 서로 연통하는 복수 개의 챔버에 서로 다른 세포를 배양하여, 자궁 내막을 3차원을 모사할 수 있다.
먼저 도 1 내지 도 4a를 참조하면, 제1 세포 배양 챔버(200), 즉, 제1 배양 채널(210)에 제1 세포(C1)를 배양한다. 세포외 기질인 하이드로겔에 제1 세포(C1)를 삽입한 상태에서, 제1 세포 배양 챔버(200)의 제1 세포 주입구(230)를 통해 제1 세포(C1)를 주입한다. 그리고 생체 모사 칩(10)을 적절한 각도로 기울여 제1 세포(C1)를 제1 배양 채널(210)로 이동시킨다.
이때, 제1 배양 채널(210)로 이동한 제1 세포(C1)는 소정의 간격(d4)으로 이격된 복수 개의 제4 포스트(540) 상에서 롤링하며 일정한 패턴으로 배치된다. 이에 따라, 제1 세포(C1)를 제1 배양 채널(210)에서 패터닝할 수 있다.
일 실시예로, 제1 세포(C1)는 자궁 내막의 특이적 세포인 자궁 혈관 내피 세포일 수 있다.
다음, 제2 세포 배양 챔버(300), 즉, 제2 배양 채널(310)에 제2 세포(C2)를 배양한다. 마찬가지로 하이드로겔에 제2 세포(C2)를 삽입한 상태에서 제2 세포 배양 챔버(300)의 제2 세포 주입구(330)를 통해 제2 세포(C2)를 주입한다. 생체 모사 칩(10)의 틸팅에 따라 제2 세포(C2)가 제2 배양 채널(310)로 이동한다.
마찬가지로, 제2 배양 채널(310)로 이동한 제2 세포(C2)는 소정의 간격(d2)으로 이격된 복수 개의 제1 포스트(510) 상에서 롤링하며 일정한 패턴으로 배치된다. 이에 따라, 제2 세포(C2)를 제2 배양 채널(310)에서 패터닝할 수 있다.
일 실시예로, 제2 세포(C2)는 자궁 내막의 특이적 세포인 자궁 내막 섬유아세포일 수 있다.
다만, 제1 세포(C1)와 제2 세포(C2)를 배양하는 순서는 특별히 한정하지 않으며, 제2 세포(C)를 배양한 후에 제1 세포(C1)를 배양하거나, 동시에 배양할 수도 있다.
다음, 제1 배양액 챔버(400)에 배양액을 주입한다. 제1 배양액 주입구(430)를 통해 주입된 배양액은 포스트(500) 간의 공간을 거쳐 챔버 전체로 전달될 수 있다. 이때, 포스트(500) 사이에는 세포외 기질로서 하이드로겔이 배치될 수 있으며, 배양액은 하이드로겔을 통해 확산될 수 있다.
이에 따라, 제1 세포 배양 챔버(200)에서 제1 세포(C1)가 배양되고, 제2 세포 배양 챔버(300)에서 제2 세포(C2)가 배양될 수 있다. 도 4d에 나타낸 바와 같이, 제1 세포(C1)는 자가 조립하면서 혈관망(C1')을 형성한다. 그리고 제2 세포(C2)로부터 혈관 내피 세포 성장 인자가 생성됨에 따라, 도 4e에 나타낸 바와 같이, 혈관망(C1')은 제2 세포(C2)가 있는 제2 세포 배양 챔버(300)를 향해 신생 혈관(C1")을 생성한다.
이와 같이, 본 발명에 따른 자궁 내막 모사 방법은 일 방향으로 나란히 배치되는 복수 개의 챔버에 서로 다른 세포를 배양함으로써 자궁 내막을 다층적으로 모사할 수 있다.
다음, 제1 기간 후에, 제1 배양액 챔버(400)에 제3 세포(C3)를 배양한다. 제1 배양액 챔버(400)를 통해 제3 세포(C3)를 주입한 다음, 생체 모사 칩(10)을 기울여 제3 세포(C3)를 롤링시킨다. 제3 세포(C3)는 중력에 의해 자연스럽게 롤링하며 제2 포스트(520) 또는 제2 포스트(520) 사이에 배치된 세포외 기질에 부착된다.
일 실시예로, 제1 기간은 제1 세포(C1)가 제1 배양 채널(210)에서 자가 조립하여 혈관망(C1')을 형성하고, 제2 세포(C2)가 있는 제2 배양 채널(310)에서 신생 혈관을 생성하는데 소요되는 기간일 수 있다.
일 실시예로, 제3 세포(C3)는 자궁 내막의 특이적 세포인 자궁 내막 상피 세포일 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 자궁 내막 모사 방법은 자궁 내막의 특이적 세포인 자궁 혈관 내피 세포, 자궁 내막 섬유아세포 및 자궁 내막 상피 세포를 다층 구조로 배양함으로써 실제 자궁을 생체 적합하게 모사할 수 있다.
일 실시예로, 제3 세포 배양 챔버(600)에 제2 세포(C2)를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 세포 배양 챔버(200)와 제2 세포 배양 챔버(300)에 각각 제2 세포(C2)와 제2 세포(C2)를 배양한 다음, 배양액을 주입하기 전에 제3 세포 배양 챔버(600)에 제2 세포(C2)를 배양한다. 제3 세포 배양 챔버(600)의 제3 세포 주입구(630)를 통해 제2 세포(C2)를 주입한 다음, 생체 모사 칩(10)을 적절한 각도로 기울여 제2 세포(C2)를 제3 배양 채널(610)로 이동시킨다(도 4c 참조).
이때, 제3 배양 채널(610)로 이동한 제2 세포(C2)는 소정의 간격(d3)으로 이격된 복수 개의 제3 포스트(530) 상에서 롤링하며 일정한 패턴으로 배치된다. 이에 따라, 제2 세포(C2)를 제3 배양 채널(610)에서 패터닝할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 자궁 내막 모사 방법은 자궁 내막 섬유아세포인 제2 세포(C2)를 복층으로 배치할 수 있다. 따라서, 제2 세포(C2)가 생성하는 혈관 내피 세포 성장 인자의 절대량이 증가하여 제1 세포(C1)의 혈관 생성을 촉진할 뿐만 아니라, 혈관이 일 방향(예를 들어, 도 4e의 윗쪽)으로 성장하도록 방향성을 부여할 수 있다.
도 5는 제1 세포(C1)가 혈관을 생성하는 상태를 나타내고, 도 6은 제1 세포 배양 챔버(200)와, 제2 세포 배양 챔버(300)와, 제3 세포 배양 챔버(600)의 조합에 다른 제1 세포(C1)의 상태를 나타내고, 도 7a는 도 6에 따른 제1 세포 배양 챔버(200)의 혈관 면적을 나타내고, 도 7b는 도 6에 따른 제2 세포 배양 챔버(300)의 혈관 면적을 나타낸다.
또한, 도 8은 혈관 생성 인자에 따른 혈관 생성 상태를 나타내고, 도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩 장치를 이용한 세포 생존도 실험과 혈관의 regression 실험 결과를 나타내고, 도 10a는 자궁 내막 상피 세포의 투과도 테스트를 나타내는 비교예이고, 도 10b는 자궁 내막 상피 세포의 투과도 테스트를 나타내는 발명예이고, 도 11a는 비교예와 발명예의 자궁 내막 상피 세포의 두께를 나타내고, 도 11b는 발명예의 투과도를 나타내고, 도 12는 약물 처리에 따른 형광 물질의 혈관 투과 상태를 나타내고, 도 12C는 도 12A와 도 12B의 투과도를 나타내고, 도 13은 본 발명을 이용한 배아 착상 테스트를 나타낸다.
본 발명에 따른 생체 모사 칩(10)은 자궁 내막의 특이적 세포인 자궁 내막 상피 세포, 자궁 내막 섬유아세포 및 자궁 혈관 내피 세포를 다층적으로 배치하여, 자궁 내막 조직의 특성을 모사할 수 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 생체 모사 칩(10)은 각각의 챔버에서 배양되는 세포의 상태를 확인하고, 약물에 대한 세포의 정량, 정성 반응을 실시간으로 모니터링할 수 있다.
보다 구체적으로, 도 5(a) 내지 도 5(c)는 생체 모사 칩(10)의 시간에 따른 자궁 내막 모사 상태를 나타내는 것으로, 도 5(a)는 1일차, 도 5(b)는 6일차, 도 5(c)는 8일차를 나타낸다.
1일차에는 자궁 혈관 내피 세포인 제1 세포(C1)(형광 주황색)이 제1 세포 배양 챔버(200)에서 배양되는 상태를 확인할 수 있다. 6일차에는 제2 세포 배양 챔버(300) 및/또는 제3 세포 배양 챔버(600)에 자궁 내막 섬유아세포인 제2 세포(C2)가 배양되고 나서, 제1 세포(C1)가 자가 조립하여 혈관망이 생성되는 것을 확인할 수 있다. 그리고 8일차에는 제1 배양액 챔버(400)에 자궁 내막 상피 세포인 제3 세포(C3)(형광 녹색)가 배양되고, 제1 세포(C1)에서 비롯된 신생 혈관이 제2 세포 배양 챔버(300)에서 성장하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 6(a)는 제1 세포 배양 챔버(200)에 제1 세포(C1)만이 배치되는 경우, 도 6(b)는 제2 세포 배양 챔버(300)에 제2 세포(C2)가 추가로 배치되는 경우, 그리고 도 6(c)는 제3 세포 배양 챔버(600)에 제2 세포(C2)가 더 배치되는 경우를 나타낸다.
도 6 내지 도 7a, 도 7b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 제1 세포 배양 챔버(200)에 제1 세포(C1)만이 배치되는 경우는 다른 경우에 비해 제1 세포 배양 챔버(200)의 혈관 면적이 매우 좁고, 특히 제2 세포 배양 챔버(300)로는 혈관이 전혀 성장하지 않음을 알 수 있다. 반면, 제2 세포 배양 챔버(300)와 제3 세포 배양 챔버(600)에 각각 제2 세포(C2)가 배양되는 경우, 제2 세포(C2)에서 생성되는 혈관 내피 세포 성장 인자에 의해 제1 세포 배양 챔버(200)와 제2 세포 배양 챔버(300)에서 혈관의 면적이 매우 넓고, 혈관이 제2 세포(C2)를 향해 뚜렷한 방향으로 생성되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 8(a) 내지 도 8(d)는 생체 모사 칩(10)에 대해 서로 다른 혈관 유도 인자를 주입한 상태를 나타내는 것으로, 도 8(a)는 혈관 유도 인자를 주입하지 않은 상태, 도 8(b)는 혈관 유도 인자로서 혈관 신생 효과를 갖는 S1P(Sphingosine-1-phosphate; 스핑고신 1-인산)를 주입한 상태, 도 8(c)는 혈관 유도 인자로서 혈관 내피 세포 성장 인자인 VEGF를 주입한 상태, 그리고 도 8(d)는 S1P와 VEGF를 모두 주입한 상태를 나타낸다.
이와 같이, 본 발명에 따른 생체 모사 칩(10)은 각각의 혈관 유도 인자의 주입 상태에 따라 혈관의 면적, 길이 및 배향 등 성장 상태를 시각적으로, 그리고 실시간으로 확인할 수 있다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 모사 칩(10)에 약물(응급 피임약; levonogestrel)을 서로 다른 양(약물 처리 하지 않음(control), 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1000 ng/ml, 10000 ng/ml)으로 투입했을 때, 제3 세포(C3)가 배양되는 제1 배양액 챔버(400, 도 9a의 Epithelium layer)와, 제2 세포(C2)가 배양되는 제2 세포 배양 챔버(300, 도 9a의 Stromal layer)의 세포 생존도(cell viability) 실험 결과와 혈관의 regression 실험 결과를 나타낸다.
도 10a는 비교예로서 자궁 내막 상피 세포와 자궁 혈관 내피 세포만을 배양한 상태를 나타낸다. 도 10a의 (a) 내지 (c)는 각각 형광 물질인 FITC-dextran을 투여하고 20 초, 100 초, 200 초가 지난 시점을 나타내는데, 자궁 내막 상피 세포가 지나치게 두꺼워(도 11a 참조) 형광 물질이 자궁 내막 상피 세포를 제대로 투과하지 못하는 것을 확인할 수 있다. 이에 따라, 자궁 내막 상피 세포와 자궁 혈관 내피 세포만을 배양할 경우, 자궁 내막의 투과도를 측정할 수 없었다.
반면, 도 10b는 발명예로서 자궁 내막 상피 세포, 자궁 내막 섬유아세포 및 자궁 혈관 내피 세포를 모두 배양한 상태를 나타낸다. 도 10b의 (a) 내지 (c)는 각각 FITC-dextran을 투여하고 20 초, 100 초, 200 초가 지난 시점을 나타내는데, 자궁 내막 상피 세포가 상대적으로 얇은 것을 알 수 있다(도 11a 참조). 이에 따라, 본 발명과 같이 자궁 내막 상피 세포, 자궁 내막 섬유아세포 및 자궁 혈관 내피 세포를 모두 배양할 경우, 자궁 내막의 투과도를 측정할 수 있었다.
도 11b는 각각 70 kDa와 10 kDa의 형광 물질(FITC-dextran)을 이용하여 본 발명에 따른 생체 모사 칩 장치(10)에서 자궁 내막의 투과도(permeability coefficient)를 산출한 결과를 나타낸다. 자궁 내막의 투과도는 아래의 식으로 계산될 수 있다.
Figure 112020064736192-pat00001
여기서 Iw는 자궁 내막 상피 세포의 두께, IJ는 자궁 내막 상피 세포 외부의 평균 밝기, I는 자궁 내막 상피 세포의 내부 공간, 즉, 자궁 내막 공간의 밝기를 나타낸다.
이와 같이, 본 발명에 따른 생체 모사 칩(10)은 자궁 내막과 생체 적합한 상태를 모사함으로써 자궁 내막에 대한 다양한 약물 반응성을 실험할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 생체 모사 칩(10)은 자궁 내막 상피 세포의 투과도를 측정할 수 있다. 또한, 이에 기초하여 피임약 투여에 따른 자궁 내막 상피 세포의 투과도를 정량적으로 측정할 수 있다.
도 12는 약물 처리에 따른 형광 물질의 투과 상태를 나타낸다. 보다 구체적으로, 도 12는 약물을 처리하지 않은 경우(control)와, 약물로서 응급 피임약을 처리(10 μg/ml)한 경우에, 형광 물질 투입 후 시간(20 초, 100 초, 200 초)에 따른 형광 물질의 투과 상태를 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 아무런 아무런 처리를 하지 않은 경우에는 형광 물질의 투과가 상대적으로 느린 반면, 약물을 처리한 경우에는 형광 물질의 투과가 상대적으로 빠른 것을 알 수 있다. 또한, 약물을 처리했을 때의 형광 물질의 투과도가 그렇지 않은 경우에 비해 훨씬 큰 것을 알 수 있다.
도 13(a) 및 도 13(b)는 제1 배양액 챔버(400)에 배아(인조 배아로서 비드(bead))가 착상된 상태를 나타낸다.
보다 구체적으로, 생체 모사 칩(10)에 자궁 내막 상피 세포, 자궁 내막 섬유아세포 및 자궁 혈관 내피 세포가 배양된 상태에서, 배아를 주입한다. 배아는 제1 배양액 챔버(400)를 통해 주입될 수 있다. 그리고 주입된 배아가 중력에 의해 자연적으로 착상될 수 있도록 생체 모사 칩(10)을 수직으로 세워, 배양을 진행한다.
전술한 바와 같이, 제2 세포 배양 챔버(300)와 제1 배양액 챔버(400)의 경계 상에는 복수 개의 제2 포스트(520)가 소정의 간격(d2)으로 배치되며, 그 주위에는 자궁 내막 상피 세포가 배양된다. 특히, 본 발명에 따른 생체 모사 칩(10)의 제2 포스트(520)는 종래의 생체 모사 장치에 비해 넓은 간격으로 배치된다. 이에 따라, 배아는 제2 포스트(520)의 곡면을 따라 롤링하면서 자연스럽게 제2 포스트(520)의 사이에 각각 배치될 수 있다.
본 발명에 따른 3차원 생체 모사 칩 및 자궁 내막 모사 방법은 다층 구조를 이루는 복수 개의 챔버에 서로 다른 세포를 배양하여 자궁 내막을 3차원으로 모사할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 3차원 생체 모사 칩 및 자궁 내막 모사 방법은 자궁 내막 특이적 세포(예를 들어, 자궁 내막 섬유아세포, 자궁 내막 상피세포, 자궁 혈관 내피세포)를 이용하여 자궁 내막과 생체 유사성이 높은 생체 모사 칩을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 3차원 생체 모사 칩 및 자궁 내막 모사 방법은 각종 자궁 질환을 치료하기 위한 약물 실험에 사용되거나, 환자 맞춤형 치료에 사용될 수 있는 생체 모사 칩을 제공할 수 있다.
본 명세서에서는 본 발명을 한정된 실시예를 중심으로 설명하였으나, 본 발명의 범위 내에서 다양한 실시예가 가능하다. 또한 본 명세서에서 명시적으로 설명하지는 않았으나, 실시예와 균등한 수단도 또한 본 발명에 그대로 결합되는 것이라 할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.
10: 생체 모사 칩
100: 플레이트
200: 제1 세포 배양 챔버
300: 제2 세포 배양 챔버
400: 제1 배양액 챔버
500: 포스트
600: 제3 세포 배양 챔버
700: 제2 배양액 챔버

Claims (13)

  1. 플레이트와, 복수 개의 챔버와, 상기 복수 개의 챔버 사이에 배치되는 복수 개의 포스트를 포함하는 자궁 내막을 모사하는 3차원 생체 모사 칩으로서,
    상기 복수 개의 챔버는
    내부에 서로 다른 세포가 배양되는 채널을 구비하며, 상기 플레이트 상에 일 방향으로 나란히 배치되고, 적어도 일부 구간이 연통하도록 서로 인접하여 배치되고,
    상기 복수 개의 챔버는
    제1 배양 채널을 구비하고, 제1 세포가 배양되는 제1 세포 배양 챔버;
    상기 제1 세포 배양 챔버의 일측에 배치되고, 상기 제1 배양 채널과 연통하는 제2 배양 채널을 구비하며, 제2 세포가 배양되는 제2 세포 배양 챔버; 및
    상기 제2 세포 배양 챔버의 일측에 배치되고, 상기 제2 배양 채널과 연통하는 제1 배양액 채널을 구비하며, 배양액이 주입되는 제1 배양액 챔버;를 포함하는, 생체 모사 칩.
  2. 삭제
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 배양 채널과, 상기 제2 배양 채널과, 상기 제1 배양액 채널은 하나의 바디로 이루어진, 생체 모사 칩.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 제2 세포 배양 챔버와 대향하도록 상기 제1 배양액 챔버의 타측에 배치되고, 상기 제1 배양액 채널과 연통하는 제3 배양 채널을 구비하며, 상기 제2 세포가 배양되는 제3 세포 배양 챔버를 더 포함하는, 생체 모사 칩.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 배양액 챔버와 대향하도록 상기 제1 세포 배양 챔버의 타측에 배치되며, 상기 제1 배양 채널과 연통하는 제2 배양액 채널을 구비하고, 배양액이 주입되는 제2 배양액 챔버를 더 포함하는, 생체 모사 칩.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 배양액 챔버는
    상기 제1 세포 및 상기 제2 세포가 각각 상기 제1 세포 배양 챔버 및 상기 제2 세포 배양 챔버에 주입되고 제1 기간이 지난 후에 제3 세포가 주입되는, 생체 모사 칩.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 복수 개의 포스트는
    상기 제1 배양 채널과 상기 제2 배양 채널의 경계를 따라 제1 간격으로 배치되는 복수 개의 제1 포스트; 및
    상기 제2 배양 채널과 상기 제1 배양액 채널의 경계를 따라 제2 간격으로 배치되는 복수 개의 제2 포스트;를 포함하고,
    상기 제2 간격은 상기 제1 간격보다 큰, 생체 모사 칩.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 복수 개의 포스트는 일면이 볼록한 곡면을 갖는 다각 기둥 형상인, 생체 모사 칩.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 세포는 자궁 내막의 특이적 세포인 자궁 내막 상피 세포, 자궁 내막 섬유아세포 및 자궁 혈관 내피 세포 중 적어도 어느 하나인, 생체 모사 칩.
  10. 일 방향으로 나란히 배치되며 서로 연통하는 복수 개의 챔버에 서로 다른 세포를 배양하여, 자궁 내막을 3차원으로 모사하는 방법으로서,
    제1 세포 배양 챔버에 제1 세포를 배양하는 단계;
    제2 세포 배양 챔버에 제2 세포를 배양하는 단계;
    제1 배양액 챔버에 배양액을 주입하는 단계; 및
    제1 기간 후에, 상기 제1 배양액 챔버에 제3 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 자궁 내막 모사 방법.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 배양액을 주입하는 단계 전에, 제3 세포 배양 챔버에 상기 제2 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는, 자궁 내막 모사 방법.
  12. 제10 항에 있어서,
    상기 제1 세포는 자궁 혈관 내피세포이고, 상기 제2 세포는 자궁 내막 섬유아세포이고, 상기 제3 세포는 자궁 내막 상피세포인, 자궁 내막 모사 방법.
  13. 제12 항에 있어서,
    상기 제1 기간은
    상기 제2 세포가 상기 제2 세포 배양 챔버에서 자가 조립(self-assembly)하여, 혈관이 상기 제1 세포 배양 챔버에서 생성되는 기간인, 자궁 내막 모사 방법.
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