CN112135900A - 用于t细胞活化和扩增以用于免疫疗法的三维生物反应器 - Google Patents

用于t细胞活化和扩增以用于免疫疗法的三维生物反应器 Download PDF

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Abstract

本发明涉及三维(3D)生物反应器在用于免疫疗法的T细胞扩增中的应用。

Description

用于T细胞活化和扩增以用于免疫疗法的三维生物反应器
发明领域
本公开内容涉及三维(3D)生物反应器在用于免疫疗法的T细胞扩增中的应用。在本发明中描述的生物反应器也能够用于其他淋巴细胞例如B细胞和天然杀伤细胞或通常非贴壁细胞的扩增。
背景
癌症免疫疗法(其代表着医学中生物技术革命的最新阶段)是利用患者自身的免疫系统来治疗癌症。最近的成功案例是基于嵌合抗原受体(CAR)T细胞的癌症治疗。典型的CAR T细胞疗法过程是这样的过程：其中将从患者自身血液收集的T淋巴细胞遗传改造以在其表面上产生特殊的受体CAR，从而使得T细胞能够识别和攻击癌细胞。经过改造的CAR T细胞在实验室中生长，并扩增到数以亿计的数量，然后被注射回患者体内以杀死癌细胞。
随着CAR T细胞疗法的成功，下一个问题是如何使其更安全和更具成本效益。当前的T细胞改造过程通常仍基于使用磁珠来与T细胞一起孵育。磁珠在其表面上用CD3和CD28涂布以充当活化T细胞的抗原，以使得它们能够增殖。悬浮在具有T细胞的细胞培养基中的微珠为T细胞提供了相对较大的表面区域以与CD3和CD28接触并暂时结合，然后活化。在T细胞生长到一定密度后，将T细胞和磁珠移入相对较大的生物反应器(例如GE的WAVE生物反应器)中，以继续刺激和扩增的过程。重复该过程多次以生长相对大量的T细胞。收获时，必须使用磁力分离器将T细胞与珠子分离。因此，当前的T细胞扩增过程通常依赖于磁珠、多阶段处理和手动相互作用，这不具有成本效益。此外，它是一个开放式系统，其可以容易地引入污染物并使其相对更昂贵(expansive)以满足良好操作规范(GMP)的要求。
因此，仍然需要通过提供改善的生物反应器设计、具有成本效益的制造技术以及改善的生物反应器操作能力以达到临床应用剂量要求来改善细胞扩增、特别是T细胞扩增的方法和装置。
概述
用于T细胞扩增的方法包括：(a)提供3D生物反应器，该3D生物反应器包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D＞d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有不超过+/-10.0％变化的所选空隙体积(V)；和(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；(b)提供在所述生物反应器的用于细胞扩增的表面区域上的聚多巴胺涂层；(c)提供附着于所述聚多巴胺涂层的四聚体蛋白，例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白；(d)提供固定在所述四聚体蛋白上的一种或多种生物素化抗体；(e)使T细胞流过具有T细胞受体的所述3D生物反应器并被活化，其中所述T细胞受体与所述生物素化抗体结合；(e)将活化的T细胞暴露于含有信号传导分子(例如细胞因子)的灌注培养基中，以促进T细胞扩增。
附图的简要说明
图1示出了3D生物反应器固定床的剖视图。
图1a示出了生物反应器的单元负模型，其显示了相邻球体的重叠。
图1b示出了单元负模型，其中每个球被12个相同的相邻球体包围。
图1c示出了3D生物反应器固定床的几何形状，其显示了相互连接的空隙系统。
图1d以断面图示出了3D生物反应器固定床的几何形状。
图1e以2D视图示出了3D生物反应器的被识别的球形空隙及其重叠区域，用以在球形空隙之间形成相互连接的孔。
图2示出了定位在具有用于流体灌注的入口和出口的壳体中的3D生物反应器固定床。
图3示出了典型的3D生物反应器灌注系统。
图4a、4b、4c和4d显示了流过3D生物反应器的流速分布。
图4e指示流过3D生物反应器的流速的标尺。
图5a和5b示出了3D生物反应器中的表面剪切应力的分布。
图5c指示以Pa为单位的剪切应力的标尺。
图6a示出了圆柱形3D生物反应器中沿流动方向的压降(梯度)。
图6b指示压力的标尺。
图7a示出了通过FDM 3D打印产生的3D生物反应器固定床。
图7b示出了与生物反应器腔室一起的3D生物反应器固定床。
图7c示出了3D生物反应器的入口和出口。
图7d示出了组装的3D生物反应器。
图7e示出了通过SLA 3D打印产生的3D生物反应器固定床。
图7f示出了通过DLP 3D打印产生的3D生物反应器固定床。
图8示出了放置在3D生物反应器的入口和出口处以接近层流的两个流体分配器。
图9示出了当使用流体分配器时流过3D生物反应器的流速分布。
图10a和10b示出了通过替代的成孔剂浸出方法形成3D生物反应器。
图11示出了将抗体固定在3D生物反应器的球形空隙体积上以用于结合和活化T细胞。
图12示出了用于T细胞活化和扩增的无珠子的基于闭环灌注的3D生物反应器。
图13示出了不同浓度的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白涂层的荧光强度。荧光标记的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白用于显示涂布在生物反应器表面上的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的浓度。
图14示出了在抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上的生物素涂层的荧光强度。荧光标记的生物素用于显示结合到抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上的生物素的浓度。
图15示出了使用抗体涂布的磁珠和生物反应器基质相对于没有抗体涂层的生物反应器基质孵育(静态)的T细胞生长(在珠子活化之后)。
图16分别示出了用具有抗体涂层的珠子、生物反应器基质和不具有抗体涂层的生物反应器基质孵育(静态)的T细胞活化和扩增。
图17示出了在使用连续灌注的3D生物反应器中的T细胞活化和扩增。
优选实施方案的详述
本公开内容涉及基于灌注的可扩展生物反应器设计，其具有用于实现用于免疫疗法目的的T细胞扩增的相应操作能力。来自患者的T细胞的活化和扩增(例如在基因修饰后)提供了一种治疗性T细胞产品，其能够被灌注回给患者，并以选择性地靶向并杀死患者的肿瘤细胞的方式使用患者自身的免疫系统。
本文中提及的生物反应器是指这样的公开的3D反应器，其中可以在所选的环境和操作条件下实施生物和/或生化过程。这包括以下一项或多项的控制：空隙的几何形状/大小，空隙之间的相互连接的孔径以及包括的空隙的总数(确定生物反应器的整体尺寸)。另外，可以选择性地控制表面涂层、流过生物反应器内的空隙的流动特性、pH、温度、压力、氧气、营养物供应和/或废物去除。临床剂量要求是指提供109个细胞或更多的剂量的能力。
3D生物反应器的首选固定床10在图1中一般性地以剖视图示出，其显示了优选的经填充的和球形的空隙结构及其在球形空隙之间的相互连接的孔的实例。更具体地，生物反应器包含连续的相互连接的3D表面区域12，其提供了在抗体存在的情况下结合细胞的能力，并且还在生物反应器内限定了多个相互连接的非随机空隙14，如图所示的，其优选为具有内部凹面的球形以最大化表面与体积的比率。空隙被理解为一定体积的开放空间。在提及非随机时，应理解，如今能够识别出3D生物反应器中的目标或所选数量的空隙，其导致所需公差的实际重复空隙大小和/或几何形状。
在提及连续表面时，应理解，扩增的细胞能够容易地从一个表面区域位置迁移到3D生物反应器内的另一个位置，并且该表面不包括任何随机打断，例如表面的随机断裂或0.1mm或更大的随机间隙。优选地，3D生物反应器内用于细胞扩增的表面区域的50％或更多是连续表面，更优选3D生物反应器内60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多或者99％或更多的表面区域是连续的。
另外，生物反应器固定床10包括在空隙之间的非随机的相互连接孔开口16。再次，提及的非随机应理解为如今能够识别出空隙的具有所选孔径的目标或所选数量的孔，其导致实际数量的具有所需公差的孔径的孔。如剖视图所示，生物反应器最终还限定了一层非随机空隙(参见箭头“L”)，并且可以理解的是，生物反应器的多个层随后可以允许在一列内识别出多个这样的非随机空隙(参见箭头“C”)。
生物反应器可以由生物相容性或生物惰性的聚合材料制成，例如在FDM(熔融沉积成型)3D打印技术中使用的聚苯乙烯、聚碳酸酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)。提及生物相容性或生物惰性应理解为对培养细胞无毒的材料。另外，用于3D生物反应器的聚合物材料优选选自在细胞培养期间不易水解的那些聚合物，使得水解的量不超过存在的聚合物材料的5.0重量％，更优选地，其不超过2.5重量％，最优选不超过1.0重量％。生物反应器也可以由在SLA(立体光刻)和DLP(数字光处理)3D打印技术中使用的生物相容性材料(例如，聚(甲基丙烯酸甲酯)或PMMA等)制成。
优选用于制造生物反应器的材料在水性介质中不可降解，并且可提供机械稳定的结构以耐受在细胞扩增期间的水性介质流动。优选的是，材料和制造工艺可以产生用于单层细胞扩增的固体和光滑的相互连接的表面区域。在提及固体表面时，应理解该表面使得其将减少或阻止通常具有约20微米至100微米直径的培养细胞的渗透或包埋。优选地，本文中的3D生物反应器是包含具有表面粗糙度值(Ra)的表面的生物反应器，该值是指在评价长度内记录的相对于平均线的轮廓高度偏差的绝对值的算术平均值。因此，本文预期3D生物反应器表面的Ra将具有小于或等于20μm，更优选地小于或等于5μm的值。
本文中的3D生物反应器还优选是由指示至少10或在10-95的范围内以及更优选在45-95的范围内的邵氏D硬度的材料形成的生物反应器。在这方面，还值得注意的是，本文的3D生物反应器是不使用包括一定量的交联并且吸收大量的水(例如10-40重量％)的水凝胶型结构(其可以理解为亲水型聚合物结构)的生物反应器。还值得注意的是，本文的3D生物反应器是优选不使用胶原蛋白、藻酸盐、血纤蛋白和细胞易于消化并进行重塑的其他聚合物的生物反应器。
此外，本文的3D生物反应器优选是由具有至少0.01GPa的拉伸模量的材料制成的3D生物反应器。更优选地，拉伸模量具有以0.01GPa增量在0.01GPa至20.0GPa的范围内的值。甚至更优选地，用于3D生物反应器的材料的拉伸模量在0.01GPa至10.0GPa或1.0GPa至10GPa的范围内。例如，对于较早引用的适用于制造本文的3D生物反应器的聚合物材料，聚苯乙烯指示约3.0GPa的拉伸模量，聚碳酸酯为约2.6GPa，ABS为约2.3GPa，PLA为约3.5GPa，PCL为约1.2GPa，和PMMA为约3.0GPa。
具有这种优选的规则几何特征和连续表面区域的3D生物反应器设计优选地通过增材制造技术(例如FDM、选择性激光烧结(SLS)、立体光刻(SLA)、数字光处理(DLP)3D打印技术等)根据例如可由SolidWorksTM计算机辅助设计(CAD)程序提供的计算机生成的设计来制造。
作为优选实例，下文描述了利用SolidWorksTM生成3D生物反应器设计的过程。最初生成负生物反应器的计算机模型。更具体地，例如使用重叠的填充的6.0mm直径的球体(其重叠以生成球体之间1.0mm直径的连接孔)来产生可因此被描述为负3D生物反应器的模型。当然，在本公开内容的广泛上下文内可以预期其他可能的尺寸。
球体优选地组织成六边形密填充(HCP)网格，以产生有效(或紧密)填充的几何形状，其导致每个球体被12个相邻球体包围。这种示例性几何形状的单格在图1a中示出。更具体地，在图1a中有HCP网格的单格，其中顶部的三个球体展示为半透明的以显示相邻球体之间的6个径向重叠区域。在这些重叠区域处形成孔。优选地，孔的最大数量为12以优化填充。最小孔数量是2，以便允许通过3D生物反应器的空隙的培养基灌注。因此，存在于3D生物反应器中的至少90.0％至100％的空隙每个空隙具有至少2个孔开口。更优选地，3D生物反应器中至少90.0％至100％的空隙每个空隙具有8-12个孔开口。在一个特别优选的实施方案中，3D生物反应器中至少90.0％至100％的空隙每个空隙具有12个孔开口。
在图1b中，示出了该单元的所有球体。然后优选地通过逆转负模型以生成包含图1c中显示的相互连接的球形空隙系统的正模型来产生生物反应器几何形状。此外，在图1d中可以再次以剖视图查看3D生物反应器，其提供了在14处的以剖视图显示的具有规则的几何特征(基本上与上文描述的相同的空隙体积控制)的相互连接的空隙和相应的相互连接的孔开口16的图示。
在上文描述的优选的规则几何3D生物反应器中，可以识别出空隙直径和相互连接的孔的直径之间的关系。参见图1e。对于这种优选的几何形状，球形空隙1以实线圆表示，直径为D(由箭头指示)。因此，直径“D”可以理解为内部空隙表面上任意两点之间的最长距离。球形空隙2由虚线圆表示，并且也将具有直径D(未示出)。球形空隙2是球形空隙1的12个相邻空隙之一。由于相邻空隙之间的重叠，它在球形空隙之间形成相互连接的孔，其直径为“d”，如由大体上水平的箭头所示。直径“d”因此可以理解为在孔开口处的任何两个点之间的最长距离。空隙的总3D球形表面区域为SA空隙＝4×π×(D/2)2。A和B之间的表面区域称为Scap＝π×D×h，其中
Figure BDA0002783694320000081
3D生物反应器中给定空隙的有用空隙表面将为SAu＝SA空隙–[12×Scap]。
空隙直径D越小，能够被填充到一组3D空间(体积)中的空隙数量越大，因此导致更大的整体细胞结合表面。然而，为了最小化或防止细胞聚集以阻止灌注，对于这种几何形状，孔的最小直径优选d＝0.2mm。孔的直径d可以在0.2mm至10mm的范围内，并且更优选在0.2mm至2.0mm的范围内。最优选地，d≥0.5mm并且在0.5mm至2.0mm的范围内。
如果D＝0.40mm或更小，则当d＝0.2mm时，计算出的SAu小于0，这导致不可能的结构，因此，对于这种3D生物反应器几何形状，D必须>0.4mm。然而，D可以具有0.4mm至100.0mm，更优选地0.4mm至50.0mm，以及也可以在0.4mm至25.0mm的范围内的值。D的一个特别优选的值落入2.0mm至10.0mm的范围内。具有相对较大的D值的球形空隙可能会降低在相同生物反应器体积内尽可能多地增加细胞培养表面区域的目标。因此，对于图1e中所示的优选几何形状，D＞0.4mm(空隙的直径)，d＞0.20mm(孔的直径)。还值得注意的是，对于空隙的直径D的在0.4mm至100.0的范围内的任何所选值，和对于孔的直径d的在0.2mm至10.0mm的范围内的任何所选值，D的值大于d的值(D>d)。
如今可以理解的是，本文的3D生物反应器可以就其非随机特征来表征。优选地，3D生物反应器内的所有空隙都使得它们具有基本上相同的体积，以实现最有效的3D空间填充并提供最大的对应连续表面区域。关于在任何给定的3D生物反应器中存在的相互连接的空隙的总数，优选地，90.0％或更多的这样的空隙，或者甚至95.0％或更多的这样的空隙，或者甚至99.0％至100％的这样的空隙具有空隙体积(V)，其公差为使得其变化不超过+/-10.0％或+/-5.0％或+/-2.5％或+/-1.0％或+/-0.5％或+/-0.1％。应当注意的是，虽然图1中的空隙被显示为大体上球形，但是考虑了其他空隙几何形状。选择空隙的直径以最小化或避免细胞聚集，并为细胞培养提供最大的有用表面区域。
本文的3D生物反应器的另一个非随机特征是空隙之间的孔开口，其具有直径d(再次参见图1e)。与上文所述类似，空隙之间的90.0％或更多的孔隙，或甚至95.0％或更多的孔隙，或甚至99.0％至100％的孔隙指示d的值，其公差变化不超过+/-10.％，或+/-5.0％，或+/-2.5％或+/-1.0％，或+/-0.5％或+/-0.1％。
因此，如今可以理解的是，本文中用于非贴壁细胞生长的3D生物反应器包含用于细胞结合的表面区域、具有直径D(内部空隙表面上任意两点之间的最长距离)的多个空隙、在所述空隙之间的具有直径d(孔开口的任意两点之间的最长距离)的多个孔开口，其中D＞d。此外，90％或更多的空隙具有变化不超过+/-10.0％的空隙体积(V)，以及90％或更多的孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
另外，本文中用于扩增非贴壁细胞如T细胞的3D生物反应器可包含具有直径D1的第一多个空隙、在所述第一多个空隙之间的具有直径d1的多个孔开口，其中D1>d1，其中90％或更多的第一多个空隙具有公差变化不超过+/-10.0％的空隙体积(V1)。此类3D生物反应器还可以包含具有直径D2的第二多个空隙、在所述第二多个空隙之间的具有直径d2的多个孔开口，其中D2>d2，其中90％的第二多个空隙具有公差变化不超过+/-10.0％的空隙体积(V2)。V1和V2的值不同，并且超出它们的公差变化。换句话说，V1的值(包括其+/-10.0％的公差)和V2的值(包括其+/-10.0％的公差)是不同的，或者[V1+/-10.0％]≠[V2+/-10.0％]。
因此，空隙内的表面的曲率半径(Rc)优选为1/0.5(D)，或1/0.2mm＝5mm-1或更低。优选地，Rc可以具有0.2mm-1至1.0mm-1的值，其对应于10.0mm至2.0mm的D值。高曲率(大的Rc)表面提供与典型的单层2D培养物(其也可能诱发细胞表型变化)相比显著不同的环境。
细胞优选结合在3D生物反应器的相互连接的球形空隙表面上。这种3D结构优选地是可扩展的，并且能够提供相对较高的表面与体积比以用于使用相对较小面积的细胞扩增生物反应器进行相对较大的细胞扩增。表面区域与体积比也优选由球形空隙的直径确定。直径越小，表面区域与体积比越高。优选地，空隙提供相对“平坦”的表面(即，≤1.0mm-1的低曲率半径)以用于具有5μm至100μm的尺寸的细胞，以及还用以减少或避免细胞聚集。另外，如上所述，通过控制相互连接的孔的直径d，也可以减少或避免细胞聚集，该直径优选为至少500μm，但是要注意，可以是大于200μm的任何尺寸。
生物反应器固定床10因此可以优选地用作一次性使用的3D生物反应器，如图2中进一步所示。更具体地，生物反应器10可以定位在壳体18中，然后放置在可以提供流体的流入和流出的入口和出口隔室20中。优选地，可以使用增材制造技术将生物反应器10、壳体18以及入口和出口隔室20制造为单个部件。如图3所示，壳体18以及入口和出口隔室20中的生物反应器10可以成为用于MSC扩增的整个3D生物反应器系统的一部分。更具体地，优选将3D生物反应器放置在灌注系统内，该灌注系统通过3D生物反应器输送细胞培养基和氧气以用于促进细胞生长。2D T培养瓶中使用的多次传代细胞扩增方法也能够直接应用于3D生物反应器，除了3D生物反应器具有等于10、100或1000个T培养瓶的细胞培养面积。
如今可以理解的是，取决于相互连接的空隙的直径，本文的3D生物反应器提供相对较大的表面与体积比。举例来说，限定了5cm直径和15cm高度的圆柱体的常规滚瓶提供了236cm2的细胞生长表面区域。如果使用相同的体积来用2.0mm直径的相互连接的空隙封入本文的3D生物反应器中，则总共可以将44,968个球形空隙填充到该空间中，从而可以提供具有约5,648cm2表面区域的基质，这几乎是滚瓶表面区域的24倍。
与中空纤维或基于微载体的生物反应器相比，本文的3D生物反应器的至少一个独特特征是能够提供大的相互连接的连续表面而不是碎片化的表面的能力。因此，本文中的3D生物反应器内的连续表面预期能够使细胞更自由地从一个区域迁移到另一个区域。使用图3中所示的灌注系统，预期可以容易地在生物反应器内部产生营养物或细胞信号的梯度以诱导细胞迁移。
结合本文所述用于制备3D生物反应器的优选3D打印技术，如今可以使用计算流体力学(CFD)来模拟生物反应器内部的培养基流动，并估算3D相互连接的表面内部任何位置的流速和剪切应力，并允许进行优化以改善细胞培养环境。更具体地，CFD被用来模拟流过本文的生物反应器的3D相互连接的空隙的流动特性，并估计(1)流速；(2)压降；和(3)壁面剪切应力的分布。可以理解，后一个参数(剪切应力)对于细胞扩增是重要的。剪切应力的减小能够减少或防止剪切诱导的细胞分化。
在下文报告的模拟中使用了直径为17.5mm、高度为5.83mm、空隙直径为2mm、孔径为0.5mm的小规模(以增加计算机模拟速度)圆柱形3D生物反应器。在这种情况下，生物反应器的直径(Φ＝17.5mm)与高度(H＝5.83mm)之比为3:1(图1d)，这是降低生物反应器的入口和出口之间营养物和氧气的梯度的最佳比率。基于固定床球形表面上可用的细胞密度，估算氧气和营养物消耗率，并确定需要更换细胞培养基的频率(即体积流速)。在此模拟中，假定38.5μm/sec的整体线性流速。使用38.5μm/sec速率的层流作为3D生物反应器的输入，CFD结果如图4-6所示。
图4a、4b、4c和4d显示了整个小规模圆柱形3D生物反应器的流速分布。图4e指示流速的标尺。更具体地，图4a指示从生物反应器的侧面观察的流速分布。流动使每个球形空隙沿着流动方向穿过孔。图中的白色/灰色区域是球形空隙之间的没有流体流动的实心区域。通过与图4e中的彩色速度标尺进行比较，图4a指示在孔处沿流动方向的流速达到200μm/s至240μm/s的最大流速。相反，球形表面附近的流速降低到0.06μm/s到19.0μm/s的最小值，这将显著减少对驻留在球形表面上的细胞的流动引起的剪切应力。
图4b指示从生物反应器的顶部到3D结构的中心截面观察的速度分布。再次，该图像显示了最大速率在沿着流动方向的球形空隙的孔的每个中心处。该最大速率再次在200μm/s至240μm/s的范围内。球形表面附近的流速再次较低，具有0.06μm/s至19.0μm/s的值。
图4c指示了单个球体空隙的速度分布，显示了流过径向相互连接的孔的流动。图4c从而提供了球形空隙内部的流动分布的有用图示。高流速是在空隙的没有细胞的空的中央空间处，并且处于200μm/s至240μm/s的水平。细胞驻留在凹形的空隙表面上，在那里流速降低，并且流速再次处于0.06μm/s至19.0μm/s的水平。因此，这种独特的结构可以保护细胞避免暴露于相对较高的流动应力。这是本文所述的3D生物反应器相对于例如基于微载体的反应器的另一个明显优势，在基于微载体的反应器中，细胞在直径为300μm至400μm的具有凸形球形表面的微珠的外表面生长，该微珠悬浮在细胞培养基中并在生物反应器中搅拌以向细胞输送营养物和氧气。驻留在这样的凸形球形表面上的细胞可能暴露在达到0.1Pa的相对较大的剪切应力下，这已知影响细胞的形态、通透性和基因表达。图4d指示沿着流动方向通过侧孔的流动轨迹，指示本文的3D生物反应器提供相对均匀的流动模式以在整个过程中提供营养物和氧气。
因此，在优选的3D生物反应器内部计算出的最大线性流速为200μm/s至240μm/s，其在2.0mm直径空隙之间的0.5mm直径的相互连接的孔处沿流动方向上发生。如图4a-4e所示，虽然流动优先在沿着流动的中心方向上，但是在球形表面附近仍然有流动(约19.0μm/sec)，以允许营养物供应到驻留在球形表面上的细胞。因此，预期细胞能够驻留在整个结构的任何地方并在任何位置繁衍，因为营养物可以通过在整个3D生物反应器结构中的流动对流和扩散提供。
图5a和5b显示了在整个上述圆柱形3D生物反应器上以及在单个球形空隙表面上的表面剪切应力的分布。图5c指示以Pa为单位的剪切应力的标尺。在相互连接的孔的边缘观察到最高的剪切应力。这是由于这些位置处的较高流速引起的。然而，生物反应器内的大多数有用球形表面区域指示小于3×10-4Pa的剪切应力，这可以理解为生物反应器的90％或更多的表面区域。这提供了细胞增殖，而没有剪切诱导的分化。此外，据信即使4.0×10-3Pa的最大剪切应力也低于在基于中空纤维的生物反应器、波动生物反应器和基于微载体的生物反应器中培养时细胞经历的平均剪切应力。因此，与现有的细胞扩增生物反应器相比，本文的3D生物反应器预期为细胞生长提供相对较低的剪切应力环境。参见例如Large-ScaleIndustrialized Cell Expansion:Producing The Critical Raw Material ForBiofabrication Processes,A.Kumar and B.Starly,Biofabrication 7(4):044103(2015)。
图6a示出了从上述圆柱形3D生物反应器的底部到顶部沿着流动方向的压降。图6b提供了适用的压力标尺。该图指示生物反应器的入口和出口之间的总压降小于或等于1.0Pa。因此，压降可能在0.1Pa至1.0Pa的范围内。换句话说，生物反应器的入口和出口附近的细胞不会经历明显的压力差。低的压力梯度提示这种设计还将在生物反应器的入口和出口之间在营养物/代谢物浓度上产生小的梯度(或差异)。低的梯度归因于生物反应器的设计，其使得直径Φ大于高度H，而总生物反应器体积保持不变。这优于中空纤维生物反应器。难以制造具有Φ>H比率以减小生物反应器的入口和出口之间的营养物/代谢物的梯度的中空纤维生物反应器。
还对具有不同纵横比(即Φ:H比率，Φ：生物反应器固定床的总直径，H：生物反应器固定床的总高度)的相同总体积的圆柱形3D生物反应器进行了比较。见图1d。如表1所示，对于相同的体积流速(体积流速＝流动的横截面积×线速度)，对于具有低的Φ:H比率的生物反应器，线速度显著增加。线速度的增加还增加了表面剪切应力、压降以及入口和出口之间营养物/代谢物浓度的梯度，这将对细胞扩增产生不利影响。因此，优选将公开的固定床3D生物反应器设计成Φ：H比率结构，例如在大于1:1且多至100:1的范围内的Φ:H比率。优选地，Φ:H比率大于1:1且多至10:1。
表1：具有不同纵横比的3D生物反应器的流速比较
# 比率(Φ:H) 直径(Φ)(cm) 高度(H)(cm) 流速(μm/sec)
1 3:1 10.5 3.5 38.5
2 1:1 7.5 7.5 75.4
3 1:3 5 15 169.8
图7a示出了通过FDM 3D打印产生的3D生物反应器固定床部件，其具有相互连接的6mm直径的空隙和1mm的相互连接的孔。该3D生物反应器用ABS细丝打印。该特定的3D生物反应器的直径(Φ)和高度(H)分别为4.28cm和1.43cm。因此，Φ:H比为3:1。固定床中包含约134个相互连接的开放空隙。用于细胞培养的相互连接的连续球形表面区域总面积SAu约为152cm2。入口和出口壁以及在入口和出口处的流体分配器22(图8)提供了用于细胞培养的额外的88cm2表面区域。换句话说，在3D生物反应器中有用于细胞附着的约240cm2的总有用表面区域。流体分配器可以改善通过生物反应器的层流。如果雷诺数小于2100或在大于0至2100(不包括2100)的范围内，则流体分配器是可选的。
图7b显示了3D生物反应器的固定床被溶剂结合到生物反应器腔室中。这将密封固定床和腔室壁之间的间隙，这将迫使灌注细胞培养基穿过相互连接的孔而不是通过那些间隙。优选地，固定床和腔室被打印在一起作为整合部分以提高制造效率。图7c示出了生物反应器的入口和出口。它们在几何学上被设计为促进通过固定床的层流。生物反应器的入口任选地包含内置的旋转齿轮，其可耦合到步进电机以控制生物反应器的旋转以用于均匀的细胞接种(请参见下文)。整合的生物反应器在图7d中示出并能够连接到1/8英寸的管道以进行流体流动。可替代地，入口和出口可以被制成用于重复使用，其中仅内部生物反应器固定床是一次性的。在图7e中还示出了通过具有3.0mm空隙和0.5mm孔的DLA 3D打印产生的相对较小尺寸的3D生物反应器固定床。图7f是使用具有相同直径的3.0mm空隙和0.5mm孔的DLP 3D打印的相对较大尺寸的3D生物反应器固定床。当按比例放大生物反应器时，维持生物反应器的内部结构。因此，可以按比例放大灌注体积流速同时使局部线性流速保持相同。以这种方式，在按比例放大过程中需要最小的工艺改变，这可以减少工艺开发成本。
接下来应注意，流体分配器22(图8)优选地使得其将改善通过3D生物反应器的流动均匀性。入口、出口和流体分配器的设计还优选考虑以下因素：(1)改善通过3D生物反应器的流动均匀性；(2)最小化入口和出口处的死体积24，以减少生物反应器的总灌注量(priming volume)；(3)防止在生物反应器内的气泡聚集。图9显示了通过使用流体分配器基于CFD模拟的整个3D生物反应器的流速分布。流体分配器(图8)的使用改善了流动均匀性。最大流速(约30μm/s)和最小流速(约10μm/s)彼此相对接近，并用于促进均匀的层流(即，流体在相对平行的层中流动)。生物反应器中各处的相对均匀的流速还将为驻留在生物反应器中不同位置处的细胞提供较小的剪切应力差异。
可以通过其他增材制造技术例如选择性激光烧结(SLS)、立体光刻(SLA)、数字光处理(DLP)等来制造3D生物反应器，图7e、7f。
除了通过增材制造或3D打印制备本文的3D生物反应器之外，预期还可以通过传统的成孔剂浸出法制备3D生物反应器以提供相互连接的细胞培养表面。图10a和10b显示了利用成孔剂浸出方法的3D生物反应器。这是指将成孔剂和聚合物在模具中组合，然后从成孔剂浸出以产生孔。图10a中的3D生物反应器开始于将4.0mm水溶性球形糖珠子(作为致孔剂)通过摇动、敲击和挤压珠子来紧密地填充在圆柱形不锈钢模具中的步骤，使得珠子接触。珠子之间的间隙填充有含5.0重量％的去离子水的丙酮。随后在真空室中蒸发丙酮和水过夜。然后在珠子之间的间隙中填充低粘度的可聚合乙烯基单体(例如苯乙烯)以及聚合引发剂(例如苯甲酰基或叔丁基过氧苯甲酸酯)。然后苯乙烯单体将聚合形成聚苯乙烯。样品在90℃下保持8-12小时，然后加热到115℃持续另外3小时，并从烤箱中取出以提供图10a中所示的物体。然后将糖珠浸出，同时浸入超声水浴中，以获得具有相互连接的空隙的聚苯乙烯3D生物反应器固定床。参见图10b。然后将3D生物反应器用甲醇萃取三天，以去除任何残留的苯乙烯单体。然而，成孔剂浸出方法不仅具有复杂的制造工艺，而且由于成孔剂珠子的填充是随机的过程，因此难以获得可精确再生的结构。
对于使用ABS或PMMA的3D打印的生物反应器(图7d)，优选对生物反应器的疏水内表面进行修饰以允许细胞粘附。聚多巴胺被用作生物反应器表面的底漆涂层，以便其他蛋白质可以通过聚多巴胺涂层容易地粘附到生物反应器表面。将生物反应器表面在溶解于10mM Tris缓冲液(pH＝8.5，在25℃)中的0.25mg/mL多巴胺中孵育约18小时，从而形成有效的聚多巴胺层用于后续的蛋白涂布。在聚多巴胺沉积在生物反应器表面后，其他蛋白质可以通过迈克尔加成和/或席夫碱反应与功能性配体结合。因此，配体分子包含亲核官能团，例如胺和硫醇官能团。
根据以上所有内容如今应当理解，本文公开的3D生物反应器的另外的特征之一是如今可以设计这样的3D生物反应器，其具有特定几何学和空隙体积要求以及相应的可用表面区域要求，并且能够以相对最小的变化实现(即在制造或生产期间)这样的目标。例如，如今可以识别出3D生物反应器的设计要求，其中一个或多个内部空隙要具有目标空隙体积“Vt”，而3D生物反应器本身要具有用于细胞培养的目标总表面区域面积“SAt”。因此，如今可以形成这样的3D生物反应器，其中一个或多个内部空隙具有在Vt的+/-10.0％之内或更优选地在Vt的+/-5.0％之内的实际空隙体积“Va”。类似地，用于细胞培养的实际表面区域面积SAa在SAt的+/-10.0％或更优选在SAt的+/-5.0％之内。此外，还可以为目标空隙内的内表面识别出用于制造的目标几何形状，例如目标曲率半径“Rct”，然后在制造中如今可以实如今Rct的+/-5％之内的空隙内表面的实际曲率半径“Rca”。
本发明进一步涉及使用上文参考的本文的3D生物反应器，以提供用于免疫疗法目的的T细胞扩增。参考图11，其示出了将抗体固定在生物反应器的球形空隙体积表面上，以用于结合和活化T细胞。更具体地说，对于3D生物反应器，如今可以通过生物素-抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白结合机制将抗体(生物素缀合的球形蛋白)例如抗CD3和抗CD28抗体固定在生物反应器表面。如上所述，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白通过聚多巴胺底漆涂层被预先涂布在生物反应器表面上。更具体地，在将聚多巴胺涂层施加到本文的3D生物反应器的表面上之后，可以附着对生物素具有亲和力的四聚体蛋白(具有四个亚基的四级结构的蛋白质)例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。因此，可以依靠具有四级结构的蛋白质(抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)将生物素化的抗体例如抗CD3抗体固定在生物反应器表面上。生物素化的抗体是指将生物素共价附着于抗体。当T细胞流过生物反应器时，它们将通过T细胞表面受体(例如CD3，经由CD3、抗CD3抗体结合)结合并活化。然后，将活化的T细胞暴露于含有信号传导分子的灌注培养基，以提供T细胞扩增。信号传导分子可优选包括细胞因子信号传导分子，例如白介素-2(IL-2)。然而，应该注意的是，在本发明的广义范围内，预期可以排除使用聚多巴胺涂层的需要，并将抗体(例如抗CD3抗体)直接固定在3D反应器的表面上，将抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白直接固定在生物反应器表面上以结合生物素化抗体。
通过使用本文的3D生物反应器，如图12所示的用于T细胞扩增的基于闭环灌注的系统如今是可能的。更具体地，图12示出了用于T细胞活化和扩增的没有珠子的基于闭环灌注的3D生物反应器。灌注系统优选地包含细胞安全的蠕动泵和培养基/细胞贮存器，其能够添加培养基以稀释细胞密度用于更有效的细胞扩增或交换培养基以维持在扩增过程中的营养物浓度。培养基贮存器也可以用作氧合器，其中使用气体灌注以及搅拌或摇动机制来混合营养物和氧气。通过3D生物反应器灌注的培养基中的悬浮T细胞有很多机会接触球形表面上的CD3和CD28抗体，从而被活化。在较大表面上固定CD3和CD 28预期为T细胞提供与在当前T细胞扩增系统中使用的磁珠相同的刺激。在没有珠子的情况下，该过程将大大简化。此外，此闭环系统还促进自动化和有成本效益的cGMP细胞生产。
表1列出了三种不同大小的生物反应器的尺寸、培养表面区域面积、具有相等总表面区域面积的磁珠的数量、预期的培养基体积等。PMMA(其是FDA批准的可植入生物相容性材料)用于使用DLP 3D打印机制造生物反应器。表1还列出了构建用于构建经鉴定的3D生物反应器的大致材料成本。
表1：使用SLA/DLP 3D打印制造不同大小的3D生物反应器的尺寸和成本
PBMC接种能力 2.5×10<sup>7α</sup> 2.2×10<sup>8</sup> 2.2×10<sup>9</sup>
生物反应器直径(cm) 2.1 4.2 9.0
生物反应器高度(cm) 0.7 1.4 3.0
表面积(cm<sup>2</sup>) 29 250 2500
等同面积的珠子的数量 7.5×10<sup>7</sup> 6.5×10<sup>8</sup> 6.5×10<sup>9</sup>
培养基体积(mL) 2 14 136
构建材料体积(mL) 0.78 5.4 53.6
材料成本<sup>β</sup> $0.20 $1.34 $13.4
α基于3:1的珠子:细胞比率
β仅基质，不包括生物反应器的入口和出口；还假设直径3mm的中空球体和0.5mm的孔径生物反应器表面上抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)的涂布
为了模拟Miltenyi MACSiBead系统，使用抗生物素蛋白(链霉抗生物素蛋白)和生物素结合机制来将抗CD2、CD3和CD28抗体固定在生物反应器表面上。首先，测试了不同浓度的荧光标记的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白(图13)，并且发现100μg/mL的抗生物素蛋白或30μg/mL的链霉抗生物素蛋白在生物反应器表面上实现了相对较高的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白涂布密度。图13显示了在不同浓度下抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白涂层的荧光强度。荧光标记的抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白用于测试可结合到聚多巴胺底漆涂层上的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的浓度。抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白涂布的优选程序描述如下。抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的涂布浓度可以进一步优化：
1)在本文首先将生物反应器表面用聚多巴胺涂布。
2)将抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白溶解在TRIS缓冲液(pH8.5)中以制备涂布溶液，其中抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的浓度分别为100μg/mL或30μg/mL。将生物反应器浸入涂布溶液中12小时，轻轻摇动并使其免受光线照射。
3)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)彻底清洗支架。然后将支架留在PBS中准备用生物素化抗体涂布。
然后关于不同浓度的作为第二层涂层以结合抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白基础层的荧光标记的生物素进行比较(图14)，并鉴定1.0μg/mL的生物素成功结合固定的蛋白抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。参见图14，其鉴定了抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上的生物素涂层的荧光强度(与生物素浓度成正比)。在确认生物素可以成功结合到涂布有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的生物反应器表面后，将生物素化的抗CD2、CD3和CD 28抗体施加到该生物反应器用于T细胞活化和扩增。
为了优选地将抗体涂层施加到直径为2.1cm的支架上(即等同于约7.5×107个珠子的总表面)：
1)从BPS中取出生物反应器支架
2)从支架上除去尽可能多的PBS，但不要让支架干燥。
3)在15mL试管中合并200μL的100μg/mL CD2-生物素、200μL的100μg/mL CD2-生物素和200μL的100μg/mL CD28-生物素，加入1.4mL的抗体标记缓冲液(不含Ca2+和Mg2+的PBS，pH＝7.2，加上0.5％热灭活的胎牛血清和2mM EDTA)，并充分混合以制成总共2mL生物素化抗体，其中每种抗体的各自浓度为10μg/mL。
4)在12孔板中加入2mL混合抗体以覆盖生物反应器基质(没有入口和出口，图7e)，上下吸移以混合。
5)在轻轻摇动的情况下在冰箱中于黑暗下在基质中孵育2小时。
6)用PBS彻底洗掉支架上未结合的抗体。
可将聚多巴胺、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白和生物素化抗体的涂布程序扩大，以涂布整个生物反应器(即生物反应器基质加上入口和出口)的内表面。
针对T细胞扩增，比较使用的抗体涂布的生物反应器基质和磁珠孵育的T细胞
将抗体涂布的基质(无入口和出口)与Miltenyi MACSiBeadTM系统进行了比较。根据制造商的方案，将磁珠(已附着有链霉抗生物素蛋白)用生物素化的抗CD2、CD3和CD28抗体进行涂布，该过程类似于涂布程序。使用表1中列出的相对较小的2.1cm直径×0.7cm高度的生物反应器(图7e)。生物反应器基质与12孔板的孔相称，使得可以容易地比较珠子和基质的性能。使用上文描述的优选程序首先使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白然后使用生物素化的CD2、CD3、CD28抗体涂布三种生物反应器基质。相同浓度的抗体用于涂布生物反应器基质和MACSiBeads。一种具有链霉抗生物素蛋白涂层的生物反应器基质没有进一步用抗体涂布，其用作阴性对照。
首先根据制造商的方案使用MACSiBeads活化并扩增(7天)人外周血CD3+Pan T细胞(ReachBio Research Labs)，然后从磁性颗粒中去除珠子。然后将4.5×106个T细胞分别添加至12孔板的四个孔中。四个孔(各自填充有3mL培养基(补充有10％胎牛血清和20IU/mL人IL2的RPMI 1640)分别包含1)7.5×106个抗体涂布的磁珠、2)抗体涂布的链霉抗生物素蛋白-基质、3)抗体涂布的抗生物素蛋白-基质和4)没有抗体涂层的链霉抗生物素蛋白-基质。在第3天将另外的培养基添加到孔中。在第5天，将细胞分到具有另外的珠子和基质的两个孔中。从磁珠或基质解离后，在第3、5和7天对每个孔中的T细胞数量进行计数。
图15显示了与没有抗体涂层的基质相比，用抗体涂布的磁珠和基质孵育的T细胞生长(活化后)。T细胞在抗体涂布的基质中的生长趋势与抗体涂布的珠子中的生长趋势相似。然而，用没有抗体的基质孵育的T细胞不发生增殖，可能是由于缺乏持续刺激。在此实验中，将基质在静态条件下置于孔中。因此，预期结果与基于灌注的生物反应器不同。此实验清楚地表明，抗体成功涂布在生物反应器的基质表面上，并且它们影响了T细胞生长。
针对T细胞活化和扩增，比较使用抗体涂布的生物反应器基质和磁珠孵育的外周血单个核细胞(PBMC)
用PBMC代替分离的T细胞进行了与上述相似的研究。通常，PBMC(包括T细胞和其他单核细胞例如B细胞、NK细胞、单核细胞)从患者收集，并直接用于细胞扩增而无需T细胞分离。这是因为非T细胞不会被CD2、CD3和CD28活化，并且在没有活化的情况下在几天后它们会被天然消除。该实验与图15中的实验的另一个不同之处在于当使用抗体涂布的基质时活化步骤的掺入。简言之，将2mL含有2.5×106个细胞/mL的密度的PBMC的培养基添加到12孔板的三个孔中。这三个孔分别包含1)7.5×106个抗体涂布的磁珠、2)抗体涂布的链霉抗生物素蛋白-基质和3)没有抗体涂层的链霉抗生物素蛋白-基质。在此实验中未使用抗生物素蛋白涂布的基质，因为在最后两个实验中链霉抗生物素蛋白显示出优于抗生物素蛋白的效果。将PBMC在每个孔中孵育两天以进行活化。然后将另外的含有IL2细胞因子的培养基添加到孔中，使得培养基具有20IU/mL的人IL2以开始扩增阶段。在5天的培养过程中总细胞数的变化示于图16中。这证实了用抗体涂布的基质扩增的T细胞比用抗体涂布的磁珠扩增的T细胞产生更多的T细胞。这也证实了抗体涂布的基质可以提供等同或更好的T细胞活化和扩增。
基于动态灌注的T细胞扩增
如本文所述制造基于灌注的3D生物反应器。3D生物反应器的内表面通过用聚多巴胺涂布12小时来制备。然后用链霉抗生物素蛋白涂布生物反应器内表面12小时。然后将生物反应器用70％乙醇孵育以进行灭菌。灭菌后，将内表面用PBS洗涤，并用CD2、CD3和CD28-生物素缀合物的等量混合物(每种抗体的10μg/mL的浓度)涂布，以使用上文所述的程序将抗体固定在生物反应器的内表面上。
如图12所示设置灌注回路。具有Cytoflow泵头的Masterflex L/S(Cole-Parmer)(其被设计用于泵送活细胞和对剪切敏感的流体)用于灌注系统。由于此应用将使用相对较小的生物反应器，并且预期灌注速率相对较低，因此采用了通过气体扩散到培养基和培养基液滴的定制氧合单元来代替氧合器。
将约20×106个PBMC接种到准备好的生物反应器灌注系统中。通过以2mL/min循环15分钟使细胞均匀分布。在活化阶段(即不包含细胞因子IL2的灌注培养基)期间，在第1天以0.1mL/min的速率和在第2天以0.14mL/min的速率灌注T细胞。在两天的活化后，测定细胞密度并向系统添加具有人IL-2的培养基，使得总IL-2浓度为20IU/mL。T细胞扩增阶段以0.2mL/min的灌注速率进行3天。在第5天测定细胞密度，结果示于图17中。类似于图15和16中所示的静态实验，在活化后获得了三倍扩增的T细胞。

Claims (22)

1.一种用于T细胞扩增的方法，其包括：
提供3D生物反应器，所述3D生物反应器包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D>d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的所选空隙体积(V)；并且(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；
提供在所述生物反应器的用于细胞扩增的表面区域上的聚多巴胺涂层；
提供附着于所述聚多巴胺涂层的四聚体蛋白；
提供固定在所述四聚体蛋白上的一种或多种生物素化抗体；
使T细胞流过具有T细胞受体的所述生物反应器并被活化，其中所述T细胞受体与所述一种或多种生物素化抗体结合；
将活化的T细胞暴露于含有信号传导分子的灌注培养基中以促进T细胞扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述四聚体蛋白包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物素化抗体包括抗CD3抗体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物素化抗体包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物素化抗体包括抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗CD2抗体。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号传导分子包括细胞因子信号传导分子。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述空隙的直径(D)大于0.4mm，并且所述孔的直径(d)大于0.20mm。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述空隙的直径(D)在大于0.4mm至100.0mm的范围内。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述孔的直径(d)在0.2mm至10.0mm的范围内。
10.根据权利要求1所述的方法，其中95.0％或更多的所述空隙指示变化不超过+/-10.0％的空隙体积(V)。
11.根据权利要求1所述的方法，其中99.0％至100％的所述空隙指示变化不超过+/-10.0％的空隙体积(V)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在所述空隙之间的95.0％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在所述空隙之间的99.0至100％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
14.根据权利要求1所述的方法，其中存在的至少90.0％的空隙每个空隙具有2个孔开口。
15.根据权利要求1所述的方法，其中存在的至少90.0％的空隙每个空隙具有8至12个孔开口。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述空隙具有内部凹面。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述空隙包含球形空隙。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述球形空隙在3D圆柱形空间中具有大于64.0％的填充效率。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述3D生物反应器由具有至少0.01GPa的拉伸模量的材料形成。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述3D生物反应器由生物相容的材料形成。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述3D生物反应器由在细胞培养期间不易水解的材料形成，使得水解的量不超过存在的材料的5.0重量％。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物反应器具有直径Φ和高度H，并且比率Φ:H在大于1:1至100:1的范围内。
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