JP2022527364A - Ｔ細胞受容体遺伝子アセンブリのための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列をアセンブリするための組成物及び方法が提供される。【選択図】図６

Description

相互参照
本出願は、２０１９年４月０５日に出願された米国仮特許出願第６２／８２９，８１３号、２０１９年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８３８，４６５号、２０１９年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８９８，０５３号、及び２０２０年２月１０日に特許出願された米国仮特許出願第６２／９７２，２３１号の利益を主張するものであり、これらの各出願は参照により本明細書に援用される。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は抗原－主要組織適合複合体の認識を担い、炎症応答の開始を導き得る。細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞を含む多くのＴ細胞サブセットが存在する。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている）は、異常な細胞（例えば、ウイルスに感染した細胞または腫瘍細胞）を殺滅する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている）は、他の免疫細胞の活性化や成熟を助ける。細胞障害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞は、それぞれの応答のトリガーとなる特異的な標的抗原を認識した後にその機能を発揮する。Ｔ細胞の抗原特異性は、Ｔ細胞の表面上に発現するＴＣＲによって定義することができる。Ｔ細胞受容体は、２つのポリペプチド鎖から構成されたヘテロ二量体タンパク質であり、最も一般的なものはアルファ鎖及びベータ鎖であるが、少数のＴ細胞がガンマ鎖及びデルタ鎖を発現することもある。ＴＣＲの特異的なアミノ酸配列及び結果としての三次元構造が、ＴＣＲの抗原特異性及び親和性を規定する。ＴＣＲは膨大な数の可能な配列が存在するため、個々のＴ細胞のＴＣＲ鎖のアミノ酸配列及びコードＤＮＡ配列は、一生物の全体のＴＣＲレパートリーの中でほぼ常に一意であるか、または非常に少ない存在量である。このような配列の多様性は、Ｔ細胞の発生中に複数の細胞機序によって達成され得、免疫システムが膨大な種類の潜在的抗原に応答する能力における極めて重要な側面と考えられる。
ＴＣＲレパートリーの解析は、免疫システムの特徴ならびに疾患の病因及び進行（特に抗原性トリガーが未知のもの）について、より十分な理解を得る一助となり得る。ＴＣＲレパートリーの極端な多様性及びＴＣＲの二分性は、解析上の大きな課題に相当し得るものである。ハイスループットシークエンシングは、スペクトラタイピングに比べて費用はかかるものの、よりシークエンシングの深さを増し、ＴＣＲクロノタイプの存在量を著しく正確に定量化することを可能にし得る。
本明細書では、ネイティブ対合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（または同族ＴＣＲ対）をコードする核酸配列をアセンブリするための組成物及び方法が提供される。例えば、ＴＣＲがＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む場合もあれば、ＴＣＲがＴＣＲガンマ鎖及びＴＣＲデルタ鎖を含む場合もある。ネイティブ対合ＴＣＲをコードする配列は、限定されるものではないが、シングルセルバーコード化及びシークエンシング技術の使用を含めた様々な方法を用いて同定することができる。ネイティブ対合ＴＣＲをコードする配列を得た後に、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して１つ以上の核酸配列を構築またはアセンブリし、任意の所与の宿主細胞（複数可）内でネイティブ対合ＴＣＲを高処理かつ低コストの方式で発現させることができる。１つ以上の核酸配列は、異なるＴＣＲをコードする異なる配列を、約１、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上含み得る。
１つの態様において、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその一部をコードする核酸分子を生成するための方法であって、（ａ）ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子を準備することと、（ｂ）複数の核酸分子を準備することであって、当該複数の核酸分子の各々がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、当該複数の核酸分子が少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する少なくとも２つの異なる配列を含む、準備することと、（ｃ）（ａ）の当該少なくとも１つの核酸分子を、同じ区画内の（ｂ）の当該複数の核酸分子に接触させることとを含み、（ａ）の当該少なくとも１つの核酸分子が、当該複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に結合して、ＣＤＲ３をコードする配列と当該少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子のうちの１つに由来する配列とを含む、第３の核酸分子を生成することが可能であり、それにより、当該ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする当該核酸分子を生成する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる配列を含む。いくつかの実施形態において、各核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む複数の各核酸分子は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、またはそれ以上の異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する異なる配列を含む。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子は第１の複数の核酸分子を含み、当該第１の複数の核酸分子の各核酸分子はＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子の任意の１つの所与のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に特異的に結合可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はさらに、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子はヒトＴＣＲ Ｖ遺伝子またはマウスＴＣＲ Ｖ遺伝子である。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ヒトＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８－１、ＴＲＡＶ８－２、ＴＲＡＶ８－３、ＴＲＡＶ８－４、ＴＲＡＶ８－６、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２－１、ＴＲＡＶ１２－２、ＴＲＡＶ１２－３、ＴＲＡＶ１３－１、ＴＲＡＶ１３－２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６－１、ＴＲＡＶ２６－２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８－１、ＴＲＡＶ３８－２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、及びＴＲＡＶ４１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３－１、ＴＲＢＶ４－１、ＴＲＢＶ４－２、ＴＲＢＶ４－３、ＴＲＢＶ５－１、ＴＲＢＶ５－４、ＴＲＢＶ５－５、ＴＲＢＶ５－６、ＴＲＢＶ５－８、ＴＲＢＶ６－１、ＴＲＢＶ６－２、ＴＲＢＶ６－３、ＴＲＢＶ６－４、ＴＲＢＶ６－５、ＴＲＢＶ６－６、ＴＲＢＶ６－８、ＴＲＢＶ６－９、ＴＲＢＶ７－２、ＴＲＢＶ７－３、ＴＲＢＶ７－４、ＴＲＢＶ７－６、ＴＲＢＶ７－７、ＴＲＢＶ７－８、ＴＲＢＶ７－９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０－１、ＴＲＢＶ１０－２、ＴＲＢＶ１０－３、ＴＲＢＶ１１－１、ＴＲＢＶ１１－２、ＴＲＢＶ１１－３、ＴＲＢＶ１２－３、ＴＲＢＶ１２－４、ＴＲＢＶ１２－５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０－１、ＴＲＢＶ２４－１、ＴＲＢＶ２５－１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９－１、及びＴＲＢＶ３０からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する複数の配列の各配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖はＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、またはＴＣＲデルタ鎖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はさらに、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子は追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３をコードする配列及び追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列は最大１００ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖及び追加のＴＣＲ鎖はＴＣＲ鎖の同族対である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はコネクター配列を含み、コネクター配列は、少なくとも１つの核酸分子を複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に結合して第３の核酸分子を生成可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子及び複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、機能的ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はアンチコネクター配列を含み、当該アンチコネクター配列は、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子のコネクター配列に相補的である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とを結合することを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とをハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズすることは、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子のコネクター配列を（ｂ）の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子のアンチコネクター配列とハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ｉ）（ａ）の少なくとも１つの核酸分子を鋳型として用いて、複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子の遊離３’末端を伸長して、及び／または（ｉｉ）複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を鋳型として用いて、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子の遊離３’末端を伸長して、第３の核酸分子を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の核酸分子を制限酵素に接触させて粘着末端を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の核酸分子を追加の核酸分子に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、追加の核酸分子はＴＣＲ鎖の定常領域またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の核酸分子と追加の核酸分子とをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、各々が異なるＴＣＲ鎖またはその一部をコードする複数の核酸分子は、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの少なくとも５つの異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの少なくとも１０の異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、同じ区画は、ウェル、管、または液滴である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子は一意のバーコードを含む。いくつかの実施形態において、一意のバーコードはプライマー結合部位である。いくつかの実施形態において、コネクター配列は一意のバーコードを含む。いくつかの実施形態において、一意のバーコードはプライマー結合部位である。
別の態様において、本開示は、（ａ）複数の核酸分子であって、当該複数の核酸分子の各核酸分子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、ＣＤＲ３配列を含まず、当該複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子が第１のアンチコネクター配列を含み、当該複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子が第２のアンチコネクター配列を含み、当該第１のアンチコネクター配列が当該第２のアンチコネクター配列と異なり、当該第１の核酸分子及び当該第２の核酸分子のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列が、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する、複数の核酸分子と、（ｂ）ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子であって、当該少なくとも１つの核酸分子が第１のアンチコネクター配列に相補的な第１のコネクター配列をさらに含む、少なくとも１つの核酸分子とを含む、組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、当該組成物は液体組成物である。いくつかの実施形態において、（ａ）の複数の核酸分子及び（ｂ）の少なくとも１つの核酸分子は同じ区画内にある。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子の少なくとも１０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子はＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＧＶ遺伝子、またはＴＲＤＶ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はさらに、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はさらに、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はさらに、追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３をコードする配列及びＣＤＲ３をコードする追加の配列は、最大１００ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖及び追加のＴＣＲ鎖はＴＣＲ鎖の同族対である。いくつかの実施形態において、（ｂ）の少なくとも１つの核酸分子は第１の複数の核酸分子を含み、当該第１の複数の核酸分子の各核酸分子はＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、異なるＴＣＲ鎖の異なるＣＤＲ３をコードする。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は異なるコネクター配列を含み、当該異なるコネクター配列は、任意の１つの所与のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む当該複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に特異的に結合可能である。いくつかの実施形態において、第１のアンチコネクター配列または第２のアンチコネクター配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子配列は、再配置された遺伝子内のＣＤＲ３をコードする配列に隣接するＴＣＲ Ｖ遺伝子の少なくとも３つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のアンチコネクター配列または第２のアンチコネクター配列は、所定の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列は第１のアンチコネクター配列とハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、（ｂ）の少なくとも１つの核酸分子は一意のバーコードを含む。いくつかの実施形態において、一意のバーコードはプライマー結合部位である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子の第１のコネクター配列は一意のバーコードを含む。いくつかの実施形態において、一意のバーコードはプライマー結合部位である。
別の態様において、本開示は、複数の核酸分子を生成するための方法を提供し、当該方法は、第１の複数の核酸分子を準備することであって、当該第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、準備することと、第２の複数の核酸分子を準備することであって、当該第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、当該１つの核酸分子が定常ドメインをコードする配列を含まない、準備することと、当該第１の複数の核酸分子及び当該第２の複数の核酸分子を接触させることであって、当該第１の複数の核酸分子のうちの当該１つの核酸分子が当該第２の複数の核酸分子のうちの当該１つの核酸分子と結合して、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３をコードする当該配列と、当該ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する当該配列とを含む、核酸分子を形成し、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３をコードする当該配列ならびに当該ＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、接触させることとを含む。
いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、第１のＴＣＲ鎖の異なる第１のＣＤＲ３及び／または第２のＴＣＲ鎖の異なるＣＤＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子は、少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の各核酸分子は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、またはそれ以上の異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子及び第２の複数の核酸分子は、同じ区画内で接触される。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はさらにコネクター配列を含み、当該コネクター配列は、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とを結合する。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はアンチコネクター配列をさらに含み、当該アンチコネクター配列はコネクター配列に相補的である。いくつかの実施形態において、コネクター配列はアンチコネクター配列とハイブリダイズして、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とを結合する。いくつかの実施形態において、コネクター配列はコドン多様化され、その結果、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子のコネクター配列は、第１の複数の核酸分子の他の核酸分子の他のコネクター配列と異なる。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はさらに、第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域及び／または第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）第１のＴＣＲ鎖がＴＣＲアルファ鎖であり、第２のＴＣＲ鎖がＴＣＲベータ鎖である、または（ｉｉ）第１のＴＣＲ鎖がＴＣＲガンマ鎖であり、第２のＴＣＲ鎖がＴＣＲデルタ鎖である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子はＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＧＶ遺伝子、またはＴＲＤＶ遺伝子である。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は二重鎖核酸分子である。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はさらに、自己切断ペプチドの一部をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチコネクター配列は、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子のオーバーハングである。いくつかの実施形態において、コネクター配列またはアンチコネクター配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００ヌクレオチド、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ｉ）第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とハイブリダイズした第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子の３’末端を伸長すること、及び／または（ｉｉ）第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とハイブリダイズした第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子の３’末端を伸長することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とライゲーションすることを含む。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列とＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む核酸分子を、制限酵素に接触させて粘着末端を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列とＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む核酸分子を、定常領域またはその一部をコードする配列を含む追加の核酸分子に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列とＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む核酸分子を、粘着末端を介し追加の核酸分子とライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、第１のＣＤＲ３をコードする配列及び第２のＣＤＲ３をコードする第２の配列は、最大約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。
別の態様において、本開示は、第１の複数の核酸分子であって、当該第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３がＴＣＲ鎖の同族対に由来する、第１の複数の核酸分子と、第２の複数の核酸分子であって、当該第２の複数の核酸分子の各核酸分子が、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、当該第２の複数の核酸分子の各核酸分子が、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３をコードする配列を含まない、第２の複数の核酸分子とを含み、（ｉ）当該第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、異なる第１のＣＤＲ３及び／または第２のＣＤＲ３をコードする配列を含む、及び／または（ｉｉ）当該第２の複数の核酸分子の各核酸分子が、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子は、少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の各核酸分子は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、またはそれ以上の異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子はさらにコネクター配列を含み、所与のコネクター配列は、第１の複数の核酸分子の所与の核酸分子と第２の複数の核酸分子の所与の核酸分子とを結合するために使用可能である。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子の各核酸分子はアンチコネクター配列をさらに含み、当該アンチコネクター配列はコネクター配列に相補的である。いくつかの実施形態において、コネクター配列はコドン多様化され、その結果、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子の所与のコネクター配列は、第１の複数の核酸分子の他の核酸分子の他のコネクター配列と異なる。いくつかの実施形態において、コネクター配列はアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、コネクター配列は、第１のＴＣＲ鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列にインフレームである。いくつかの実施形態において、コネクター配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００ヌクレオチド、またはそれ以上を含む。いくつかの実施形態において、コネクター配列は、第１のＴＣＲ鎖の第１のＣＤＲ３または第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列に隣接した少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００ヌクレオチド、またはそれ以上のＴＣＲ Ｖ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、所与のコネクター配列によってコードされた所与のアミノ酸配列は、少なくとも１つの他のコネクター配列によってコードされた少なくとも１つの他のアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じである。いくつかの実施形態において、所与のコネクター配列によってコードされた所与のアミノ酸配列は、他のコネクター配列によってコードされた他のアミノ酸配列と異なる。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域及び／または第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、当該組成物は液体組成物である。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子及び第２の複数の核酸分子は、同じ区画内にある。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子は、所与のコネクター配列を介し、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子に結合する。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子は、所与のアンチコネクター配列とハイブリダイズした所与のコネクター配列を介し、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子とハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、第１のＣＤＲ３をコードする配列及び第２のＣＤＲ３をコードする配列は、最大１００ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子または第２の複数の分子の各核酸分子は化学的に合成される。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、最大で約２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、または５０ヌクレオチド長である。
別の態様において、本開示は、複数の核酸分子を含む組成物であって、当該複数の核酸分子の各核酸分子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ遺伝子配列に由来する配列を含み、当該複数の核酸分子が、第１のコネクター配列を有する第１の核酸分子と、第２のコネクター配列を有する第２の核酸分子とを含み、当該第１のコネクター配列が当該第２のコネクター配列と異なる、組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は異なるコネクター配列を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含まない。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖の定常ドメインをコードする配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子の少なくとも１０、２０、３０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチド、またはそれ以上を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子はＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＧＶ遺伝子、またはＴＲＤＶ遺伝子である。
別の態様において、本開示は、複数の核酸分子を含む組成物であって、当該複数の核酸分子の各核酸分子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖のＣＤＲ３またはその一部をコードし、当該複数の核酸分子が、第１のコネクター配列を有する第１の核酸分子と、第２のコネクター配列を有する第２の核酸分子とを含み、当該第１のコネクター配列が当該第２のコネクター配列と異なる、組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、第１のＴＣＲ鎖の第１のＣＤＲ３またはその一部と、第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３またはその一部とをコードする。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域と、第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域とを含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、異なるＴＣＲ鎖の異なるＣＤＲ３またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は異なるコネクター配列を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、２００、１５０、１００、８０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチドを超えるＴＣＲ Ｖ遺伝子を含まない。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖の定常ドメインをコードする配列を含まない。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列または第２のコネクター配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、再配置された遺伝子内のＣＤＲ３をコードする配列に隣接した少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００ヌクレオチド、またはそれ以上のＴＣＲ Ｖ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列または第２のコネクター配列は、所定の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列または第２のコネクター配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、当該組成物はさらに第２の複数の核酸分子を含み、当該第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子は第１のアンチコネクター配列を含み、当該第１のアンチコネクター配列は第１のコネクター配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子は第２のアンチコネクター配列を含み、当該第２のアンチコネクター配列は第２のコネクター配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子の第１のアンチコネクター配列は、第１の複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子の第１のコネクター配列に結合する。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子の第２のアンチコネクター配列は、第１の複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子の第２のコネクター配列に結合する。
別の態様において、本開示は、複数の核酸分子を含む組成物であって、当該複数の核酸分子の各々が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の少なくとも１０のアミノ酸（例えば、いくつかの場合では、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、またはそれ以上のアミノ酸）をコードする配列を含み、当該複数の核酸分子が、第１のコネクター配列を有する第１の核酸分子と、第２のコネクター配列を有する第２の核酸分子とを含み、当該第１のコネクター配列が当該第２のコネクター配列と異なり、当該第１のコネクター配列または当該第２のコネクター配列がＴＣＲ鎖の一部をコードし、当該第１のコネクター配列または当該第２のコネクター配列が、ＴＣＲ鎖の少なくとも１０のアミノ酸をコードする（例えば、いくつかの場合において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、またはそれ以上のアミノ酸をコードする）配列にインフレームである、組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列または第２のコネクター配列は、ＴＣＲ鎖遺伝子の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含み、ＴＣＲ鎖の少なくとも１０のアミノ酸をコードする配列にインフレームである。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列及び第２のコネクター配列は、ＴＣＲ鎖の少なくとも２つの連続したアミノ酸をコードする。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の一部のＴＣＲ鎖及び少なくとも１０のアミノ酸をコードする配列によってコードされたＴＣＲ鎖は同じである。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子は、第１のＴＣＲ鎖の第１のＣＤＲ３またはその一部と、第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３またはその一部とをコードする。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域と、第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域とを含む。いくつかの実施形態において、第１のＣＤＲ３またはその一部をコードする配列及び第２のＣＤＲ３またはその一部をコードする配列は、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列または第２のコネクター配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列または第２のコネクター配列は、所定の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列は、第２のコネクター配列のヌクレオチドとは異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列は、第２のコネクター配列と同じアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、第１のコネクター配列は、第２のコネクター配列とは異なるアミノ酸配列をコードする。
別の態様において、本開示は、各核酸分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその領域をコードする、複数の核酸分子を生成するための方法であって、第１の複数の核酸分子及び第２の複数の核酸分子を接触させて、少なくとも２つ（例えば、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上）の異なる核酸分子を含む、第３の複数の核酸分子を生成することを含み、当該少なくとも２つの異なる核酸分子の各々が、異なるＴＣＲ鎖またはその領域をコードする異なる配列を有し、当該少なくとも２つの異なる核酸分子が同じ区画内で生成される、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子はヒトＴＣＲ Ｖ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ヒトＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８－１、ＴＲＡＶ８－２、ＴＲＡＶ８－３、ＴＲＡＶ８－４、ＴＲＡＶ８－６、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２－１、ＴＲＡＶ１２－２、ＴＲＡＶ１２－３、ＴＲＡＶ１３－１、ＴＲＡＶ１３－２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６－１、ＴＲＡＶ２６－２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８－１、ＴＲＡＶ３８－２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、またはＴＲＡＶ４１である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３－１、ＴＲＢＶ４－１、ＴＲＢＶ４－２、ＴＲＢＶ４－３、ＴＲＢＶ５－１、ＴＲＢＶ５－４、ＴＲＢＶ５－５、ＴＲＢＶ５－６、ＴＲＢＶ５－８、ＴＲＢＶ６－１、ＴＲＢＶ６－２、ＴＲＢＶ６－３、ＴＲＢＶ６－４、ＴＲＢＶ６－５、ＴＲＢＶ６－６、ＴＲＢＶ６－８、ＴＲＢＶ６－９、ＴＲＢＶ７－２、ＴＲＢＶ７－３、ＴＲＢＶ７－４、ＴＲＢＶ７－６、ＴＲＢＶ７－７、ＴＲＢＶ７－８、ＴＲＢＶ７－９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０－１、ＴＲＢＶ１０－２、ＴＲＢＶ１０－３、ＴＲＢＶ１１－１、ＴＲＢＶ１１－２、ＴＲＢＶ１１－３、ＴＲＢＶ１２－３、ＴＲＢＶ１２－４、ＴＲＢＶ１２－５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０－１、ＴＲＢＶ２４－１、ＴＲＢＶ２５－１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９－１、またはＴＲＢＶ３０である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖はＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、またはＴＣＲデルタ鎖である。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖及び追加のＴＣＲ鎖はＴＣＲ鎖の同族対である。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、異なるＴＣＲ鎖またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子はコネクター配列を含み、当該コネクター配列は、第１の複数の核酸分子のうちの当該所与の核酸分子を第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子に結合するために使用可能である。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子及び第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子は、機能的ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子は、アンチコネクター配列を含み、当該アンチコネクター配列は、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子のコネクター配列と相補的である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子と、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子とを結合することを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子と、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子とをハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズすることは、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子のコネクター配列を、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子のアンチコネクター配列とハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ｉ）第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子を鋳型として用いて、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子の遊離３’末端を伸長して、及び／または（ｉｉ）第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子を鋳型として用いて、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子の遊離３’末端を伸長して、第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子と、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子とをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を制限酵素に接触させて粘着末端を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を追加の核酸分子に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、追加の核酸分子はＴＣＲ鎖の定常領域またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と追加の核酸分子とをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、第３の複数の核酸分子のうちの少なくとも５つ（例えば、いくつかの場合では、少なくとも約６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、またはそれ以上）の異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、第３の複数の核酸分子のうちの少なくとも１０の異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、同じ区画は、ウェル、管、または液滴である。
別の態様において、本開示は、複数の核酸分子を生成するための方法であって、（ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、当該第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、準備することと、（ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、当該第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、準備することと、（ｃ）当該第１の複数の核酸分子及び当該第２の複数の核酸分子を接触させることであって、当該第１の複数の核酸分子のうちの当該１つの核酸分子が当該第２の複数の核酸分子のうちの当該１つの核酸分子と結合して、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３をコードする当該配列と、当該ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する当該配列とを含む、直鎖状の核酸分子を形成し、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３をコードする当該配列ならびに当該ＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、接触させることとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の各核酸分子は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、またはそれ以上の異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子を含む。
別の態様において、本開示は、複数の核酸分子を生成するための方法であって、（ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、当該第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、（ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする合成配列と、（ｉｉ）第３のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第３のＣＤＲ３及び第４のＴＣＲ鎖の第４のＣＤＲ３をコードする合成配列とを含み、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の第１の同族対に由来し、当該第３のＣＤＲ３及び当該第４のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の第２の同族対に由来する、準備することと、（ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、当該第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、準備することと、（ｃ）当該第１の複数の核酸分子及び当該第２の複数の核酸分子を接触させることであって、当該第１の複数の核酸分子のうちの当該１つの核酸分子が当該第２の複数の核酸分子のうちの当該１つの核酸分子と結合して、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３をコードする当該配列と、当該ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する当該配列とを含む、核酸分子を形成し、当該第１のＣＤＲ３及び当該第２のＣＤＲ３をコードする当該配列ならびに当該ＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、接触させることとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子は、少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の各核酸分子は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、またはそれ以上の異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子を含む。
別の態様において、本開示は、対象からの組織試料中のネイティブ対合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の配列を同定する方法であって、（ａ）当該対象から得られた複数の末梢Ｔ細胞を含む試料中の１つ以上のネイティブ対合ＴＣＲの１つ以上の対合配列を同定することであって、当該１つ以上の対合配列の各々がＣＤＲ３配列を含む、同定することと、（ｂ）ネイティブ対合他方のＴＣＲ鎖が未知である、当該組織試料中のＴＣＲのＴＣＲ鎖の組織ＣＤＲ３配列を同定することであって、当該組織ＣＤＲ３配列が、当該１つ以上のネイティブ対合ＴＣＲのうちの当該１つ以上の対合配列の少なくとも１つの対合配列のＣＤＲ３配列に適合して、それにより、当該少なくとも１つの対合配列を、当該組織試料中の当該ネイティブ対合ＴＣＲの配列として同定する、同定することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、（ａ）における同定することは、複数の末梢Ｔ細胞を含む試料中の１つ以上のネイティブ対合ＴＣＲをシークエンシングすることを含む。いくつかの実施形態において、シークエンシングはシングルセルシークエンシングを含む。いくつかの実施形態において、シングルセルシークエンシングは、複数の末梢Ｔ細胞を、各区画が複数の末梢Ｔ細胞の個々の末梢Ｔ細胞を含む、複数の区画に分割することを含む。いくつかの実施形態において、組織試料は体液組織試料ではない。いくつかの実施形態において、組織試料は固形腫瘍試料である。いくつかの実施形態において、組織試料は固定または凍結された試料である。いくつかの実施形態において、複数の末梢Ｔ細胞を含む試料は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ａ）の前に、対象から血液試料を得ることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ａ）の前に、血液試料から末梢血単核細胞を単離することを含む。いくつかの実施形態において、組織試料は腫瘍浸潤性Ｔ細胞を含む。
別の態様において、本開示は、標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法を用いて同定されたＴＣＲを含む細胞を準備することと、（ｂ）当該細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示された標的抗原に接触させることであって、当該細胞が当該ＴＣＲを介し当該ＡＰＣによって提示された当該標的抗原に結合し、それにより、当該ＴＣＲを当該標的反応性ＴＣＲとして同定する、接触させることとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍抗原（例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原）である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、標的反応性ＴＣＲをコードする配列を宿主細胞内に送達することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、対象に宿主細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は自己由来Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は同種異系Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はレポーター細胞株であり、当該レポーター細胞株は、当該細胞がＡＰＣによって提示された標的抗原に結合した際に発現するレポーター遺伝子を含む。
本開示のさらなる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し説明する以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。了解されるように、本開示は、他の及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明らかな点で変更が可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に例示とみなし、制限とはみなさないものとする。
参照による援用
本開示で言及されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれているように示されている場合と同じ程度において、参照により本明細書に援用される。参照により援用される刊行物及び特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示内容と矛盾する程度において、本明細書は、任意のこのような矛盾する内容に取って代わる及び／または優先するように意図されている。
本明細書の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点については、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及びその添付図面（本明細書では「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」、「図（Ｆｉｇ）」、及び「図（ＦＩＧＵＲＥ）」とも称される）を参照することによって、より十分な理解が得られるであろう。
Ｔ細胞受容体をコードする核酸コンストラクトを生成するスキームの例を示している。 Ｔ細胞受容体をコードする核酸コンストラクトを生成するスキームの例を示している。 Ｔ細胞受容体をコードする核酸コンストラクトを生成するスキームの例を示している。 本明細書に記載の方法を用いたシミュレーション結果の例を示している。 本明細書に記載の方法を用いたシミュレーション結果の例を示している。 本明細書に記載の方法を用いたシミュレーション結果の例を示している。 本明細書に記載の方法を用いたシミュレーション結果の一例を示している。 ＴＣＲ Ｖ遺伝子の生殖系列ゲノムＤＮＡの模式図である。 再配置されたＴＣＲ Ｖ－Ｊ遺伝子のゲノムＤＮＡの模式図である。 再配置されたＴＣＲ Ｖ－Ｄ－Ｊ遺伝子のゲノムＤＮＡの模式図である。 ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドを正しいＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドに結合することに関連する潜在的チャレンジのスキームを示している。破線の矢印は、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドと誤ったＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドとの間で結合が起こり得ることを示している。 プライマーのオーバーラップ伸長により、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド（白枠とつながった灰色の枠）を、指定された予め合成されたＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチド（細い矢印が示す灰色の枠とつながった黒枠）に結合するスキームを示している。上の太い矢印（６０３）は、予め合成されたＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチド上のコネクター配列（６０１）と、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド上のコネクター配列（６０２）との間のハイブリダイゼーションを示している。下の太い矢印（６０４）はプライマー伸長を示している。６０１はコネクター配列と称され得、６０２はアンチコネクター配列と称され得る（またはその逆）。 任意のコネクター（７０１）及びアンチコネクター（７０２）配列を用いた、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド及び指定されたＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドの結合を示している。 ＴＣＲ遺伝子の自己アセンブリの一般的な原理を示している。８０１：予め合成されたＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチド。８０２：ＣＤＲ３－Ｊ配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド）。８０３：Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチド配列及びＣＤＲ３－Ｊ配列を含む核酸配列。Ｘは、各々が異なるＶ遺伝子の生殖系列ポリヌクレオチドの一部であるポリヌクレオチドの数である。Ｙは、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドの数である。ＹはＸよりはるかに大きい場合がある。矢印は、各ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドが、指定された予め合成されたＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドに結合するバルク反応を示している。 血液試料を使用して腫瘍試料中の腫瘍浸潤ＴＣＲを同定するワークフローの例を示している。 図９Ａに示された方法を用いて同定されたＴＣＲの適用例を示している。 図９Ａに示された方法を用いて同定されたＴＣＲの適用例を示している。 本明細書に記載の方法を用いたシミュレーション結果の例を示している。 本明細書に記載の方法を用いたシミュレーション結果の例を示している。 本明細書に記載の方法を用いたシミュレーション結果の例を示している。 本明細書に記載の方法を用いたシミュレーション結果の例を示している。 本明細書に記載の遺伝子アセンブリ法を評価する次世代シークエンシングデータの例を示している。 本明細書に記載の遺伝子アセンブリ法を評価する次世代シークエンシングデータの例を示している。 本明細書に記載の遺伝子アセンブリ法を評価する次世代シークエンシングデータの例を示している。 本明細書に記載の遺伝子アセンブリ法を評価する次世代シークエンシングデータの例を示している。 本明細書に記載の遺伝子アセンブリ法を評価する次世代シークエンシングデータの例を示している。 本明細書に記載の遺伝子アセンブリ法を評価する次世代シークエンシングデータの例を示している。 本明細書に記載の遺伝子アセンブリ法を評価する次世代シークエンシングデータの例を示している。
本開示では、別段の明記がない限り、単数形の使用は複数形を含む。さらに、「または」の使用は、別段の記載がない限り、「及び／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定的であるようには意図されていない。
「約」または「およそ」という用語は、当業者による判定で特定の値に対し許容される誤差範囲を意味し、この誤差は、部分的には、値がどのように測定または定量されるか、すなわち、測定システムの制約に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における慣例に従い、１以内のまたは１以上の標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。代替的に、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、当該用語は、値の１桁以内、例えば、５倍以内または２倍以内を意味し得る。別段の明記がない限り、本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載される場合、「約」という用語は、特定の値における許容可能な誤差範囲内を意味することを想定するものとする。
２つ以上の一連の数値の最初の数値の前に「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」、「～より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）」、または「～以上（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ｏｒ ｅｑｕａｌ ｔｏ）」という用語がある場合は常に、その一連の数値の各数値に「少なくとも」、「～より大きい」、または「～以上」という用語が適用される。例えば、１、２、または３以上は、１以上、２以上、または３以上と等価である。
２つ以上の一連の数値の最初の数値の前に「～以下（ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）」、「～未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」、または「～以下（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｏｒ ｅｑｕａｌ ｔｏ）」という用語がある場合は常に、その一連の数値の各数値に「～以下」、「～未満」、または「～以下」という用語が適用される。例えば、３、２、または１以下は、３以下、２以下、１以下と等価である。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本開示では互換的に使用される。これらは、様々な長さのヌクレオチドの多量体形態を指す場合もある。これらは、デオキシリボヌクレオチド及び／またはリボヌクレオチド、あるいはこれらのアナログを含み得る。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）から選択される１つ以上のヌクレオチド、またはこれらのバリアントを含み得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のリン酸（ＰＯ３）基を含み得る。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）、及び１つ以上のリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有し得、様々な機能を発揮し得る。ポリヌクレオチドは、直鎖状、環状、ステムループ状、分枝状などの様々な構造を有し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例は以下の通り：遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義される座位（ｌｏｃｉ）（座位（ｌｏｃｕｓ））、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそのアナログなどの１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、多量体の集成の前に付与されても後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識構成要素とのコンジュゲートにより、重合後にさらに修飾され得る。ポリヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド（複数可）、非天然ヌクレオチド（複数可）、ヌクレオチドアナログ（複数可）、及び／または修飾ヌクレオチドを含めた１つ以上のヌクレオチドバリアントを含み得る。
本明細書で使用する場合、「配列」とは、核酸分子のヌクレオチドの順序、またはペプチドのアミノ酸残基の順序を指す。核酸配列は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列であってもリボ核酸（ＲＮＡ）配列であってもよく、直鎖状であっても環状であっても分枝状であってもよく、単鎖であっても二重鎖であってもよい。配列は、参照配列（例えば、野生型配列）と異なるように変異させることができる。配列は、任意の長さとすることができ、例えば、長さが２～１，０００，０００アミノ酸もしくはヌクレオチドまたはそれ以上（またはその間もしくはそれを上回る任意の整数値）、例えば、約１００～約１０，０００ヌクレオチド、または約２００～約５００アミノ酸もしくはヌクレオチドとすることができる。いくつかの場合では、所与の核酸配列は、所与の核酸配列の配列情報及び所与の核酸配列の逆相補配列を包含し得る。いくつかの場合では、ＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡから転写される対応するＲＮＡ配列の配列情報を包含し得る。配列は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子のアルファベット表記であり得る。配列は、コンピュータープロセッサーに使用され得る情報であり得る。いくつかの場合では、核酸配列は、物理的な核酸分子自体を指すために使用され得る。
本明細書で使用する場合、「平滑末端」という用語は、核酸分子の一方の鎖の末端にあるヌクレオチドの実質的に全てが、同じ核酸分子の他方の鎖の末端にある対向ヌクレオチドと塩基対合している、二重鎖核酸分子の末端を指す。核酸分子は、少なくとも１ヌクレオチド長の単鎖部分を含む末端を有する場合、平滑末端ではない。このような末端は、本明細書では「オーバーハング」または「粘着末端」と称される。
本明細書で使用する場合、「ＴＣＲ Ｖ遺伝子」という用語は、リーダーペプチドの第１の部分をコードする配列（例えば、ＩＭＧＴによって定義されたＬ－ＰＡＲＴ１）、イントロン（例えば、ＩＭＧＴによって定義されたＶイントロン）、及びエクソン（例えば、ＩＭＧＴによって定義されたＶ－ＥＸＯＮ）をコードする配列を、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ（組換えシグナル配列を含む）と共に含む、生殖系列構成のＴ細胞受容体可変（Ｖ）遺伝子のゲノム核酸配列を指す。組換えシグナル配列は、スペーサーエレメント（例えば、ＩＭＧＴによって定義されたＶスペーサー）によって分離された七量体（例えば、ＩＭＧＴによって定義されたＶ七量体）及び九量体（例えば、ＩＭＧＴによって定義されたＶ九量体）を含み得る。Ｖエクソンは、リーダーペプチドの第２の部分（Ｌ－ＰＡＲＴ２）及びＶ領域をコードする配列を包含する。ＴＣＲ Ｖ遺伝子の例としては、ＴＣＲアルファ可変（ＴＲＡＶ）遺伝子、ＴＣＲベータ可変（ＴＲＢＶ）遺伝子、ＴＣＲガンマ可変（ＴＲＧＶ）遺伝子、及びＴＣＲデルタ可変（ＴＲＤＶ）遺伝子が挙げられる。本明細書に記載の核酸は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み得る。「由来する」とは、参照配列に対し少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を意味する。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、上記のようにＴＣＲ Ｖ遺伝子のゲノム核酸配列の完全長配列であり得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチド、またはそれ以上を含むＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部であり得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、コドン最適化（またはコドン多様化）された核酸配列であり得る。所与の核酸配列のコドン最適化配列とは、タンパク質コード領域が所与の核酸のタンパク質コード領域と同じアミノ酸配列をコードする修飾核酸配列を指す。修飾核酸配列は、所与の核酸配列とは異なる配列を有する場合もあれば、所与の核酸に由来する場合もある。コドン最適化は、制限部位の除去、ポリヌクレオチド配列内の不要な二次構造の除去、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド及びＴＣＲ Ｖ遺伝子の指定された合成前部分の正しい結合の促進、または他の目的で実施され得る。コドン最適化またはコドン多様化は、所定の核酸配列の１つ以上のヌクレオチドを変更することによって達成され得る。例えば、コドン最適化またはコドン多様化は、計算的方法によって達成され得る。本開示では、コドン最適化及びコドン多様化が互換的に使用され得る。
本明細書で使用する場合、「Ｖ領域」という用語は、生殖系列ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるＴＣＲ Ｖ遺伝子のコード領域（（存在する場合）Ｖ七量体の前の１または２ヌクレオチドを含む）、または再配置されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるＶ－（Ｄ）－Ｊ再配置によって通常３’でトリミングされた可変（Ｖ）領域を指す。
本明細書で使用する場合、「Ｄ領域」という用語は、生殖系列ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるＴＣＲ Ｄ遺伝子のコード領域（（存在する場合）５’Ｄ七量体の後及び／または３’Ｄ七量体の前の１または２ヌクレオチド（複数可）を含む）、または、部分的に再配置されたまたは再配置されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるＤ－ＪまたはＶ－Ｄ－Ｊ再配置によって通常５’及び／または３’でトリミングされた多様性（Ｄ）領域を指す。
本明細書で使用する場合、「Ｊ領域」という用語は、生殖系列ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるＴＣＲ Ｊ遺伝子のコード領域（（存在する場合）Ｊ七量体の後の１または２ヌクレオチド（複数可）を含む）、または再配置されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるＶ－（Ｄ）－Ｊ再配置によって通常５’でトリミングされた接合（Ｊ）領域を指す。
本明細書で使用する場合、「Ｖ－Ｊ領域」という用語は、再配置されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるＶ領域及びＪ領域を含むＴＣＲ鎖のコード領域を指す。
本明細書で使用する場合、「Ｖ－Ｄ－Ｊ領域」という用語は、再配置されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域を含むＴＣＲ鎖のコード領域を指す。
本開示では、「結合」または「接続」という用語が互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の核酸分子を物理的に結合することを指す。２つ以上の核酸分子は、２つ以上の核酸分子が連続した核酸分子を形成するように結合してもよい。２つ以上の核酸分子は、共有結合であっても非共有結合であってもよい。結合は、水素結合、イオン結合、共有結合、またはファンデルワールス力を含めた様々な方式で遂行され得る。
参照核酸配列（またはペプチド配列）に関する配列同一性パーセント（％）とは、配列をアラインメントし、必要な場合はギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照核酸配列（またはペプチド配列）におけるヌクレオチド（ペプチド配列の場合はアミノ酸残基）と同一である、候補配列におけるヌクレオチド（またはアミノ酸残基）のパーセンテージである。パーセント配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、当業者の技量範囲内の様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を使用して、達成することができる。当業者は、配列をアラインメントするための適切なパラメーター（比較されている配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。
核酸またはアミノ酸配列に適用される「実質的に同じ」という用語及びその文法上の等価物は、核酸またはアミノ酸配列が、標準的なパラメーターを用いて、上記のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）を用いて、参照配列と比較して少なくとも９０％以上の配列同一性、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較をデフォルトで使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトで使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）を参照）。
概要
ハイスループットペアードシークエンシングを使用してＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をシークエンシングすることができる。例えば、シングルセル技術の開発により、個々のＴ細胞を隔離された区画に分割し、同じＴ細胞からのＴＣＲアルファ及びベータ鎖ｍＲＮＡを同じ一意のバーコードに結び付けることができる。これらのシステムのいくつかは（例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって）市販されている。Ｔ細胞受容体アルファ可変（ＴＲＡＶ）遺伝子識別情報、ＣＤＲ３アルファ配列、Ｔ細胞受容体アルファ接合（ＴＲＡＪ）遺伝子識別情報、Ｔ細胞受容体ベータ可変（ＴＲＢＶ）遺伝子識別情報、ＣＤＲ３ベータ配列、及びＴ細胞受容体ベータ接合（ＴＲＢＪ）遺伝子識別情報を記録する対合配列情報により、完全長の発現可能なＴＣＲを再構築することができる。しかし、機能的研究及びスクリーニングのためにこのようなＴＣＲ配列を細胞内に導入可能なＤＮＡまたはＲＮＡの形式で合成する技術は、処理能力が低いことがある。本開示は、ＴＣＲ配列（例えば、いくつかの場合では、対合した完全長の発現可能なＴＣＲ配列）をコードするポリヌクレオチドを超高処理能力で構築することを可能にし得る複数の方法及び組成物を提供する。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
ＴＣＲを使用して、様々ながんまたは感染性生物に関連する抗原を認識するＴ細胞の能力を付与することができる。ＴＣＲは、２本の鎖、例えば、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖、またはガンマ（γ）鎖及びデルタ（δ）鎖から構成される。これらの鎖を構成するタンパク質はＤＮＡによってコードされており、ＤＮＡは、ＴＣＲの膨大な多様性を生成するための固有の機構を用いる。このマルチサブユニット免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体と会合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩ及びＩＩタンパク質によって提示されるペプチドに結合する。ＴＣＲとＡＰＣ上の抗原ペプチドとの結合はＴ細胞活性化における中心的な事象であり、これはＴ細胞とＡＰＣとの接触点にある免疫学的シナプスで生じる。
ＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩ分子の文脈でＴ細胞エピトープを認識し得る。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、高等脊椎動物の全ての有核細胞で発現し得る。ＭＨＣクラスＩ分子は、１２ｋＤａの軽鎖β－２ミクログロブリンと非共有結合している４６ｋＤａの重鎖から構成されたヘテロ二量体である。ヒトにはいくつかのＭＨＣアレル（例えば、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ２８、ＨＬＡ－Ａ３１、ＨＬＡ－Ａ３３、ＨＬＡ－Ａ３４、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ４５、及びＨＬＡ－Ｃｗ８）が存在する。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩアレルはＨＬＡ－Ａ２アレルであり、いくつかの集団では集団のおよそ５０％がそれを発現する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ２アレルは、ＨＬＡ－Ａ*０２０１、*０２０２、*０２０３、*０２０６、または*０２０７の遺伝子産物であり得る。いくつかの場合では、異なる集団間でサブタイプの頻度に差が生じ得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ２陽性コーカサス人集団の９５％超がＨＬＡ－Ａ*０２０１であるのに対し、中国人集団では、およそ２３％がＨＬＡ－Ａ*０２０１、４５％がＨＬＡ－Ａ*０２０７、８％がＨＬＡ－Ａ*０２０６、２３％がＨＬＡ－Ａ*０２０３という頻度であることが報告されている。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の文脈でＴ細胞エピトープを認識し得る。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ＡＰＣのサブセットで発現する。ヒトにはいくつかのＭＨＣクラスＩＩアレル（例えば、ＤＲ１、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＲ５２、ＤＱ１、ＤＱ２、ＤＱ４、ＤＱ８、及びＤＰＩ）が存在する。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩアレルは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１*０１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ*０３０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ*０７０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ*０４０１、またはＨＬＡ－ＤＱＢ１*０２０１の遺伝子産物である。
ＴＣＲ鎖は、可変ドメイン（または可変領域）及び定常ドメイン（または定常領域）を含み得る。可変ドメインは、ＩＭＧＴユニークナンバリングシステムによって定義されたＶドメインであり得る。可変ドメインは、ＴＣＲ鎖のＶ－Ｊ領域またはＶ－Ｄ－Ｊ領域に対応し得る。定常ドメインは、ＩＭＧＴユニークナンバリングシステムによって定義されたＣドメインであり得る。いくつかの場合では、定常ドメインは定常領域の一部であり得る。例えば、完全長の定常領域は、定常ドメイン（細胞外領域）、接続領域、膜貫通領域、及び細胞質領域を含み得る。
ＴＣＲαまたはＴＣＲδ鎖の可変ドメインは、生殖系列内の多数の可変（Ｖ）及び接合（Ｊ）遺伝子セグメントによってコードされ得、一方、ＴＣＲβまたはＴＣＲγ鎖の可変ドメインは、追加的に多様性（Ｄ）遺伝子セグメントによってコードされる。各遺伝子セグメントは、組換えシグナル配列で挟まれてもよい。組換えシグナルは、スペーサーエレメントによって分離された七量体及び九量体を含み得る。スペーサーエレメントの長さは１２または２３ｂｐであり得る。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え中に、各遺伝子セグメントの１つのランダムなアレルが他の遺伝子と組み換えられて機能的な可変ドメインが形成される。可変ドメインを定常（Ｃ）遺伝子セグメントで組み換えることにより、機能的ＴＣＲ鎖の転写物が得られる。加えて、遺伝子セグメント間の接合部位にランダムなヌクレオチドが付加及び／または欠失されてもよい。このプロセスは、強力な組合せ（どの遺伝子領域が組み換わるかに依存）及び接合多様性（どのヌクレオチドがどれだけ付加／欠失されるかに依存）をもたらし得、その結果、大規模かつ高度に可変のＴＣＲレパートリーが得られ、非常に多数の抗原を確実に同定することができる。α鎖及びβ鎖またはγ鎖及びδ鎖を対合（「アセンブリ」とも称される）して機能的ＴＣＲを形成することにより、さらなる多様性を達成することができる。組換え、ランダムな挿入、欠失、置換により、Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子の小さなセットは、１０１５～１０２０のＴＣＲクロノタイプを作出する潜在可能性を有する。本明細書で使用する場合、「クロノタイプ」とは、同一の免疫受容体を保有する免疫細胞の集団を指す。例えば、クロノタイプとは、同一のＴＣＲを保有するＴ細胞の集団、または同一のＢＣＲ（または抗体）を保有するＢ細胞の集団を指す。免疫受容体の多様性の文脈における「多様性」とは、集団における免疫受容体（例えば、ＴＣＲ、ＢＣＲ、及び抗体）のクロノタイプの数を指す。本明細書で使用する場合、「同族対の組合せ」とは、Ｔ細胞からのＴＣＲの２つの鎖（例えば、ＴＣＲα及びＴＣＲβ、またはＴＣＲγ及びＴＣＲδ）のネイティブな組合せを指す。２つの鎖の同じ同族対の組合せは、結果的に同じＴＣＲとなり得る。例えば、同じクロノタイプを有するＴ細胞は、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の同じ同族対の組合せを有する。クロノタイプの高い多様性は、同族対の組合せの高い多様性を示し得る。
各ＴＣＲ鎖は、その構造内に３つの超可変ループを含み得、これらは相補性決定領域（ＣＤＲ１～３）と称される。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２はＶ遺伝子によってコードされ得、ＴＣＲとＭＨＣ複合体との相互作用に必要とされ得る。しかし、ＣＤＲ３は、（１）Ｖ及びＪ遺伝子間の接合領域（ＴＣＲαもしくはＴＣＲγの場合）、または（２）Ｖ及びＤ遺伝子間の接合領域ならびにＤ及びＪ遺伝子間の接合領域（ＴＣＲβまたはＴＣＲδの場合）によって一部がコードされているため、非常に可変性の高いものとなり得る。ＣＤＲ３は、ペプチド抗原に直接接触するＴＣＲの領域であり得る。ＣＤＲ３は、Ｔ細胞のクロノタイプを決定するための目的領域として使用され得る。１つの個体のＴ細胞による全てのＴＣＲの和は、ＴＣＲレパートリーまたはＴＣＲプロファイルと称される。ＴＣＲレパートリーは、疾患の発症及び進行に伴って変化し得る。そのため、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び感染性疾患などの異なる疾患条件下での免疫レパートリーの状態を決定することは、疾患の診断及び予後予測に有用であり得る。
ＴＣＲは、完全長ＴＣＲだけでなく、その抗原結合部分または抗原結合フラグメント（ＭＨＣペプチド結合フラグメントとも呼ばれる）も包含するものと理解すべきである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはインタクトまたは完全長ＴＣＲである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲよりも短い、ただしＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合した特異的な抗原ペプチドに結合する、抗原結合部分である。いくつかの場合では、ＴＣＲの抗原結合部分またはフラグメントは、完全長またはインタクトなＴＣＲの構造ドメインの一部のみを含む場合があるが、それでもなお、完全なＴＣＲが結合するエピトープ（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合することができる。いくつかの場合では、ＴＣＲの抗原結合部分またはフラグメントは、例えば、概して、各鎖が３つの相補性決定領域を含む場合において、特定のＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン（例えばＴＣＲの可変α鎖及び可変β鎖）を含む。抗原結合ドメインであるまたは抗原結合ドメインと相同である結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。
ＴＣＲ分子は、アルファ鎖（ＴＲＡ遺伝子／配列によってコードされたα鎖またはＴＣＲα鎖）及びベータ鎖（ＴＲＢ遺伝子／配列によってコードされたβ鎖またはＴＣＲβ鎖）、またはガンマ鎖（ＴＲＧ遺伝子／配列によってコードされたγ鎖またはＴＣＲγ鎖）及びデルタ鎖（ＴＲＤ遺伝子／配列にコードされるδ鎖またはＴＣＲδ鎖）によって形成され得る。これらの免疫受容体鎖は、（例えば、再配置されたＶＤＪまたはＶＪ領域によってコードされた）可変ドメインを有し得る。可変領域の一部が超可変であってもよい。超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み得る。いくつかの場合では、１つのＴ細胞内で、１つの機能的α鎖配列及び１つの機能的β鎖配列のみが発現することがある。いくつかの場合では、１つのＴ細胞内で、１つの機能的γ鎖配列及び１つの機能的δ鎖配列のみが発現することがある。
チップベースのオリゴヌクレオチド合成：見込み及び課題
チップベースの高処理オリゴヌクレオチド合成技術が進歩し、任意の配列を有するオリゴヌクレオチドを一度に数十万から数百万個合成できるようになったものの、このような方法で合成されたオリゴヌクレオチドの長さは、約２００～３００塩基に限定され得る。これに対し、完全長のＴＣＲのコンストラクトはほぼ２キロ塩基長であり得る。一見すると、ＴＣＲ遺伝子の合成問題を解決するには、チップベースの合成では不十分なように思われ得る。しかし、ＴＣＲの構造を調べることで見込みが明らかになると考えられる。第一に、ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖の定常領域（例えば、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ）は一定であると考えられる。したがって、ＴＣＲ鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲ配列の残りの部分に付加することができる。第二に、ＢＣＲ／抗体配列とは異なり、ＴＣＲは体細胞超変異を起こさないと考えられ、このことは、ＣＤＲ３領域以外の配列が生殖系列起源であり得ることを意味する。そのため、各々がＴＣＲ Ｖ遺伝子またはその一部に由来する配列を含むポリヌクレオチドを予め合成しておくことができる。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部であり得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、コドン最適化された配列の場合もあれば、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む場合もある。例えば、Ｌ－ＰＡＲＴ１（リーダーペプチドの第１の部分）、Ｌ－ＰＡＲＴ２（リーダーペプチドの第２の部分）、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含むＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列（Ｌ－Ｖ領域と称される）を予め合成することができる。別の例としては、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３のコード配列を含むＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列（Ｖ領域と称される）を予め合成することができる。Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、またはＦＲ３の核酸配列セグメントは、ＩＭＧＴユニークナンバリングシステム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従って定義することができる。いくつかの場合では、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１をコードする配列から始まり、第２の保存されたシステインをコードするコドンで終わる配列を含み得る（例えば、ＩＭＧＴによって定義された第２のＣＹＳは、Ｖドメインの位置１０４の保存されたシステインのコドンに対応する）。ヒトゲノムには約８０以上のＴＣＲ Ｖ遺伝子（例えば、ＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子）が存在するため、このような「Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドライブラリー」（図８の８０１及び括弧Ｘで示される）の合成は実現可能である。いくつかの場合では、種（例えば、ヒトまたはマウス）のＴＣＲ Ｖ遺伝子のサブセットを合成して、「Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドライブラリー」を生成する。全ての同定されたＴＣＲ Ｖ遺伝子またはそのサブセットが合成され得る。例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０ ６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、またはそれ以上の種のＴＣＲ Ｖ遺伝子を合成してライブラリーを生成することができる。いくつかの場合では、１つの種の全ての同定されたＴＣＲ Ｖ遺伝子を合成してライブラリーを生成する。ＴＣＲ Ｖ遺伝子はＴＲＡＶ、ＴＲＢＶ、ＴＲＧＶ、またはＴＲＤＶであり得る。本明細書に記載のように、いくつかの場合では、「Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチド」とは、ＴＣＲ Ｖ遺伝子のゲノムポリヌクレオチドまたはコドン最適化されたポリヌクレオチドの一部を指す。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドであり得る。ＦＲ３と定常領域との間の配列（例えば、ＣＤＲ３及びＪ領域の残部（本明細書では「ＣＤＲ３－Ｊ」と称される））は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ヌクレオチド長またはそれ以上であり得、いくつかの場合では最大約９０ヌクレオチド長であり得る。ＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖のＣＤＲ３－Ｊ配列は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０ヌクレオチド長またはそれ以上であり得る。ＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖のＣＤＲ３－Ｊ配列（いくつかの場合では、合計で最大約１８０ヌクレオチド長）は、（図８の８０２及び８０２を包含する括弧Ｙに示すように）チップベースの合成に適用可能なオリゴヌクレオチド（「対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴ」、「対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチド」、または「対合ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド」と称され、これらは互換的に使用され得る）内に含めることができる。いくつかの場合では、対合ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドは、ＴＣＲガンマ鎖のＣＤＲ３－Ｊ配列及びＴＣＲデルタ鎖のＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド」、「ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチド」、及び「ＣＤＲ３－Ｊオリゴ」という用語（互換的に使用可能）は、１つ以上のＣＤＲ３－Ｊ配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドは、対合ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド（例えば、対合ＴＣＲ鎖由来のＣＤＲ３－Ｊ配列を含む）であってもよい。ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド（例えば、非対合）は、対合ＴＣＲ鎖のうちの一方に由来するＣＤＲ３－Ｊ配列のみを含んでもよい。例えば、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、またはＴＣＲデルタ鎖に由来するＣＤＲ３－Ｊ配列のみを含んでもよい。残る課題は、このような対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドを、高処理（例えば、１バッチで１，０００超のＴＣＲ構築）で発現可能なＴＣＲコンストラクトに変換することと考えられる。本明細書に記載の方法を用いて、対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドを、バルク反応でこれらの対応するＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドに結合することができる（例えば、図８の８０３）。いくつかの場合では、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドプール（例えば、対合または非対合）は、少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる配列を含み得る。Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、またはそれ以上のＴＣＲ Ｖ遺伝子を含み得る。本明細書に記載の方法を使用する場合、異なるネイティブ対合ＴＣＲをコードする少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の複数の異なる配列を生成することができる。ネイティブ対合ＴＣＲは、単一の区画内でバルク生成することができる。
ＴＣＲ Ｖ遺伝子配列を含む核酸分子の生殖系列または再配置された遺伝子コンストラクトの例が図４Ａ～４Ｃに示されている。例えば、図４Ａは、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｖイントロン、Ｖエクソン、ならびに組換えシグナル配列（Ｖ七量体、Ｖスペーサー、及びＶ九量体）を含むＴＣＲ Ｖ遺伝子の生殖系列ゲノムＤＮＡを示している。保存されている２つのシステインも図４Ａに示されている。Ｖ－（Ｄ）－Ｊ組換え後、再配置されたゲノムＤＮＡのコンストラクトの例が図４Ｂまたは図４Ｃに示されている。ＣＤＲ３は、（ｉ）Ｖ領域とＪ領域との間の接合部（もしくは接合領域）、または（ｉｉ）Ｖ領域とＤ領域との間の接合部及びＤ領域とＪ領域との間の接合部、によってコードされ得る。
ＴＣＲ Ｖの遺伝子は非常に多様であり得る。ヒトにおいては、４０を超えるＴＲＡの機能的Ｖ遺伝子が同定されており、例えば、ＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８－１、ＴＲＡＶ８－２、ＴＲＡＶ８－３、ＴＲＡＶ８－４、ＴＲＡＶ８－６、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２－１、ＴＲＡＶ１２－２、ＴＲＡＶ１２－３、ＴＲＡＶ１３－１、ＴＲＡＶ１３－２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６－１、ＴＲＡＶ２６－２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８－１、ＴＲＡＶ３８－２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、及びＴＲＡＶ４１がこれに含まれる。これらのＶ遺伝子のうち、いくつかは同じサブグループに分類することができ、それらは「ＴＲＡＶ」の直後に同じサブグループの番号、ただし「－」記号の後は異なる番号で示される。例えば、ＴＲＡＶ１－１及びＴＲＡＶ１－２は同じサブグループである。本明細書で使用する場合、「グループ」とは、同じ「遺伝子型」（例えば、Ｖ、Ｄ、Ｊ、またはＣ型）を共有し、同じ「鎖型」のポリペプチドの合成に潜在的に参加する遺伝子のセットを指す。さらには、グループには関連する偽遺伝子及びオルフォンも含まれる。「サブグループ」とは、所与の種において、同じグループに属し、ヌクレオチドレベルで（Ｖ、Ｄ、Ｊについては生殖系列構成で）少なくとも７５％の同一性を共有する遺伝子のセットを意味する。
ヒトにおいては、４０以上のＴＲＢの機能的Ｖ遺伝子が同定されており、例えば、ＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３－１、ＴＲＢＶ４－１、ＴＲＢＶ４－２、ＴＲＢＶ４－３、ＴＲＢＶ５－１、ＴＲＢＶ５－４、ＴＲＢＶ５－５、ＴＲＢＶ５－６、ＴＲＢＶ５－８、ＴＲＢＶ６－１、ＴＲＢＶ６－２、ＴＲＢＶ６－３、ＴＲＢＶ６－４、ＴＲＢＶ６－５、ＴＲＢＶ６－６、ＴＲＢＶ６－８、ＴＲＢＶ６－９、ＴＲＢＶ７－２、ＴＲＢＶ７－３、ＴＲＢＶ７－４、ＴＲＢＶ７－６、ＴＲＢＶ７－７、ＴＲＢＶ７－８、ＴＲＢＶ７－９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０－１、ＴＲＢＶ１０－２、ＴＲＢＶ１０－３、ＴＲＢＶ１１－１、ＴＲＢＶ１１－２、ＴＲＢＶ１１－３、ＴＲＢＶ１２－３、ＴＲＢＶ１２－４、ＴＲＢＶ１２－５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０－１、ＴＲＢＶ２４－１、ＴＲＢＶ２５－１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９－１、及びＴＲＢＶ３０がこれに含まれる。他の種（例えば、マウス）のＶ遺伝子はＩＭＧＴデータベースで検索することができる。
コネクター配列の多様化
Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドとＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドとの接続は、ライゲーション及びオーバーラッププライマー伸長などの分子生物学手法によって達成することができる（図６）。ただし、チップベースのオリゴヌクレオチド合成の力を十分に活用するために、（図８の８０３の矢印によって示されるように）数千以上のＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドと、それに対応するＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドとを接続してバルク反応させてもよい。これを行う上での大きな課題は、Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチド（図６の６０１）とＣＤＲ３－Ｊ（図６の６０２）との間のコネクター領域が、保存されたＦＲ３領域の可能性があることである。そのため、バルク反応では、どのＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドがどのＣＤＲ３－Ｊに接続されるかを制御することが困難であり得る（図５に示されている通り。実線の矢印は正しいＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドに接続していることを示し、破線の矢印は誤ったＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドに接続していることを示す）。例えば、ＴＣＲ配列は、特定のＣＤＲ３－Ｊベータ配列に接続したＴＲＢＶ４－１によって形成され得る。バルク反応では、ＴＲＢＶ４－１及びＴＲＢＶ４－２両方のＶ遺伝子の生殖系列ポリヌクレオチドが存在し得、これらのＴＲＢＶ遺伝子のＦＲ３領域は極めて類似している可能性がある。そのため、このＴＣＲのＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドは、ＴＲＢＶ４－２生殖系列ポリヌクレオチドに誤って接続する可能性がある。この問題を軽減するため、コドン多様化を使用して異なるＦＲ３配列間の相違を作出することができる。例えば、コネクター配列は、同一のアミノ酸配列をコードすることがあっても異なる核酸配列を有することができるように、コドン多様化することができる。コドン多様化は、実施例２に示される方法などの計算的方法によって達成することができる。複数の核酸配列は、コドンをランダムにまたは任意の規則に従ってアミノ酸に割り当てることによって生成することができ、このとき各核酸配列は同じアミノ酸配列をコードすることができる。次に、複数の核酸配列を計算的に評価して、任意の規則に従ってスコアを割り当てることができる。任意の規則においては、制限部位、不要な配列とハイブリダイズする傾向、所定の配列とハイブリダイズする傾向、または配列内の不要な二次構造などの因子が考慮され得る。次に、スコアに基づき、複数の核酸配列の中から、コドン多様化されたコネクター配列としての核酸配列を選択することができる。コドン多様化されたコネクター配列を使用して、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチド及び指定されたＴＣＲ Ｖ遺伝子の予め合成された部分を正しく結合することができる。いくつかまたは全ての既知のＴＣＲ Ｖ遺伝子を含む「Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドライブラリー」では、例えば、それぞれの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子が異なるコネクター配列を有し得、これを使用して、対応するＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドに正しく接続し、参照配列に従ってＴＣＲ鎖を形成することができる。参照配列は、ＴＣＲ鎖の同族対をシークエンシングすることによって生成することができる。しかし、いくつかの場合では、コネクター配列をどこまで多様化できるか、また、Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドとＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドとの接続がどこまでバルク反応で正しくできるかが明らかでないことがある。実施例２で示されるように、ヒトＴＣＲ Ｖ遺伝子のＦＲ３領域を多様化して、任意の所与のＣＤＲ３－Ｊ配列に対する「誤接続確率」が事実上検出不可能にすることは可能と考えられる。実施例２に示したアルゴリズムを使用して、「コドン多様化されたＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチド」及びその対応するＣＤＲ３－Ｊ配列を生成することができる。
多様なコネクター配列のセットを見出したら、分子生物学技法を用いた多くの方法（例えば、ライゲーション、制限消化、環状化）を使用して、ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドプールを完全長の発現可能なＴＣＲプールに変換することができる。実施例１はワークフローの一例を示している。本明細書で提供する方法を使用して、バルク反応で個々のＴＣＲ鎖（例えば、対合していない鎖）のプールを生成することもできる。例えば、ＴＣＲアルファ鎖のプールを生成するには、各個々のＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドは、ＴＣＲアルファ鎖からのＣＤＲ３及びＪ領域を含み得るが、ＴＣＲベータ鎖からの別のＣＤＲ３及びＪ領域は含まなくてもよく、その場合、ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドを使用して、対応するＴＲＡＶ遺伝子と結合してＴＣＲアルファ鎖を形成することができる。
ＴＣＲをコードする核酸分子を構築するための方法
本明細書に記載のＴＣＲをコードする核酸分子は、２つ以上の核酸フラグメントから構築することができる。いくつかの実施形態において、２つ以上の核酸フラグメントは、第１の核酸分子、第２の核酸分子、第３の核酸分子、第４の核酸分子などと称され得る。核酸分子を構築する際には標準的な分子生物学技法が使用され得、このような技法には、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション、伸長、ライゲーション、及び酵素消化／切断が含まれる。
本明細書に記載の核酸フラグメントはＴＣＲ鎖またはその一部をコードし得る。例えば、核酸フラグメントによってコードされるＴＣＲ鎖の一部は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０アミノ酸、またはそれ以上を含み得る。核酸フラグメントは、機能的ＴＣＲ鎖をコードする配列を含み得る。機能的ＴＣＲ鎖は、完全長のＴＣＲ鎖である場合もそうでない場合もある。機能的ＴＣＲ鎖は、１つ以上の変異または修飾を含み得る。いくつかの場合では、機能的ＴＣＲ鎖は、宿主細胞内で発現した場合、ＴＣＲ複合体（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、及びζ鎖を有する複合体）に組み込むことができる。いくつかの場合では、機能的ＴＣＲがその標的リガンドに結合し得る。いくつかの場合では、機能的ＴＣＲは、宿主細胞内で発現した場合、細胞膜内に取り込まれ得る。いくつかの場合では、機能的ＴＣＲは宿主細胞内で発現し得る。
ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、ＣＤＲ３をコードする配列を含み得る。
ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、第１のＴＣＲ鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み得、このとき、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３はＴＣＲ鎖の同族対に由来する。いくつかの実施形態において、第１のＣＤＲ３をコードする配列及び第２のＣＤＲ３をコードする配列は、最大約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ヌクレオチド離れている。
ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、ＴＣＲ Ｖ遺伝子配列またはその一部を含み得る。ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、ＴＣＲ Ｖ遺伝子配列に由来する配列を含み得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｖ領域核酸配列を含み得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３の核酸配列をコードする配列を含み得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、リーダーペプチドをコードする配列を含み得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３の核酸配列をコードする配列を含み得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部を含み得るか、またはＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部であり得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部の長さは、少なくとも１０ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部の長さは、約１０、２０、３０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子またはその一部とは異なる配列を有しても同じアミノ酸配列をコードすることができるように、コドン最適化（またはコドン多様化）することができる。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＣＤＲ３の一部をコードする配列を含まなくてもよい。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、再配置された遺伝子の接合領域の配列を含まなくてもよい。
ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、定常ドメインまたはその一部をコードする配列を含み得る。ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、定常領域またはその一部をコードする配列を含み得る。いくつかの場合では、定常ドメインまたは定常領域は、ＴＣＲアルファ定常ドメインもしくは定常領域、ＴＣＲベータ定常ドメインもしくは定常領域、ＴＣＲガンマ定常ドメインもしくは定常領域、またはＴＣＲデルタ定常ドメインもしくは定常領域である。いくつかの場合では、定常領域は定常ドメインを含む。いくつかの場合では、定常領域はさらに、膜貫通領域、接続領域、細胞質領域、またはこれらの組合せを含む。
ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、コネクター配列を含み得る。コネクター配列は、ある核酸分子を別の核酸分子に結合するために使用され得る。ある核酸分子のコネクター配列は、別の核酸分子のアンチコネクター配列とハイブリダイズ（例えば、塩基対（単数または複数）を形成）することができる。アンチコネクター配列は、コネクター配列と相補的（例えば、完全または実質的に相補的）であり得る。アンチコネクター配列は、ある特定の条件下（例えば、温度、緩衝液条件、ｐＨなど）でコネクター配列とハイブリダイズすることができる。アンチコネクター配列は、コネクター配列の逆相補的配列（または相補的配列）であり得る。コネクター配列がアンチコネクター配列とハイブリダイズする場合、形成される塩基対（複数可）は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００塩基対、またはそれ以上であり得る。コネクター配列とアンチコネクター配列との間に形成される塩基対は、連続していても非連続であってもよい。例えば、非連続的な塩基対が形成されている場合、非対合領域または対合領域を分離する領域が存在してもよい。第１の核酸分子がコネクター配列を含む場合、第２の核酸分子上のコネクター配列の相補的配列は、アンチコネクター配列と称され得る。コネクター配列（またはアンチコネクター配列）は様々な長さであり得る。例えば、コネクター配列（またはアンチコネクター配列）の長さは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。コネクター配列（またはアンチコネクター配列）の長さは、約３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２ヌクレオチド以下であり得る。コネクター配列（またはアンチコネクター配列）は、核酸分子の５’末端または３’末端にあり得る。また、コネクター配列（またはアンチコネクター配列）は、核酸分子の内部配列であってもよい。例えば、コネクター配列は内部コネクター配列であってもよく、核酸分子の内部配列（例えば、内部コネクター配列に隣接する配列）を切断することにより、５’末端または３’末端で露出させることができる。内部コネクター配列の一例として、実施例１で鎖間コネクター（ＩＣＣ）が示される。いくつかの場合では、コネクター配列及びアンチコネクター配列を使用して、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３またはその一部をコードする核酸分子と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子またはその一部を含む別の核酸分子とを結合する。いくつかの場合では、コネクター配列及びアンチコネクター配列を使用して、ＴＣＲのＪ領域を含む核酸分子と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子またはその一部を含む別の核酸分子とを結合する。いくつかの場合では、コネクター配列及びアンチコネクター配列を使用して、ＴＣＲのＣＤＲ３またはその一部及びＪ領域をコードする配列を含む核酸分子と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子またはその一部を含む別の核酸分子とを結合する。いくつかの場合では、コネクター配列及びアンチコネクター配列を使用して、ＣＤＲ３またはその一部、Ｊ領域、及びＴＣＲ Ｖ遺伝子またはその一部をコードする配列を含む核酸分子と、ＴＣＲの定常ドメインまたはその一部をコードする別の核酸分子とを結合する。
コネクター配列（またはアンチコネクター配列）は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部（例えば、再配置された遺伝子内のＣＤＲ３をコードする配列に隣接するＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部）をコードする配列であり得る。また、このような場合、コネクター配列及びコネクター配列のプール内の１つ以上の他のコネクター配列が、同じアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ３に隣接するＴＣＲ Ｖ遺伝子の保存された部分）をコードする可能性がある。コネクター配列がＴＣＲ Ｖ遺伝子の保存された部分をコードする場合、コネクター配列をコドン多様化して、核酸分子を別の核酸分子に特異的に結合するためにコネクター配列を使用し、結果的にＴＣＲの同族対をコードする構築された核酸分子が得られるようにすることができる。いくつかの実施形態において、コネクター配列（またはアンチコネクター配列）は、再配置された遺伝子内のＣＤＲ３をコードする配列に隣接した少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００ヌクレオチド、またはそれ以上のＴＣＲ Ｖ遺伝子を含む。コネクター配列及びアンチコネクター配列の特異性により、異なるＴＣＲをコードする異なる配列を有する核酸分子のプールをバルク反応で（例えば、同じ区画内で）構築することができる。コネクター配列は、参照配列（例えば、シークエンシングによって決定されたＴＣＲ鎖のネイティブ配列）に従って、ＣＤＲ３をコードする配列がどのＴＣＲ Ｖ遺伝子に結合するべきかを規定することができる。コネクター配列（またはアンチコネクター配列）は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子の一部をコードしない場合がある任意の（例えば、所定の）配列であり得る。そしてこのような場合、この任意の配列は、２つの核酸フラグメントを結合した後に除去することができる。
図７は、任意のコネクター（７０１）及びアンチコネクター（７０２）配列を使用して、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドを指定されたＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチド（細い矢印）に結合する実施例を示している。ここでは、各Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドは、部分的に二重鎖構造を有する。この図内で３’末端が右にある上の鎖は、その３’末端に単鎖領域を有する。コネクター配列及びアンチコネクター配列は、単鎖であってもよく、互いにハイブリダイズしてもよい。コネクター及びアンチコネクター配列は、特異的ハイブリダイゼーションの目的を果たすに過ぎないものであり、ＴＣＲに全く関連しなくてもよい。そのためこの配列は任意である。コネクターとアンチコネクターとの間のハイブリダイゼーションの後、Ｖ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドの上の鎖の３’末端は、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドとハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長することができる。ＣＤＲ３－ＪポリヌクレオチドにハイブリダイズするＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドの上の鎖の３’末端のヌクレオチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５、または最大２０であり得る。
ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、自己切断ペプチドを含み得る。自己切断ペプチドは、２Ａペプチド、インテインペプチド、またはヘッジホッグペプチドであり得る。２Ａペプチドの例としては、限定されるものではないが、Ｐ２Ａ（例えば、配列ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａ（例えば、配列ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）、Ｆ２Ａ（例えば、配列ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）、及びＴ２Ａ（例えば、配列ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）ペプチドが挙げられる。
ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、制限酵素認識部位を含み得る。例えば、制限酵素の認識部位は、ＩＩＳ型制限酵素の認識部位であり得る。本開示において有用なＩＩＳ型制限酵素の例としては、限定されるものではないが、ＥａｒＩ、ＭｎｌＩ、ＰｌｅＩ、ＡｌｗＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＭＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＨｇａＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｂｖＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＦｏｋＩ、ＢｓｅＲＩ、ＨｐｈＩ、ＭｌｙＩ、及びＭｂｏＩＩが挙げられる。いくつかの場合では、２つ以上の異なる制限酵素が核酸構築プロセス中に使用され得る。いくつかの場合では、４ｂｐの５’オーバーハングを作出する制限酵素（例えば、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦｏｋＩなど）が使用され得る。いくつかの場合では、平滑末端または３’オーバーハングを作出する制限酵素（例えば、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩなど）が使用され得る。
ＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、環状化することができる。例えば、核酸フラグメントの２つの末端をライゲーションによって連結することにより、核酸フラグメントを環状化することができる。ライゲーションは平滑末端ライゲーションであってもよい。ライゲーションは、５’→３’エキソヌクレアーゼ（例えば、ギブソンアセンブリ）、３’→５’エキソヌクレアーゼ（例えば、配列及びリガーゼに依存しないクローニング（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｇａｓｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ）、すなわちＳＬＩＣ）、またはＵＳＥＲ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（例えば、ＵＳＥＲフレンドリーＤＮＡ組換え（ｆｒｉｅｎｄｌｙ ＤＮＡ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、すなわちＵＳＥＲｅｃ）を用いて粘着末端を作出した後に実施することができる。環状化の追加的な例としては、限定されるものではないが、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）及びシームレスライゲーションクローニング抽出（ＳＬｉＣＥ）アセンブリが挙げられる。代替的に、この２つの末端を重複ＰＣＲによって連結してもよい。ライゲーションには様々なリガーゼを使用することができ、例えば、限定されるものではないが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼが挙げられる。
ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする核酸分子を構築するために使用される核酸フラグメントは、化学的に合成することができる。例えば、核酸フラグメントは、チップベースの合成により、予め合成しておくことができる。いくつかの場合では、合成された核酸フラグメントの長さは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。いくつかの場合では、合成された核酸フラグメントの長さは、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。
ＴＣＲの２つのペプチド鎖をコードする２つの核酸配列は、いくつかの方向（例えば、ヘッドトゥヘッド、ヘッドトゥテール、及びテールトゥテール）で構築することができる。本明細書で使用する場合、「ヘッド」とはセンス核酸鎖の「５’末端」を指し、「テール」とはセンス核酸鎖の「３’末端」を指す。方向がヘッドトゥテールであるいくつかの場合では、ＴＣＲをコードする対合核酸配列の順序（例えば、ＴＲＡの後にＴＲＢ、またはＴＲＢの後にＴＲＡ）が制御され得る。
本明細書に記載の任意の核酸分子は、二重鎖核酸分子または単鎖核酸分子であり得る。いくつかの場合では、核酸分子は二重鎖領域及び単鎖領域を含み得る。例えば、コネクター配列またはアンチコネクター配列を有する核酸分子は、コネクター配列またはアンチコネクター配列領域を単鎖領域（例えば、オーバーハングまたは粘着末端）として有する二重鎖核酸分子であり得る。オーバーハングは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド長、またはそれ以上であり得る。オーバーハングは、核酸分子の５’末端にあっても３’末端にあってもよい。
本明細書に記載の任意の核酸分子は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドの例としては、限定されるものではないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモロウラシル、５－クロロロウラシル、５－ヨードロウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルリノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリンなどが挙げられる。いくつかの場合では、ヌクレオチドは、そのリン酸部分の修飾（三リン酸部分の修飾を含む）を含み得る。このような修飾の非限定的な例としては、比較的長いリン酸鎖（例えば、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）及びチオール部分を有する修飾（例えば、アルファ－チオトリホスフェート及びベータ－チオトリホスフェート）が挙げられる。また、核酸分子は、塩基部分（例えば、典型的には相補的ヌクレオチドとの水素結合の形成に利用可能な１つ以上の原子、及び／または典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成できない１つ以上の原子）、糖部分、あるいはリン酸骨格で修飾されていてもよい。また、核酸分子は、アミン反応性部位（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ））の共有結合を可能にするために、アミノアリル－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアクリルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含んでもよい。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対またはＲＮＡ塩基対の代替物は、１立方ｍｍ当たりのビット密度を高め、安全性（天然毒素の偶発的もしくは意図的な合成に対する抵抗性）を高め、光プログラム化（ｐｈｏｔｏ－ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）ポリメラーゼでの識別を容易にし、または二次構造を低度にすることができる。このような代替的な塩基対は、新規及び／または増幅合成のための天然及び変異ポリメラーゼと互換性を有し得る。
ＴＣＲをコードする核酸分子を構築するワークフローの一例が図１Ａ～１Ｃに示されている。ＴＣＲをコードする核酸分子を構築するための本明細書に記載の方法を使用する前に、様々な既存の方法（例えば、シングルセルバーコード化及びシークエンシング）を使用して複数のＴＣＲの同族対を予め決定することができる。様々なシークエンシング法、例えば、サンガーシークエンシング、ハイスループットシークエンシング、合成によるシークエンシング、単一分子シークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、次世代シークエンシング、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｃｌｏｎａｌ Ｓｉｎｇｌｅ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシークエンシング、マクサム・ギルバートシークエンシング、または超並列シークエンシングを使用して、対合ＴＣＲ鎖の配列を決定することができる。シークエンシングライブラリーからの対合配列は、ＴＣＲ鎖の同族対の参照配列として機能することができ、それにより、コネクター配列とアンチコネクター配列との間の特定の相互作用によってどのＣＤＲ３がどのＶ遺伝子と対合しているかを知ることができる。異なるＴＣＲをコードする複数の核酸分子は、本明細書に記載の方法を用いてバルクで構築することができるが、図１Ａ～１Ｃでは一例として、ある分子の構築について示されている。第１のＣＤＲ３（例えば、ＣＤＲ３α）及び第２のＣＤＲ３（例えば、ＣＤＲ３β）をコードする配列を含む第１の核酸分子は、第１のＴＣＲ Ｖ遺伝子（例えば、ＴＲＡＶ）に由来する配列を含む第２の核酸分子に接触させることができる。第１の核酸分子のコネクター配列（例えば、ＣｏｎＡ＃*）は、第２の核酸分子のアンチコネクター配列（ＣｏｎＡ＃）とハイブリダイズして、２つの核酸分子を結合することができる。伸長及びライゲーションを実施して、第１のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列と、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列とを含む、第３の核酸分子を生成することができる。次に、制限酵素（例えば、図１ＡのＴＩＩＳＲＥ１）を使用して、第３の核酸分子のオーバーハング（または粘着末端）を生成することができる。次に、第３の核酸分子を、第１の定常領域または定常ドメイン（例えば、ＴＲＢＣ）をコードする配列を含む第４の核酸分子に接触させることができる。次いで、第３の核酸分子を第４の核酸分子とオーバーハングを介してライゲーションして、第１のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列と、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列と、第１の定常領域をコードする配列とを含む、第５の核酸分子を生成することができる。第５の核酸分子を環状化し、制限酵素（例えば、ＴＩＩＳＲＥ３）で切断して内部コネクター配列（例えば、ＩＣＣ）を露出させることができる。次に、第５の核酸分子を、第２のＴＣＲ Ｖ遺伝子（例えば、ＴＲＢＶ）に由来する配列を含む第６の核酸分子に接触させることができる。第５の核酸分子は、コネクター配列とアンチコネクター配列との間の相互作用を介して第６の核酸分子とライゲーションすることができる。次に、第６の核酸分子を制限酵素（例えば、ＴＩＩＳＲＥ２）で切断してオーバーハングを生成することができる。次に、第６の核酸分子を、第２の定常領域または定常ドメイン（例えば、ＴＲＡＣ）をコードする配列を含む第７の核酸分子に接触させることができる。第６の核酸分子と第７の核酸分子とをライゲーションして、対合ＴＣＲ鎖をコードする全ての領域を含む第８の核酸分子を形成することができる。第８の核酸分子はさらに、宿主細胞内でＴＣＲ鎖を発現させるための発現ベクターに構築することができる。ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む核酸フラグメントは単鎖であってもよく、このような場合、ＣＤＲ３をコードする核酸フラグメントのコネクター配列の３’末端が、抗コネクター配列とのハイブリダイゼーション時に伸長され得ることを理解されたい。
本明細書に記載の方法を使用して、個々のＴＣＲ鎖のプール、例えば、ＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖のプールを生成することができる。
本明細書に記載の複数の核酸分子を生成するための方法は、第１の複数の核酸分子（または核酸フラグメント）を準備することを含み得る。第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み得る。第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３はＴＣＲ鎖の同族対に由来し得る。次に、第２の複数の核酸分子を準備することができる。第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み得る。核酸分子は、定常ドメインをコードする配列を含まなくてもよい。次に、第１の複数の核酸分子と第２の複数の核酸分子とを接触させることができる。第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と結合して、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む、核酸分子を形成することができる。第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列ならびにＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ＴＣＲ鎖の同族対に由来し得る。
各核酸分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその領域をコードする、複数の核酸分子を生成するための方法は、第１の複数の核酸分子と第２の複数の核酸分子とを接触させて、少なくとも２つの異なる核酸分子を含む第３の複数の核酸分子を生成することを含み得る。少なくとも２つの異なる核酸分子の各々は、異なるＴＣＲ鎖またはその領域をコードする異なる配列を有し得る。少なくとも２つの異なる核酸分子は、同じ区画内で生成することができる。いくつかの場合では、異なるＴＣＲをコードする少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる配列を同じ区画内で生成することができる。
本明細書に記載の複数の核酸分子を生成するための方法は、第１の複数の核酸分子を準備することを含み得る。第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み得る。第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３はＴＣＲ鎖の同族対に由来し得る。次に、第２の複数の核酸分子を準備することができる。第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み得る。次に、第１の複数の核酸分子と第２の複数の核酸分子とを接触させることができる。第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と結合して、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む、直鎖状核酸分子を形成することができる。第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列ならびにＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ＴＣＲ鎖の同族対に由来し得る。
複数の核酸分子を生成するための方法は、第１の複数の核酸分子を提供することを含み得る。第１の複数の核酸分子は、（ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする合成配列と、（ｉｉ）第３のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第３のＣＤＲ３及び第４のＴＣＲ鎖の第４のＣＤＲ３をコードする合成配列とを含み得る。第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３はＴＣＲ鎖の第１の同族対に由来し得、第３のＣＤＲ３及び第４のＣＤＲ３はＴＣＲ鎖の第２の同族対に由来し得る。次に、第２の複数の核酸分子を準備することができる。第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み得る。次に、第１の複数の核酸分子と第２の複数の核酸分子とを接触させることができる。第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と結合して、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む、核酸分子を形成することができる。第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列ならびにＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ＴＣＲ鎖の同族対に由来し得る。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその一部をコードする核酸分子を生成するための方法は、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子を準備することを含み得る。次に、複数の核酸分子を準備することができる。複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み得る。複数の核酸分子は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する少なくとも２つの異なる配列を含み得る。いくつかの場合では、複数の核酸分子は、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上の異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上の異なる配列を含み得る。次に、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子を、各々がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む複数の核酸分子に、同じ区画内で接触させることができる。ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子は、複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に結合して、ＣＤＲ３をコードする配列と少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子のうちの１つに由来する配列とを含む、第３の核酸分子を生成することが可能であり、それにより、ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする核酸分子を生成することができる。
本明細書に記載の方法に使用することができる本明細書に記載の組成物は、第１の複数の核酸分子を含み得る。第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含み得る。第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３はＴＣＲ鎖の同族対に由来し得る。組成物はさらに、第２の複数の核酸分子を含み得る。第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み得る。第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列を含まなくてもよい。この組成物においては、（ｉ）第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、異なる第１のＣＤＲ３及び／または第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み得、及び／または（ｉｉ）第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。
本明細書に記載の方法に使用することができる本明細書に記載の組成物は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子の各核酸分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ遺伝子に由来する配列を含み得る。複数の核酸分子は、第１のコネクター配列を有する第１の核酸分子と、第２のコネクター配列を有する第２の核酸分子とを含み得る。第１のコネクター配列は、第２のコネクター配列と異なっていてもよい。
本明細書に記載の方法に使用することができる本明細書に記載の組成物は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子の各核酸分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖のＣＤＲ３をコードし得る。第１の複数核酸分子は第１のコネクター配列を含み得、第２の複数の核酸分子は第２のコネクター配列を含み得る。第１のコネクター配列は、第２のコネクター配列と異なっていてもよい。
本明細書に記載の方法に使用することができる本明細書に記載の組成物は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子の各核酸分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の少なくとも１０のアミノ酸をコードする配列を含み得る。第１の複数核酸分子は第１のコネクター配列を含み得、第２の複数の核酸分子は第２のコネクター配列を含み得る。第１のコネクター配列は、第２のコネクター配列と異なっていてもよい。第１のコネクター配列または第２のコネクター配列は、ＴＣＲ鎖の一部をコードし得る。第１のコネクター配列または第２のコネクター配列は、ＴＣＲ鎖の少なくとも１０アミノ酸をコードする配列にインフレームであり得る。
本明細書に記載の方法に使用することができる本明細書に記載の組成物は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子の各核酸分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、ＣＤＲ３配列を含まない場合がある。複数のうちの第１の核酸分子は第１のアンチコネクター配列を含み得、複数のうちの第２の核酸分子は第２のアンチコネクター配列を含み得る。第１のアンチコネクター配列は、第２のアンチコネクター配列とは異なっていてもよい。第１の核酸分子及び第２の核酸分子のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来するものであってもよい。当該組成物はさらに、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含み得る。少なくとも１つの核酸分子はさらに、第１のアンチコネクター配列に相補的な第１のコネクター配列を含み得る。
本開示は、複数のＴＣＲを含むＴＣＲライブラリーのアセンブリまたは合成のための組成物及び方法を提供する。いくつかの場合では、ＴＣＲライブラリーから特定のＴＣＲ配列（例えば、目的ＴＣＲ）を単離または精製してさらなる特性評価または操作を行うことが有用であり得る。これを行うために、ＴＣＲまたはその一部をコードする配列を構築するために使用される核酸分子またはフラグメントにバーコードを含めることができる。いくつかの場合では、ＣＤＲ３をコードする配列を含む核酸フラグメントはバーコードを含む。いくつかの場合では、第１のＴＣＲ鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含む核酸フラグメントは、バーコードを含む。例えば、ＣＤＲ３－Ｊオリゴまたは対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴはバーコードを含み得る。コネクター配列（または、いくつかの場合ではアンチコネクター配列）はバーコードを含み得る。ＣＤＲ３－Ｊオリゴの鎖間コネクター（すなわちＩＣＣ）はバーコードを含み得る。バーコードは、プライマー結合部位（例えば、ＴＣＲ特異的プライマー結合部位またはＤＯＰＢＳ）であり得る。
例えば、対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴプール内の一意の対合ＣＤＲ３－Ｊをコードする各配列（例えば、図１Ａ）は、一意のバーコード（または一意のＤＯＰＢＳ）を含み得る。ＤＯＰＢＳの配列は任意に設計することができる。ＤＯＰＢＳの配列は、一般的なピットフォール、例えば、不要な二次構造、制限部位、ＴＣＲ遺伝子内の他の配列との類似性、またはプライマー結合部位間の類似性を回避するように設計することができる。バーコード（またはＤＯＰＢＳ）は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長、またはそれ以上であり得る。ＤＯＰＢＳは、対合ＣＤＲ３－Ｊプールの各配列に含まれる追加の配列であり得る。ＤＯＰＢＳは、対合ＣＤＲ３－Ｊプールの各配列に既に含まれている配列であり得る。例えば、コネクター配列またはその一部をＤＯＰＢＳとして使用することができる。表３に収載された配列は、ＤＯＰＢＳとして使用することができる。図１Ｃのステップ（９）の産物は、Ｔ２Ａ－３に対応するフォワードプライマーと、目的ＴＣＲに関連するＤＯＰＢＳに対応するリバースプライマーとを用いたダイアルアウトＰＣＲの鋳型として使用することができる。ＰＣＲ産物は、図１Ｃのステップ（１０）及び（１１）に供することができる。最終産物は、主に目的ＴＣＲを含み得る。
ＴＣＲの発現
本明細書で提供される方法を用いて、各々がＴＣＲまたはその一部をコードする核酸分子のプールをさらに、発現のために宿主細胞内に送達することができる。構築された核酸分子は、宿主細胞内で発現させるためにベクター内に挿入することができる。構築された核酸分子は、直鎖状または環状の核酸鎖としてレシピエント細胞内に送達することができる。いくつかの場合では、構築された核酸または構築された核酸を含むベクターは、エレクトロポレーションによってレシピエント細胞内に送達することができる。いくつかの場合では、構築された核酸または構築された核酸を含むベクターは、カチオン性ポリマーなどの担体によって送達することができる。
ベクターは、プラスミド、トランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙ Ｂａｃ）、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。ベクターの非限定的な例としては、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、ビリオン、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、あるいは遺伝子治療で一般的に使用される粒子及び／またはベクターが挙げられる。好適なプラスミドベクターの非限定的な例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びこれらのバリアントが挙げられる。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。ベクターは、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。また、ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子及び他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターは、ＴＣＲの発現を可能にする配列に作用可能に結合した、本開示に従うＴＣＲまたはその一部をコードする構築された核酸配列を含む、発現ベクターであり得る。ベクターの追加的な例としては、限定されるものではないが、ウイルス及び非ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター（その複製可能形態、複製欠損形態、及びガットレス形態を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシ乳頭腫ベクター、エプスタインバーベクター、ヘルペスベクター、ワクシニアベクター、モロニーマウス白血病ベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、ならびに非ウイルス性プラスミドが挙げられる。バキュロウイルスベクターは、昆虫細胞での発現に適していると考えられる。非ウイルス性ベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞貫通ペプチド、またはリポスフィアに製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは自己増幅ＲＮＡレプリコン（自己複製（ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）（ｍ）ＲＮＡ、自己複製（ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ｍ）ＲＮＡ、自己増幅（ｍ）ＲＮＡ、またはＲＮＡレプリコンとも称される）である。自己増幅ＲＮＡレプリコンは、自分自身を複製することができるＲＮＡである。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、細胞の内部で自分自身を複製することができる。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡポリメラーゼ及び目的分子をコードする。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰまたはＲｄＲｐ）であり得る。自己増幅ＲＮＡレプリコンは、プロテアーゼまたはＲＮＡキャッピング酵素もコードすることができる。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、アルファウイルスとして知られるＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミリーであるかそれに由来し、これには、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、シンドビスウイルス、南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６、セムリキフォレストウイルス、ミデルブルフウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バルマフォレストウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ホワロアウイルス、ババンキウイルス、キジラガチ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス、ハイランズＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ンドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、バギークリークウイルス、及び国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）によってアルファウイルスとして分類された他の任意のウイルスが含まれ得る。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、弱毒化形態のアルファウイルス（例えば、ＶＥＥ ＴＣ－８３ワクチン株）の一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、宿主細胞、標的細胞、または生物における特定の機能（例えば、二分性免疫受容体発現の持続または増加）のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｌｉｃａで操作または選択されている。例えば、自己増幅ＲＮＡレプリコンの異なるバリアントを有する宿主細胞の集団を、異なる時点での（自己増幅型ＲＮＡレプリコンまたは宿主ゲノムによってコードされた）１つ以上の目的分子の発現レベルに基づいて選択することができる。いくつかの実施形態において、選択または操作された自己増幅ＲＮＡレプリコンは、宿主細胞または生物からのＩ型インターフェロン応答、自然抗ウイルス応答、または適応免疫応答を低減するように修飾されており、その結果、ＲＮＡレプリコンのタンパク質発現は、宿主細胞、標的細胞、または生物でより長く持続するまたはより高いレベルで発現する。いくつかの実施形態において、この最適化された自己増幅ＲＮＡレプリコン配列は、所望の表現型形質（例えば、野生型株またはワクチン株と比較して、より高いもしくは持続的な目的分子の発現、またはより低いベクターに対する自然抗ウイルス免疫応答）を有する個々の細胞または細胞集団から得られる。いくつかの実施形態において、所望のまたは選択された自己増幅ＲＮＡレプリコン配列を有する細胞は、自己増幅ＲＮＡレプリコンを含む治療薬剤で治療された後に有益な応答特性を有する対象（例えば、ヒトまたは動物）（例えば、エリートレスポンダーまたは完全寛解中の対象）から得られる。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、１つ以上のサブゲノムポリヌクレオチド（複数可）を生成するために１つ以上のサブゲノム配列（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態において、サブゲノムポリヌクレオチドは、細胞の翻訳機構による翻訳のための機能的ｍＲＮＡ分子として作用する。サブゲノムポリヌクレオチドは、サブゲノム配列からサブゲノムポリヌクレオチドを産生するようポリメラーゼに指示する自己増幅ＲＮＡレプリコン上の定義された配列エレメント（例えば、サブゲノムプロモーターまたはＳＧＰ）の機能を介し産生することができる。いくつかの実施形態において、ＳＧＰは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰまたはＲｄＲｐ）によって認識される。いくつかの実施形態において、複数のＳＧＰ配列が単一の自己増幅ＲＮＡレプリコン上に存在し、そしてこの配列は、二分性免疫受容体、二分性免疫受容体の構成成分、または追加の作用物質をコードするサブゲノム配列の上流に位置し得る。いくつかの実施形態において、ＳＧＰ配列のヌクレオチド長または組成物を修飾して、サブゲノムポリヌクレオチドの発現特性を変更することができる。いくつかの実施形態において、同一でないＳＧＰ配列は、対応するサブゲノムポリヌクレオチドの比率がＳＧＰ配列が同一である場合と異なるように自己増幅ＲＮＡレプリコン上に位置する。いくつかの実施形態において、同一でないＳＧＰ配列は、ＴＣＲ及び追加の作用物質（例えば、サイトカイン）の産生を指示して、ＴＣＲ発現が増加し、標的細胞または宿主に対する細胞傷害効果なしで標的細胞が増加またはより迅速に増殖し、またはＲＮＡレプリコンに対する自然もしくは適応免疫応答を弱めるような互いに対する比率で産生されるようにする。いくつかの実施形態において、サブゲノム配列及びＳＧＰ配列の互いに対する位置及びゲノム配列自体に対する位置を使用して、サブゲノムポリヌクレオチドの互いに対する比率を変更することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードするＳＧＰ及びサブゲノム配列は、ＴＣＲの発現が追加の作用物質に対し実質的に増加するように、追加の作用物質をコードするＳＧＰ及びサブゲノム領域の下流に位置し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡレプリコンまたはＳＧＰは、サイトカインがＴ細胞の増殖を促進し、またはＴＣＲの治療効果を増強し、ただし重篤な副作用（例えば、サイトカイン放出症候群、サイトカインストーム、または神経学的毒性）を引き起こさないように、最適な量のサイトカインを発現するように選択または操作されている。
２つの鎖の発現は、２つのプロモーターまたは１つのプロモーターによって駆動され得る。いくつかの場合では、２つのプロモーターが使用される。いくつかの場合では、２つのプロモーターが、２つの鎖のそれぞれのタンパク質コード化配列と共に、ヘッドトゥヘッド、ヘッドトゥテール、またはテールトゥテールの方向に配置され得る。いくつかの場合では、１つのプロモーターが使用される。２つのタンパク質コード配列は、１つのプロモーターを使用して両方の鎖を発現させることができるように、インフレームで結合し得る。そして、このような場合、２つのタンパク質コード配列をヘッドトゥテール方向で配置し、リボソーム結合部位（例えば、内部リボソーム結合部位、すなわちＩＲＥＳ）、プロテアーゼ切断部位、または自己プロセシング切断部位（例えば、２Ａペプチドをコードする配列）で接続して、バイシストロニック発現を促進することができる。いくつかの場合では、２つの鎖が単鎖ポリペプチドとして発現できるように２つの鎖をペプチドリンカーで結合することができる。各発現鎖は、再配置されたＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子を含めた完全な可変ドメイン配列を含み得る。各発現鎖は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含めた完全な可変ドメイン配列を含み得る。各発現鎖は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ３を含めた完全な可変ドメイン配列を含み得る。いくつかの場合では、各発現鎖はさらに定常ドメイン配列を含み得る。
発現ベクターを作出するために、構築した核酸分子に追加的配列が加えられ得る。このような追加的配列としては、ベクター骨格（例えば、標的細胞内または大腸菌などの一時的な宿主内でのベクターの複製に必要なエレメント）、プロモーター、ＩＲＥＳ、自己切断ペプチドをコードする配列、ターミネーター、アクセサリー遺伝子（例えば、ペイロード）、さらには免疫受容体ポリヌクレオチドの部分配列（例えば、定常ドメインをコードする配列の一部）が挙げられる。
プロテアーゼの切断部位としては、限定されるものではないが、エンテロキナーゼ切断部位：（Ａｓｐ）４Ｌｙｓ；第Ｘａ因子の切断部位：Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ；トロンビン切断部位、例えば、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ；レニン切断部位、例えば、Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ；コラゲナーゼ切断部位、例えば、Ｘ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（Ｘは任意のアミノ酸である）；トリプシン切断部位、例えば、Ａｒｇ－Ｌｙｓ；ウイルスプロテアーゼ切断部位、例えばウイルス２Ａまたは３Ｃプロテアーゼ切断部位（限定されるものではないが、ピコルナウイルスからのプロテアーゼ２Ａ切断部位、Ａ型肝炎ウイルス３Ｃ切断部位、ヒトライノウイルス２Ａプロテアーゼ切断部位、ピコルナウイルス３プロテアーゼ切断部位を含む）；ならびにカスパーゼプロテアーゼ切断部位、例えば、活性化されたカスパーゼ－３によって認識及び切断されるＤＥＶＤ（切断は第２のアスパラギン酸残基の後に生じる）が挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示は、プロテアーゼ切断部位を含む発現ベクターであって、当該プロテアーゼ切断部位が細胞プロテアーゼ切断部位またはウイルスプロテアーゼ切断部位を含む、発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質切断部位は、フリン；ＩＰＮＶのＶＰ４；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ；ＰＣ５／６プロテアーゼ；ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ；エンテロキナーゼ；第Ｘａ因子プロテアーゼ；トロンビン；ゲネナーゼＩ；ＭＭＰプロテアーゼ；カブモザイクポティウイルスの核内包タンパク質（Ｎ１ａ）；デング熱４型フラビウイルスのＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、黄熱ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ；カリフラワーモザイクウイルスのＯＲＦ Ｖ；ＫＥＸ２プロテアーゼ；ＣＢ２；または２Ａによって認識される部位を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質切断部位は、ウイルス内部切断可能シグナルペプチド切断部位である。いくつかの実施形態において、ウイルス内部切断可能シグナルペプチド切断部位は、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、または風疹ウイルスに由来する部位を含む。
本開示のベクターに含めるのに適したＩＲＥＳエレメントは、真核生物リボソームに係合可能なＲＮＡ配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示のＩＲＥＳエレメントは、少なくとも約２５０塩基対、少なくとも約３５０塩基対、または少なくとも約５００塩基対である。本開示のＩＲＥＳエレメントは、限定されるものではないが、ウイルス、哺乳類、及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａを含めた生物のＤＮＡに由来し得る。いくつかの場合では、ＩＲＥＳエレメントが由来するウイルスＤＮＡとしては、限定されるものではないが、ピコルナウイルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ、及びポリオウイルスｃＤＮＡが挙げられる。ＩＲＥＳエレメントが由来する哺乳類ＤＮＡの例としては、限定されるものではないが、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）をコードするＤＮＡ及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をコードするＤＮＡが挙げられる。ＩＲＥＳエレメントが由来するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＤＮＡの例としては、限定されるものではないが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝子が挙げられる。ポリオウイルスＩＲＥＳエレメントの追加例としては、例えば、ポリオウイルスＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、またはＡ型肝炎ウイルスＩＲＥＳが挙げられる。フラビウイルスＩＲＥＳエレメントの例としては、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ＧＢウイルスＢ ＩＲＥＳ、またはペスチウイルスＩＲＥＳ（限定されるものではないが、ウシウイルス性下痢ウイルスＩＲＥＳもしくは古典的豚熱ウイルスＩＲＥＳを含む）が挙げられる。
自己プロセシング切断部位の例としては、限定されるものではないが、インテイン配列；修飾インテイン；ヘッジホッグ配列；他のホッグファミリー配列；２Ａ配列（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａ配列）；及び各々のバリエーションが挙げられる。
組換え免疫グロブリンまたは他のタンパク質の発現のためのベクターは、任意の数のプロモーターを含むことができ、このプロモーターは、構成的、調節可能または誘導可能、細胞型特異的、組織特異的、または種特異的である。さらなる例としては、テトラサイクリン応答性プロモーターが挙げられる。ベクターは、組換え構築された遺伝子を発現させる宿主細胞に適合したレプリコンとすることができ、また、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内でも機能するレプリコンを含み得る。プロモーターは構成的または誘導的であり得、このとき誘導は、例えば、特定の細胞型または特定の成熟度に関連する。代替的に、複数のウイルスプロモーターが好適な場合がある。プロモーターの例としては、β－アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、伸長因子１Ａ（ＥＦ－１Ａ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｆｒｉｅｎｄ脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーターが挙げられる。プロモーターは、エンハンサーに関連しても関連しなくてもよく、エンハンサーは、特定のプロモーターに天然に関連しても異なるプロモーターに関連してもよい。
適用
本明細書に記載の組成物及び方法は様々な適用を行うことができる。適用例としては、シークエンシングデータ（例えば、シングルセルシークエンシングデータ）からネイティブ対合ＴＣＲをコードする配列を再構築することが考えられる。いくつかの適用では、腫瘍浸潤Ｔ細胞から同定されたネイティブ対合ＴＣＲをコードする配列を再構築したい場合がある。このような適用では、対象からの新鮮な組織試料（例えば、新鮮な固形腫瘍試料）をシングルセルシークエンシングに使用して、ネイティブ対合ＴＣＲの両方のＴＣＲ鎖の配列情報を得ることができる。しかし、腫瘍浸潤細胞を含む組織試料（例えば、体液ではない固体試料）が凍結試料または固定試料（例えば、ＦＦＰＥ試料）である場合、細胞を分離して単一細胞懸濁液を得ることが困難な場合がある。このような場合には、同じ対象からの末梢Ｔ細胞を含む血液試料をシングルセルシークエンシングに使用して、ネイティブ対合ＴＣＲの配列を同定することができる。血液試料は、組織試料から血流に放出された腫瘍浸潤性Ｔ細胞を含み得るため、血液試料から得られた配列は、これらの腫瘍浸潤性Ｔ細胞からの配列を含み得る。次いで、同じ対象からの組織試料を使用してバルクシークエンシングを行うことができる。組織試料のバルクシークエンシングでは、ネイティブ対合ＴＣＲの対合配列は得られない場合があるが、個々のＴＣＲ鎖のＣＤＲ３配列が得られ得る。次いで、組織試料のバルクシークエンシングで得られたＣＤＲ３配列（本明細書では「組織ＣＤＲ３配列」と称される）を使用して、血液試料のシングルセルシークエンシングで得られた対合配列とアラインメントすることができる。対合配列のＣＤＲ３配列が組織ＣＤＲ３配列と一致すれば、対合配列を同定し、任意の下流適用に使用することができる。
シングルセルシークエンシングとは、個々の細胞から配列情報を得ることを指す。シングルセルシークエンシングでは、細胞の集団を単一細胞懸濁液にし、区画化して個々のパーティションにすることができる。各パーティション内で、単一の細胞から放出された配列をバーコード化し、後でシークエンシングすることができる。様々なシングルセルシークエンシング法がＴＣＲの再構築に使用され得る（Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ Ｍ，Ｒｏｓｓｅｔｔｉ Ｇ ａｎｄ Ｐａｇａｎｉ Ｍ（２０１８）Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１６３８を参照）。バルクシークエンシングとは、細胞の集団から配列情報を得ることを指す。バルクシークエンシングでは、核酸分子を細胞の混合物から単離し、共にシークエンシングに供することができる。
図９Ａは、血液試料を使用して腫瘍試料中の腫瘍浸潤性ＴＣＲを同定するワークフローの一例を示している。最初に、患者から血液を採取することができる。次に、血液試料から、末梢血単核細胞を含むＰＢＭＣ試料を単離することができる。例えば、これらの細胞は全血から、フィコール（血液の層を分離する親水性多糖類）及び勾配遠心分離を用いて抽出することができる。次に、ＰＢＭＣ試料からＴ細胞を単離することができる。Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離または対向流遠心溶出法によって単球を枯渇させることにより、ＰＢＭＣから単離される。任意選択で、マーカーベースの選別により、Ｔ細胞のサブ集団をさらに濃縮してもよい。マーカーは細胞表面マーカーであってもよい。細胞表面マーカーの例としては、限定されるものではないが、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、及びＦｏｘＰ３が挙げられる。マーカーはサイトカインであってもよい。サイトカインマーカーの例としては、限定されるものではないが、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、及びパーフォリンが挙げられる。次いで、Ｔ細胞またはＴ細胞のサブ集団をシングルセルシークエンシングに供して、ネイティブ対合ＴＣＲの対合配列（例えば、図９Ａのインフォマティクスにより対合したＴＣＲ配列）を得ることができる。腫瘍試料は、同じ患者から得ることもできる。腫瘍試料は、固定試料であっても凍結試料であってもよい。例えば、ホルムアルデヒドなどの固定剤で腫瘍試料を固定してもよい。腫瘍試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であり得る。次に、腫瘍試料をバルクシークエンシングに供してＴＣＲ鎖のＣＤＲ３配列を得ることができる。次に、腫瘍試料から得られたＣＤＲ３配列を使用し、対合配列のＣＤＲ３配列と比較して、腫瘍浸潤性ＴＣＲを同定することができる。腫瘍浸潤性ＴＣＲは、正常なＴ細胞または細胞株で発現させることができ、これは図９Ａに「バーチャルＴＩＬ」として示されている。
図９Ｂは、バーチャルＴＩＬの適用例を示している。バーチャルＴＩＬはレポーターシステムを含むことができ、これは標的反応性ＴＣＲに対するレポーターベースのＴ細胞選択に使用することができる。例えば、バーチャルＴＩＬは、レポーター遺伝子を含むレポーター細胞であってもよく、このレポーター遺伝子は、細胞のＴＣＲが標的抗原に結合したときにシグナルを送るように調節される。これらのバーチャルＴＩＬは、抗原を装填した抗原提示細胞（ＡＰＣ）または人工的ＡＰＣに接触させることにより、活性化させることができる。次に、標的反応性Ｔ細胞は、例えばＦＡＣＳにより、レポーターシステムまたは他の選択機構（例えば、細胞表面マーカーまたはサイトカインマーカー）によって生成された信号に基づき、選択することができる。選択は、細胞がＭＨＣ結合抗原に接触した後のバーチャルＴＩＬ上の細胞表面マーカー発現に基づくことができる。細胞表面マーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ３９、ＣＤ１０３、ＣＤ１３７、及び他のＴ細胞活性化マーカー、またはこれらの組合せであり得る。選択は、カルシウム流入に基づいてもよい。また、選択は、レポーター遺伝子発現に基づいてもよい。レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）であり得る。レポーター遺伝子は、ＴＣＲシグナルによって調節される転写因子の制御下にあってもよい。このような転写因子の例としては、限定されるものではないが、ＡＰ－１、ＮＦＡＴ、ＮＦ－カッパ－Ｂ、Ｒｕｎｘ１、Ｒｕｎｘ３などが挙げられる。選択は、ＩＣＳ及びサイトカイン捕捉アッセイなどの方法を用いて、活性化したバーチャルＴＩＬから放出されるサイトカインに基づいてもよい。図９Ｃは、バーチャルＴＩＬの別の適用例を示している。標的反応性ＴＣＲを同定した後、標的反応性ＴＣＲは、自己由来Ｔ細胞（組織試料及び血液試料を得たのと同じ患者から単離されたＴ細胞）などの宿主細胞に送達し、発現させることができる。標的反応性ＴＣＲは、同種異系Ｔ細胞に送達し発現させることができる。次いで、標的反応性ＴＣＲを発現するＴ細胞を同じ患者に投与して、がんなどの疾患を治療することができる。
対象からの組織試料（例えば、固体試料）中のネイティブ対合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の配列を同定する方法は、対象から得られた複数の末梢Ｔ細胞を含む試料中の１つ以上のネイティブ対合ＴＣＲの１つ以上の対合配列を同定することを含み得る。１つ以上の対合配列の各々はＣＤＲ３配列を含み得る。次に、組織試料中のＴＣＲのＴＣＲ鎖の組織ＣＤＲ３配列を同定することができるが、ネイティブ対合他方のＴＣＲ鎖が未知である場合がある。組織ＣＤＲ３配列は、１つ以上のネイティブ対合ＴＣＲの対合配列のうちの少なくとも１つの対合配列のＣＤＲ３配列と一致し、それにより、少なくとも１つの対合配列を、組織試料中のネイティブ対合ＴＣＲの配列として同定することができる。また、本明細書では、標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法も提供される。当該方法は、本明細書に記載の方法を用いて同定されたＴＣＲを含む細胞を準備することを含み得る。次に、細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示された標的抗原に接触させることができる。細胞は、ＴＣＲを介しＡＰＣによって提示された標的抗原に結合し、それにより、ＴＣＲを標的反応性ＴＣＲとして識別することができる。
本明細書に記載のＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞などの専門的なＡＰＣであり得る。ＡＰＣは、単球または単球由来の樹状細胞であり得る。ａＡＰＣは、Ｔ細胞受容体のリガンド及び共刺激分子を発現することができ、また移入のためのＴ細胞を活性化及び増殖することができ、いくつかの場合ではＴ細胞の効力や機能を向上させることができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞を活性化するための任意の遺伝子を発現するように設計することができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞を増殖するための任意の遺伝子を発現するように設計することができる。ａＡＰＣは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカイン、または任意の組合せであり得る。ａＡＰＣは、ゲノム移植を受け得る細胞集団にシグナルを送達することができる。例えば、ａＡＰＣは、シグナル１、シグナル、２、シグナル３、または任意の組合せを送達することができる。シグナル１は抗原認識シグナルであり得る。例えば、シグナル１は、ペプチド－ＭＨＣ複合体によるＴＣＲのライゲーション、またはＣＤ３シグナル伝達複合体の活性化をもたらし得るＣＤ３に向けられたアゴニスト抗体の結合であり得る。シグナル２は共刺激シグナルであり得る。例えば、共刺激シグナルは、抗ＣＤ２８、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）であり得、これらはそれぞれＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬに結合する。シグナル３はサイトカインシグナルであり得る。サイトカインは任意のサイトカインとすることができる。サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはこれらの任意の組合せであり得る。
いくつかの場合では、ａＡＰＣは、細胞集団を活性化及び／または増殖するために使用され得る。いくつかの場合では、人工物質がアロ特異性を誘導しないことがある。ａＡＰＣは、いくつかの場合ではＨＬＡを発現しないことがある。ａＡＰＣは、活性化及び／または刺激に使用され得る遺伝子を安定的に発現するように遺伝子修飾することができる。いくつかの場合では、Ｋ５６２細胞を活性化に使用することができる。Ｋ５６２細胞は、増殖のために使用することもできる。Ｋ５６２細胞はヒト赤白血病細胞株である。Ｋ５６２細胞は、目的遺伝子を発現するように操作することができる。Ｋ５６２細胞は、内在的にＨＬＡクラスＩ、ＩＩ、またはＣＤ１ｄ分子を発現しない場合があるが、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）及びＬＦＡ－３（ＣＤ５８）を発現し得る。Ｋ５６２は、Ｔ細胞にシグナル１を送達するように操作することができる。例えば、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現するように操作することができる。いくつかの場合では、Ｋ５６２細胞は、追加的な分子、例えば、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、膜結合ＩＬ－１５、膜結合ＩＬ－１７、膜結合ＩＬ－２１、膜結合ＩＬ－２、切断ＣＤ１９、または任意の組合せを発現するように操作することができる。いくつかの場合では、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３ ｍＡｂの膜形態、クローンＯＫＴ３を発現することができる。いくつかの場合では、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３ ｍＡｂの膜形態、クローンＯＫＴ３、抗ＣＤ２８ ｍＡｂの膜形態を発現することができる。
キット
本明細書に記載の組成物は、キットで提供することができる。例えば、キットは、複数のポリヌクレオチド分子の構築に使用され得る核酸分子のプールを有する容器を含むことができ、各ポリヌクレオチドは、ＴＣＲ鎖もしくはその一部、またはＴＣＲ鎖の同族対をコードする。いくつかの場合では、核酸分子のプールの各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする。いくつかの場合では、核酸分子のプールの各核酸分子は、ＴＣＲ鎖の同族対の第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする。いくつかの場合では、核酸分子のプールの各核酸分子は、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの場合では、核酸分子のプールの各核酸分子は、本明細書に記載のコネクター配列を含む。コネクター配列は、核酸分子の同じプール内の他のコネクター配列とは異なる配列を有し得る。キットは、各容器が核酸分子のプールを含む１つ以上の容器を含み得る。キットで提供される核酸分子は、液体形態または乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）をとり得る。
キットはさらに、核酸分子のプールを使用してＴＣＲをコードする複数のポリヌクレオチド分子を構築することをユーザーに指示するための説明資料を含み得る。
キットはさらに、核酸分子を構築する反応で使用することができる少なくとも１つの試薬（例えば、緩衝液、酵素、添加剤など）を含み得る。
実施例１．ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドプールを完全長の発現可能なＴＣＲプールに変換する
この実施例では、３つのＩＩＳ型制限酵素を使用して粘着末端を作出する。このような酵素は市販されている。この実施例では、４ｂｐの５’オーバーハングを作出する２つの酵素（例えば、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦｏｋＩなど）と、平滑末端または３’オーバーハングを作出する１つの制限酵素（例えば、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩなど）とを使用する。使用する最適な酵素セットは、実用的な因子（例えば、局所的可用性、切断効率、スター活性）に依存し得、実験的に容易に選択することができる。ここでは、最初の２つの制限酵素を「ＴＩＩＳＲＥ１」、「ＴＩＩＳＲＥ２」と呼び、最後の制限酵素を「ＴＩＩＳＲＥ３」と呼ぶ。
この実施例では、対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドを、アルファ及びベータＣＤＲ３－Ｊのコード配列に対し「ヘッドトゥテール」の方向で合成する。言い換えれば、アルファＣＤＲ－３Ｊ及びベータＣＤＲ－３Ｊは同じ５’→３’方向で合成する。得られた完全長の発現可能なＴＣＲポリヌクレオチドもヘッドトゥテール方向である。対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドは、他の方向で、例えば、ヘッドトゥヘッド及びテールトゥテールで合成することができる。本明細書に記載の方法は、米国仮特許出願第６２／７１８，２２７号、同第６２／７２５，８４２号、同第６２／７３２，８９８号、同第６２／８１８，３５５号、同第６２／８２３，８３１号（これらの各出願は参照により全体が本明細書に援用される）に記載の方法と組み合わせて、対合ＣＤＲ－３Ｊオリゴヌクレオチドを設計し、他の方向の完全長の発現可能なＴＣＲポリヌクレオチドを得ることができる。
図１Ａ～１Ｃに示されているように、対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴは、ＴＲＢＪ、ＣＤＲ３ベータ、ＴＲＡＪ、ＣＤＲ３アルファの逆相補鎖配列を５’から３’の順に含み、その他の介在するドメインは後述する通りである。本明細書全体にわたり、記号「*」は相補性を意味する。例えば、Ｐがポリヌクレオチド配列を指す場合、Ｐ*はＰの逆相補配列を指す。また、適切な場合、ＡまたはＢを指すために文字Ｘが使用される。例えば、ＴＲＸＶは、ＴＲＡＶとＴＲＢＶをまとめて指すために使用され得る。明確にするため、この実施例及び図１Ａ～１Ｃでは、ＴＲＡＪドメイン及びＴＲＢＪドメインはそれぞれ、ＣＤＲ３に含まれないＴＲＡＪ領域及びＴＲＢＪ領域の一部をコードするポリヌクレオチド配列を指す。
ＢＣＣは「ベータ定常コネクター（ｂｅｔａ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）」を表し、その機能はＴＲＢＣ配列との接続である。ＣｏｎＢ＃は特定のＴＲＢＶ配列のコネクターであり、記号＃はＴＲＢＶ遺伝子の数値的ＩＤを示す。同様に、ＣｏｎＡ＃は、特定のＴＲＡＶ配列のコネクターである。ＩＣＣは「鎖間コネクター（Ｉｎｔｅｒ－ｃｈａｉｎ ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）」を表し、ＴＲＢＶのＣｏｎＢ＃への接続、及びＴＲＡＣのＴＲＡＪへの接続に使用される。
ＣｏｎＢ＃及びＣｏｎＡ＃ドメインをコドン多様化して（実施例２を参照）、ＣｏｎＸ＃及びＣｏｎＸ＃*の数値的ＩＤが同じ場合にのみ、ＣｏｎＸ＃及びＣｏｎＸ＃*が高い収率でハイブリダイズするように、異なるＴＲＢＶ遺伝子のＣｏｎＸ＃がヌクレオチドレベルで十分に異なるようにすることができる。
４８の部分二重鎖ＴＲＡＶ＃＿ＧＬポリヌクレオチドのライブラリー（機能的と注釈されているＩＭＧＴ中の各ＴＲＡＶ遺伝子に対し１つ）は、従来的な方法で調製することができる。全てのＴＲＡＶ＃＿ＧＬポリヌクレオチドを混合してＴＲＡＶ＃＿ＧＬプールを作出することができる。ＧＬは生殖系列を表す。各ＴＲＡＶ＃＿ＧＬポリヌクレオチドの上の鎖は、（１）自己切断Ｐ２Ａペプチドの３’部分をコードするＰ２Ａ－３ドメインと、（２）Ｌ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＣｏｎＡ＃上流のＦＲ３部分を含むＴＲＡＶ＃の生殖系列配列の５’部分をこの順でコードするＴＲＡＶ＃＿ＧＬ５ドメインと、（３）ＦＲ３の最後の連なりをコードしコドン多様化されているＣｏｎＡ＃とを含む。各ＴＲＡＶ＃＿ＧＬポリヌクレオチドの下の鎖は、ＴＲＡＶ＃＿ＧＬ５*及びＰ２Ａ－３*を含む。したがって、ＴＲＡＶ＃＿ＧＬポリヌクレオチドは、配列ＣｏｎＡ＃の３’オーバーハングを有する。４８のＴＲＢＶ＃＿ＧＬポリヌクレオチドのライブラリー及びプールも同様に調製することができる。ＴＲＡＶ＃＿ＧＬのＰ２Ａ－３ドメインは、ＴＲＢＶ＃＿ＧＬのＴ２Ａ－３によって置き換えることができる。Ｔ２Ａは別の自己切断ペプチドである。
１，０００～５００，０００の対合ＣＤＲ３－Ｊオリゴヌクレオチドのプールを、チップベースの合成によって調製することができる。
ステップ（１）では、ＣｏｎＡ＃とＣｏｎＡ＃*との間の特異的なハイブリダイゼーションが可能な温度で、ＴＲＡＶ＃＿ＧＬプールを対合ＣＤＲ３－Ｊプールと混合することができる。次いでステップ（２）では、ＤＮＡポリメラーゼを使用してＴＲＡＶ＃＿ＧＬの上の鎖を伸長し、リガーゼを使用して対合ＣＤＲ３－ＪオリゴとＴＲＡＶ＃＿ＧＬの下の鎖とをライゲーションすることができる。
ＢＣＣはＴＩＩＳＲＥ１の認識部位を含む。ステップ（３）では、ＴＩＩＳＲＥ１を使用してＢＣＣで切断し、下の鎖に４塩基の５’オーバーハングを残すことができる。この実施例では、この４塩基は、ＴＲＢＣ１の最初の４塩基のアンチセンスである。ステップ（４）では、この切断産物を予め調製したＴＲＢＣ＿Ｐ２Ａ－５＿ＳＥ（完全なＴＲＢＣ１配列及びＰ２Ａ－５ドメインを含み、ＴＲＢＣ１配列の先頭に４塩基の５’オーバーハングを有する）とライゲーションすることができる。Ｐ２Ａ－５ドメインは、Ｐ２Ａコード配列の５’末端部分である。ＳＥは粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）を表す。このライゲーション産物は、ステップ（５）でＰＣＲ増幅することができる。
ステップ（６）では、この増幅産物は、米国仮特許出願第６２／７１８，２２７号、同第６２／７２５，８４２号、同第６２／７３２，８９８号、同第６２／８１８，３５５号、及び同第６２／８２３，８３１号に記載の方法を使用してＰ２Ａ－５とＰ２Ａ－３との間でライゲーションすることにより、環状化することができる。ライゲーション後、Ｐ２Ａ－５及びＰ２Ａ－３はＰ２Ａを形成する。この実施例では、ＩＣＣはＴＩＩＳＲＥ３の認識部位を含み、ステップ（７）では、この認識部位を使用して、下の鎖上のＣｏｎＢ＃*のすぐ３’側を切断することができる。上の鎖の切断部位はそれほど重要ではない。ステップ（８）では、この切断産物を加熱して上下の鎖を分離することができる。ＴＲＢＣ１の最初の約２０塩基を含むプライマーを使用して下の鎖上で伸長し、下の鎖の３’末端に単鎖領域を残すことができる。この鎖の３’末端の先端にあるのがＣｏｎＢ＃*ドメインである。ステップ（９）では、ＴＲＢＶ＃＿ＧＬの上の鎖のＣｏｎＢ＃が対応するＣｏｎＢ＃*とハイブリダイズするように、ＴＲＢＶ＃＿ＧＬプールを追加することができる。ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを加えて、ハイブリダイゼーション産物を完全な二重鎖ＤＮＡに変換することができる。
ＩＣＣのレムナントにはＴＩＩＳＲＥ２の認識部位も含まれ、ステップ（１０）ではこれを使用してＩＣＣを切断し、ＴＲＡＣの最初の４塩基のアンチセンス配列である４塩基の５’オーバーハングを残すことができる。ステップ（１１）では、上記のステップ（４）と同様に、予め準備したＴＲＡＣ＿ＳＥを５’オーバーハングとライゲーションして、完全なＴＲＡＣ配列を形成することができる。
最終産物は、レンチウイルス骨格、またはＣＲＩＳＰＲ／ＴＡＬＥＮ／ＺＦＮベースノックインに使用される適切な「相同性配列」にライゲーションすることができる。
実施例２．ヒトＴＲＡＶ及びＴＲＢＶ配列を用いたコドン多様性の試験
この実施例では、コドン多様化されたＣｏｎＡ＃及びＣｏｎＢ＃配列を設計するために、熱力学に基づくアルゴリズムが示される。アルゴリズムは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）言語で書かれている。このアルゴリズムで使用されているいくつかの変数やカスタム関数については以下の「ノート」セクションで説明する。残りの部分についてはコードのコメントで説明されているか、または当業者には自明の内容である。いくつかのカスタム関数は、公開されている熱力学パラメーター（例えば、塩基対スタックのΔＨ及びΔＳ）ならびにモデル（例えば、ループサイズの関数としてのΔＳ）を用いた熱力学ベースのＤＮＡハイブリダイゼーションのシミュレーションに依存する。これらのパラメーター及びモデルは、Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊｒ．によって広く公開されている。当業者であれば、これらの関数は、ゼロから、またはＮＵＰＡＣＫなどの一般に公開されているソフトウェアパッケージを利用して、容易に記述することができる。このアルゴリズムは２つの段階：初期設計及びコドン多様化を含み、これらはそれぞれスクリプト１及びスクリプト２で記述される。初期設計では、ＣｏｎＡ＃及びＣｏｎＢ＃配列は、元のＴＲＡＶまたはＴＲＢＶの配列に従って設計する。次いで、全てのＣｏｎＸ＃*に対する全てのＣｏｎＸ＃のハイブリダイゼーション収率を計算してベースラインとする（図２Ａ及び図２Ｂ）。図２Ａは、コドン多様化を伴わない元のＴＲＡＶ配列に従って設計されたコネクター配列のハイブリダイゼーション収率を示している（ＣｏｎＡ＃対ＣｏｎＡ＃*）。図２Ｂは、コドン多様化を伴わない元のＴＲＢＶ配列に従って設計されたコネクター配列のハイブリダイゼーション収率を示している（ＣｏｎＢ＃対ＣｏｎＢ＃*）。コドン多様化中に、ＴＲＸＶ＃＿ＧＬの一部の最後の約６０塩基のコドン選択をランダム化し、特異的なハイブリダイゼーションを可能にするＣｏｎＸ＃配列を選択する。次に、コドン多様化された配列セットを用いて全ＣｏｎＸ＃対全ＣｏｎＸ＃*のハイブリダイゼーション収率を計算し、コドン多様化が成功したかどうかを確認する（図３Ａ及び図３Ｂ）。図３Ａは、コドン多様化されたコネクター配列（ＣｏｎＡ＃～ＣｏｎＡ＃*）のハイブリダイゼーション収率を示している。図３Ｂは、コドン多様化されたコネクター配列（ＣｏｎＢ＃～ＣｏｎＢ＃*）のハイブリダイゼーション収率を示している。
スクリプト１：初期設計。
ｃｌｅａｒ
ｆＨｙｂＴｅｍｐ＝６０；％ハイブリダイゼーション温度（単位：℃）
ｆＣｏｎｃＮａ＝１２５；％ナトリウムイオン濃度（単位：ｍＭ）
ｆＣｏｎｃＭｇ＝３；％マグネシウムイオン濃度（単位：ｍＭ）
ｆＣｏｎｃＱＢ＝５；％ＣｏｎＡ＃またはＣｏｎＢ＃の濃度
％上のパラメーターをｓｔｒｕＰａｒａに格納
ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＨｙｂＴｅｍｐ＝ｆＨｙｂＴｅｍｐ；
ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＣｏｎｃＮａ＝ｆＣｏｎｃＮａ；
ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＣｏｎｃＭｇ＝ｆＣｏｎｃＭｇ；
ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＣｏｎｃＱＢ＝ｆＣｏｎｃＱＢ；
ｃＣｈａｉｎ＝’Ｂ’；％値は、ＣｏｎＡ及びＣｏｎＢの初期配列を設計するためにそれぞれＡまたはＢとすることができる。
ｃＦｉｌｅＧｅｎｅＳｅｑ＝ｓｐｒｉｎｔｆ（’ｈｓＴＲ％ｓＶ＿ＵＴＲ２００－Ｌ－Ｖ＿Ｓｏｒｔｅｄ＿ＦＯｎｌｙ．ｔｘｔ’，ｃＣｈａｉｎ）；％注を参照
％Ｖ遺伝子配列の読取り
ｆｉｄＧｅｎｅ＝ｆｏｐｅｎ（ｃＦｉｌｅＧｅｎｅＳｅｑ）；
ｒａＧｅｎｅＩｎｆｏ＝ｔｅｘｔｓｃａｎ（ｆｉｄＧｅｎｅ，’％ｓ＼ｔ％ｄ＼ｔ％ｄ＼ｔ％ｓ’，’Ｈｅａｄｅｒｌｉｎｅｓ’，１）；
ｆｃｌｏｓｅ（ｆｉｄＧｅｎｅ）；
％初期設計されたＣｏｎＡまたはＣｏｎＢ配列を格納するセルアレイ（ｒａ１ｏｎ１）の初期化
ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ＝ｓｉｚｅ（ｒａＧｅｎｅＩｎｆｏ｛１｝，１）；
ｒａ１ｏｎ１ｓ｛１｝＝－ｏｎｅｓ（ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ，２）；
ｒａ１ｏｎ１ｓ｛２｝＝ｃｅｌｌ（ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ，４）；
ｆｏｒ ｉＧｅｎｅＮｕｍ＝１：ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ
ｆｐｒｉｎｔｆ（’Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ １ｏｎ１ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ＃％ｕ．＼ｎ’，ｉＧｅｎｅＮｕｍ）；
ｃＧｅｎｅＮａｍｅ＝ｒａＧｅｎｅＩｎｆｏ｛１｝｛ｉＧｅｎｅＮｕｍ｝；
ｃＧｅｎｅＳｅｑ＝ｒａＧｅｎｅＩｎｆｏ｛４｝｛ｉＧｅｎｅＮｕｍ｝；
ｉＬＳｔａｒｔ＝ｒａＧｅｎｅＩｎｆｏ｛２｝（ｉＧｅｎｅＮｕｍ）；
ｃＣＤＳ＝ｃＧｅｎｅＳｅｑ（ｉＬＳｔａｒｔ：ｅｎｄ）；
ｃＡＡ＝ｎｔ２ａａ（ｃＣＤＳ）；
ｉＰｏｓＡＡＣｏｎｓｅｒｖｅｄＣ＝ｆｉｎｄ（ｃＡＡ＝＝’Ｃ’，１，’ｌａｓｔ’）；
ｖｉＰｏｓＮＴＣｏｎｓｅｒｖｅｄＣ＝ｉＰｏｓＡＡＣｏｎｓｅｒｖｅｄＣ*３－２：ｉＰｏｓＡＡＣｏｎｓｅｒｖｅｄＣ*３；
ｖＰｏｓＯｆＴｉｎＣｙｓ（ｉＧｅｎｅＮｕｍ）＝ｖｉＰｏｓＮＴＣｏｎｓｅｒｖｅｄＣ（１）；％ＣＤＲ３のＮ末端にある保存されたＣｙｓのコドンの最初のヌクレオチドの位置
ｃＳＡ６０＝ｃＣＤＳ（ｖｉＰｏｓＮＴＣｏｎｓｅｒｖｅｄＣ（１）－５９：ｖｉＰｏｓＮＴＣｏｎｓｅｒｖｅｄＣ（１））；
ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ＝ｆｕｎ＿Ｄｅｓｉｇｎ１ｏｎ１（ｃＳＡ６０，ｓｔｒｕＰａｒａ）；％注を参照
ｄｉｓｐ（ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛１｝）
ｒａ１ｏｎ１ｓ｛１｝（ｉＧｅｎｅＮｕｍ，：）＝ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛１｝；
ｒａ１ｏｎ１ｓ｛２｝（ｉＧｅｎｅＮｕｍ，：）＝ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝；
ｅｎｄ
％％
ｃＴｉｍｅ＝ｄａｔｅｓｔｒ（ｎｏｗ）；
ｃＴｉｍｅ（ｃＴｉｍｅ＝＝’ ’）＝’＿’；
ｃＴｉｍｅ（ｃＴｉｍｅ＝＝’：’）＝’＿’；
ｓａｖｅ（［’ＩｎｉＤｅｓｉｇｎ１ｏｎ１＿’，ｃＣｈａｉｎ，ｎｕｍ２ｓｔｒ（ｆＨｙｂＴｅｍｐ），’＿’，ｃＴｉｍｅ，’．ｍａｔ’］，’ｖＰｏｓＯｆＴｉｎＣｙｓ’，’ｃＣｈａｉｎ’，’ｒａＧｅｎｅＩｎｆｏ’，’ｒａ１ｏｎ１ｓ’，’ｓｔｒｕＰａｒａ’）；
％％クロスハイブリダイゼーション収率の計算
ｘＦｒａｃＢｏｕｎｄＨｙｂ＿ＴＨｙｂ＝－ｏｎｅｓ（ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ，ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ）；
ｆｏｒ ｉＳｉｍＱＢ＝１：ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ
ｆｏｒ ｉＤＥ＝１：ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ
ｉｆ ｘＦｒａｃＢｏｕｎｄＨｙｂ＿ＴＨｙｂ（ｉＳｉｍＱＢ，ｉＤＥ）＞＝０
ｃｏｎｔｉｎｕｅ；
ｅｎｄ
ｃＳｉｍＱＢ＝ｒａ１ｏｎ１ｓ｛２｝｛ｉＳｉｍＱＢ，３｝；％ ｃＳｉｍＱＢ＝ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣｏｎＡ／Ｂ
ｃＤＥ＝ｒａ１ｏｎ１ｓ｛２｝｛ｉＤＥ，４｝；％ ｃＤＥ＝ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣｏｎＡ／Ｂ*
ｆＴｈｉｓＦｒａｃＢｏｕｎｄ＿ＴＨｙｂ＝ＮＰ＿ＧｅｔＢｏｕｎｄＦｒａｃ（ｃＳｉｍＱＢ，ｆＣｏｎｃＱＢ，ｃＤＥ，ｆＣｏｎｃＱＢ／１００，．．．
ｆＨｙｂＴｅｍｐ，’Ｎａ’，ｆＣｏｎｃＮａ，’Ｍｇ’，ｆＣｏｎｃＭｇ）；％ Ｓｅｅ ｎｏｔｅ
ｘＦｒａｃＢｏｕｎｄＨｙｂ＿ＴＨｙｂ（ｉＳｉｍＱＢ，ｉＤＥ）＝ｆＴｈｉｓＦｒａｃＢｏｕｎｄ＿ＴＨｙｂ；
ｅｎｄ
ｅｎｄ
％％
ｓａｖｅ（’ＩｎｉＤｅｓｉｇｎ．ｍａｔ’，’ｘＦｒａｃＢｏｕｎｄＨｙｂ＿ＴＨｙｂ’，’ｘＦｒａｃＢｏｕｎｄＨｙｂ＿ＴＨｙｂＭｉｎｕｓ５ｏＣ’）；
ｆｉｇｕｒｅ；
ｃｏｌｏｒｍａｐ（ｇｒａｙ）；
ｉｍａｇｅｓｃ（１－ｘＦｒａｃＢｏｕｎｄＨｙｂ＿ＴＨｙｂ）；
スクリプト１の注：
「ｈｓＴＲＡＶ＿ＵＴＲ２００－Ｌ－Ｖ＿Ｓｏｒｔｅｄ＿ＦＯｎｌｙ．ｔｘｔ」及び「ｈｓＴＲＢＶ＿ＵＴＲ２００－Ｌ－Ｖ＿Ｓｏｒｔｅｄ＿ＦＯｎｌｙ．ｔｘｔ」というファイルは、ＩＭＧＴデータベースで「機能的」と注釈されている全てのＴＣＲ Ｖ遺伝子の配列を記録するＴＳＶファイルである。各ファイルは４列あり、１列目はＶ遺伝子の名称、４列目は（Ｌ－ＰＡＲＴ１の）開始コドンの約２００ｎｔ上流から始まるＶ遺伝子ｃＤＮＡシークエンシングの配列、２列目は開始コドンの最初のヌクレオチドの位置である。３列目は、（例えば、Ｌ－ＰＡＲＴ２の後の）Ｖ遺伝子の最初のヌクレオチドの位置である。
関数「ｆｕｎ＿Ｄｅｓｉｇｎ１ｏｎ１」は、２つの入力：（１）ＴＲＸＶ＃＿ＧＬの最後の６０塩基を記録する変数ｃＳＡ６０、及び（２）変数ｓｔｒｕＰａｒａに格納された熱力学モデル用パラメーターを用いて、ＣｏｎＡまたはＣｏｎＢ配列を返す。簡潔に述べると、この関数は、以下の記述を満たすｃＳＡ６０の３’末端で終わるｃＳＡ６０の最短の連続サブ配列（ＣｏｎＸと表記）を見出す：配列ＣｏｎＸを有する５ｎＭの第１のＤＮＡオリゴヌクレオチド及び配列ＣｏｎＸ*を有する０．０５ｎＭの第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドを混合したときに、ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＨｙｂＴｅｍｐ、ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＣｏｎｃＮａ、及びｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＣｏｎｃＭｇによって定義されたそれぞれ温度、ナトリウムイオン濃度、及びマグネシウムイオン濃度で、第２のオリゴヌクレオチドの９７％超が第１のオリゴヌクレオチドに結合することが予測される。この関数の出力（ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ）は２つのセルを有するセルアレイで、第１のセルｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛１｝は１ｘ２ベクトルであり、ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛１｝（１）はこの実施例では使用しない出力、ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛１｝（２）はｃＳＡ６０上のＣｏｎＸの最初の塩基の位置である。ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝は１ｘ４セルアレイであり、ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝｛１｝及びｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝｛２｝はこの実施例では使用しない出力、ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝｛３｝はＣｏｎＸの配列、そしてｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝｛４｝はＣｏｎＸ*の配列である。当業者は、上記のようにこの機能を書き込むことができる。
関数「ＮＰ＿ＧｅｔＢｏｕｎｄＦｒａｃ」は、５ｎＭ（ｆＣｏｎｃＱＢにより記録される）の第２のヌクレオチド及び０．０５ｎＭ（ｆＣｏｎｃＱＢ／１００により記録される）の第１のヌクレオチドを６０℃（ｆＨｙｂＴｅｍｐにより記録される）で混合し、１２５ｍＭのＮａ＋（ｆＣｏｎｃＮａにより記録される）及び５ｍＭのＭｇ＋＋（ｆＣｏｎｃＭｇにより記録される）の存在下で平衡に達したときに、配列ＣｏｎＸ*を有する第１のＤＮＡオリゴヌクレオチドのうち、配列ＣｏｎＸを有する第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合しているものの割合を返す。
このスクリプトによって生成された画像は、上記の条件で０．０５ｎＭのＣｏｎＸ＃*を５ｎＭのＣｏｎＸ＃と混合したときに、どの程度の割合のＣｏｎＸ＃*がＣｏｎＸ＃に結合すると予測されるかのグレースケールヒートマップを示す。図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、実質的なクロス接続（例えば、誤接続）は、特にＴＲＢＶ（図２Ｂ）に存在する。
スクリプト２．コドンの多様化
ｃｌｅａｒ；
ｌｏａｄ（’ＩｎｉＤｅｓｉｇｎ．ｍａｔ’）；
ｆＣｏｎｃＱＢ＝ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＣｏｎｃＱＢ；
ｆＣｏｎｃＮａ＝ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＣｏｎｃＮａ；
ｆＣｏｎｃＭｇ＝ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＣｏｎｃＭｇ；
ｆＨｙｂＴｅｍｐ＝ｓｔｒｕＰａｒａ．ｆＨｙｂＴｅｍｐ；
ｆＣｏｄｏｎＦｒｅｑＴｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．１５；％許容されるコドン頻度の最低値
ｆＳＳＴｈｒｅｈｏｌｄ＝０．６；
ｆＣｒｏｓｓＡｓｓｅｍｂｌｙＴｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．０２；％誤接続の許容レベルの最低値
ｉＭａｘＬｅｎｇｔｈＤＥ＝３５；％ ＣｏｎＸの最大許容長
ｓｔｒｕＰａｒａＤｉｖ．ｆＣｏｄｏｎＦｒｅｑＴｈｒｅｓｈｏｌｄ＝ｆＣｏｄｏｎＦｒｅｑＴｈｒｅｓｈｏｌｄ；
ｓｔｒｕＰａｒａＤｉｖ．ｆＳＳＴｈｒｅｈｏｌｄ＝ｆＳＳＴｈｒｅｈｏｌｄ；
ｓｔｒｕＰａｒａＤｉｖ．ｆＣｒｏｓｓＡｓｓｅｍｂｌｙＴｈｒｅｓｈｏｌｄ＝ｆＣｒｏｓｓＡｓｓｅｍｂｌｙＴｈｒｅｓｈｏｌｄ；
ｓｔｒｕＰａｒａＤｉｖ．ｉＭａｘＬｅｎｇｔｈＤＥ＝ｉＭａｘＬｅｎｇｔｈＤＥ；
％％開始
ｒａ１ｏｎ１ＮｅｗＤｅｓｉｇｎ＝ｃｅｌｌ（１，２）；
ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ＝ｓｉｚｅ（ｒａ１ｏｎ１ｓ｛１｝，１）；
ｘＣｒｏｓｓＰｒｉｍｅＡｌｒｅａｄｙＤｅｓｉｇｎｅｄ＿Ｈｙｂ＿ＴＨｙｂ＝－ｏｎｅｓ（ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ）；
％％
ｆｏｒ ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ＝１：ｉＴｏｔａｌＮｕｍＯｆＧｅｎｅ
ｃＳＡ６０＝ｒａ１ｏｎ１ｓ｛２｝｛ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ，１｝；
ｃＡＡＩｎＦｒａｍｅ＝ｎｔ２ａａ（ｃＳＡ６０（３：５９））；
ｆｐｒｉｎｔｆ（’％ｓ＼ｎ’，ｃＳＡ６０）；
ｂＨａｖｅＹｏｕＴｒｉｅｄＩｎｉｔｉａｌＤｅｓｉｇｎ＝ｆａｌｓｅ；
ｗｈｉｌｅ（１）
ｉｆ ～ｂＨａｖｅＹｏｕＴｒｉｅｄＩｎｉｔｉａｌＤｅｓｉｇｎ
ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛１｝＝ｒａ１ｏｎ１ｓ｛１｝（ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ，：）；
ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝＝ｒａ１ｏｎ１ｓ｛２｝（ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ，：）；
ｂＨａｖｅＹｏｕＴｒｉｅｄＩｎｉｔｉａｌＤｅｓｉｇｎ＝ｔｒｕｅ；
ｅｌｓｅ ％ランダム化
ｃＴｒｉａｌＭｉｄｄｌｅ５７＝ｆｕｎ＿ａａ２ｎｔ（ｃＡＡＩｎＦｒａｍｅ，ｒａＣｏｄｏｎＴａｂｌｅ，ｆＣｏｄｏｎＦｒｅｑＴｈｒｅｓｈｏｌｄ）；％注を参照
ｃＡＡＴｏＭａｋｅＳｕｒｅ＝ｎｔ２ａａ（ｃＴｒｉａｌＭｉｄｄｌｅ５７，’ＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＳｔａｒｔＣｏｄｏｎｓ’，’ｆａｌｓｅ’）；
ｉｆ ～ｓｔｒｃｍｐｉ（ｃＡＡＩｎＦｒａｍｅ，ｃＡＡＴｏＭａｋｅＳｕｒｅ）
ｅｒｒｏｒ（’ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ ｉｓ ｗｒｏｎｇ’）；
ｅｎｄ
ｃＴｒｉａｌＳＡ６０＝［ｃＳＡ６０（１：２），ｃＴｒｉａｌＭｉｄｄｌｅ５７，’Ｔ’］；
ｆｐｒｉｎｔｆ（’％ｓ＼ｎ’，ｃＴｒｉａｌＳＡ６０）；
ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ＝ｆｕｎ＿Ｄｅｓｉｇｎ１ｏｎ１（ｃＴｒｉａｌＳＡ６０，ｓｔｒｕＰａｒａ）；
ｅｎｄ
ｉＳｔａｒｔＰｏｓＢＭ＝ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛１｝（２）；
ｃＴｒｉａｌＳｉｍＱＢ＝ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝｛３｝；
ｃＴｒｉａｌＤＥ＝ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝｛４｝；
％ＤＥの長さをチェック
ｉＬｅｆｔｅｓｔＳｔａｒｔＰｏｓＢＭ＝６０－ｉＭａｘＬｅｎｇｔｈＤＥ＋１；
ｉｆ ｉＳｔａｒｔＰｏｓＢＭ＜ｉＬｅｆｔｅｓｔＳｔａｒｔＰｏｓＢＭ
ｆｐｒｉｎｔｆ（’ＤＥ ｔｏｏ ｌｏｎｇ＼ｎ’）；
ｃｏｎｔｉｎｕｅ；
ｅｎｄ
％％
ｖＲｏｗ＿ＴＨｙｂ＝－ｏｎｅｓ（１，ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ）；
ｖＣｏｌｕｍｎ＿ＴＨｙｂ＝－ｏｎｅｓ（ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ，１）；
ｆｏｒ ｉＤＥ＝１：ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ
ｉｆ ｉＤＥ～＝ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ
ｃＤＥ＝ｒａ１ｏｎ１ＮｅｗＤｅｓｉｇｎ｛２｝｛ｉＤＥ，４｝；
ｅｌｓｅ
ｃＤＥ＝ｃＴｒｉａｌＤＥ；
ｅｎｄ
ｆＦｒａｃＨｙｂ＿ＴＨｙｂ＝ＮＰ＿ＧｅｔＢｏｕｎｄＦｒａｃ（ｃＴｒｉａｌＳｉｍＱＢ，ｆＣｏｎｃＱＢ，ｃＤＥ，ｆＣｏｎｃＱＢ／１００，．．．
ｆＨｙｂＴｅｍｐ，’Ｎａ’，ｆＣｏｎｃＮａ，’Ｍｇ’，ｆＣｏｎｃＭｇ）；
ｖＲｏｗ＿ＴＨｙｂ（ｉＤＥ）＝ｆＦｒａｃＨｙｂ＿ＴＨｙｂ；
ｅｎｄ
ｆｏｒ ｉＱＢ＝１：ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ
ｉｆ ｉＱＢ～＝ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ
ｃＥｘｔＳｉｍＱＢ＝ｒａ１ｏｎ１ＮｅｗＤｅｓｉｇｎ｛２｝｛ｉＱＢ，２｝；
ｅｌｓｅ
ｃＥｘｔＳｉｍＱＢ＝ｃＴｒｉａｌＥｘｔＳｉｍＱＢ；
ｅｎｄ
ｆＦｒａｃＨｙｂ＿ＴＨｙｂ＝ＮＰ＿ＧｅｔＢｏｕｎｄＦｒａｃ（ｃＥｘｔＳｉｍＱＢ，ｆＣｏｎｃＱＢ，ｃＴｒｉａｌＤＥ，ｆＣｏｎｃＱＢ／１００，．．．
ｆＨｙｂＴｅｍｐ，’Ｎａ’，ｆＣｏｎｃＮａ，’Ｍｇ’，ｆＣｏｎｃＭｇ）；
ｖＣｏｌｕｍｎ＿ＴＨｙｂ（ｉＱＢ）＝ｆＦｒａｃＨｙｂ＿ＴＨｙｂ；
ｅｎｄ
ｖＲｏｗＴｏＵｓｅ＝ｖＲｏｗ＿ＴＨｙｂ；
ｖＣｏｌｕｍｎＴｏＵｓｅ＝ｖＣｏｌｕｍｎ＿ＴＨｙｂ；
ｉｆ ｖＲｏｗＴｏＵｓｅ（ｅｎｄ）＞＝０．５ ＆＆ ｓｕｍ（ｖＲｏｗＴｏＵｓｅ（１：ｅｎｄ－１））＜ｆＣｒｏｓｓＡｓｓｅｍｂｌｙＴｈｒｅｓｈｏｌｄ ＆＆ ．．．
ｖＣｏｌｕｍｎＴｏＵｓｅ（ｅｎｄ）＞＝０．５ ＆＆ ｓｕｍ（ｖＣｏｌｕｍｎＴｏＵｓｅ（１：ｅｎｄ－１））＜ｆＣｒｏｓｓＡｓｓｅｍｂｌｙＴｈｒｅｓｈｏｌｄ
ｒａ１ｏｎ１ＮｅｗＤｅｓｉｇｎ｛１｝（ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ，：）＝ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛１｝；
ｒａ１ｏｎ１ＮｅｗＤｅｓｉｇｎ｛２｝（ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ，：）＝ｒａ１ｏｎ１ｏｆＴｈｉｓＧｅｎｅ｛２｝；
ｘＣｒｏｓｓＰｒｉｍｅＡｌｒｅａｄｙＤｅｓｉｇｎｅｄ＿Ｈｙｂ＿ＴＨｙｂ（ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ，１：ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ）＝ｖＲｏｗ＿ＴＨｙｂ；
ｘＣｒｏｓｓＰｒｉｍｅＡｌｒｅａｄｙＤｅｓｉｇｎｅｄ＿Ｈｙｂ＿ＴＨｙｂ（１：ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ，ｉＧｅｎｅＴｏＭｏｄｉｆｙ）＝ｖＣｏｌｕｍｎ＿ＴＨｙｂ；
ｂｒｅａｋ；
ｅｎｄ
ｅｎｄ
ｅｎｄ
％％
ｆｉｇｕｒｅ；
ｃｏｌｏｒｍａｐ（ｇｒａｙ）
ｉｍａｇｅｓｃ（１－ｘＣｒｏｓｓＰｒｉｍｅＡｌｒｅａｄｙＤｅｓｉｇｎｅｄ＿Ｈｙｂ＿ＴＨｙｂ）；
スクリプト２の注：
関数「ｆｕｎ＿ａａ２ｎｔ」は、入力ｒａＣｏｄｏｎＴａｂｌｅによって提供されるコドンテーブル情報及び入力ｆＣｏｄｏｎＦｒｅｑＴｈｒｅｓｈｏｌｄによって提供される最低許容コドン頻度を用いて、入力配列ｃＡＡＩｎＦｒａｍｅと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を返す。
このスクリプトによって生成された画像は、コドン多様化後、上記の条件で０．０５ｎＭのＣｏｎＸ＃*を５ｎＭのＣｏｎＸ＃と混合したときに、どの程度の割合のＣｏｎＸ＃*がＣｏｎＸ＃に結合すると予測されるかのグレースケールヒートマップを示す。図３Ａ及び図３Ｂで示されているように、特異的ハイブリダイゼーションのみが顕著に起こることが予測される。したがって、この実施例は、コドン多様化スキームが実現可能であることを示し、またコドン多様化されたＣｏｎＡ及びＣｏｎＢ配列を得る方法を示している。
実施例３．マウスＴＲＡＶ及びＴＲＢＶ遺伝子に由来するコネクター配列
この実施例では、マウスのＴＲＡＶ及びＴＲＢＶ遺伝子に由来するコドン多様化されたコネクター配列が示される。上記の例と同様、ＣｏｎＡは特定のＴＲＡＶ配列のためのコネクターであり、ＣｏｎＢは特定のＴＲＢＶ配列のためのコネクターである。実施例２に記載のものと同じ方法でコドン多様化を実施した。表１は、マウスＴＲＡＶ遺伝子に由来するコドン多様化されたコネクター配列を示している。表２は、マウスＴＲＢＶ遺伝子に由来するコドン多様化されたコネクター配列を示している。表１及び表２では、１列目に各Ｖ遺伝子の遺伝子名及びアクセッション番号、２列目に対応するコネクター配列を示している。
Figure 2022527364000002
Figure 2022527364000003
Figure 2022527364000004
Figure 2022527364000005
Figure 2022527364000006
Figure 2022527364000007
Figure 2022527364000008
Figure 2022527364000009
Figure 2022527364000010
Figure 2022527364000011
Figure 2022527364000012
初期設計では、ＣｏｎＡ＃及びＣｏｎＢ＃の配列は、元のＴＲＡＶまたはＴＲＢＶの配列に従って設計する。本明細書で使用する場合、記号＃は、ＴＲＡＶまたはＴＲＢＶ遺伝子の数値的ＩＤを示す。次いで、全てのＣｏｎＸ＃*に対する全てのＣｏｎＸ＃のハイブリダイゼーション収率を計算してベースラインとする（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。図１０Ａは、コドン多様化を伴わない元のＴＲＡＶ配列に従って設計されたコネクター配列のハイブリダイゼーション収率を示している（ＣｏｎＡ＃対ＣｏｎＡ＃*）。図１０Ｂは、コドン多様化を伴わない元のＴＲＢＶ配列に従って設計されたコネクター配列のハイブリダイゼーション収率を示している（ＣｏｎＢ＃対ＣｏｎＢ＃*）。コドン多様化中に、ＴＲＸＶ＃＿ＧＬの一部の最後の約６０塩基のコドン選択をランダム化し、特異的なハイブリダイゼーションを可能にするＣｏｎＸ＃配列を選択する。次に、コドン多様化された配列セットを用いて全ＣｏｎＸ＃対全ＣｏｎＸ＃*のハイブリダイゼーション収率を計算し、コドン多様化が成功したかどうかを確認する（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。図１１Ａは、コドン多様化されたコネクター配列（ＣｏｎＡ＃～ＣｏｎＡ＃*）のハイブリダイゼーション収率を示している。図１１Ｂは、コドン多様化されたコネクター配列（ＣｏｎＢ＃～ＣｏｎＢ＃*）のハイブリダイゼーション収率を示している。
実施例４．任意の配列を有するコネクター配列
表３は、図７に記載のスキームに従って、ＣＤＲ３－Ｊポリヌクレオチドと指定されたＶ遺伝子生殖系列ポリヌクレオチドとを結合するためのコネクター配列として使用され得る任意の配列を示している。
Figure 2022527364000013
Figure 2022527364000014
Figure 2022527364000015
Figure 2022527364000016
Figure 2022527364000017
実施例５．次世代シークエンシングを用いた集成ＴＣＲ遺伝子の特性評価
対合ＴＣＲをコードする核酸配列のプールを、本明細書に記載の方法（例えば、実施例１にいくらかの変更を加えたもの）を用いて調製した。ネイティブ対合ＴＣＲをコードする参照配列は、一般に公開されているライブラリーから入手した。５５３の参照配列をこの実施例で実証するように選択した。この実施例では、ＣＤＲ３－Ｊα（またはＣＤＲ３－Ｊαフラグメント）をコードする核酸配列及びＣＤＲ３－Ｊβ（またはＣＤＲ３－Ｊβフラグメント）をコードする核酸配列を別々に合成した。代替的に、対合ＣＤＲ３－Ｊα及びＣＤＲ３－Ｊβを一緒に合成して１つのフラグメントにしてもよい。
５５３のＣＤＲ３－Ｊαフラグメント及び５５３のＣＤＲ３－Ｊβフラグメントを合成し、（例えば、ライゲーション、オーバーラップＰＣＲなどにより）一緒に接続して、ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントの対合プールを生成した。ＣＤＲ３－Ｊαをネイティブ対合ＣＤＲ３－Ｊβと確実にライゲーションするため、各ＣＤＲ３－Ｊα上に任意のコネクター配列を合成し、この任意のコネクター配列を、ＣＤＲ３－Ｊαフラグメントのプール内の他の任意のコネクター配列とのクロスハイブリダイゼーションを最小限に抑えることができるように設計した。任意のコネクター配列の相補的な配列を、ネイティブ対合ＣＤＲ３－Ｊβ上で合成した。次に、ＴＲＡＶフラグメントのプール（参照配列に従って予め合成したもの）を対合ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントに接続して、各々が同族ＣＤＲ３－Ｊαに接続したＴＲＡＶ配列を含むＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントのプールを生成した。次に、ＴＲＢＣ１配列をＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントの下流に付加して、ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１フラグメントを形成した。これらのフラグメントを環状化し、ＣＤＲ３－Ｊβのすぐ上流で切断することにより再び直鎖化して、ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαのフラグメントを形成した。ＴＲＢＣ１及びＴＲＡＶフラグメントは、インフレーム自己切断するＰ２Ａ配列がＴＲＢＣ１及びＴＲＡＶを接続するように設計した。次に、ＴＲＢＶフラグメントのプール（参照配列に従って事前に合成）をＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαフラグメントに接続してＴＲＢＶ－ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαを生成し、これを次世代シークエンシング（ＮＧＳ）に供してクローンの存在量及びクローンの接続精度を評価した。ここでは、ＮＧＳデータの各クローンは一意の配列を指す。この実施例では５５３の参照配列を使用したため、ＮＧＳデータには合計５５３のクローンが含まれた。本明細書に記載のデータ解析については、ＣＤＲ３－Ｊα配列を使用してクローンを表した。
図１２は、対合ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントを生成した後の各クローンの精度及び存在量を示している。各データポイントはＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントのクローンに対応する。精度とは、ＣＤＲ３－Ｊαフラグメントが同族ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントに接続している割合を指す。各ＣＤＲ－Ｊαにおいて、精度は、正しく接続したＣＤＲ３－Ｊβフラグメントの数を接続したＣＤＲ３－Ｊβフラグメントの総数で割ったものによって計算することができる。存在量とは、クローンの総プールにおける各クローンの割合を指し、そのクローンの総リード数を全てのクローンの総リード数で割ることによって計算することができる。データは、ボックス内に示されているように、５５３中４９７のクローンが９５％より高い精度及び０．１／５５３より高い存在量を示している。
図１３は、ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントを生成した後の各クローンの精度及び存在量を示している。各データポイントはＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントのクローンに対応する。精度とは、ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントが同族ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントに接続している割合を指す。各ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβにおいて、精度は、正しく接続したＴＲＡＶフラグメントの数を接続したＴＲＡＶフラグメントの総数で割ったものによって計算することができる。存在量とは、クローンの総プールにおける各クローンの割合を指し、そのクローンの総リード数を全てのクローンの総リード数で割ることによって計算することができる。データは、ボックス内に示されているように、５５３中５２３のクローンが９５％より高い精度及び０．１／５５３より高い存在量を示している。
図１４は、各ＴＲＡＶをプール内の各クローンにマッピングしたヒートマップを示している。クローン番号は、その同族ＴＲＡＶ遺伝子名に従ってランク付けされる。各クローンにおけるデータは、大部分のリードが正しいＴＲＡＶ配列を有することが示されており、このことから、ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントをその同族ＴＲＡＶフラグメントに接続する際の精度が高いことが示される。
図１５は、ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントを生成（例えば、図１５のＴＲＡＶ付加）した後の各クローンの存在量及びＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントを生成した後の存在量を示している。このデータは、全体的なバイアスが、ＣＤＲ３－ＪαフラグメントとＣＤＲ３－Ｊβフラグメントとのライゲーション中のバイアスによって支配されていることを示している。このバイアスは、対合ＣＤＲ３－Ｊα－ＣＤＲ３－Ｊβフラグメントを直接的に合成することにより、低減または回避され得る。
図１６は、ＴＲＢＶ－ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαフラグメントを生成した後の各クローンの精度及び存在量を示している。各データポイントは、ＴＲＢＶ－ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαフラグメントのクローンに対応する。精度とは、ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαフラグメントが同族ＴＲＢＶフラグメントに接続している割合を指す。各ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαにおいて、精度は、正しく接続したＴＲＢＶフラグメントの数を接続したＴＲＢＶフラグメントの総数で割ったものによって計算することができる。存在量とは、クローンの総プールにおける各クローンの割合を指し、そのクローンの総リード数を全てのクローンの総リード数で割ることによって計算することができる。データは、ボックス内に示されているように、５５３中５１４のクローンが９５％より高い精度及び０．１／５５３より高い存在量を示している。
図１７は、各ＴＲＢＶをプール内の各クローンにマッピングしたヒートマップを示している。クローン番号は、その同族ＴＲＢＶ遺伝子名に従ってランク付けされる。各クローンにおけるデータは、大部分のリードが正しいＴＲＢＶ配列を有することが示されており、このことから、ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαフラグメントをその同族ＴＲＢＶフラグメントに接続する際の精度が高いことが示される。
図１８は、ＴＲＢＶ－ＣＤＲ３－Ｊβ－ＴＲＢＣ１－ＴＲＡＶ－ＣＤＲ３－Ｊαフラグメントを生成した後の各クローンの全体的な精度及び存在量を示している。各クローンにおける全体的な精度は、図１２、１３、及び１６に示される各ステップでの精度を乗じて計算した。存在量は、そのクローンの総リード数を全てのクローンの総リード数で割ることによって計算した。
本発明の様々な実施形態が本明細書で示され説明されてきたが、当業者にはこのような実施形態が単に例として提供されていることが明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変化、及び置換えが想到され得る。本明細書に記載の本発明の実施形態に対し、様々な代替物が用いられ得ることを理解されたい。
実施形態のパラグラフ
［１］Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその一部をコードする核酸分子を生成するための方法であって、（ａ）ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子を準備することと、（ｂ）複数の核酸分子を準備することであって、前記複数の核酸分子の各々がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、前記複数の核酸分子が少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する少なくとも２つの異なる配列を含む、準備することと、（ｃ）（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子を、同じ区画内の（ｂ）の前記複数の核酸分子に接触させることとを含み、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子が、前記複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に結合して、ＣＤＲ３をコードする配列と前記少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子のうちの１つに由来する配列とを含む、第３の核酸分子を生成することが可能であり、それにより、前記ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする前記核酸分子を生成する、前記方法。
［２］前記少なくとも１つの核酸分子が第１の複数の核酸分子を含み、前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［１］に記載の方法。
［３］（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子が、前記少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子の任意の１つの所与のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む前記複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に特異的に結合可能である、パラグラフ［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記少なくとも１つの核酸分子が前記ＴＣＲ鎖のＪ領域をさらに含む、パラグラフ［１］に記載の方法。
［５］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ鎖のＪ領域をさらに含む、パラグラフ［２］に記載の方法。
［６］前記少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子がヒトＴＣＲ Ｖ遺伝子またはマウスＴＣＲ Ｖ遺伝子である、パラグラフ［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］前記少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ヒトＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８－１、ＴＲＡＶ８－２、ＴＲＡＶ８－３、ＴＲＡＶ８－４、ＴＲＡＶ８－６、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２－１、ＴＲＡＶ１２－２、ＴＲＡＶ１２－３、ＴＲＡＶ１３－１、ＴＲＡＶ１３－２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６－１、ＴＲＡＶ２６－２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８－１、ＴＲＡＶ３８－２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、及びＴＲＡＶ４１からなる群より選択される、パラグラフ［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］前記少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３－１、ＴＲＢＶ４－１、ＴＲＢＶ４－２、ＴＲＢＶ４－３、ＴＲＢＶ５－１、ＴＲＢＶ５－４、ＴＲＢＶ５－５、ＴＲＢＶ５－６、ＴＲＢＶ５－８、ＴＲＢＶ６－１、ＴＲＢＶ６－２、ＴＲＢＶ６－３、ＴＲＢＶ６－４、ＴＲＢＶ６－５、ＴＲＢＶ６－６、ＴＲＢＶ６－８、ＴＲＢＶ６－９、ＴＲＢＶ７－２、ＴＲＢＶ７－３、ＴＲＢＶ７－４、ＴＲＢＶ７－６、ＴＲＢＶ７－７、ＴＲＢＶ７－８、ＴＲＢＶ７－９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０－１、ＴＲＢＶ１０－２、ＴＲＢＶ１０－３、ＴＲＢＶ１１－１、ＴＲＢＶ１１－２、ＴＲＢＶ１１－３、ＴＲＢＶ１２－３、ＴＲＢＶ１２－４、ＴＲＢＶ１２－５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０－１、ＴＲＢＶ２４－１、ＴＲＢＶ２５－１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９－１、及びＴＲＢＶ３０からなる群より選択される、パラグラフ［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［９］前記少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記複数の配列の各配列が、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］前記ＴＣＲ鎖がＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、またはＴＣＲデルタ鎖である、パラグラフ［１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］前記少なくとも１つの核酸分子が、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列をさらに含む、パラグラフ［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］前記少なくとも１つの核酸分子が前記追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域を含む、パラグラフ［１１］に記載の方法。
［１３］前記ＣＤＲ３をコードする前記配列及び前記追加のＣＤＲ３をコードする前記追加の配列が、最大１００ヌクレオチド離れている、パラグラフ［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］前記ＴＣＲ鎖及び前記追加のＴＣＲ鎖がＴＣＲ鎖の同族対である、パラグラフ［１１］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］前記少なくとも１つの核酸分子がコネクター配列を含み、前記コネクター配列が、前記少なくとも１つの核酸分子を前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子に結合して前記第３の核酸分子を生成可能である、パラグラフ［１］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］前記少なくとも１つの核酸分子及び前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が、機能的ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする、パラグラフ［１５］に記載の方法。
［１７］前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子の前記コネクター配列に相補的なアンチコネクター配列を含む、パラグラフ［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とを結合することをさらに含む、パラグラフ［１］～［１７］のいずれか１つに記載の方法。
［１９］結合することが、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とをハイブリダイズすることを含む、パラグラフ［１８］に記載の方法。
［２０］ハイブリダイズすることが、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子のコネクター配列を（ｂ）の前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子のアンチコネクター配列とハイブリダイズすることを含む、パラグラフ［１９］に記載の方法。
［２１］（ｉ）（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子を鋳型として用いて、前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子の遊離３’末端を伸長して、及び／または（ｉｉ）前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子を鋳型として用いて、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子の遊離３’末端を伸長して、第３の核酸分子を生成することをさらに含む、パラグラフ［１８］～［２０］のいずれか１つに記載の方法。
［２２］（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とをライゲーションすることをさらに含む、パラグラフ［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］前記第３の核酸分子を制限酵素に接触させて粘着末端を生成することをさらに含む、パラグラフ［１］～［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［２４］前記第３の核酸分子を追加の核酸分子に接触させることをさらに含む、パラグラフ［１］～［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］前記追加の核酸分子がＴＣＲ鎖の定常領域またはその一部をコードする、パラグラフ［２４］に記載の方法。
［２６］前記第３の核酸分子と前記追加の核酸分子とをライゲーションすることをさらに含む、パラグラフ［２４］または［２５］に記載の方法。
［２７］各々が異なるＴＣＲ鎖またはその一部をコードする複数の核酸分子が同じ区画内で生成される、パラグラフ［１］～［２６］のいずれか１つに記載の方法。
［２８］前記複数の核酸分子のうちの少なくとも５つの異なる核酸分子が同じ区画内で生成される、パラグラフ［２７］に記載の方法。
［２９］前記複数の核酸分子のうちの少なくとも１０の異なる核酸分子が同じ区画内で生成される、パラグラフ［１］～［２６］のいずれか１つに記載の方法。
［３０］前記区画がウェル、管、または液滴である、パラグラフ［１］～［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３１］前記少なくとも１つの核酸分子が一意のバーコードを含む、パラグラフ［１］～［３０］のいずれか１つに記載の方法。
［３２］前記一意のバーコードがプライマー結合部位である、パラグラフ［３１］に記載の方法。
［３３］前記コネクター配列が一意のバーコードを含む、パラグラフ［１５］～［３０］のいずれか１つに記載の方法。
［３４］前記一意のバーコードがプライマー結合部位である、パラグラフ［３３］に記載の方法。
［３５］組成物であって、
（ａ）複数の核酸分子であって、前記複数の核酸分子の各核酸分子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、ＣＤＲ３配列を含まず、前記複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子が第１のアンチコネクター配列を含み、前記複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子が第２のアンチコネクター配列を含み、前記第１のアンチコネクター配列が前記第２のアンチコネクター配列と異なり、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する、前記複数の核酸分子と、
（ｂ）ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子であって、前記第１のアンチコネクター配列に相補的な第１のコネクター配列をさらに含む、前記少なくとも１つの核酸分子とを含む、前記組成物。
［３６］前記組成物が液体組成物である、パラグラフ［３５］に記載の組成物。
［３７］（ａ）の前記複数の核酸分子及び（ｂ）の前記少なくとも１つの核酸分子が同じ区画内にある、パラグラフ［３５］または［３６］に記載の組成物。
［３８］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、前記ＴＣＲＶ遺伝子のうちの少なくとも１０のヌクレオチドを含む、パラグラフ［３５］～［３７］のいずれか１つに記載の組成物。
［３９］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子がＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＧＶ遺伝子、またはＴＲＤＶ遺伝子である、パラグラフ［３５］～［３８］のいずれか１つに記載の組成物。
［４０］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［３５］～［３９］のいずれか１つに記載の組成物。
［４１］前記少なくとも１つの核酸分子が前記ＴＣＲ鎖のＪ領域をさらに含む、パラグラフ［３５］～［４０］のいずれか１つに記載の組成物。
［４２］前記少なくとも３５つの核酸分子が、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列をさらに含む、パラグラフ［３５］～［４１］のいずれか１つに記載の組成物。
［４３］前記少なくとも１つの核酸分子が、前記追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域をさらに含む、パラグラフ［４２］に記載の組成物。
［４４］前記ＣＤＲ３をコードする前記配列及び前記追加のＣＤＲ３をコードする前記追加の配列が、最大１００ヌクレオチド離れている、パラグラフ［４２］または［４３］に記載の組成物。
［４５］前記ＴＣＲ鎖及び前記追加のＴＣＲ鎖がＴＣＲ鎖の同族対である、パラグラフ［４２］～［４４］のいずれか１つに記載の組成物。
［４６］（ｂ）の前記少なくとも１つの核酸分子が第１の複数の核酸分子を含み、前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［３５］～［４５］のいずれか１つに記載の組成物。
［４７］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、異なるＴＣＲ鎖の異なるＣＤＲ３をコードする、パラグラフ［４６］に記載の組成物。
［４８］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が異なるコネクター配列を含み、前記異なるコネクター配列が、任意の１つの所与のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む前記複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に特異的に結合可能である、パラグラフ［４６］または［４７］に記載の組成物。
［４９］前記第１のアンチコネクター配列または前記第２のアンチコネクター配列がＴＣＲ Ｖ遺伝子配列を含む、パラグラフ［３５］～［４８］のいずれか１つに記載の組成物。
［５０］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子配列が、再配置された遺伝子内のＣＤＲ３をコードする配列に隣接する前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子の少なくとも３つのヌクレオチドを含む、パラグラフ［４９］に記載の組成物。
［５１］前記第１のアンチコネクター配列または前記第２のアンチコネクター配列が所定の配列を含む、パラグラフ［３５］～［５０］のいずれか１つに記載の組成物。
［５２］前記第１のコネクター配列が前記第１のアンチコネクター配列とハイブリダイズする、パラグラフ［３５］～［５１］のいずれか１つに記載の組成物。
［５３］（ｂ）の前記少なくとも１つの核酸分子が一意のバーコードを含む、パラグラフ［３５］～［５２］のいずれか１つに記載の組成物。
［５４］前記一意のバーコードがプライマー結合部位である、パラグラフ［５３］に記載の組成物。
［５５］前記少なくとも１つの核酸分子の前記第１のコネクター配列が一意のバーコードを含む、パラグラフ［３５］～［５２］のいずれか１つに記載の組成物。
［５６］前記一意のバーコードがプライマー結合部位である、パラグラフ［５５］に記載の組成物。
［５７］複数の核酸分子を生成するための方法であって、（ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、前記準備することと、（ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、前記第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、前記１つの核酸分子が定常ドメインをコードする配列を含まない、前記準備することと、（ｃ）前記第１の複数の核酸分子及び前記第２の複数の核酸分子を接触させることであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子と結合して、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列と、前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列とを含む、核酸分子を形成し、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列ならびに前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の前記同族対に由来する、前記接触させることとを含む、前記方法。
［５８］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１のＴＣＲ鎖の異なる第１のＣＤＲ３及び／または第２のＴＣＲ鎖の異なるＣＤＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［５７］に記載の方法。
［５９］前記第２の複数の核酸分子の各核酸分子が、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、パラグラフ［５７］または［５８］に記載の方法。
［６０］前記第１の複数の核酸分子及び前記第２の複数の核酸分子が同じ区画内で接触される、パラグラフ［５７］～［５９］のいずれか１つに記載の方法。
［６１］前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子がコネクター配列をさらに含み、前記コネクター配列が、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子と、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とを結合する、パラグラフ［５７］～［６０］のいずれか１つに記載の方法。
［６２］前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子がアンチコネクター配列をさらに含み、前記アンチコネクター配列が前記コネクター配列に相補的である、パラグラフ［６１］に記載の方法。
［６３］前記コネクター配列が前記アンチコネクター配列とハイブリダイズして、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子と前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とを結合する、パラグラフ［６２］に記載の方法。
［６４］前記コネクター配列がコドン多様化され、その結果、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子の前記コネクター配列が、前記第１の複数の核酸分子の他の核酸分子の他のコネクター配列と異なる、パラグラフ［５８］～［６３］のいずれか１つに記載の方法。
［６５］前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が、前記第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域及び／または前記第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域をさらに含む、パラグラフ［５７］～［６４］のいずれか１つに記載の方法。
［６６］（ｉ）前記第１のＴＣＲ鎖がＴＣＲアルファ鎖であり、前記第２のＴＣＲ鎖がＴＣＲベータ鎖である、または（ｉｉ）前記第１のＴＣＲ鎖がＴＣＲガンマ鎖であり、前記第２のＴＣＲ鎖がＴＣＲデルタ鎖である、パラグラフ［５７］～［６５］のいずれか１つに記載の方法。
［６７］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子がＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＧＶ遺伝子、またはＴＲＤＶ遺伝子である、パラグラフ［５７］～［６６］のいずれか１つに記載の方法。
［６８］前記第２の複数の核酸分子の前記１つの核酸分子が二重鎖核酸分子である、パラグラフ［５７］～［６７］のいずれか１つに記載の方法。
［６９］前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が、自己切断ペプチドの一部をコードする配列をさらに含む、パラグラフ［５７］～［６８］のいずれか１つに記載の方法。
［７０］前記アンチコネクター配列が、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子のオーバーハングである、パラグラフ［６２］～［６９］のいずれか１つに記載の方法。
［７１］前記コネクター配列または前記アンチコネクター配列の長さが少なくとも３ヌクレオチドである、パラグラフ［６２］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７２］（ｉ）前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とハイブリダイズした前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子の３’末端を伸長すること、及び／または（ｉｉ）前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とハイブリダイズした前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子の３’末端を伸長することをさらに含む、パラグラフ［６３］～［７１］のいずれか１つに記載の方法。
［７３］前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子を、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とライゲーションすることをさらに含む、パラグラフ［５７］～［７２］のいずれか１つに記載の方法。
［７４］前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列と前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列とを含む前記核酸分子を、制限酵素に接触させて粘着末端を生成することをさらに含む、パラグラフ［５７］～［７３］のいずれか１つに記載の方法。
［７５］前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列と前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列とを含む前記核酸分子を、定常領域またはその一部をコードする配列を含む追加の核酸分子に接触させることを含む、パラグラフ［５７］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［７６］前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列と前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列とを含む前記核酸分子を、前記粘着末端を介し前記追加の核酸分子とライゲーションすることをさらに含む、パラグラフ［７４］または［７５］に記載の方法。
［７７］前記第１のＣＤＲ３をコードする前記配列及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記第２の配列が、最大１００ヌクレオチド離れている、パラグラフ［５７］～［７６］のいずれか１つに記載の方法。
［７８］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［５７］～［７７］のいずれか１つに記載の方法。
［７９］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［５７］～［７７］のいずれか１つに記載の方法。
［８０］組成物であって、（ａ）第１の複数の核酸分子であって、前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３がＴＣＲ鎖の同族対に由来する、前記第１の複数の核酸分子と、（ｂ）第２の複数の核酸分子であって、前記第２の複数の核酸分子の各核酸分子が、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、前記第２の複数の核酸分子の各核酸分子が、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする配列を含まない、前記第２の複数の核酸分子とを含み、
（ｉ）前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、異なる第１のＣＤＲ３及び／または第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、及び／または（ｉｉ）前記第２の複数の核酸分子の各核酸分子が、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、前記組成物。
［８１］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子がコネクター配列をさらに含み、所与のコネクター配列が、前記第１の複数の核酸分子の所与の核酸分子と前記第２の複数の核酸分子の所与の核酸分子とを結合するために使用可能である、パラグラフ［８０］に記載の組成物。
［８２］前記第２の複数の核酸分子の各核酸分子がアンチコネクター配列をさらに含み、前記アンチコネクター配列が前記コネクター配列に相補的である、パラグラフ［８０］または［８１］に記載の組成物。
［８３］前記コネクター配列がコドン多様化され、その結果、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子の前記所与のコネクター配列が、前記第１の複数の核酸分子の他の核酸分子の他のコネクター配列と異なる、パラグラフ［８１］または［８２］に記載の組成物。
［８４］前記コネクター配列がアミノ酸配列をコードする、パラグラフ［８１］～［８３］のいずれか１つに記載の組成物。
［８５］前記コネクター配列が、前記第１のＴＣＲ鎖の前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＴＣＲ鎖の前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列にインフレームである、パラグラフ［８４］に記載の組成物。
［８６］前記コネクター配列が少なくとも３つのヌクレオチドを含む、パラグラフ［８１］～［８５］のいずれか１つに記載の組成物。
［８７］前記コネクター配列が、再配置された遺伝子内の前記第１のＴＣＲ鎖の前記第１のＣＤＲ３または前記第２のＴＣＲ鎖の前記第２のＣＤＲ３をコードする配列に隣接するＴＣＲ Ｖ遺伝子の少なくとも３つのヌクレオチドを含む、パラグラフ［８６］に記載の組成物。
［８８］前記所与のコネクター配列によってコードされた所与のアミノ酸配列が、少なくとも１つの他のコネクター配列によってコードされた少なくとも１つの他のアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じである、パラグラフ［８４］～［８７］のいずれか１つの記載の組成物。
［８９］前記所定のコネクター配列によってコードされる所定のアミノ酸配列が、他のコネクター配列によってコードされる他のアミノ酸配列と異なる、パラグラフ［８４］～［８７］のいずれか１つに記載の組成物。
［９０］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、前記第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域及び／または前記第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域をさらに含む、パラグラフ［８０］～［８９］のいずれか１つに記載の組成物。
［９１］前記組成物が液体組成物である、パラグラフ［８０］～［９０］のいずれか１つに記載の組成物。
［９２］前記第１の複数の核酸分子及び前記第２の複数の核酸分子が同じ区画内にある、パラグラフ［８０］～［９１］のいずれか１つに記載の組成物。
［９３］前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子が、前記所与のコネクター配列を介し、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子に結合する、パラグラフ［８１］～［９２］のいずれか１つに記載の組成物。
［９４］前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子が、所与のアンチコネクター配列とハイブリダイズした前記所与のコネクター配列を介し、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子とハイブリダイズする、パラグラフ［９３］に記載の組成物。
［９５］前記第１のＣＤＲ３をコードする前記配列及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列が、最大１００ヌクレオチド離れている、パラグラフ［８０］～［９４］のいずれか１つに記載の組成物。
［９６］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［８０］～［９５］のいずれか１つに記載の組成物。
［９７］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［８０］～［９５］のいずれか１つに記載の組成物。
［９８］前記第１の複数の核酸分子または前記第２の複数の分子の各核酸分子が化学的に合成されている、パラグラフ［８０］～［９７］のいずれか１つに記載の組成物。
［９９］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が最大約２５０ヌクレオチド長である、パラグラフ［８０］～［９８］のいずれか１つに記載の組成物。
［１００］複数の核酸分子を含む組成物であって、前記複数の核酸分子の各核酸分子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、前記複数の核酸分子が、第１のコネクター配列を有する第１の核酸分子と、第２のコネクター配列を有する第２の核酸分子とを含み、前記第１のコネクター配列が前記第２のコネクター配列と異なる、前記組成物。
［１０１］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、パラグラフ［１００］に記載の組成物。
［１０２］前記複数の核酸分子の各核酸分子が異なるコネクター配列を含む、パラグラフ［１００］または［１０１］に記載の組成物。
［１０３］前記複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含まない、パラグラフ［１００］～［１０２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１０４］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、ＴＣＲ鎖の定常ドメインをコードする配列を含まない、パラグラフ［１００］～［１０３］のいずれか１つに記載の組成物。
［１０５］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子のうちの少なくとも１０のヌクレオチドを含む、パラグラフ［１００］～［１０４］のいずれか１つに記載の組成物。
［１０６］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子がＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＧＶ遺伝子、またはＴＲＤＶ遺伝子である、パラグラフ［１００］～［１０５］のいずれか１つに記載の組成物。
［１０７］複数の核酸分子を含む組成物であって、複数の核酸分子の各核酸分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖のＣＤＲ３をコードし、複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子が第１のコネクター配列を含み、複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子が第２のコネクター配列を含み、前記第１のコネクター配列が前記第２のコネクター配列と異なる、組成物。
［１０８］前記複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ鎖のＪ領域をさらに含む、パラグラフ［１０７］に記載の組成物。
［１０９］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、第１のＴＣＲ鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする、パラグラフ［１０７］に記載の組成物。
［１１０］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域と、第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域とをさらに含む、パラグラフ［１０９］に記載の組成物。
［１１１］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、異なるＴＣＲ鎖の異なるＣＤＲ３をコードする、パラグラフ［１０７］～［１１０］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１２］前記複数の核酸分子の各核酸分子が異なるコネクター配列を含む、パラグラフ［１０７］～［１１１］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１３］前記複数の核酸分子の各核酸分子が２００ヌクレオチドより大きいＴＣＲ Ｖ遺伝子を含まない、パラグラフ［１０７］～［１１２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１４］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、ＴＣＲ鎖の定常ドメインをコードする配列を含まない、パラグラフ［１０７］～［１１３］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１５］前記第１のコネクター配列または前記第２のコネクター配列がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、パラグラフ［１００］～［１１４］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１６］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、再配置された遺伝子内のＣＤＲ３をコードする配列に隣接する前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子の少なくとも３つのヌクレオチドを含む、パラグラフ［１１５］に記載の組成物。
［１１７］前記第１のコネクター配列または前記第２のコネクター配列が所定の配列を含む、パラグラフ［１００］～［１１６］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１８］前記第１のコネクター配列または前記第２のコネクター配列がＴＣＲ Ｖ遺伝子配列に相補的な配列を含む、パラグラフ［１０７］～［１１４］のいずれか１つに記載の組成物。
［１１９］前記組成物が第２の複数の核酸分子をさらに含み、前記第２の複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、パラグラフ［１０７］～［１１４］及び［１１８］のいずれか１つに記載の組成物。
［１２０］前記第２の複数の核酸分子の前記第１の核酸分子が第１のアンチコネクター配列を含み、前記第１のアンチコネクター配列が前記第１のコネクター配列に相補的である、パラグラフ［１１９］に記載の組成物。
［１２１］前記第２の複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子が第２のアンチコネクター配列を含み、前記第２のアンチコネクター配列が前記第２のコネクター配列に相補的である、パラグラフ［１１９］または［１２０］に記載の組成物。
［１２２］前記第２の複数の核酸分子のうちの前記第１の核酸分子の前記第１のアンチコネクター配列が、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記第１の核酸分子の前記第１のコネクター配列に結合する、パラグラフ［１２０］または［１２１］に記載の組成物。
［１２３］前記第２の複数の核酸分子のうちの前記第２の核酸分子の前記第２のアンチコネクター配列が、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記第２の核酸分子の前記第２のコネクター配列に結合する、パラグラフ［１２１］または［１２２］に記載の組成物。
［１２４］各々がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の少なくとも１０個のアミノ酸をコードする配列を含む複数の核酸分子を含む組成物であって、前記複数の核酸分子の第１の核酸分子が第１のコネクター配列を含み、前記複数の核酸分子の第２の核酸分子が第２のコネクター配列を含み、前記第１のコネクター配列が前記第２のコネクター配列と異なり、前記第１のコネクター配列または前記第２のコネクター配列がＴＣＲ鎖の一部をコードし、前記第１のコネクター配列または前記第２のコネクター配列がＴＣＲ鎖の少なくとも１０個のアミノ酸をコードする前記配列にインフレームである、前記組成物。
［１２５］前記第１のコネクター配列または前記第２のコネクター配列が、ＴＣＲ鎖遺伝子の少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、ＴＣＲ鎖の少なくとも１０個のアミノ酸をコードする前記配列にインフレームである、パラグラフ［１２４］に記載の組成物。
［１２６］前記第１のコネクター配列及び前記第２のコネクター配列が、ＴＣＲ鎖の少なくとも２つの連続したアミノ酸をコードする、パラグラフ［１２４］または［１２５］に記載の組成物。
［１２７］前記ＴＣＲ鎖の前記一部の前記ＴＣＲ鎖及び少なくとも１０のアミノ酸をコードする前記配列によってコードされる前記ＴＣＲ鎖が同じである、パラグラフ［１２４］～［１２６］のいずれか１つに記載の組成物。
［１２８］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、パラグラフ［１２４］に記載の方法。
［１２９］前記複数の核酸分子の各核酸分子が前記ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする、パラグラフ［１２４］～［１２８］のいずれか１つに記載の組成物。
［１３０］前記複数の核酸分子の各核酸分子が前記ＴＣＲ鎖のＪ領域をさらに含む、パラグラフ［１２９］に記載の組成物。
［１３１］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、第１のＴＣＲ鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする、パラグラフ［１２９］に記載の組成物。
［１３２］前記複数の核酸分子の各核酸分子が、第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域と、第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域とをさらに含む、パラグラフ［１３１］に記載の組成物。
［１３３］前記第１のＣＤＲ３をコードする配列及び前記第２のＣＤＲ３をコードする配列が、最大１００ヌクレオチド離れている、パラグラフ［１３１］または［１３２］に記載の組成物。
［１３４］前記第１のコネクター配列または前記第２のコネクター配列がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、パラグラフ［１２４］～［１３３］のいずれか１つに記載の組成物。
［１３５］前記第１のコネクター配列または前記第２のコネクター配列が所定の配列を含む、パラグラフ［１２４］～［１３４］のいずれか１つに記載の組成物。
［１３６］前記第１のコネクター配列が、前記第２のコネクター配列のヌクレオチドと異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含む、パラグラフ［１００］～［１３５］のいずれか１つに記載の組成物。
［１３７］前記第１のコネクター配列が、第２のコネクター配列と同じアミノ酸配列をコードする、パラグラフ［１００］～［１３６］のいずれか１つに記載の組成物。
［１３８］前記第１のコネクター配列が前記第２のコネクター配列と異なるアミノ酸配列をコードする、パラグラフ［１００］～［１３６］のいずれか１つに記載の組成物。
［１３９］各核酸分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその領域をコードする、複数の核酸分子を生成するための方法であって、第１の複数の核酸分子と第２の複数の核酸分子とを接触させて、少なくとも２つの異なる核酸分子を含む、第３の複数の核酸分子を生成することを含み、前記少なくとも２つの異なる核酸分子の各々が、異なるＴＣＲ鎖またはその領域をコードする異なる配列を有し、前記少なくとも２つの異なる核酸分子が同じ区画内で生成される、前記方法。
［１４０］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が前記ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［１３９］に記載の方法。
［１４１］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が前記ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む、パラグラフ［１４０］に記載の方法。
［１４２］前記第２の複数の核酸分子の各核酸分子が、ＴＣＲ鎖のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、パラグラフ［１３９］～［１４１］のいずれか１つに記載の方法。
［１４３］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子がヒトＴＣＲ Ｖ遺伝子である、パラグラフ［１４２］に記載の方法。
［１４４］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ヒトＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８－１、ＴＲＡＶ８－２、ＴＲＡＶ８－３、ＴＲＡＶ８－４、ＴＲＡＶ８－６、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２－１、ＴＲＡＶ１２－２、ＴＲＡＶ１２－３、ＴＲＡＶ１３－１、ＴＲＡＶ１３－２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６－１、ＴＲＡＶ２６－２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８－１、ＴＲＡＶ３８－２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、またはＴＲＡＶ４１である、パラグラフ［１４２］または［１４３］に記載の方法。
［１４５］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３－１、ＴＲＢＶ４－１、ＴＲＢＶ４－２、ＴＲＢＶ４－３、ＴＲＢＶ５－１、ＴＲＢＶ５－４、ＴＲＢＶ５－５、ＴＲＢＶ５－６、ＴＲＢＶ５－８、ＴＲＢＶ６－１、ＴＲＢＶ６－２、ＴＲＢＶ６－３、ＴＲＢＶ６－４、ＴＲＢＶ６－５、ＴＲＢＶ６－６、ＴＲＢＶ６－８、ＴＲＢＶ６－９、ＴＲＢＶ７－２、ＴＲＢＶ７－３、ＴＲＢＶ７－４、ＴＲＢＶ７－６、ＴＲＢＶ７－７、ＴＲＢＶ７－８、ＴＲＢＶ７－９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０－１、ＴＲＢＶ１０－２、ＴＲＢＶ１０－３、ＴＲＢＶ１１－１、ＴＲＢＶ１１－２、ＴＲＢＶ１１－３、ＴＲＢＶ１２－３、ＴＲＢＶ１２－４、ＴＲＢＶ１２－５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０－１、ＴＲＢＶ２４－１、ＴＲＢＶ２５－１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９－１、またはＴＲＢＶ３０である、パラグラフ［１４２］または［１４３］に記載の方法。
［１４６］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［１３９］～［１４５］のいずれか１つに記載の方法。
［１４７］前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む、パラグラフ［１３９］～［１４５］のいずれか１つに記載の方法。
［１４８］前記ＴＣＲ鎖がＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、またはＴＣＲデルタ鎖である、パラグラフ［１３９］～［１４７］のいずれか１つに記載の方法。
［１４９］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列をさらに含む、パラグラフ［１４０］～［１４８］のいずれか１つに記載の方法。
［１５０］前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が前記追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域を含む、パラグラフ［１４９］に記載の方法。
［１５１］前記ＴＣＲ鎖及び前記追加のＴＣＲ鎖がＴＣＲ鎖の同族対である、パラグラフ［１４９］または［１５０］に記載の方法。
［１５２］前記複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、異なるＴＣＲまたはその領域をコードする、パラグラフ［１３９］～［１５１］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５３］前記第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子がコネクター配列を含み、前記コネクター配列が、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子を前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子に結合するために使用可能である、パラグラフ［１３９］～［１５２］のいずれか１つに記載の方法。
［１５４］前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子及び前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子が、機能的ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする、パラグラフ［１５３］に記載の方法。
［１５５］前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子がアンチコネクター配列を含み、前記アンチコネクター配列が、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子の前記コネクター配列と相補的である、パラグラフ［１５３］または［１５４］に記載の方法。
［１５６］前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子と、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子とを結合することをさらに含む、パラグラフ［１５３］～［１５５］のいずれか１つに記載の方法。
［１５７］結合することが、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子と、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子とをハイブリダイズすることを含む、パラグラフ［１５６］に記載の方法。
［１５８］ハイブリダイズすることが、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子の前記コネクター配列を、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子の前記アンチコネクター配列とハイブリダイズすることを含む、パラグラフ［１５７］に記載の方法。
［１５９］（ｉ）前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子を鋳型として用いて、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子の遊離３’末端を伸長して、及び／または（ｉｉ）前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子を鋳型として用いて、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子の遊離３’末端を伸長して、前記第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を生成することをさらに含む、［１５６］～［１５８］のいずれか１つに記載の方法。
［１６０］前記第１の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子と、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記所与の核酸分子とをライゲーションすることをさらに含む、パラグラフ［１３９］～［１５９］のいずれか１つに記載の方法。
［１６１］前記第３の複数の核酸分子のうちの前記核酸分子を制限酵素に接触させて粘着末端を生成することをさらに含む、パラグラフ［１３９］～［１６０］のいずれか１つに記載の方法。
［１６２］前記第３の核酸分子のうちの前記核酸分子を追加の核酸分子に接触させることをさらに含む、パラグラフ［１３９］～［１６１］のいずれか１つに記載の方法。
［１６３］前記追加の核酸分子がＴＣＲ鎖の定常領域またはその一部をコードする、パラグラフ［１６２］に記載の方法。
［１６４］前記第３の複数の核酸分子のうちの前記核酸分子と前記追加の核酸分子とをライゲーションすることをさらに含む、パラグラフ［１６２］または［１６３］に記載の方法。
［１６５］前記第３の複数の核酸分子のうちの少なくとも５つの異なる核酸分子が同じ区画内で生成される、パラグラフ［１３９］～［１６４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６６］前記第３の複数の核酸分子のうちの少なくとも１０の異なる核酸分子が同じ区画内で生成される、パラグラフ［１３９］～［１６５］のいずれか１つに記載の方法。
［１６７］前記区画がウェル、管、または液滴である、パラグラフ［１３９］～［１６６］のいずれか１つに記載の方法。
［１６８］複数の核酸分子を生成するための方法であって、（ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、前記準備することと、（ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、前記第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、前記準備することと、（ｃ）前記第１の複数の核酸分子及び前記第２の複数の核酸分子を接触させることであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子と結合して、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列と、前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列とを含む、直鎖状の核酸分子を形成し、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列ならびに前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の前記同族対に由来する、前記接触させることとを含む、前記方法。
［１６９］複数の核酸分子を生成するための方法であって、（ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、（ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする合成配列と、（ｉｉ）第３のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第３のＣＤＲ３及び第４のＴＣＲ鎖の第４のＣＤＲ３をコードする合成配列とを含み、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の第１の同族対に由来し、前記第３のＣＤＲ３及び前記第４のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の第２の同族対に由来する、前記準備することと、（ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、前記第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、前記準備することと、（ｃ）前記第１の複数の核酸分子及び前記第２の複数の核酸分子を接触させることであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子と結合して、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列と、前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列とを含む、核酸分子を形成し、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列ならびに前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の前記同族対に由来する、前記接触させることとを含む、前記方法。
［１７０］対象からの組織試料中のネイティブ対合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の配列を同定する方法であって、（ａ）前記対象から得られた複数の末梢Ｔ細胞を含む試料中の１つ以上のネイティブ対合ＴＣＲの１つ以上の対合配列を同定することであって、前記１つ以上の対合配列の各々がＣＤＲ３配列を含む、前記同定することと、（ｂ）ネイティブ対合他方のＴＣＲ鎖が未知である、前記組織試料中のＴＣＲのＴＣＲ鎖の組織ＣＤＲ３配列を同定することであって、前記組織ＣＤＲ３配列が、前記１つ以上のネイティブ対合ＴＣＲのうちの前記１つ以上の対合配列の少なくとも１つの対合配列のＣＤＲ３配列に適合して、それにより、前記少なくとも１つの対合配列を、前記組織試料中の前記ネイティブ対合ＴＣＲの配列として同定する、前記同定することとを含む、前記方法。
［１７１］（ａ）における同定することが、複数の末梢Ｔ細胞を含む試料中の１つ以上のネイティブ対合ＴＣＲをシークエンシングすることを含む、パラグラフ［１７０］に記載の方法。
［１７２］前記シークエンシングがシングルセルシークエンシングを含む、パラグラフ［１７１］に記載の方法。
［１７３］前記シングルセルシークエンシングが、前記複数の末梢Ｔ細胞を、各区画が複数の末梢Ｔ細胞の個々の末梢Ｔ細胞を含む、複数の区画に分割することを含む、パラグラフ［１７２］に記載の方法。
［１７４］前記組織試料が体液試料ではない、パラグラフ［１７０］～［１７３］のいずれか１つに記載の方法。
［１７５］前記組織試料が固形腫瘍試料である、パラグラフ［１７０］～［１７４］のいずれか１つに記載の方法。
［１７６］前記組織試料が固定または凍結試料である、パラグラフ［１７０］～［１７５］のいずれか１つに記載の方法。
［１７７］前記複数の末梢Ｔ細胞を含む前記試料が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料である、パラグラフ［１７０］～［１７６］のいずれか１つに記載の方法。
［１７８］（ａ）の前に、前記対象から血液試料を得ることをさらに含む、パラグラフ［１７０］～［１７７］のいずれか１つに記載の方法。
［１７９］（ａ）の前に、前記血液試料から末梢血単核細胞を分離することをさらに含む、パラグラフ［１７８］に記載の方法。
［１８０］前記組織試料が腫瘍浸潤Ｔ細胞を含む、パラグラフ［１７０］～［１７９］のいずれか１つに記載の方法。
［１８１］標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法であって、（ａ）パラグラフ［１７０］～［１８０］のいずれか１つに記載の方法を用いて同定されたＴＣＲを含む細胞を準備することと、（ｂ）前記細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示された標的抗原に接触させることであって、前記細胞が前記ＴＣＲを介し前記ＡＰＣによって提示された前記標的抗原に結合し、それにより、前記ＴＣＲを前記標的反応性ＴＣＲとして同定する、前記接触させることとを含む、前記方法。
［１８２］前記標的抗原が腫瘍抗原である、パラグラフ［１８１］に記載の方法。
［１８３］前記標的反応性ＴＣＲをコードする配列を宿主細胞内に送達することをさらに含む、パラグラフ［１８１］または［１８２］に記載の方法。
［１８４］対象に宿主細胞を投与することをさらに含む、パラグラフ［１８３］に記載の方法。
［１８５］前記宿主細胞がＴ細胞である、パラグラフ［１８３］またはパラグラフ［１８４］に記載の方法。
［１８６］前記Ｔ細胞が自己由来Ｔ細胞である、パラグラフ［１８５］に記載の方法。
［１８７］前記Ｔ細胞が同種異系Ｔ細胞である、パラグラフ［１８５］に記載の方法。
［１８８］前記細胞がレポーター細胞株であり、前記レポーター細胞株が、前記細胞が前記ＡＰＣによって提示された前記標的抗原に結合した際に発現するレポーター遺伝子を含む、パラグラフ［１８１］～［１８７］のいずれか１つに記載の方法。

Claims (58)

  1. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその一部をコードする核酸分子を生成するための方法であって、
    （ａ）ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子を準備することと、
    （ｂ）複数の核酸分子を準備することであって、前記複数の核酸分子の各々がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、前記複数の核酸分子が少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する少なくとも２つの異なる配列を含む、前記準備することと、
    （ｃ）（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子を、同じ区画内の（ｂ）の前記複数の核酸分子に接触させることとを含み、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子が、前記複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に結合して、ＣＤＲ３をコードする配列と前記少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子のうちの１つに由来する配列とを含む、第３の核酸分子を生成することが可能であり、それにより、前記ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする前記核酸分子を生成する、前記方法。
  2. 前記少なくとも１つの核酸分子が第１の複数の核酸分子を含み、前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む、請求項１に記載の方法。
  3. （ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子が、前記少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子の任意の１つの所与のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む前記複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に特異的に結合可能である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記少なくとも１つの核酸分子が前記ＴＣＲ鎖のＪ領域をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ鎖のＪ領域をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子がヒトＴＣＲ Ｖ遺伝子またはマウスＴＣＲ Ｖ遺伝子である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ヒトＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８－１、ＴＲＡＶ８－２、ＴＲＡＶ８－３、ＴＲＡＶ８－４、ＴＲＡＶ８－６、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２－１、ＴＲＡＶ１２－２、ＴＲＡＶ１２－３、ＴＲＡＶ１３－１、ＴＲＡＶ１３－２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６－１、ＴＲＡＶ２６－２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８－１、ＴＲＡＶ３８－２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、及びＴＲＡＶ４１からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３－１、ＴＲＢＶ４－１、ＴＲＢＶ４－２、ＴＲＢＶ４－３、ＴＲＢＶ５－１、ＴＲＢＶ５－４、ＴＲＢＶ５－５、ＴＲＢＶ５－６、ＴＲＢＶ５－８、ＴＲＢＶ６－１、ＴＲＢＶ６－２、ＴＲＢＶ６－３、ＴＲＢＶ６－４、ＴＲＢＶ６－５、ＴＲＢＶ６－６、ＴＲＢＶ６－８、ＴＲＢＶ６－９、ＴＲＢＶ７－２、ＴＲＢＶ７－３、ＴＲＢＶ７－４、ＴＲＢＶ７－６、ＴＲＢＶ７－７、ＴＲＢＶ７－８、ＴＲＢＶ７－９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０－１、ＴＲＢＶ１０－２、ＴＲＢＶ１０－３、ＴＲＢＶ１１－１、ＴＲＢＶ１１－２、ＴＲＢＶ１１－３、ＴＲＢＶ１２－３、ＴＲＢＶ１２－４、ＴＲＢＶ１２－５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０－１、ＴＲＢＶ２４－１、ＴＲＢＶ２５－１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９－１、及びＴＲＢＶ３０からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記複数の配列の各配列が、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３をコードする配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＴＣＲ鎖がＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、またはＴＣＲデルタ鎖である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つの核酸分子が、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つの核酸分子が前記追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＣＤＲ３をコードする前記配列及び前記追加のＣＤＲ３をコードする前記追加の配列が、最大１００ヌクレオチド離れている、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記ＴＣＲ鎖及び前記追加のＴＣＲ鎖がＴＣＲ鎖の同族対である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つの核酸分子がコネクター配列を含み、前記コネクター配列が、前記少なくとも１つの核酸分子を前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子に結合して前記第３の核酸分子を生成可能である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの核酸分子及び前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が、機能的ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子の前記コネクター配列に相補的なアンチコネクター配列を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. （ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とを結合することをさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 結合することが、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とをハイブリダイズすることを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. ハイブリダイズすることが、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子のコネクター配列を（ｂ）の前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子のアンチコネクター配列とハイブリダイズすることを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. （ｉ）（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子を鋳型として用いて、前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子の遊離３’末端を伸長して、及び／または（ｉｉ）前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子を鋳型として用いて、（ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子の遊離３’末端を伸長して、第３の核酸分子を生成することをさらに含む、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. （ａ）の前記少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の前記複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子とをライゲーションすることをさらに含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記第３の核酸分子を制限酵素に接触させて粘着末端を生成することをさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記第３の核酸分子を追加の核酸分子に接触させることをさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記追加の核酸分子がＴＣＲ鎖の定常領域またはその一部をコードする、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記第３の核酸分子と前記追加の核酸分子とをライゲーションすることをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 各々が異なるＴＣＲ鎖またはその一部をコードする複数の核酸分子が同じ区画内で生成される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記複数の核酸分子のうちの少なくとも５つの異なる核酸分子が同じ区画内で生成される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記複数の核酸分子のうちの少なくとも１０の異なる核酸分子が同じ区画内で生成される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記区画がウェル、管、または液滴である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記少なくとも１つの核酸分子が一意のバーコードを含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記一意のバーコードがプライマー結合部位である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記コネクター配列が一意のバーコードを含む、請求項１５～３０のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記一意のバーコードがプライマー結合部位である、請求項３３に記載の方法。
  35. 組成物であって、
    （ａ）複数の核酸分子であって、前記複数の核酸分子の各核酸分子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、ＣＤＲ３配列を含まず、前記複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子が第１のアンチコネクター配列を含み、前記複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子が第２のアンチコネクター配列を含み、前記第１のアンチコネクター配列が前記第２のアンチコネクター配列と異なり、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する、前記複数の核酸分子と、
    （ｂ）ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子であって、前記第１のアンチコネクター配列に相補的な第１のコネクター配列をさらに含む、前記少なくとも１つの核酸分子とを含む、前記組成物。
  36. 前記組成物が液体組成物である、請求項３５に記載の組成物。
  37. （ａ）の前記複数の核酸分子及び（ｂ）の前記少なくとも１つの核酸分子が同じ区画内にある、請求項３５または３６に記載の組成物。
  38. 前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、前記ＴＣＲＶ遺伝子のうちの少なくとも１０のヌクレオチドを含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の組成物。
  39. 前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子がＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＧＶ遺伝子、またはＴＲＤＶ遺伝子である、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の組成物。
  40. 前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列が、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３をコードする配列を含む、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の組成物。
  41. 前記少なくとも１つの核酸分子が前記ＴＣＲ鎖のＪ領域をさらに含む、請求項３５～４０のいずれか１項に記載の組成物。
  42. 前記少なくとも１つの核酸分子が、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列をさらに含む、請求項３５～４１のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 前記少なくとも１つの核酸分子が、前記追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域をさらに含む、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記ＣＤＲ３をコードする前記配列及び前記追加のＣＤＲ３をコードする前記追加の配列が、最大１００ヌクレオチド離れている、請求項４２または４３に記載の組成物。
  45. 前記ＴＣＲ鎖及び前記追加のＴＣＲ鎖がＴＣＲ鎖の同族対である、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の組成物。
  46. （ｂ）の前記少なくとも１つの核酸分子が第１の複数の核酸分子を含み、前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子がＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の組成物。
  47. 前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が、異なるＴＣＲ鎖の異なるＣＤＲ３をコードする、請求項４６に記載の組成物。
  48. 前記第１の複数の核酸分子の各核酸分子が異なるコネクター配列を含み、前記異なるコネクター配列が、任意の１つの所与のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む前記複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に特異的に結合可能である、請求項４６または４７に記載の組成物。
  49. 前記第１のアンチコネクター配列または前記第２のアンチコネクター配列がＴＣＲ Ｖ遺伝子配列を含む、請求項３５～４８のいずれか１項に記載の組成物。
  50. 前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子配列が、再配置された遺伝子内のＣＤＲ３をコードする配列に隣接する前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子の少なくとも３つのヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記第１のアンチコネクター配列または前記第２のアンチコネクター配列が所定の配列を含む、請求項３５～５０のいずれか１項に記載の組成物。
  52. 前記第１のコネクター配列が前記第１のアンチコネクター配列とハイブリダイズする、請求項３５～５１のいずれか１項に記載の組成物。
  53. （ｂ）の前記少なくとも１つの核酸分子が一意のバーコードを含む、請求項３５～５２のいずれか１項に記載の組成物。
  54. 前記一意のバーコードがプライマー結合部位である、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記少なくとも１つの核酸分子の前記第１のコネクター配列が一意のバーコードを含む、請求項３５～５２のいずれか１項に記載の組成物。
  56. 前記一意のバーコードがプライマー結合部位である、請求項５５に記載の組成物。
  57. 複数の核酸分子を生成するための方法であって、
    （ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３がＴＣＲ鎖の同族対に由来する、前記準備することと、
    （ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、前記第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、前記準備することと、
    （ｃ）前記第１の複数の核酸分子及び前記第２の複数の核酸分子を接触させることであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子と結合して、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列と、前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列とを含む、直鎖状の核酸分子を形成し、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列ならびに前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子がＴＣＲ鎖の前記同族対に由来する、前記接触させることとを含む、前記方法。
  58. 複数の核酸分子を生成するための方法であって、
    （ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、（ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする合成配列と、（ｉｉ）第３のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第３のＣＤＲ３及び第４のＴＣＲ鎖の第４のＣＤＲ３をコードする合成配列とを含み、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３がＴＣＲ鎖の第１の同族対に由来し、前記第３のＣＤＲ３及び前記第４のＣＤＲ３がＴＣＲ鎖の第２の同族対に由来する、前記準備することと、
    （ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、前記第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、前記準備することと、
    （ｃ）前記第１の複数の核酸分子及び前記第２の複数の核酸分子を接触させることであって、前記第１の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子が、前記第２の複数の核酸分子のうちの前記１つの核酸分子と結合して、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列と、前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する前記配列とを含む、核酸分子を形成し、前記第１のＣＤＲ３及び前記第２のＣＤＲ３をコードする前記配列ならびに前記ＴＣＲ Ｖ遺伝子がＴＣＲ鎖の前記同族対に由来する、前記接触させることとを含む、前記方法。
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