KR102552344B1 - 면역요법을 위한 t 세포의 활성화 및 증폭용 3차원 생물반응기 - Google Patents

면역요법을 위한 t 세포의 활성화 및 증폭용 3차원 생물반응기 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역요법을 위한 T 세포 증폭용 3차원 (3D) 생물반응기의 이용에 관한 것이다.

Description

면역요법을 위한 T 세포의 활성화 및 증폭용 3차원 생물반응기
본 발명은 면역요법을 위한 T 세포 증폭용 3차원 (3D) 생물반응기의 이용에 관한 것이다. 본 발명에 기술된 생물반응기는 일반적으로 B 세포 및 자연 살상 세포와 같은 기타 림프구 또는 비-부착성 세포를 증폭시키기 위해 이용할 수 있다.
암 면역요법은 의학에서 가장 최신의 생물공학 혁명 단계로서, 암을 치료하기 위해 환자 자신의 면역 시스템을 이용한다. 최근 성공 사례는 만성 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포-기반의 암 치료이다. 전형적인 CAR T 세포 요법의 과정은 T 림프구를 환자 자신의 혈액에서 수집하여, T 세포가 암 세포를 인지하여 공격할 수 있도록 표면에 특정 수용체 CAR을 생산하도록 유전자 조작하는 것이다. 조작된 CAR T 세포는 실험실에서 배양하여 수 십억개로 증폭한 후 암 세포를 사멸시키기 위해 환자에게 다시 주입된다.
CAR T 세포 요법의 성공에 이어, 다음 과제는 이를 더 안전하고 비용 효율적으로 만드는 가이다. 현행 T 세포 조작 과정은 여전히 일반적으로 자기 비드를 T 세포와 함께 인큐베이션하는 방법에 기반한다. 자기 비드는 항원으로서 작동하기 위해 표면이 CD3 및 CD28로 코팅되어, T 세포가 증식할 수 있도록 이를 활성화한다. 세포 배양 배지에 현탁된 미세-비드는, CD3 및 CD28에 접촉하고 일시적으로 결합한 다음 활성화할 수 있도록, T 세포에게 비교적 넓은 표면적을 제공해준다. T 세포는 특정 밀도로 배양된 후, GE의 WAVE 생물반응기와 같은 비교적 큰 생물반응기로 T 세포와 자기 비드를 이동시켜, 자극 및 증폭 과정을 계속 진행한다. 이러한 과정은 여러번 반복하여, T 세포를 상대적으로 다량으로 배양한다. T 세포는, 회수한 후, 자기 분리기를 사용해 비드로부터 분리시켜야 한다. 이에, 현행 T 세포 증폭 과정은 일반적으로 자기 비드, 다-단계 처리 및 수동 상호작용에 의존하며, 비용-효율적이지 않다. 또한, 이는 개방형 시스템이므로, 오염물의 유입이 용이할 수 있으며, 우수 제조 공정 (good manufacturing process, GMP) 요건을 충족하기에는 상대적으로 비용이 많이 든다.
따라서, 임상적인 적용 용량 요건을 달성하기 위해 개선된 생물반응기 디자인, 비용-효율적인 제작 기법 및 개선된 생물반응기 작동 능력을 제공함으로써, 세포 증폭, 특히 T 세포 증폭을 개선하기 위한 방법 및 장치가 여전히 필요한 실정이다.
T 세포 증폭 방법은, (a) 세포 증폭을 위한 표면적을 가진 복수의 공동 (void)을 포함하는 3D 생물반응기를 공급하는 단계로서, 상기 복수의 공동은 직경 D를 가지며, 상기 공동들 사이의 존재하는 복수의 개기공 (pore opening)은 D> d인 직경 d를 가지며, 여기서, (a) 90% 이상의 공동이 편차 +/- 10.0%를 초과하지 않는 선택된 공동 용적 (V)를 가지고; (b) 공동들 사이의 개기공의 90% 이상이 편차 +/- 10.0%를 초과하지 않는 d 값을 가지는, 단계; (b) 세포 증폭을 위해 생물반응기 표면적에 폴리도파민 코팅을 제공하는 단계; (c) 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 테트라머 단백질을 폴리도파민 코팅에 부착하는 단계; (d) 테트라머 단백질 상에 하나 이상의 바이오틴화된 항체를 고정하는 단계; (e) T 세포 수용체를 갖는, 생물반응기를 통해 T 세포를 유동시키는 단계로서, T 세포 수용체는 바이오틴화된 항체에 결합하고 활성화가 이루어지는, 단계; (e) 활성화된 T 세포를 신호전달 분자 (예, 사이토카인)를 함유한 관류 매질 (perfusion media)에 노출시켜 T 세포 증폭을 촉진하는 단계를 포함한다.
도 1은 3D 생물반응기 고정상의 단면도를 나타낸 것이다.
도 1a는 인접 구체들의 중첩을 나타낸 생물반응기의 유닛 네거티브 모델 (unit negative model)을 도시한 것이다.
도 1b는 각 구체가 12개의 동일한 인접 구체들로 둘러싸인 유닛 네거티브 모델을 도시한 것이다.
도 1c는 상호 연결된 공동 시스템을 보여주는 3D 생물반응기 고정상의 기하학적 구조를 도시한 것이다.
도 1d는 3D 생물반응기 고정상 기하학적 구조를 보여주는 횡단면도이다.
도 1e는 3D 생물반응기에서 확인되는 구형 공동, 및 구형 공동들 간에 상호 연결된 기공을 형성하는 공동들의 중첩 영역을 2D로 도시한 것이다.
도 2는 유체 관류를 위한 유입구 및 유출구가 구비된 하우징 (housing) 안에 배치된 3D 생물반응기 고정상을 도시한 것이다.
도 3은 전형적인 3D 생물반응기 관류 시스템을 도시한 것이다.
도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d는 3D 생물반응기를 통과하는 유속 프로파일 (flow rate profile)을 나타낸 것이다.
도 4e는 3D 생물반응기를 통과하는 유속 스케일을 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 3D 생물반응기의 표면 전단 응력 (surface shear stress)의 분포를 나타낸 것이다.
도 5c는 단위 Pa의 전단 응력 스케일을 나타낸 것이다.
도 6a는 원통형 3D 생물반응기의 유동 방향에 따른 압력 강하 (구배)를 나타낸 것이다.
도 6b는 압력 스케일을 나타낸 것이다.
도 7a는 FDM 3D 인쇄에 의해 생성된 3D 생물반응기 고정상을 예시한 것이다.
도 7b는 3D 생물반응기 고정상을 생물반응기 챔버와 함께 예시한 것이다.
도 7c는 3D 생물반응기의 유입구 및 유출구를 예시한 것이다.
도 7d는 조립된 3D 생물반응기를 예시한 것이다.
도 7e는 SLA 3D 인쇄에 의해 생성된 3D 생물반응기 고정상을 예시한 것이다.
도 7f는 DLP 3D 인쇄에 의해 생성된 3D 생물반응기 고정상을 예시한 것이다.
도 8은 층류 (laminar flow)에 도달하기 위한 3D 생물반응기의 유입구 및 유출구에 배치된 두 개의 유체 분배기를 예시한 것이다.
도 9는 유체 분배기를 사용할 경우의 3D 생물반응기를 통과하는 유속 프로파일을 예시한 것이다.
도 10a 및 도 10b는 대안적인 포로겐-침출법 (porogen-leaching method)에 의한 3D 생물반응기의 생성예를 예시한 것이다.
도 11은 T 세포에 결합하여 이를 활성화하기 위해 3D 생물반응기의 구형 공동 용적에 항체를 고정하는 방법을 예시한 것이다.
도 12는 T 세포 활성화 및 증폭용 3D 생물반응기를 이용한 비드-무함유성 폐루프 관류 (bead-free, closed loop perfusion) 시스템을 예시한 것이다.
도 13은 여러가지 농도에서 아비딘 및 스트렙타비딘 코팅제의 형광 강도를 나타낸 것이다. 형광-표지된 아비딘 및 스트렙타비딘을 사용해, 생물반응기 표면에 코팅된 아비딘 및 스트렙타비딘의 농도를 확인하였다.
도 14는 아비딘 또는 스트렙타비딘 상의 바이오틴 코팅의 형광 강도를 예시한 것이다. 형광-표지된 바이오틴을 이용해, 아비딘 또는 스트렙타비딘 상에 결합된 바이오틴의 농도를 확인하였다.
도 15는 항체-코팅된 자기 비드 및 생물반응기 매트릭스와 함께 배양 (정적 배양)한 (비드 활성화 후) T 세포의 증식을 항체 코팅되지 않은 생물반응기 매트릭스 비교하여 도시한 것이다.
도 16은 비드, 항체 코팅된 생물반응기 매트릭스 및 항체 코팅되지 않은 생물반응기 매트릭스와 배양 (정적 배양)한 경우의 T 세포 활성화 및 증폭을 각각 나타낸 것이다.
도 17은 3D 생물반응기에서 연속 관류 조건에서의 T 세포의 활성화 및 증폭을 나타낸 것이다.
본 발명은 면역요법을 위해 T 세포 증폭을 달성하기 위한 대응되는 작동 능력을 갖춘 관류-기반의 확장형 생물반응기 (perfusion-based scalable bioreactor) 디자인에 관한 것이다. 환자로부터 유래된, 예를 들어, 유전자-변형 후, T 세포의 활성화 및 증폭은, 환자에게 다시 주입하여 환자의 종양 세포를 선택적으로 타겟팅하여 사멸시키는 방식으로 환자 자신의 면역 시스템을 이용할 수 있는 치료학적 T 세포 산물을 제공해준다.
본원에서 생물반응기는 선택 환경 및 작동 조건에서 생물학적 및/또는 생화학적 공정을 구현할 수 있는 기술된 3D 반응기를 지칭한다. 이는 다음 중 하나 이상의 제어를 포함한다: 공동의 기하 구조/크기, 공동들 간에 상호 연결된 기공 크기, 및 포함된 공동의 총 수 (생물반응기의 전체 크기를 결정함). 또한, 표면 코팅, 생물반응기의 공동을 통한 유동 특징, pH, 온도, 압력, 산소, 영양분 공급 및/또는 폐기물 제거를 선택적으로 제어할 수 있다. 임상적인 용량 요건은 세포 109개 이상의 양을 제공하는 능력을 나타낸다.
3D 생물반응기의 바람직한 고정상 (10)은 일반적으로 도 1에서 컷-어웨이 도 (cut-away view)로 예시되는데, 도 1은 바람직한 패킹된 구형 공동 구조와 구형 공동들을 상호 연결하는 기공의 일 예를 보여준다. 보다 구체적으로, 생물반응기는, 항체 존재시 세포 결합력을 제공해주며; 또한 예시된 바와 같이 바람직하게는 표면/용적 비를 최대화하기 위해 내부 오목면을 가진 구 형상의, 복수의 상호 연결된 비-무작위 공동 (14)을 생물반응기 내에 또한 정의하는, 연속적으로 상호 연결된 3D 표면 영역 (12)을 포함한다. 공동은 일부 규정된 용적을 가진 개방된 공간으로서 이해된다. 비-무작위는, 바람직한 공차 (tolerance)를 가진 실제 반복되는 공동 크기 및/또는 기하 구조를 형성하는 공동을 3D 생물반응기에서 타겟 또는 선택 개수로 식별할 수 있는 것으로, 이해되어야 한다.
연속 표면은, 증폭 세포가 3D 생물반응기의 하나의 표면 영역 위치에서 다른 위치로 쉽게 이동할 수 있고, 표면이 임의의 무작위 중단, 예를 들어 표면에 무작위 파단 또는 0.1 mm 이상의 무작위 틈 (gap)이 없는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 세포 증폭을 위한 3D 생물반응기의 내부 표면 영역의 50% 이상이 연속 표면이고, 더 바람직하게는 3D 생물반응기의 내부 표면 영역의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상이 연속적이다.
또한, 생물반응기 고정상 (10)은 공동 사이에 상호 연결된 비-무작위성 개기공 (16)을 포함한다. 다시 말하면, 비-무작위는, 이것이 바람직한 공차를 가진 기공 직경의 기공을 실제 개수로 형성하는, 선택 기공 직경의, 공동에 대한 기공의 타겟 또는 선택 개수를 식별할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 컷-어웨이 도로 예시된 생물반응기는 또한 궁극적으로 비-무작위 공동들로 된 층 (화살표 "L" 참조)을 정의하며, 생물반응기의 다중 층들은 이러한 비-무작위 공동을 복수개로 컬럼 (화살표 "C" 참조)에서 식별가능할 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
생물반응기는 FDM (융합 증착 모델링) 3D 프린팅 기법에 사용되는 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴-부타다이엔-스티렌 (ABS), 폴리락트산 (PLA), 폴리카프로락톤 (PCL)과 같은, 생체적합한 또는 생체-불활성 폴리머 소재로 제조될 수 있다. 생체적합한 또는 생체-불활성은, 배양 세포에 무독성인 소재로서 이해되어야 한다. 또한, 3D 생물반응기의 폴리머 소재는 바람직하게는 가수분해되는 수준이 함유된 폴리머 소재의 5.0 중량%를 초과하지 않도록, 더 바람직하게는 2.5 중량%를 초과하지 않도록, 가장 바람직하게는 1.0 중량%를 초과하지 않도록, 세포 배양 중에 가수분해에 민감하지 않은 폴리머들로부터 선택된다. 또한, 생물반응기는 SLA (스테레오리소그래피) 및 DLP (디지털 라이트 프로세싱) 3D 프린팅 기법에 사용되는 생체적합한 소재 (예, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 또는 PMMA 등)로 제작할 수 있다.
생물반응기를 제작하는데 사용되는 소재는 수성 매질에서 분해 가능하지 않으며, 세포 증폭시 수성 매질의 흐름을 허용하기 위한 기계적으로 안정한 구조를 제공할 수 있는 것이, 바람직하다. 소재 및 제조 공정은 단층 세포 증폭을 위해 고형 (solid)의 매끈한 상호 연결된 표면적을 구축할 수 있는 것이 바람직하다. 고형 표면은, 배양 중인 세포의 침투 또는 임베딩 (embedding)을 줄이거나 또는 방지하고; 전형적으로 약 20 미크론 내지 100 미크론 직경을 가진, 표면으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 본원의 3D 생물반응기는 표면 거칠기 값 (Ra)을 가진 표면을 가진 것이며, 표면 거칠기는 조사 길이에서 기록한, 평균 라인으로부터 프로파일 높이 편차 절대값의 산술 평균이다. 즉, 본원에서는, 3D 생물반응기 표면의 Ra는 20 ㎛ 이하, 더 바람직하게는 5 ㎛ 이하의 값을 가질 것으로, 예상된다.
본원의 3D 생물반응기는 또한 바람직하게는 적어도 10, 또는 10-95 범위, 더 바람직하게는 45-95 범위의 쇼어 D 경도 (Shore D Hardness)를 가진 소재로부터 제조된 것이다. 이와 관련하여, 본원의 3D 생물반응기는, 어느 정도의 가교를 포함하고 물을 다량 (예, 10-40 중량%) 흡수하는, 친수성 타입의 폴리머 구조로서 이해될 수 있는, 하이드로겔 타입의 구조를 사용하지 않는 것이라는 점에서, 또한 주목할 수 있다. 또한, 본원의 3D 생물반응기는, 바람직하게는 세포가 쉽게 소화하여 리모델링할 수 있는, 콜라겐, 알기네이트, 피브린 및 기타 폴리머를 사용하지 않는다는 점에서, 주목할만하다.
아울러, 본원의 3D 생물반응기는, 바람직하게는, 0.01 GPa 이상의 인장 탄성률을 가지는 소재로 제조된 것이다. 더 바람직하게는, 인장 탄성률은 0.01 GPa 내지 20.0 GPa 범위의 값을 가지며, 증가 단위는 0.01 GPa이다. 보다 더 바람직하게는, 3D 생물반응기의 소재는 인장 탄성률이 0.01 GPa 내지 10.0 GPa, 또는 1.0 GPa 내지 10 GPa 범위이다. 예를 들어, 본원의 3D 생물반응기를 제조하는데 적합한 기존에 참조된 폴리머 소재의 경우, 폴리스티렌은 약 3.0 GPa, 폴리카보네이트는 약 2.6 GPa, ABS는 약 2.3 GPa, PLA는 약 3.5 GPa, PCL은 약 1.2 GPa, 그리고 PMMA는 약 3.0 GPa의 인장 탄성률을 나타낸다.
이러한 바람직한 규칙적인 기하학적 특징과 연속적인 표면을 가진 본원의 3D 생물반응기 디자인은, 바람직하게는, 예를 들어 SolidWorks™ 컴퓨터-지원 설계 (CAD) 프로그램에 의해 이용가능한 컴퓨터 생성 설계에 따라, FDM, 선택적 레이저 소결 (selective laser sintering, SLS), 스테레오리소그래피 (SLA), 디지털 라이트 프로세싱 (DLP) 3D 프린팅 기법 등과 같은 적층 가공 기법에 의해 제작된다.
바람직한 예로, 3D 생물반응기 디자인을 설계하기 위한 SolidWorks™ 이용 공정은 아래에서 설명한다. 먼저. 생물반응기 네거티브 (bioreactor negative)에 대한 컴퓨터 모델을 생성한다. 보다 구체적으로, 3D 생물반응기 네거티브로서 설명될 수 있는 것은, 예를 들어 6.0 mm 직경의 구체들이 중첩되어 구체들 간에 1.0 mm 직경의 연결 기공이 형성된 패킹을 이용해, 생성한다. 물론, 다른 가능한 치수도 본원의 넓은 의미에서 고려된다.
구체는 바람직하게는 조밀 육방 (hexagonal close packed, HCP) 격자로 구성되어, 각각의 구체가 12개의 이웃 구체들로 둘러싸인 효율적으로 (또는 기밀하게) 패킹된 기하 구조를 형성한다. 이러한 예시적인 기하 구조의 단위 셀 (unit cell)은 도 1a에 도시된다. 보다 구체적으로, 도 1a에는, 이웃 구체들 간의 방사상 중첩부 6곳을 보여주기 위해 상부 구체 3개가 반투명으로 표현된, HCP 격자의 단위 셀이 도시되어 있다. 이들 중첩부에서 기공이 형성된다. 바람직하게는, 기공의 최대 개수는 패킹 최적화를 위해 12개이다. 기공의 최소 개수는, 3D 생물반응기의 공동들을 통한 매질의 관류를 허용하기 위해, 2개이다. 따라서, 3D 생물반응기에 존재하는 공동들 중 적어도 90.0% 내지 100%가 공동 1개 당 2개 이상의 개기공을 가진다. 더 바람직하게는, 3D 생물반응기에서 공동들 중 적어도 90.0% 내지 100%가 공동 1개 당 8-12개의 개기공을 가진다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 3D 생물반응기에서 공동들 중 적어도 90.0% 내지 100%는 공동 1개 당 12개의 개기공을 가진다.
도 1b에, 단위의 모든 구체들이 예시된다. 생물반응기 기하 구조는, 바람직하게는, 네거티브 모델을 뒤집어 도 1c에 도시된 상호 연결된 구형 공동 시스템 (interconnected spherical void system)을 포함하는 파지티브 모델을 생성함으로써, 구축한다. 아울러, 도 1d에서 3D 생물반응기를 횡단면도로 다시 볼 수 있는데, 이는 규칙적인 기하학적 특징 (실질적으로 전술한 바와 같은 공동 용적에 대한 동일한 제어)과 상응하는 상호 연결된 개기공 (16)을 가진, 14에서 컷-어웨이 도로 도시된 상호 연결된 공동의 또 다른 예를 보여준다.
전술한 바람직한 규칙적인 기하학적 3D 생물반응기에서, 공동 직경과 상호 연결된 기공 직경 간의 관계를 확인할 수 있다. 도 1e를 주목한다. 이러한 바람직한 기하학적 구조에서, 구형 공동 1은 실선의 원으로 표시되고, 직경은 D (화살표로 표시)이다. 따라서, 직경 "D"는 내부 공동의 표면에 위치한 임의의 두 지점 간의 최장 거리로서 이해될 수 있다. 구형 공동 2는 점선의 원으로 표시되며, 역시 직경 D (도시되지 않음)를 가질 것이다. 구형 공동 2는 구형 공동 1의 이웃 공동 12개 중 하나이다. 이웃 공동 간의 중첩으로, 이는 일반적으로 수평 화살표로 또한 표시된 직경 "d"를 가진, 구형 공동들을 상호 연결하는 기공이 형성된다. 따라서, 직경 "d"는 개기공에 위치한 임의의 두 지점 사이의 최장 거리로서 이해될 수 있다. 공동의 전체 3D 구형 표면적은 SA공동 = 4×π×D/2)2이다. A와 B 사이의 표면적은 Scap = π×D×h이고, 여기서
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이다. 3D 생물반응기에 구비된 공동의 유용 공동 표면 (useful void surface)은 SAu = SA공동 - [12×Scap]일 것이다.
공동 직경 D가 작을수록, 세트 3D 공간 (부피)에 더 많은 수의 공동이 패킹될 수 있으며, 따라서 전체 세포 결합 표면은 더 넓어진다. 그러나, 세포 응집을 최소화하거나 또는 방지하기 위해, 이러한 기하 구조에서는 기공의 최소 직경 d = 0.2 mm가 바람직하다. 기공의 직경 d는 0.2 mm 내지 10 mm, 더 바람직하게는 0.2 mm 내지 2.0 mm의 범위에 포함될 것이다. 가장 바람직하게는, d ≥ 0.5이며, 0.5 mm 내지 2.0 mm의 범위에 포함된다.
D = 0.40 mm 또는 그 미만일 경우, SAu 계산값은 d = 0.2 mm일 때 0보다 작아 구조상 불가능하므로, 이 3D 생물반응기 기하학적 구조에서는 D > 0.4 mm이어야 한다. 그러나, D는 0.4 mm 내지 100.0 mm, 더 바람직하게는 0.4 mm 내지 50.0 mm, 또한 0.4 mm 내지 25.0 mm 범위의 값을 가질 수 있다. 특히 바람직한 D 값은 2.0 mm 내지 10.0 mm의 범위이다. D 값이 비교적 큰 구형 공동은 동일한 생물반응기 용적에서 세포 배양 표면적을 가능한 한 넓이고자 하는 목표를 떨어뜨릴 수 있다. 따라서, 도 1e에 예시된 바람직한 기하학적 구조의 경우, D > 0.4 mm (공동 직경) 및 d > 0.20 mm (기공 직경)이다. 0.4 mm 내지 100.0 mm 범위에서의 공동 직경 D의 임의 선택 값, 및 0.2 mm 내지 10.0 mm 범위에서 기공 직경 d의 임의 선택 값과 관련하여, D 값은 d 값보다 크다 (D>d)는 점에 주목한다.
이제, 본원의 3D 생물반응기가 이의 비-무작위 특징으로 특정화될 수 있는 것으로, 이해될 수 있다. 바람직하게는, 3D 생물반응기 내 모든 공동은, 이들 공동이 가장 효율적인 3D 공간 패킹을 달성하고 상응하는 가장 넓은 연속적인 표면적을 제공하도록 실질적으로 동일한 부피를 가진다. 임의의 주어진 3D 생물반응기에 존재하는 상호 연결된 공동의 총 개수와 관련하여, 바람직하게는 이러한 공동들 중 90.0% 이상, 또는 이러한 공동들 중 심지어 95.0% 이상, 또는 이러한 공동들 중 심지어 99.0% 내지 100%는, 공차가 +/- 10.0%, 또는 +/- 5.0%, 또는 +/- 2.5% 또는 +/- 1.0%, 또는 +/- 0.5% 또는 +/- 0.1%를 초과하지 않는 공동 용적 (V)을 가진다. 도 1에서 공동은 일반적으로 구체로 도시되었지만, 다른 공동 구조도 고려됨에 유념한다. 공동의 직경은 세포 응집을 최소화하거나 또는 방지하고, 세포 배양을 위한 최대 유용 표면적을 제공하도록 선택된다.
본원의 3D 생물반응기의 또 다른 비-무작위 특징은 직경 d를 가진 공동들 간의 개기공이다 (도 1e 다시 참조). 전술한 바와 마찬가지로, 공동들 간의 개기공들 중 90.0% 이상, 또는 개기공들 중 심지어 95.0% 이상, 또는 개기공들 중 심지어 99.0% 내지 100%는, 공차가 +/- 10.%, 또는 +/- 5.0%, 또는 +/- 2.5% 또는 +/- 1.0%, 또는 +/- 0.5% 또는 +/- 0.1%를 초과하지 않는 d 값을 가진다.
따라서, 비-부착성 세포 증식을 위한 본원의 3D 생물반응기는 세포 결합을 위한 표면 영역, 직경 D (내부 공동 표면 상의 임의의 두 지점 간의 최장 거리)의 복수의 공동, 공동 사이에 직경 d (개기공의 임의 두 지점 간의 최장 거리)를 가진 복수의 개기공을 포함하며, 여기서 D> d인 것으로 이해될 것이다. 아울러, 공동들 중 90% 이상이 공차가 +/- 10.0%를 초과하지 않는 공동 용적 (V)을 가지며, 개기공들 중 90% 이상이 공차가 +/- 10.0%를 초과하지 않는 d 값을 가진다.
또한, T 세포와 같은 비-부착성 세포를 증폭시키기 위한 본원의 3D 생물반응기는 직경 D1인 제1 복수의 공동; 직경 d1인, 상기 제1 복수의 공동들 간의 복수의 개기공을 포함할 수 있으며, D1 >d1이고, 제1 복수의 공동들 중 90% 이상이 공차가 +/- 10.0%를 초과하지 않는 공동 용적 (V1)을 가진다. 이러한 3D 생물반응기는 또한 직경 D2의 제2 복수의 공동; 직경 d2인, 상기 제2 복수의 공동들 간의 복수의 개기공을 가질 수 있으며, D2>d2이고, 제2 복수의 공동들 중 90%는 공차가 +/- 10.0%를 초과하지 않는 공동 용적 (V2)을 가진다. V1 값과 V2 값은 서로 상이하며, 이의 공차 편차를 벗어난다. 달리 기술하면, +/- 10.0%의 공차를 포함한 V1 값, 및 +/- 10.0%의 공차를 포함한 V2 값은 서로 상이하거나, 또는, [V1 +/- 10.0%] ≠ [V2 +/- 10.0%]이다.
따라서, 공동 내부 표면의 곡률 반경 (radius of curvature, Rc)은 바람직하게는 1/0.5(D), 또는 1/0.2 mm = 5 mm-1 또는 그 이하이다. 바람직하게는, Rc는 0.2 mm-1 내지 1.0 mm-1의 값을 가질 수 있으며, 이는 D 값 10.0 mm 내지 2.0 mm에 상응한다. 높은 곡률 (높은 Rc) 표면은 전형적인 단층 2D 배양과는 현저하게 다른 환경을 제공하며, 세포 표현형의 변화를 또한 유도할 수 있다.
세포는 바람직하게는 3D 생물반응기의 상호 연결된 구형 공동 표면에 결합한다. 이러한 3D 구조는 바람직하게는 확장 가능하며, 비교적 소형의 풋프린트 세포 증폭 생물반응기로 비교적 대규모 세포 증폭을 위해 상대적으로 높은 표면/용적 비를 제공할 수 있다. 표면적/용적 비는 또한 바람직하게는 구형 공동의 직경에 의해 결정된다. 직경이 작을수록 표면적/용적 비는 높아진다. 바람직하게는, 공동은, 20 ㎛ 내지 100 ㎛ 크기의 세포를 감안해, 그리고 세포 응집을 줄이거나 또는 방지할 수 있도록, 상대적으로 "편평한 (flat)" 표면 (즉, ≤ 1.0 mm-1의 낮은 곡률 반경)을 제공한다. 아울러, 전술한 바와 같이, 세포 응집은 상호 연결된 기공의 직경 d를 제어함으로써 줄이거나 또는 방지하고, 이 직경은 바람직하게는 적어도 500 ㎛이되, 언급한 바와 같이, 200 ㎛ 보다 큰 임의 크기이다.
따라서, 생물반응기 고정상 (10)은 바람직하게는 도 2에 추가로 예시된 바와 같이 일회용 3D 생물반응기로서 이용할 수 있다. 보다 구체적으로, 생물반응기 (10)를 하우징 (18) 내에 배치한 다음, 유체의 유입 및 유출을 제공할 수 있는 유입구 및 유출구 구획 (20)에 배치할 수 있다. 바람직하게는, 생물반응기 (10), 하우징 (18) 및 유입구 및 유출구 구획 (20)은 적층 가공 기법으로 단일한 컴포넌트로 제작할 수 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 하우징 (18) 및 유입구 및 유출구 구획 (20) 내 생물반응기 (10)는 MSC를 증폭시키기 위한 전체 3D 생물반응기 시스템의 일부가 될 수 있다. 보다 구체적으로, 3D 생물반응기는, 바람직하게는, 세포 증식을 촉진하기 위해 3D 생물반응기를 통과하여 세포 배양 배지와 산소를 전달하는 관류 시스템 안에 배치된다. 2D T-플라스크에서 사용되는 다중 계대 (multiple passage) 세포 증폭 방법은 3D 생물반응기에 직접 또한 적용할 수 있으며, 단 3D 생물반응기가 T-플라스크 10s, 100s 또는 1000s에 상응하는 세포 배양 면적을 가진다.
현재 이해될 수 있는 바와 같이, 본원의 3D 생물반응기는 상호 연결된 공동의 직경에 따라 상대적으로 높은 표면/용적 비를 제공한다. 예를 들어, 직경 5 cm 및 길이 10 cm의 통상적인 원통형 롤러 바틀의 경우, 세포 배양 표면적 236 cm2를 제공해준다. 2.0 mm 직경의 상호 연결된 공동을 가진 본 발명의 3D 생물반응기를 동일 용적에 넣을 경우, 구형 공동 총 44,968개를 공간에 패킹할 수 있으며, 이는 약 5,648 cm2인 롤러 바틀 표면적에 거의 24배 넓은 표면적을 가진 매트릭스를 제공해줄 수 있다.
중공사 또는 미세담체-기반의 생물반응기와 비교해, 본원의 3D 생물반응기의 한가지 이상의 독특한 특징은, 단편화된 표면 (fragmented surface) 대신 넓은 상호 연결된 연속적인 표면을 제공할 수 있다는 것이다. 따라서, 본원의 3D 생물반응기의 내부 연속 표면은 세포를 한 영역에서 또 다른 영역으로 보다 자유롭게 이동할 수 있게 하는 것으로 생각된다. 도 3에 나타낸 관류 시스템을 사용해, 세포 이동을 유도하도록 생물반응기 내부에 영양분 또는 세포 신호의 구배 (gradient)를 용이하게 구축할 수 있을 것으로 생각된다.
3D 생물반응기를 제조하기 위해 본원에 언급된 바람직한 3D 프린팅 기술과 조합하여, 전산 유체 역학 (computational fluid dynamics, CFD)을 이용해, 생물반응기 내부의 매질 흐름을 시뮬레이션하고, 3D 상호 연결된 표면 내부의 임의 위치에서 유량 및 전단 응력을 추정할 수 있으며, 최적화를 위해 세포 배양 환경을 개선할 수 있다. 구체적으로, CFD를 채택해, 본원의 생물반응기의 3D 상호 연결된 공동들을 통한 유동 특징을 추정하고, (1) 유속; (2) 압력 강하; 및 (3) 벽면 전단 응력 (wall shear stress)의 분포를 예측한다. 후자 파라미터, 즉 전단 응력은 세포 증폭에 중요한 것으로 이해될 수 있다. 전단 응력 감소는 전단 유발성 세포 분화를 줄이거나 또는 방지할 수 있다.
(컴퓨터 시뮬레이션 속도를 높이기 위해) 직경 17.5 mm, 높이 5.83 mm, 공동 직경 2 mm 및 기공 직경 0.5 mm 규격의 소규모 원통형 3D 생물반응기를 이하 실시한 시뮬레이션에 사용하였다. 이 경우, 생물반응기의 직경 (Φ-17.5 mm) : 높이 (H=5.83 mm) 비는 3:1 (도 1d)로서, 이 비율은 생물반응기의 유입구와 유출구 사이에 영양분과 산소의 농도 구배를 줄이는데 바람직한 비이다. 고정상의 구형 표면에서 이용가능한 세포 밀도에 기반하여, 산소와 영양분의 소비율을 추정하고, 세포 배양 배지의 교체 횟수 (즉, 부피 유속)를 결정한다. 이 시뮬레이션에서는 전체 선형적인 유속 (overall linear flow rate) 38.5　㎛/sec가 추정되었다. 3D 생물반응기에 인풋으로서 층류 (laminar flow) 38.5 ㎛/sec를 적용할 경우, CFD 결과는 도 4-6에 도시한다.
도 4a, 4b, 4c 및 4d는 소형 원통형 3D 생물반응기를 통과하는 유속 프로파일 (flow velocity profile)을 보여준다. 도 4e는 유속 스케일을 나타낸 것이다. 보다 구체적으로, 도 4a는 생물반응기의 측면에서 관찰한 유속 분포를 나타낸 것이다. 흐름은 기공을 통해 흐름 방향을 따라 각각의 구형 공동을 통과한다. 도에서 흰색/회색 영역은 유체가 흐르지 않는 구형 공동들 사이에 존재하는 고상 영역이다. 도 4e에서 유색 속도 스케일 바와 비교해, 도 4a는 흐름 방향에서 기공 위치에서의 유속이 최대 유속 200 ㎛/s 내지 240 ㎛/s에 도달함을 보여준다. 대조적으로, 구형 표면 근처에서의 유속은 최소 0.06 ㎛/s 내지 19.0 ㎛/s로 감소하는데, 이는 구형 표면에 상주하는 세포에 전단 응력을 유발하는 흐름을 현저하게 줄여줄 것이다.
도 4b는 생물반응기의 최상부에서 3D 생물반응기의 중심 횡단면을 관통하여 바라본 속도 프로파일을 나타낸 것이다. 다시 말해, 이미지는, 흐름 방향을 따라서 구형 공동의 각 기공 중앙에서 최대 유속이 달성됨을 보여준다. 이러한 최대 속도는 즉 200 ㎛/s 내지 240 ㎛/s 범위이다. 구형 표면 근처에서는 유속이 낮고, 0.06 ㎛/s 내지 19.0 ㎛/s 범위이다.
도 4c는 방사상으로 상호 연결된 기공을 통과하여 흐르는 것을 보여주는 개별 구체의 속도 프로파일을 나타낸 것이다. 즉, 도 4c는 구형 공동 내부의 유용 흐름 분포의 예를 제공해준다. 세포가 없는 공동의 가운데 빈 공간에서는 유속이 빠르고, 200 ㎛/s 내지 240 ㎛/s 수준이다. 세포는 오목한 공동 표면에 상주하며, 이곳의 유속은 감소하며, 유속은 0.06 ㎛/s 내지 19.0 ㎛/s 수준이다. 이러한 독특한 구조는 따라서 세포가 상대적으로 높은 유도 응력 (flow stress)에 노출되지 않도록 방지한다. 이는, 예를 들어, 세포를 세포 배양 배지에 현탁하고 영양분과 산소를 세포에 전달하기 위해 생물반응기에서 교반하는, 볼록형 구체 표면을 가진 300 ㎛ 내지 400 ㎛ 직경의 미세비드의 외표면에서 배양하는 미세담체 기반의 반응기를 능가하는 본원에 기술된 3D 생물반응기의 구분되는 또 다른 이점이다. 이러한 볼록형 구체 표면 상에 상주하는 세포는, 세포 형태, 투과성 및 유전자 발현에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는, 0.1 Pa에 이르는 상대적으로 높은 전단 응력에 노출될 수 있다. 도 4d는 흐름 방향을 따라 사이드 기공을 통한 유동 궤적 (flow trajectory)을 나타낸 것으로, 이는 본원의 3D 생물반응기가 비교적 균일한 유동 패턴을 제공하여, 영양분 및 산소를 전체적으로 공급함을 보여준다.
이에, 바람직한 3D 생물반응기 내부에서 계산되는 최대 선형 유속은 유동 방향을 따라 2.0 mm 직경의 공동들 사이의 0.5 mm 직경의 상호 연결된 기공에서 발생하는 200 ㎛/초 내지 240 ㎛/초이다. 도 4a 내지 도 4e에 나타낸 바와 같이, 흐름을 따라서 중심 방향 (central direction)으로 선호적으로 흐르지만, 구형 표면 근처에서도 여전히 흘러 (~19.0 ㎛/초), 구형 표면에 상주하는 세포에 영양분을 공급할 수 있다. 따라서, 3D 생물반응기 구조 전체에서 영양분을 유동 대류 (flow convection) 및 확산을 통해 공급할 수 있어, 세포는 구조물 전체 어느 곳에서도 상주할 수 있으며, 임의 위치에서 증식할 수 있는 것으로 생각된다.
도 5a 및 5b는 전술한 원통형 3D생물반응기 전체에서 뿐 아니라 단일한 구형 공동 표면에서의 표면 전단 응력의 분포를 보여준다. 도 5c는 Pa 단위의 전단 응력 스케일을 표시한다. 최대 전단 응력은 상호 연결된 기공의 에지에서 관찰된다. 그 이유는 이들 위치에서의 높은 유속 때문이다. 그러나, 생물반응기 내부 유용한 구형 표면 영역 대부분에서 3x10-4 Pa 미만의 전단 응력이 관찰되며, 이는 생물반응기의 표면 영역 중 90% 이상으로 이해될 수 있다. 이는 전단 유발성 분화 없는 세포의 증식을 제공해준다. 또한, 심지어 최대 전단 응력 4.0 x 10-3 Pa는, 중공사 기반의 생물반응기, 웨이브 생물반응기 및 미세담체 기반의 생물반응기에서 배양할 경우에 세포가 겪는 평균 전단 응력보다도 낮은 것으로 보인다. 따라서, 본원의 3D 생물반응기는 기존의 세포 증폭 생물반응기와 비교해 세포 증식에 상대적으로 낮은 전단 응력을 제공할 것으로 생각된다. 이는, 예를 들어, Large-Scale Industrialized Cell Expansion: Producing The Critical Raw Material For Biofabrication Processes, A. Kumar and B. Starly, Biofabrication 7(4):044103 (2015)를 참고한다.
도 6a는 전술한 원통형 3D 생물반응기의 바닥부에서 최상부로의 유동 방향에 따른 압력 강하를 나타낸 것이다. 도 6b는 적용가능한 압력 스케일을 표시한다. 도는, 생물반응기의 유입구와 유출구 사이 간의 전체 압력 강하가 1.0 Pa 미만임을 보여준다. 압력 강하는 따라서 0.1 Pa에서 최대 1.0 Pa의 범위에 해당할 수 있다. 다시 말해, 생물반응기의 유입구와 유출구 근처 세포는 유의한 압력 차이를 경험하지 않을 것이다. 낮은 압력 구배는, 이러한 설계가 생물반응기의 유입구와 유출구 사이에 영양분/대사산물의 소폭의 농도 구배 (또는 차이)를 또한 형성함을, 시사한다. 소폭의 농도 구배는, 직경 Φ이 높이 H보다 크지만 생물반응기의 총 부피는 동일하게 유지한 생물반응기의 설계로 인한 것이다. 이는 중공사 생물반응기 보다 우수하다. 생물반응기의 유입구에서 유출구까지의 영양분/대사산물의 농도 구배를 줄이기 위해, Φ>H 비율을 가진 중공사 생물반응기를 제작하기는 어렵다.
또한, 종횡비 (즉. Φ:H 비, Φ: 생물반응기 고정상의 총 직경, H: 생물반응기 고정상의 총 높이)는 다르지만 전체 용적은 동일한 원통형 3D 생물반응기를 비교하였다. 도 1d를 참조한다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 체적 유량 (volume flow rate)이 동일하기 위해서는 (체적 유량 = 유동의 횡단 면적 x 선 속도), 선 속도는 Φ:H 비율이 낮은 생물반응기에서 현저하게 증가한다. 선 속도의 증가는, 또한 표면 전단 응력, 압력 강하뿐 아니라 유입구에서 유출구까지의 영양분/대사산물의 농도 구배도 증가시키며, 이는 세포 증폭에 비우호적으로 영향을 미칠 것이다. 따라서, 개시된 고정상 3D 생물반응기는 바람직하게는, 예를 들어, Φ:H 비율이 1:1 보다 높은 비율에서부터 최대 100:1까지의 범위를 가진 Φ:H 비율의 구조로 설계된다. 바람직하게는, Φ:H 비율은 1:1보다 높은 비율에서부터 최대 10:1 범위이다.
표 1
종횡비가 상이한 3D 생물반응기의 유속 비교
# 비율 ( Φ:H ) 직경 (Φ) (cm) 높이 (H) (cm) 유속 (㎛/sec)
1 3:1 10.5 3.5 38.5
2 1:1 7.5 7.5 75.4
3 1:3 5 15 169.8
도 7a는 FDM 3D 프린팅에 의해 제조된, 6 mm 직경의 상호 연결된 공동과 1 mm의 상호 연결된 기공을 구비한 3D 생물반응기 고정상을 도시한다. 이 3D 생물반응기는 ABS 필라멘트로 프린팅하였다. 이 특수 3D 생물반응기의 직경 (Φ) 및 높이 (H)는 각각 4.28 cm 및 1.43 cm이다. 즉, Φ:H 비율은 3:1이다. 고정상에는 상호 연결된 개방-공동이 약 134개 존재한다. 세포 배양을 위한 상호 연결된 연속적인 구형의 총 표면적 SAu는 약 152 cm2이다. 유입구 및 유출구에서 유입구 및 유출구 벽부 및 유체 분배기 (22) (도 8)가 세포 배양을 위한 추가적 표면적 88 cm2를 제공해준다. 다시 말해, 3D 생물반응기에서 세포 부착에 이용가능한 총 표면적은 약 240 cm2이다. 유체 분배기는 생물반응기 전체 층류를 개선할 수 있다. 유체 분배기는, 레이놀즈 수 (Reynolds number)가 <2100이거나 >0 내지 <2100의 범위인 경우, 선택적이다.
도 7b는 3D 생물반응기의 고정상이 생물반응기 챔버 내로 용매 결합됨을 보여준다. 이는 고정상과 챔버 벽부 사이의 틈을 밀봉할 것이며, 그래서 세포 배양 배지가 이들 틈을 통과하는 대신 상호 연결된 기공을 통과하여 관류하도록 강제할 것이다. 바람직하게는, 고정상 및 챔버는 제조 효율을 높이기 위해 일체형 부품 (integrated part)으로서 함께 프린팅된다. 도 7c는 생물반응기의 유입구 및 유출구를 예시한다. 이는 기하학적으로 고정상을 통한 층류를 촉진하도록 설계된다. 생물반응기의 유입구는 선택적으로 내장형 회전 기어를 포함하며, 이는 균일한 세포 접종을 위해 생물반응기의 회전을 제어하도록 스테퍼 모터 (stepper motor)와 커플링될 수 있다 (하기 참조). 일체형 생물반응기는 도 7d에 도시되며, 이것은 유체의 흐름을 안내하기 위해 1/8 인치 튜빙과 연결될 수 있다. 대안적으로, 유입구 및 유출구는 다회용 (repeated usage)으로 제조될 수 있으며, 이 경우 내부 생물반응기 고정상만 일회용이다. 또한, 도 7e에는 DLA 3D 프린팅에 의해 제조된, 3.0 mm 공동 및 0.5 mm 기공을 가진 비교적 소형의 3D 생물반응기 고정상이 도시된다. 도 7f는 DLP 3D 프린팅에 의해 제조된 동일한 3.0 mm 공동 및 0.5 mm 기공을 가진 상대적으로 큰 3D 생물반응기 고정상이다. 생물반응기를 확장할 경우, 생물반응기의 내부 구조는 유지한다. 따라서, 관류 체적 용량 비례적으로 커지지만, 국소 선형 유속 (local linear flow rate)은 동일하게 유지된다. 이런 방식으로, 규모 확장시 공정 변화가 최소화되며, 따라서 공정 개발 비용을 줄일 수 있다.
다음으로, 유체 분배기 (22) (도 8)는, 바람직하게는, 3D 생물반응기를 관통하는 유동 균일성 (flow uniformity)을 개선한다는 점에 유념하여야 한다. 유입구, 유출구 및 유체 분배기의 디자인은 또한 바람직하게는 다음과 같은 사항을 고려한다: (1) 3D 생물반응기를 관통하는 유동 균일성 개선; (2) 생물반응기의 전체 프라이밍 체적 (priming volume)을 줄이기 위한 유입구 및 유출구에서 불용 체적 (dead-volume) (24)의 최소화; 및 (3) 생물반응기 내부에 기포 포집 방지. 도 9는 유체 분배기를 이용한 CFD 시뮬레이션에 기반한 3D 생물반응기 전체의 유속 프로파일을 보여준다. 유체 분배기 (도 8)의 사용으로 유동 균일성이 개선되었다. 최대 유속 (약 30 ㎛/초) 및 최소 유속 (약 10 ㎛/초)은 비교적 서로 가까우며, 균일한 층류 (즉, 비교적 평행한 층으로의 유체의 유동)를 촉진하는 역할을 한다. 생물반응기 내 도처에서 비교적 균일한 유속은 생물반응기의 여러 위치에 상주하는 세포에게 더 작은 전단 응력 차이를 제공할 것이다.
3D 생물반응기는 선택적 레이저 소결 (SLS), 스테레오리소그래피 (SLA), 디지털 라이트 프로세싱 (DLP) 등과 같은 다른 적층 가공 기법에 의해 제작할 수 있다. 도 7e, 도 7f.
적층 가공 또는 3D 프린팅에 의한 본원의 3D 생물반응기의 제조 외에도, 3D 생물반응기는 상호 연결된 세포 배양 표면을 제공하기 위해 전통적인 포로겐-침출법에 의해 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 도 10a 및 도 10b는 포로겐-침출 방법을 이용하여 제조된 3D 생물반응기를 도시한다. 이는 몰드 안에 포로겐과 폴리머를 배합한 후, 포로겐 침출에 의해 기공을 생성하는 방법이다. 도 10a의 3D 생물반응기는, 비드가 접촉하도록, 비드를 흔들고, 두드리고, 눌러, 원통형 스테인레스 몰드 안에 4.0 mm의 수용성 구체 당 비드 (포로겐으로서)를 기밀하게 패킹하는 단계로 시작한다. 비드 간의 틈은 5.0 중량%의 탈이온수를 함유한 아세톤으로 채운다. 그런 후, 진공 챔버에서 밤새 두어 아세톤 및 물을 증발시킨다. 다음으로, 비드 사이의 틈을 벤조일 또는 tert-부틸퍼옥시벤조에이트와 같은 중합 개시제와 함께 스티렌과 같은 저점도의 중합가능한 비닐 모노머로 채운다. 그리고, 스티렌 모노머를 중합하여, 폴리스티렌을 제조한다. 샘플을 90℃에서 8-12시간 동안 둔 후 다시 3시간 동안 115℃로 가열하고, 오븐에서 꺼내, 도 10a에 예시된 것을 수득한다. 이후, 당 비드를 초음파 수조에 잠긴 채로 침출시켜, 상호 연결된 공동을 가진 폴리스티렌 3D 생물반응기 고정상을 수득한다. 도 10b를 참조한다. 그런 후, 3D 생물반응기를 3일 동안 메탄올로 추출하여 임의의 잔류 스티렌 모노머를 제거한다. 하지만, 포로겐 침출 방법은 제조 공정이 복잡할 뿐 아니라 포로겐 비드의 패킹이 무작위 공정이기에 정확한 재현가능한 구조를 달성하긴 어렵다.
ABS 또는 PMMA를 이용한 3D 프린팅된 생물반응기 (도 7d)의 경우, 생물반응기의 소수성 내부 표면은 바람직하게는 세포 부착을 허용하도록 변형된다. 기타 단백질이 폴리도파민 코팅을 통해 생물반응기 표면에 쉽게 부착될 수 있도록, 생물반응기 표면에 프라이머 코팅으로서 폴리도파민을 이용한다. 생물반응기 표면을 10 mM 트리스 완충제 (25℃에서 pH = 8.5)에 용해된 0.25 mg/mL 도파민 용액 중에 약 18시간 동안 인큐베이션하여, 후속적인 단백질 코팅을 위한 효과적인 폴리도파민 층을 구축한다. 폴리도파민을 생물반응기 표면에 증착한 후, 마이클 첨가 (Michael addition) 및/또는 쉬프 염기 반응 (Schiff base reaction)을 통해 기타 단백질을 기능성 리간드와 결합시킬 수 있다. 따라서, 리간드 분자는 아민 및 티올 관능기와 같은 친핵성 관능기를 포함한다.
본원에 기술된 3D 생물반응기의 추가적인 특징 중 한가지는, 특수한 기하 구조 및 공동 용적 요건과, 상응하는 이용가능한 표면적 요건을 가진, 3D 생물반응기를 설계할 수 있으며, 비교적 최소한의 편차로 이러한 타겟을 (즉, 제작 또는 제조시) 달성할 수 있는 것으로, 상기한 전체 내용으로부터 이해되어야 한다. 예를 들어, 하나 이상의 내부 공동이 타겟 공동 용적 "Vt"을 가지고 3D 생물반응기 자체가 세포 배양을 위한 타겟 총 표면적 "SAt"을 가지는, 3D 생물반응기에 대한 설계 요건을 이제 확인할 수 있다. 즉, 하나 이상의 내부 공동이 Vt +/- 10.0%인 실제 공동 용적 "Va"을 가진, 3D 생물반응기를 제작할 수 있다. 마찬가지로, 세포 배양을 위한 실제 표면적 SAa는 SAt +/- 10.0%이거나, 더 바람직하게 SAt +/- 5.0%이다. 아울러, 타겟 공동의 내부 표면은 타겟 곡률 반경 (targeted radius of curvature) "Rct"과 같이 제작을 위한 타겟 기하구조를 확인할 수 있으며, 제작시 공동 내부 표면의 실제 곡률 반경 "Rca"은 Rct +/- 5% 범위로 달성할 수 있다.
본 발명은, 면역요법 목적으로 적용되는 T 세포의 증폭을 제공하기 위한, 전술한 본 발명의 3D 생물반응기의 이용을 더욱 발전시킨다. T 세포의 결합 및 활성화를 위해 생물반응기의 구형 공동 용적 표면 상에서의 항체 고정화를 예시한 도 11을 참조한다. 보다 구체적으로, 3D 생물반응기에서, 생물반응기 표면에 바이오틴-아비딘/스트렙타비딘 결합 기전을 통해 anti-CD3 및 anti-CD28 항체와 같은 항체 (바이오틴이 접합된 구 형상의 단백질)를 고정할 수 있다. 아비딘 또는 스트렙타비딘은 전술한 바와 같이 프라임 폴리도파민 코팅을 통해 생물반응기 표면에 사전-코팅된다. 보다 구체적으로, 폴리도파민 코팅을 본원의 3D 생물반응기의 표면에 적용한 후, 바이오틴에 대해 친화성을 가진 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 테트라머 단백질 (4개의 서브유닛으로 된 4성 구조의 단백질)을 부착시킬 수 있다. 따라서, 4성 구조의 단백질 (아비딘 또는 스트렙타비딘)에 기반하여, 바이오틴화된 항체, 예를 들어, anti-CD3 항체를 생물반응기 표면에 고정할 수 있다. 바이오틴화된 항체는 바이오틴이 항체에 공유 결합된 것을 의미한다. T 세포가 생물반응기를 통과하여 흐를 때, T 세포 표면 수용체를 통해 결합되어 활성화될 것이며, 예를 들어 CD3를 통해 anti CD3 항체 결합이 이루어질 것이다. 그런 후, 활성화된 T 세포는, T 세포 증폭을 제공하기 위한 신호전달 분자가 함유된 관류 매질에 노출된다. 신호전달 분자는, 바람직하게는, 인터루킨-2 (IL-2)와 같은 사이토카인 신호전달 분자를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 넓은 의미에서, 폴리도파민 코팅의 사용 필요성은 생략할 수 있으며, 3D 반응기의 표면에 직접 항체 (예, anti-CD3 항체)를 고정하거나, 바이오틴화된 항체에 결합하기 위해 생물반응기 표면에 직접 아비딘/스트렙타비딘을 고정할 수도 있는 것으로, 생각된다.
본원의 3D 생물반응기를 이용함으로써, T 세포 증폭을 위한 폐루프 관류-기반의 시스템 (closed-loop perfusion-based system for T-cell expansion)이 도 12에 예시된 바와 같이 가능하다. 보다 구체적으로, 도 12는 T 세포의 활성화 및 증폭을 위한 비드-비사용의 폐루프 관류-기반의 3D 생물반응기를 예시한다. 관류 시스템은, 바람직하게는, 세포-안전한 연동 펌프 (cell-safe peristaltic pump) 및 매질/세포 저장소를 포함하며, 이는 매질을 투입하여, 보다 효과적인 세포 증폭을 위해 세포 밀도를 희석하거나 또는 증폭 공정 동안에 영양분 농도를 유지하도록 매질을 교체할 수 있다. 매질 저장소는 또한 기체 주입 및 영양분과 산소를 혼합하기 위한 교반 또는 혼합 기전을 갖춘 산소공급기 (oxygenator)로서 제공할 수도 있다. 3D 생물반응기를 통해 관류된 매질에 현탁된 T 세포는 구형 표면에서 CD3 및 CD28 항체와 접촉할 기회가 많아지며, 따라서 활성화된다. 넓은 표면 상에 고정된 CD3 및 CD28은 현행 T 세포 증폭 시스템에서 사용되는 자기 비드와 같이 비슷한 자극을 T 세포에 제공할 것으로 예상된다. 이러한 공정은 비드의 사용 없이 현저하게 단순화될 것이다. 또한, 이러한 폐루프 시스템은 자동화 및 비용-효율적인 cGMP 세포 제조를 가능케 한다.
표 1은 3가지 크기의 생물반응기의, 치수, 배양 표면적, 총 표면적이 동일한 자기 비드의 개수, 예상되는 매질 부피 등을 열거한다. PMMA, FDA 허가된 이식가능한 생체적합한 소재를 사용해, DLP 3D 프린터로 생물반응기를 제작하였다. 표 1은 또한 지정된 3D 생물반응기를 구축하기 위한 대략적인 재료 비용을 열거한다.
표 1: SLA/DLP 3D 프린팅을 이용한 여러가지 크기의 3D 생물반응기의 치수 및 제작 비용
PBMC 시딩 용량 2.5x10 7 α 2.2x10 8 2.2x10 9
생물반응기 직경 (cm) 2.1 4.2 9.0
생물반응기 높이 (cm) 0.7 1.4 3.0
표면적 (cm2) 29 250 2500
비드 #개에 해당하는 전체 면적 7.5x107 6.5x108 6.5x109
매질 부피 (mL) 2 14 136
빌드 재료 부피 (mL) 0.78 5.4 53.6
재료 비용β $0.20 $1.34 $13.4
α 비드 : 세포의 비 3:1
β 매트릭스 단독, 생물반응기의 유입구 및 유출구를 포함하지 않음; 또한 3 mm 직경의 중공형 구체 및 0.5 mm 기공 크기로 추정
생물반응기 표면에 아비딘 (또는 스트렙타비딘 )의 코팅
Miltenyi MACSiBead 시스템을 모방하기 위해, 아비딘 (스트렙타비딘) 및 바이오틴 결합 기전을 채택하여 생물반응기 표면에 anti-CD2, CD3 및 CD28 항체를 고정하였다. 먼저, 형광-표지된 아비딘 및 스트렙타비딘을 여러가지 농도로 테스트하였으며 (도 13), 100 ㎍/mL 아비딘 또는 30 ㎍/mL 스트렙타비딘이 생물반응기 표면에 상대적으로 높은 아비딘 또는 스트렙타비딘 코팅 밀도를 구축하는 것으로 확인되었다. 도 13은 여러가지 농도의 아비딘 및 스트렙타비딘 코팅에서의 형광 강도를 나타낸 것이다. 형광-표지된 아비딘/스트렙타비딘을 이용해, 폴리도파민 프라임 코팅 상에 결합시킬 수 있는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 농도를 테스트하였다. 아비딘/스트렙타비딘의 바람직한 코팅 공정은 다음과 같이 설명된다. 아비딘 또는 스트렙타비딘의 코팅 농도는 더욱더 최적화할 수 있다:
1) 생물반응기 표면을 먼저 폴리도파민으로 코팅한다.
2) 아비딘 또는 스트렙타비딘을 TRIS 완충제 (pH 8.5)에 용해하여, 아비딘 또는 스트렙타비딘 농도가 각각 100 ㎍/mL 또는 30 ㎍/mL인 코팅액을 제조한다. 생물반응기를 코팅액에 부드럽게 교반하면서 12시간 침지하고, 빛에 노출되지 않게 차단한다.
3) 스캐폴드를 포스페이트-완충화된-염수 (PBS)로 충분히 헹군다. 그런 후 스캐폴드를 PBS에 두어 바이오틴화된 항체로 코팅할 준비를 마친다.
그런 후, 아비딘 또는 스트렙타비딘 베이스 층에 결합시키기 위한 제2 층 코팅으로서 형광-표지된 바이오틴을 여러가지 농도로 사용해 비교하였으며 (도 14), 1.0 ㎍/mL 바이오틴이 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 성공적으로 결합됨을 확인하였다. 아비딘 또는 스트렙타비딘 상의 바이오틴 코팅의 형광 강도 (바이오틴 농도에 비례)를 확인한 도 14를 참조한다. 바이오틴이 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅된 생물반응기 표면에 성공적으로 결합될 수 있다는 것을 검증한 후, 바이오틴화된 anti-CD2, CD3 및 CD 28 항체를 T 세포 활성화 및 증폭을 위해 생물반응기에 적용하였다.
바람직하게는, 2.1 cm 직경의 스캐폴드 (즉, 비드 약 7.5x107개의 총 면적에 해당함)에 항체 코팅을 적용하기 위해:
1) 생물반응기 스캐폴드를 PBS에서 꺼낸다.
2) 스캐폴드에서 PBS를 가능한 많이 제거하기만, 스캐폴드는 마르지 않게 한다.
3) 100 ㎍/mL CD2-바이오틴 200 ㎕, 100 ㎍/mL CD3-바이오틴 200 ㎕, 100 ㎍/mL CD28-바이오틴 200 ㎕을 15 mL 시험관에서 합치고, 항체 표지 완충제 (Ca2 + 및 Mg2+-무함유성 PBS, pH = 7.2 + 0.5% 열-불활화된 소 태아 혈청 + 2 mM EDTA) 1.4 mL을 첨가한 다음 잘 혼합하여, 각 항체의 농도가 10 ㎍/mL인 총 2 mL의 바이오틴화된 항체를 준비한다.
4) 생물반응기 매트릭스 (유입구 및 유출구 비-포함)를 덮기 위해 12웰 플레이트에서 혼합 항체 2 mL를 첨가하고, 파이펫으로 상하 파이펫팅하여 혼합한다.
5) 매트릭스를 냉장고에 넣어 암 조건에서 서서히 교반하면서 2시간 동안 인큐베이션한다.
6) 스캐폴드를 PBS로 충분히 헹구어 결합되지 않은 항체를 제거한다.
폴리도파민, 아비딘/스트렙타비딘 및 바이오틴화된 항체의 코팅 공정은 완전한 생물반응기 (즉, 생물반응기 매트릭스 + 유입구 및 유출구)의 코팅으로 확대할 수 있다.
항체-코팅된 생물반응기 매트릭스 및 자기 비드와 함께 인큐베이션한 경우의 T 세포 증폭 비교
항체-코팅된 매트릭스 (유입구 및 유출구 비-포함)를 Miltenyi MACSiBeadTM 시스템과 비교하였다. (스트렙타비딘이 이미 결합된) 자기 비드를 코팅 공정과 비슷한 제조사의 프로토콜에 따라 바이오틴화된 anti-CD2, CD3 및 CD28 항체로 코팅하였다. 표 1에 나타낸 직경 2.1 cm 및 높이 0.7 cm의 비교적 작은 생물반응기 (도 7e)를 사용하였다. 생물반응기 매트릭스는 비드 및 매트릭스의 성능을 쉽게 비교할 수 있도록 12웰 플레이트의 웰에 맞추었다. 3종의 생물반응기 매트릭스를 먼저 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅한 다음 바이오틴화된 CD2, CD3, CD28 항체를 전술한 바람직한 공정에 따라 코팅하였다. 항체는 동일한 농도로 생물반응기 매트릭스 및 MACSiBeads에 코팅하였다. 스트렙타비딘으로 코팅된 생물반응기 매트릭스 하나는 항체로 코팅하지 않고, 음성 대조군으로 사용하였다.
인간 말초혈 CD3+ Pan T 세포 (ReachBio Research Labs)를 MACSiBeads를 제조사의 프로토콜에 따라 사용해 먼저 활성화 및 증폭 (7일)시킨 다음 자기 입자로부터 비드-입수하였다. 그런 후, T 세포 4.5x106개를 12웰 플레이트의 웰 4개에 각각 넣었다. 각각 배양 배지 (RPMI 1640 + 10% 소 태아 혈청 + 20 IU/mL 인간 IL2) 3 mL이 충전된 웰 4개는, 1) 항체-코팅된 자기 비드 7.5x106개, 2) 항체-코팅된 스트렙타비딘-매트릭스, 3) 항체-코팅된 아비딘-매트릭스, 및 4) 항체 코팅되지 않은 스트렙타비딘-매트릭스를 각각 포함한다. 3일차에 웰에 추가로 배지를 첨가하였다. 5일차에, 세포를 부가적인 비드 및 매트릭스와 함께 2개의 웰로 나누었다. 각 웰에서 T 세포의 수를, 자기 비드 또는 매트릭스로부터 해리한 후, 3일, 5일 및 7일에 계수하였다.
도 15는 항체-코팅된 자기 비드 및 매트릭스와 인큐베이션한 경우의 T 세포 (활성화 후) 증식을 항체 코팅하지 않은 매트릭스와 비교하여 보여준다. 항체 코팅된-매트릭스에서 T 세포 증식 경향은 항체-코팅된 비드와 비슷하였다. 그러나, 항체없이 매트릭스와 함께 인큐베이션한 T 세포는 증식하지 않았으며, 아마도 연속적인 자극이 없는 것이 그 이유일 수 있다. 본 실험에서, 매트릭스는 정적 조건 하에 웰 안에 두었다. 따라서, 그 결과는 관류-기반의 생물반응기와는 다를 것으로 예상된다. 본 실험에서, 항체가 생물반응기의 매트릭스 표면에 성공적으로 코팅되었으며, T 세포 증식에 영향을 미치는 것으로, 명확하게 확인되었다.
항체-코팅된 생물반응기 매트릭스 및 자기 비드와 함께 인큐베이션한 말초 혈 단핵세포 (PBMC)의 T 세포 활성화 및 증폭 비교
상기와 비슷한 실험을 단리된 T 세포 대신 PBMC를 대상으로 수행하였다. 전형적으로, T 세포와 그외 단핵구, 예를 들어 B 세포, NK 세포, 단핵구를 포함하는 PBMC를 환자로부터 수집하였으며, T 세포 단리없이 세포 증폭에 바로 사용하였다. 그 이유는, T 세포가 아닌 세포는 CD2, CD3 및 CD28에 의해 활성화되지 않을 것이며, 활성화없이 수일 후 자연적으로 없어질 것이기 때문이다. 도 15에 나타낸 실험과 본 실험의 또 다른 차이는 항체-코팅된 매트릭스를 이용할 경우 활성화 단계가 통합된다는 것이다. 간략하게는, PBMC를 2.5x106 세포/mL 밀도로 포함하는 배양 배지 2 mL을 12웰 플레이트의 웰 3개에 넣었다. 3개의 웰은 1) 항체-코팅된 자기 비드 7.5x106개, 2) 항체-코팅된 스트렙타비딘-매트릭스 및 3) 항체 코팅되지 않은 스트렙타비딘-매트릭스를 각각 포함한다. 스트렙타비딘이 마지막 2종의 실험들에서 아비딘 보다 우수한 것으로 확인되어, 본 실험에서는 아비딘 코팅된 매트릭스는 사용하지 않았다. PBMC를 2일간 활성화를 위해 각 웰에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 증폭 단계를 개시하기 위해 배지 내 인간 IL2 함량이 20 IU/mL이 되도록 IL12 사이토카인을 함유한 추가의 배지를 각 웰에 첨가하였다. 5일간 배양하는 동안, 총 세포 수 변화를 도 16에 나타내었다. 이는, 항체-코팅된 매트릭스를 사용해 증폭시킨 T 세포가 항체 코팅된 자기 비드를 이용한 경우보다 더 많이 수득됨을 보여준다. 이는, 또한, 항체-코팅된 매트릭스가 비슷하거나 또는 더 우수한 T 세포 활성화 및 증폭을 제공할 수 있음을, 보여준다
다이나믹 관류 기반의 T 세포 증폭
관류-기반의 3D 생물반응기를 본원에 기술된 바와 같이 제작하였다. 3D 생물반응기의 내부 표면은 폴리도파민으로 12시간 코팅하여 준비하였다. 그런 후, 생물반응기 내부 표면을 스트렙타비딘으로 12시간 코팅하였다. 그 후, 생물반응기를 살균 처리하기 위해 70% 에탄올과 함께 인큐베이션하였다. 살균 처리 후, 내부 표면을 PBS로 헹구고, 전술한 공정을 이용해 생물반응기의 내부 표면에 항체를 고정하기 위해 CD2, CD3 및 CD28-바이오틴 접합체를 동량으로 혼합한 혼합물 (각각의 항체 농도 10 ㎍/mL)로 코팅하였다.
관류 회로 (perfusion circuit)를 도 12에 예시한 바와 같이 설정하였다. 살아있는 세포 및 전단-민감성 유체 (shear-sensitive fluid)를 펌핑하기 위해 고안된, Cytoflow 펌프 헤드 (Cole-Parmer)가 장착된 Masterflex L/S를, 관류 시스템에 사용하였다. 이러한 어플리케이션은 상대적으로 작은 생물반응기를 사용하고 관류 속도가 상대적으로 낮을 것으로 예상되므로, 산소공급기 대신 배지 및 배지 액적에 기체 확산을 통한 맞춤형 산소공급 유닛 (custom-built oxygenation unit)을 채택하였다.
PBMC 약 20x106개를 프라이밍된 생물반응기 관류 시스템에 접종하였다. 세포는 15분간 2 mL/min으로 순환시켜 균일하게 분포시켰다. 사이토카인 IL2가 함유되지 않은 관류 매질을 이용한 활성화 단계 동안에는, T 세포를 1일차에 0.1 mL/min, 2일차에 0.14 mL/min의 속도로 관류시켰다. 2일 간의 활성화 후, 세포 밀도를 측정하고, 인간 IL2가 첨가된 매질을 IL-2 총 농도 20 IU/mL이 되도록 시스템에 첨가하였다. T 세포 증폭 단계는 3일간 관류 속도 0.2 mL/min으로 수행하였다. 5일차에 세포 밀도를 측정하였으며, 그 결과는 도 17에 도시한다. 도 15 및 16에 나타낸 정적 실험에서와 마찬가지로, T 세포는 활성화 후 3배 증폭하였다.

Claims (22)

  1. T 세포의 증폭 (T-cell expansion) 방법으로서,
    세포 증폭을 위한 표면 영역을 가진 복수의 공동 (void)을 포함하는 3D 생물반응기를 공급하는 단계로서, 상기 복수의 공동은 직경 D를 가지고, 상기 공동들 사이에는 직경 d의 복수의 개기공이 D>d로 존재하고: (a) 상기 공동들 중 90% 이상은 편차 +/- 10.0%를 초과하지 않는 선택 공동 용적 (V)을 가지고; (b) 상기 공동들 사이에 상기 개기공들 중 90% 이상은 편차 +/- 10.0%를 초과하지 않는 d 값을 가진, 단계;
    세포 증폭을 위한 상기 생물반응기의 표면 영역에 폴리도파민 코팅을 제공하는 단계;
    상기 폴리도파민 코팅에 테트라머 단백질 (tetrameric protein)을 제공하는 단계;
    상기 테트라머 단백질에 하나 이상의 바이오틴화된 항체를 고정하는 단계;
    T 세포 수용체를 갖는, 상기 생물반응기를 통해 T 세포를 유동시키는 단계로서, 상기 T 세포 수용체는 상기 하나 이상의 바이오틴화된 항체에 결합하여 활성화되는, 단계;
    상기 활성화된 T 세포를, T 세포 증폭을 촉진하는 신호전달 분자를 함유한 관류 매질 (perfusion media)에 노출시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 테트라머 단백질이 아비딘 또는 스트렙타비딘인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바이오틴화된 항체가 anti-CD3 항체를 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이오틴화된 항체가 anti-CD3 항체 및 anti-CD28 항체를 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 바이오틴화된 항체가 anti-CD3 항체, anti-CD28 항체 및 anti-CD2 항체를 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 신호전달 분자가 사이토카인 신호전달 분자를 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 공동의 직경 (D)이 0.4 mm 보다 크고,
    상기 개기공의 직경 (d)이 0.20 mm 보다 큰, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 공동의 직경 (D)이 0.4 mm 초과 내지 100.0 mm 이하의 범위인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 개기공의 직경 (d)이 0.2 mm 내지 10.0 mm 범위인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 공동들 중 95.0% 이상이 편차 +/- 10.0%를 초과하지 않는 공동 용적 (V)을 가지는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 공동들 중 99.0% 내지 100%가 편차 +/- 10.0%를 초과하지 않는 공동 용적 (V)을 가지는, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 공동들 사이의 개기공들 중 95.0% 이상이 편차 +/- 10.0%를 초과하지 않는 d 값을 가지는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 공동들 사이의 개기공들 중 99.0 내지 100%가 편차 +/- 10.0%를 초과하지 않는 d 값을 가지는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    존재하는 공동들 중 적어도 90.0%가 공동 1개 당 개기공 2개를 가지는, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    존재하는 공동들 중 적어도 90.0%가 공동 1개 당 개기공 8-12개를 가지는, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 공동이 내부 오목면 (internal concave surface)을 가지는, 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 공동이 구형 공동 (spherical void)을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 구형 공동이 3D 원통형 공간 내 64.0%를 초과하는 패킹 효율 (packing efficiency)을 가지는, 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 3D 생물반응기가 인장 탄성률이 적어도 0.01 GPa인 소재로부터 제조되는, 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 3D 생물반응기가 생체적합한 소재로 제조되는, 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 3D 생물반응기가, 세포 배양 중에, 가수분해 수준이 존재하는 소재의 5.0 중량%를 초과하지 않도록, 가수분해에 민감하지 않은 소재로 제조되는, 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 직경 Φ 및 높이 H를 가지며, Φ:H의 비율이 1:1 초과 내지 100:1 이하의 범위인, 방법.
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