CN117940465A - 经修饰的细胞、其制备方法及应用 - Google Patents

经修饰的细胞、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种修饰的细胞、制备所述经修饰的细胞的方法，及其在疾病治疗中的用途。经修饰的细胞包含编码呈递肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸处于内源B2M基因的转录调控下。

Description

经修饰的细胞、其制备方法及应用 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种修饰的细胞，制备所述经修饰的细胞的方法，以及它们的应用，所述经修饰的细胞具有降低的异体免疫排斥反应。
背景技术
细胞疗法在多种肿瘤(例如，复发难治的淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤等)等重大疾病中有很好的疗效，成为了近年来的研发热点。现有细胞疗法中的免疫细胞通常取自病人自体细胞，修饰后再回输入同一病人，存在生产周期长、制备成本高的问题，且很多情况下病人细胞状态不好，导致难以制备成功。
为了解决细胞异体移植的排异问题，一方面，去除供体免疫细胞TCR复合体的表达，以防止供体免疫细胞识别杀伤宿主细胞；另一方面去除供体免疫细胞的I类MHC分子的表达，可以消除供体细胞抗原呈递，逃离宿主免疫细胞的识别和杀伤。但I类MHC分子的缺失会引发受体NK细胞介导的杀伤。因此亟需能够同时抵抗T细胞和NK细胞排异，且制备工艺流程简单，适合于产业化应用的新型的经修饰的细胞。
发明内容
本申请提供了一种经修饰的细胞，以及制备该细胞的方法。本申请通过基因编辑技术，基于CRISPR/Cas系统，特别是通过任何已知的位点特异性方法，将编码限制性呈递肽的基因组序列插入、替换或修正到活细胞中，可实现特定MHC复合体的敲除/下调，同时过表达另一特定MHC复合体，进而制备出不引发移植物抗宿主反应(Graft-versus-Host Disease,GvHD)，且同时抵抗宿主抗移植物反应(HvGR)，特别是抵抗异体T细胞和NK细胞排斥的通用型T细胞。
一方面，本申请提供了一种经修饰的细胞，其包含编码呈递肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸处于内源B2M基因的转录调控下。
在某些实施方式中，所述多核苷酸处于内源B2M基因的基因座中。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞能够表达B2M蛋白。
在某些实施方式中，所述呈递肽能够与所述B2M蛋白共价结合。
在某些实施方式中，所述B2M蛋白的至少一部分由所述内源B2M基因编码。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞能够表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白基本上由 所述内源B2M基因编码。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的细胞相比，所述B2M蛋白在细胞表面的表达和/或活性基本上不下调。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的细胞相比，所述B2M蛋白在细胞表面的表达和/或活性下调不超过约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或更少。
在某些实施方式中，所述多核苷酸还包含编码所述B2M蛋白片段的核酸分子。
在某些实施方式中，所述多核苷酸不包含完整的B2M基因编码区。
在某些实施方式中，所述多核苷酸不包含编码MHC分子重链的核酸分子。
在某些实施方式中，所述多核苷酸与所述内源B2M基因处于同一个读码框中。
在某些实施方式中，所述多核苷酸与所述内源B2M基因的启动子可操作地连接。
在某些实施方式中，所述多核苷酸位于编码信号肽的核酸分子和编码B2M成熟蛋白的核酸分子之间。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的细胞相比，所述经修饰的细胞具有降低的异体排异反应。
在某些实施方式中，所述呈递肽能够与所述B2M蛋白和MHC分子重链形成复合物。
在某些实施方式中，所述复合物能够抑制免疫细胞激活。
在某些实施方式中，所述免疫细胞选自下组：天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述免疫细胞为天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和/或T淋巴细胞。
在某些实施方式中，所述抑制免疫细胞激活包括抑制免疫细胞参与免疫应答。
在某些实施方式中，所述抑制免疫细胞激活包括与所述免疫细胞的抑制性受体结合。
在某些实施方式中，所述免疫细胞的抑制性受体选自下组：NKG2A、NKG2B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3。
在某些实施方式中，所述MHC分子重链包括非经典I类MHC分子重链和/或MHC样分子重链。
在某些实施方式中，所述非经典I类MHC分子重链包括HLA-E重链、HLA-F重链和/或HLA-G重链。
在某些实施方式中，所述MHC样分子重链包括CD1重链、MR1重链、FcRn重链和/或UL18重链。
在某些实施方式中，所述MHC分子重链为HLA-E重链。
在某些实施方式中，所述呈递肽能够结合至所述MHC分子重链的肽结合沟(peptide binding groove)中。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自病毒、原核生物、真核生物或哺乳动物。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自人类。
在某些实施方式中，所述呈递肽包括非经典I类MHC限制性呈递肽和/或MHC样分子限制性呈递肽。
在某些实施方式中，所述呈递肽为非经典I类MHC限制性呈递肽。
在某些实施方式中，所述呈递肽为HLA-E限制性呈递肽。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自选自下组的蛋白：ATP结合盒转运蛋白、多药耐药相关蛋白7、麦醇溶蛋白(gliadin)、HSP60保守区和GroEL保守区。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自I类MHC分子的信号肽或其片段。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自选自下组蛋白的信号肽：HLA-Al、HLA-A2、HLA-A*02、HLA-A*0203、HLA-A*0210、HLA-A3、HLA-A*23、HLA-A*24、HLA-A*2403、HLA-A*2410、HLA-A*2502、HLA-A*2501、HLA-A*26、HLA-A*66(01,02)、HLA-A9、HLA-A*6603、HLA-A10、HLA-A*11、HLA-A19、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*32、HLA-A*33、HLA-A*74、HLA-A*7403、HLA-A28、HLA-A36、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A*3401、HLA-A*80、HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-B22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-B41、HLA-B42、HLA-B46、HLA-B47、HLA-B48、HLA-B49、HLA-B50、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B53、HLA-B54、HLA-B55、HLA-B56、HLA-B57、HLA-B58、HLA-B59、HLA-B60、HLA-B61、HLA-B62、HLA-B63、HLA-B64、HLA-B65、HLA-B67、HLA-B70、HLA-B71、HLA-B73、HLA-B75、HLA-B76、HLA-B77、HLA-B78、HLA-B81、HLA-B82、HLA-B83、HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7、HLA-Cw8、HLA-Cw9、HLA-Cw10、HLA-Cw*0809、HLA-Cw7、HLA-Cw*1701、HLA-G和HLA-F。
在某些实施方式中，所述呈递肽具有5-30个氨基酸长度。
在某些实施方式中，所述呈递肽具有7-20个氨基酸长度。
在某些实施方式中，所述呈递肽具有8-10个氨基酸长度。
在某些实施方式中，所述呈递肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述呈递肽包含SEQ ID NO:18-70中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述呈递肽包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述多核苷酸还包含编码连接子的核酸分子。
在某些实施方式中，在所述经修饰的细胞的表达产物中，所述呈递肽与所述B2M蛋白之间通过所述连接子连接。
在某些实施方式中，所述连接子包括刚性连接子和/或柔性连接子。
在某些实施方式中，所述连接子包含如下所示的氨基酸序列：(EAAAK) n，其中n为3、4或5。
在某些实施方式中，所述连接子包含如下所示的氨基酸序列：(GGGGS) n，其中n为3、4或5。
在某些实施方式中，所述连接子包含如SEQ ID NO:71-99中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述连接子包含如SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述连接子位于所述呈递肽的C端。
在某些实施方式中，所述多核苷酸不包含编码B2M蛋白或其片段的核酸分子。
在某些实施方式中，所述多核苷酸编码如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞用于细胞移植、组织移植和/或器官移植。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞包括哺乳动物细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞包括干细胞和/或体细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞包括血液细胞、肌肉细胞、神经细胞和/或免疫细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞包括选自下组的免疫细胞：天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞为天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和/或T淋巴细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞细胞表面的经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达为阳性。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞细胞表面经典I类MHC分子的表达下调，且非经 典I类MHC分子的表达基本不下调。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞细胞表面经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达上调。
在某些实施方式中，所述的经修饰的细胞的T细胞受体α恒定区蛋白(TRAC)的表达和/或活性被下调。例如，与未经所述修饰的细胞相比，所述经修饰的细胞的T细胞受体α恒定区蛋白(TRAC)的表达和/或活性被下调至少20％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞还包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)、T细胞抗原偶联剂(TAC)、抗体TCR受体(AbTCR)、嵌合CD3ε受体和/或至少一种合成受体。
另一方面，本申请提供了一种制备经修饰的细胞的方法，所述方法包括：将编码呈递肽的多核苷酸插入细胞，使得所述多核苷酸处于内源B2M基因的转录调控下。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞能够表达B2M蛋白。
在某些实施方式中，所述呈递肽能够与所述B2M蛋白共价结合。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞能够表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白的至少一部分由所述内源B2M基因编码
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞能够表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白基本上由所述内源B2M基因编码。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的细胞相比，所述插入基本上不下调所述B2M蛋白在所述经修饰的细胞的表面的表达和/或活性。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的细胞相比，所述插入使所述B2M蛋白在所述经修饰的细胞的表面的表达和/或活性下调不超过80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或更少。
在某些实施方式中，所述多核苷酸还包含编码所述B2M蛋白片段的核酸分子。
在某些实施方式中，所述多核苷酸不包含完整的B2M基因编码区。
在某些实施方式中，所述多核苷酸不包含编码MHC分子重链的核酸分子。
在某些实施方式中，所述插入包括将所述多核苷酸插入至所述内源B2M基因的基因座。
在某些实施方式中，所述插入包括将所述多核苷酸插入与所述内源B2M基因的读码框中。
在某些实施方式中，所述插入使得所述多核苷酸与所述内源B2M基因的启动子可操作地 连接。
在某些实施方式中，所述插入包括将所述多核苷酸插入至编码信号肽的核酸分子和编码B2M成熟蛋白的核酸分子之间。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的细胞相比，所述经修饰的细胞具有降低的异体排异反应。
在某些实施方式中，所述呈递肽能够与所述B2M蛋白和MHC分子重链形成复合物。
在某些实施方式中，所述复合物能够抑制免疫细胞激活。
在某些实施方式中，所述免疫细胞选自下组：天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述免疫细胞为天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和/或T淋巴细胞。
在某些实施方式中，所述抑制免疫细胞激活包括抑制免疫细胞参与免疫应答。
在某些实施方式中，所述抑制免疫细胞激活包括与所述免疫细胞的抑制性受体结合。
在某些实施方式中，所述免疫细胞的抑制性受体选自下组：NKG2A、NKG2B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3。
在某些实施方式中，所述MHC分子重链包括非经典I类MHC分子重链和/或MHC样分子重链。
在某些实施方式中，所述非经典I类MHC分子重链包括HLA-E重链、HLA-F重链和/或HLA-G重链。
在某些实施方式中，所述MHC样分子重链包括CD1重链、MR1重链、FcRn重链和/或UL18重链。
在某些实施方式中，所述MHC分子重链为HLA-E重链。
在某些实施方式中，所述呈递肽能够结合至所述MHC分子重链的肽结合沟(peptide binding groove)中。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自病毒、原核生物、真核生物或哺乳动物。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自人类。
在某些实施方式中，所述呈递肽包括非经典I类MHC限制性呈递肽和/或MHC样分子限制性呈递肽。
在某些实施方式中，所述呈递肽为非经典I类MHC限制性呈递肽。
在某些实施方式中，所述呈递肽为HLA-E限制性呈递肽。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自选自下组的蛋白：ATP结合盒转运蛋白、多药耐药相关蛋白7、麦醇溶蛋白(gliadin)、HSP60保守区和GroEL保守区。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自I类MHC分子的信号肽或其片段。
在某些实施方式中，所述呈递肽源自选自下组蛋白的信号肽：HLA-Al、HLA-A2、HLA-A*02、HLA-A*0203、HLA-A*0210、HLA-A3、HLA-A*23、HLA-A*24、HLA-A*2403、HLA-A*2410、HLA-A*2502、HLA-A*2501、HLA-A*26、HLA-A*66(01,02)、HLA-A9、HLA-A*6603、HLA-A10、HLA-A*11、HLA-A19、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*32、HLA-A*33、HLA-A*74、HLA-A*7403、HLA-A28、HLA-A36、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A*3401、HLA-A*80、HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-B22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-B41、HLA-B42、HLA-B46、HLA-B47、HLA-B48、HLA-B49、HLA-B50、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B53、HLA-B54、HLA-B55、HLA-B56、HLA-B57、HLA-B58、HLA-B59、HLA-B60、HLA-B61、HLA-B62、HLA-B63、HLA-B64、HLA-B65、HLA-B67、HLA-B70、HLA-B71、HLA-B73、HLA-B75、HLA-B76、HLA-B77、HLA-B78、HLA-B81、HLA-B82、HLA-B83、HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7、HLA-Cw8、HLA-Cw9、HLA-Cw10、HLA-Cw*0809、HLA-Cw7、HLA-Cw*1701、HLA-G和HLA-F。例如，上述蛋白表示HLA的多种分型，HLA分型可通过细胞学(例如，流式细胞术)、血清学、基因组学(例如，一代测序、二代测序、基因芯片)进行分型。
在某些实施方式中，所述呈递肽具有5-30个氨基酸长度。
在某些实施方式中，所述呈递肽具有7-20个氨基酸长度。
在某些实施方式中，所述呈递肽具有8-10个氨基酸长度。
在某些实施方式中，所述呈递肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述呈递肽包含SEQ ID NO:18-70中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述呈递肽包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述多核苷酸还包含编码连接子的核酸分子。
在某些实施方式中，在所述经修饰的细胞的表达产物中，所述呈递肽与所述B2M蛋白之间通过所述连接子连接。
在某些实施方式中，所述连接子包括刚性连接子和/或柔性连接子。
在某些实施方式中，所述连接子包含如下所示的氨基酸序列：(EAAAK)n，其中n为3、4或5。
在某些实施方式中，所述连接子包含如下所示的氨基酸序列：(GGGGS)n，其中n为3、4或5。
在某些实施方式中，所述连接子包含如SEQ ID NO:71-99中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述连接子包含如SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述连接子位于所述呈递肽的C端。
在某些实施方式中，所述多核苷酸不包含编码B2M蛋白或其片段的核酸分子。
在某些实施方式中，所述多核苷酸编码如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述插入通过导入包含所述多核苷酸的载体进行。
在某些实施方式中，所述插入包括将包含所述多核苷酸的载体与所述细胞接触。
在某些实施方式中，所述包含所述多核苷酸的载体不包含完整的B2M基因编码区。
在某些实施方式中，所述包含所述多核苷酸的载体不包含编码MHC分子重链的核酸分子。
在某些实施方式中，所述包含所述多核苷酸的载体还包括同源臂。
在某些实施方式中，所述包含所述多核苷酸的载体包括上游同源臂、所述编码呈递肽的多核苷酸和下游同源臂。
在某些实施方式中，所述包含所述多核苷酸的载体包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述方法还包括向所述细胞引入特异性靶向所述内源B2M基因的基因座的至少一种序列特异性试剂。
在某些实施方式中，所述序列特异性试剂包括核酸酶。
在某些实施方式中，所述序列特异性试剂包括RNA和/或DNA引导的核酸内切酶。
在某些实施方式中，所述核酸内切酶包括Cas蛋白。
在某些实施方式中，所述Cas蛋白包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，所述序列特异性试剂还包括指导RNA(gRNA)。
在某些实施方式中，所述gRNA为单链指导RNA。
在某些实施方式中，所述gRNA包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述gRNA包含5’-(X)n-SEQ ID NO:13-骨架序列-3’，其中X为 选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。
在某些实施方式中，所述gRNA包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞源自哺乳动物细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞源自干细胞和/或体细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞源自血液细胞、肌肉细胞、神经细胞和/或免疫细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞源自选自下组的免疫细胞：天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞为天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和/或T淋巴细胞。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达为阳性。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达基本不下调。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达上调。
在某些实施方式中，所述方法还包括下调T细胞受体α恒定区蛋白(TRAC)、T细胞受体β恒定区蛋白(TRBC)、CD3ε、CD3γ、CD3δ和/或DC3ζ的表达和/或活性。
在某些实施方式中，所述方法还包括向所述细胞施用靶向编码所述TRAC的核酸分子的指导RNA。
在某些实施方式中，所述靶向编码所述TRAC的核酸分子的指导RNA包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述方法还包括使所述经修饰的细胞表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)、T细胞抗原偶联剂(TAC)、抗体TCR受体(AbTCR)、嵌合CD3ε受体和/或至少一种其他合成受体。
在某些实施方式中，所述方法还包括将编码嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)、T细胞抗原偶联剂(TAC)、抗体TCR受体(AbTCR)、嵌合CD3ε受体和/或至少一种合成受体的核酸分子导入所述经修饰的细胞。
另一方面，本申请提供了根据所述的方法制备得到的经修饰的细胞。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，所述核酸分子包含所述的方法中的多核苷酸。
另一方面，本申请提供了所述的方法中的指导RNA。
另一方面，本申请提供了核酸组合，所述核酸组合包含所述的分离的核酸分子，以及所述的方法中的指导RNA。
另一方面，本申请提供了载体，所述载体包含所述的分离的核酸分子和/或所述的核酸组合。
在某些实施方式中，所述载体为病毒载体。
在某些实施方式中，所述载体为慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
另一方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含所述的分离的核酸分子、所述的指导RNA、所述的核酸组合和/或所述的载体。
另一方面，本申请提供了细胞群，其包含至少30％的所述经修饰的细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述宿主细胞和/或所述细胞群，以及任选地药学上可接受的载剂(carrier)。
另一方面，本申请提供了所述的分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述细胞、所述细胞群和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于异体移植。
另一方面，本申请提供了异体移植的方法，其包括向受试者施用所述分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述细胞、所述细胞群和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请提供了增加异体移植相容性的方法，其包括使用所述方法。
另一方面，本申请提供了所述的分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述细胞、所述细胞群和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或缓解肿瘤。
另一方面，本申请提供了治疗或缓解肿瘤的方法，其包括向受试者施用所述分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述细胞、所述细胞群和/或所述药物组合物。
本发明的优势：
1.细胞制备方面，基于本发明CRISPR Knock in方式可以获得高达70-80％的敲入表达 效率，而现有技术通过CAR共表达的HLA-E复合体或是CM，均因载量大，限制转染效率在少20-50％之间。更高的递送效率，使得CAR-T细胞具备更高的效率。
2.抵抗免疫排斥方面，与现有技术不同，本发明并未敲除B2M，完全失活HLA-ABC/B2M复合物。当HLA-ABC/B2M缺失表达后，虽可以躲避CD8阳性CTL的杀伤，但对NK细胞非常敏感，导致NK细胞快速清除这些HLA-ABC/B2M阴性的细胞。本发明，保留了B2M功能，在高表达HLA-E的同时，弱表达HLA-ABC，处于较优的平衡点，可以同时抵抗CTL和NK的杀伤，从而体现出更长的存续和扩增能力。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是CRISPR/Cas9介导的HLA-E限制性呈递肽定向插入B2M基因座设计示意图。
图2显示的是流式细胞术检测原代T细胞定向插入表达HLA-E效率。
图3显示的是DNA测序检测基因组水平定向插入，其中，A：流式细胞术检测HLA-ABC-HLA-E+细胞亚群(箭头所示)，B：DNA测序指示定向插入序列。
图4显示的是流式细胞术分析NK92杀伤靶细胞，其中，A：流式细胞术分析流程，B：比较NK92杀伤前后HLA-E+细胞亚群比例变化。
图5显示的是基于定向插入表达HLA-E的细胞抵抗NK92杀伤的评价。
图6A显示的是基于AAV递送同源重组模板的细胞制备流程。
图6B显示的是基于AAV递送同源重组模板的细胞中HLA-ABC和HLA-E表达情况。
图7显示的是基于AAV递送同源重组模板的UCAR-T细胞制备流程，其中，A：慢病毒递送CAR，AAV递送同源重组模板，用于在B2M基因定点插入HLA-E限制性呈递肽的制备流程；B：AAV递送同源重组模板，用于在TRAC基因定点插入CAR和在B2M基因定点插入HLA-E限制性呈递肽的制备流程。
图8显示的是基于DNA递送同源重组模板的UCAR-T细胞制备流程，其中，A：慢病毒递送CAR，DNA递送同源重组模板，用于在B2M基因定点插入HLA-E限制性呈递肽的制备流程；B：DNA递送同源重组模板，用于在TRAC基因定点插入CAR和在B2M基因定点插入HLA-E限制性呈递肽的制备流程。
图9显示的是本申请实施例9中不同方法制备UCAR-T细胞中双基因编辑效率和CAR/HLA-E表达效率的比较。
图10显示的是本申请实施例9中不同方法制备UCAR-T细胞在异体PBMC共培养体系中CAR阳性细胞的扩增情况。
图11显示的是本申请实施例9中不同方法制备UCAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤活性的检测结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“修饰”通常是指分子或细胞的状态或结构被改变。分子可以以多种方式被修饰，包括化学、结构和功能修饰。细胞可以通过引入多核苷酸而被修饰。在本申请中，所述修饰可以是基因编辑，所述修饰使得细胞中蛋白质的表达和/或活性被改变。
在本申请中，术语“呈递肽”通常是指能够与主要组织相容性复合物(MHC)结合形成复合体的多肽。呈递肽能够稳定MHC复合体的稳定性和/或结构特异性。与MHC结合后，呈递肽可以被呈递至细胞表面。每个MHC分子都有自己匹配的呈递肽。对于不同的MHC分子来说，呈递肽可以是限制性的，即特定MHC分子的限制性呈递肽是指该呈递肽可以与该特定MHC分子形成稳定的复合物。例如，HLA-C限制性呈递肽可与细胞表面上的HLA-C形成稳定的复合物，而HLA-E限制性呈递肽可与细胞表面上的HLA-E形成稳定的复合物。可以通过选择与HLA稳定结合的呈递肽来鉴定特定HLA的限制性呈递肽。
在本申请中，术语“多核苷酸”通常是指脱氧核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。单链多核苷酸包括编码链和反义链。多核苷酸包括RNA和DNA，且可分离自天然来源、体外合成、或由天然和合成的分子组合制备。多核苷酸的示例包括但不限于基因、cDNA、mRNA、自复制RNA分子、自复制DNA分子、基因组DNA序列、基因组RNA序列、或寡核苷酸。多核苷酸可以为线性或非线性。
在本申请中，术语“内源”用于形容分子时，通常是指在细胞中天然存在的分子，或者由细胞中天然存在的分子经过细胞中天然存在的生理过程(例如，转录或翻译)得到的产物。在本申请中，“内源”分子可以是未经所述修饰时(即，经所述修饰之前)，细胞中存在的分子或其天然产物。对于核酸来说，“内源”可以指在基因座处天然存在，或以天然的含量存在的细胞基因组序列。
与“内源”相对的是“外源”，“外源”分子通常是指在细胞中非天然存在的分子。外源分子可以通过一种或多种基因、生物化学或其它方法引入到细胞中。外源分子可以是：(a)对于给定的细胞而言是外来的(即，对所述细胞而言为外源性的)；(b)天然存在于细胞中(即，“内源”)，但以不自然量存在于细胞中(即，比细胞中天然存在的量大或少)；或(c)天然存在于宿主细胞中但位于其天然基因座外。外源分子可以通过诸如组合化学方法产生的小分子、或大分子(诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经过修饰的衍生物)、或包含一种或多种上述分子的任何复合物。
外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，例如，蛋白或核酸(包括DNA和/或RNA)。例如，外源核酸可以包含感染性病毒基因组、引入到细胞中的质粒或游离基因、或通常不存在于细胞中的染色体。本领域技术人员已知用于引入外源分子到细胞中的方法且包括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性脂质和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、生物聚合物纳米粒子递送(参见Nitta与Numata(2013)Int J Mol Sci 14:1629)、磷酸钙共沉淀、DEAE-聚葡萄糖-介导的转移和病毒载体介导的转移。外源分子还可以是与内源分子相同类型但源自一来源不同的细胞的分子。
对于核酸来说，“外源”通常是指在所特定基因座处不天然存在的任何核苷酸或核酸序列，例如，通过本申请的方法插入的多核苷酸被称为“外源”多核苷酸。“外源”多核苷酸的插入可能对内源序列产生基因编辑作用。“外源”多核苷酸和“内源”多核苷酸的核酸序列可以部分或全部相同，或可能编码部分或全部相同的氨基酸序列。
在本申请中，术语“基因座”通常是指DNA序列(例如，基因)在基因组中的特定位置。基因座可以包含编码蛋白的信息的遗传元件和/或与基因的转录翻译有关的调控元件。
在本申请中，术语“内源B2M基因座”通常是指未经本申请所述修饰时，最初存在与细胞基因组中的B2M基因座。例如，内源B2M基因座可以对应于人类参考基因组GRCh38/hg38版本中，Chr15:44,711,487-44,718,851位置及其附近(可参见Ensembl数据库ENSG00000166710)，包含B2M的启动子，转录调控因子等位置，例如Fishilevich,S.et al.GeneHancer:genome-wide integration of enhancers and target genes in GeneCards.Database (Oxford).2017,10.1093/database/bax028(2017)数据库中展示的B2M启动子和增强子位置：如chr15:44705644-44717291(GRCh38/hg38)，chr15:44661600-44667653(GRCh38/hg38)，chr15:44723092-44732751(GRCh38/hg38)，chr15:45047617-45050241(GRCh38/hg38)，chr15:44783825-44785452(GRCh38/hg38)等。例如，内源B2M基因座也可以参考NCBI Gene ID:567下的描述，其位置可以对应于GRCh38.p13(GCF_000001405.39)，chromosome15，NC_000015.10(44711492..44718145)，及其附近。本领域人员应理解，使用不同划分方法或划分规则时，基因座位置可存在一个或多个碱基的差异。
在本申请中，术语“转录调控”通常是指调控元件可以诱导、阻抑或者调控与其可操纵的连接的蛋白质编码序列的转录。能够转录调控的调控元件可以包括起始序列，增强子，启动子，终止子，有效的RNA加工信号(例如剪接和多腺苷酸化信号)，稳定细胞质mRNA的序列，提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)，增加蛋白质稳定性的序列，以及需要时，增加蛋白质分泌的序列。
在本申请中，术语“处于内源B2M基因座的转录调控下”用于修饰某一多核苷酸时，通常是指该多核苷酸的转录由内源B2M基因座中的调控元件所调控。
在本申请中，术语“B2M”也可称为“β-2微球蛋白”，通常是指I类MHC分子的轻链。所述“B2M”包括任何脊椎动物来源的任何天然B2M，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人和食蟹猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。所述“B2M”涵盖“全长”、未加工的B2M以及由细胞加工所产生的任何形式的B2M。“B2M”包括完整的B2M1及其片段，还包括B2M的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物和类似物。B2M(也称为β链)可以与HLA编码的α链(或重链)组成MHC I类的分子。在人类基因组中，B2M蛋白一般由位于15号染色体上的b2m基因编码。人类的全长B2M蛋白通常有119个氨基酸，其中，第1至20位氨基酸为信号肽(见UniProt数据库编码P61769)。β2M的示例性功能片段包括例如缺少成熟β2M的6个N末端氨基酸的截短形式的ΔN6β2M(93个氨基酸)和缺乏10个N末端的ΔN10β2M(89个氨基酸)。β2M的示例性变体可包括，例如，UniProt上提供的以下同工型:条目F5H6I0(101个氨基酸)，H0YLF3(71个氨基酸)，B4E0X1(122个氨基酸)，A6XMH4(124个氨基酸)，A6XMH5(92个氨基酸)，A6XND9(101个氨基酸)，Q9UM88(29个氨基酸)，Q16446(51个氨基酸)和J3KNU0(57个氨基酸)。
在本申请中，术语“B2M成熟蛋白”通常是指不具有20个氨基酸的信号肽的B2M的一种或多种形式，该信号肽可以在B2M在细胞表面表达之前被切割。示例性的B2M成熟蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“B2M蛋白片段”通常是指全长B2M蛋白氨基酸序列的一部分。对于长度为119个氨基酸的全全长人类B2M蛋白来说，B2M蛋白片段包含118个氨基酸至1个氨基酸中的任意一个长度，但不包含所有的119个氨基酸。
在本申请中，术语“下调”通常是指经本申请所述修饰后的免疫细胞中，编码一种或多种蛋白质或其功能性片段的核酸分子(例如，RNA或DNA)的水平和/或活性、或一种或多种蛋白质或其功能性片段的水平和/或活性降低或消除，低于未经本申请所述修饰的免疫细胞中的水平。
在本申请中，术语“基本上不下调”通常是指，与参考细胞(例如，未经所述修饰的细胞)相比，实验细胞(例如，经修饰的细胞)的细胞表面的B2M蛋白的表达和/或活性的水平相当，或不产生显著下调。例如，“基本上不下调”可以指，与参考细胞(例如，未经所述修饰的细胞)相比，实验细胞(例如，经修饰的细胞)的细胞表面的B2M蛋白的表达和/或活性，下调的程度不超过约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或更少。
在本申请中，术语“共价结合”通常是指两个多肽之间，通过氨基酸共价键结合的方式。
在本申请中，术语“完整的B2M基因编码区”通常是指编码全部的B2M成熟蛋白的基因。例如，“完整的B2M基因编码区”编码99个氨基酸长度的B2M成熟蛋白。
在本申请中，术语“MHC分子重链”通常是指MHC I类分子中长度较长的那条链，也可称为α链。MHC分子重链可包括肽结合区、免疫球蛋白样区、跨膜区和胞内区。
在本申请中，术语“读码框”通常是指编码蛋白的无终止序列打断的核酸序列。读码框由起始密码子开始，到终止密码子结束。读码框也可称为阅读框(reading frame)。
在本申请中，术语“可操作地连接”通常是指将编码序列表达所必需的调控序列置于相对于编码序列的适当位置，以便实现编码序列的表达。例如，当第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且其中在相同的读码框中必须接合两个蛋白质编码区。
在本申请中，术语“异体排异反应”通常是指来自于一个个体的细胞、组织或器官被另一个个体的免疫系统识别，免疫系统对来自不同个体的细胞、组织或器官进行攻击、破坏和清除的免疫学反应。异体可以是同一物种的不同个体，也可以是不同物种的不同个体。
在本申请中，术语“MHC复合物”通常又称为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)，是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC也叫做HLA(human leukocyte antigen，HLA)复合体。由于MHC的多基因特性，依据其编码分子的结构、组织分布与功能差异，可分为MHC I类、MHC II类、MHC III类基因，分别编码MHC I类分子、MHC II类分子、MHC III类分子。MHC I类分子通常由四个区组成，其中三个区位于α链上(α1-α3)，β2微球蛋白(B2M)组成第四个区。
在本申请中，术语“免疫细胞激活”通常是指对于给定类型的免疫细胞，产生免疫应答的状态。例如，对于T细胞，T细胞激活的特征通常包括以下一种或多种变化：产生多种蛋白质(包括CD69、CD7、和CD25和HLA-DR)，释放穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素(脱粒)或者产生细胞因子(如IFN-γ、TNF和LT-α等)。例如，对于T细胞，T细胞激活的特征通常包括以下一种或多种变化：释放穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素(脱粒)，产生细胞因子(如IFN-γ、TNF、GM-CSF、IL-3、M-CSF等)。
在本申请中，术语“抑制性受体”通常是指在免疫细胞表面表达的受体分子，该受体分子在结合其配体后可以抑制免疫细胞激活。免疫系统采用多种抑制机制来控制免疫反应以确保免疫耐受和体内平衡，包括通过抑制受体介导的抑制途径。例如，NK细胞受自体I类MHC结合受体的调节，这些受体在结合自身I类MHC分子后抑制NK细胞激活。I类MHC结合抑制性受体不仅可以在NK细胞表达，而且可以在T细胞亚群表达，例如，CD8 +T细胞。在本申请中，所述抑制性受体通常是指I类MHC分子特异性的受体。这些抑制性受体可包括杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)家族和C型凝集素样家族。例如，所述抑制性受体可以包括NKG2A/KLRD1(CD159a/CD94)、KIR2DL1(CD158a)、KIR2DL2(CD158b)、KIR2DL3(CD158d)、KIR2DL5(CD158f)、KIR3DL1(CD158e1)、KIR3DL2(CD158k)、ILT2/LIR-1(CD85J)、LAG-3(CD223)和/或KIR2DL4(CD158d)。
在本申请中，术语“非经典I类MHC分子”通常包括HLA-E、HLA-F和HLA-G等。HLA-E分子有多种等位基因，可表达于各种组织细胞，在羊膜和滋养层细胞表面高表达。HLA-E分子是表达于NK细胞和部分CTL表面的C型凝集素受体超家族中CD94/NKG2家 族的专一性配体。HLA-G分子主要分布于母胎界面绒毛外滋养层细胞，相应的受体为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族成员，因而HLA-G可以在母胎耐受中发挥功能。与经典I类MHC分子一样，非经典I类MHC分子可以包括重链和轻链，非经典I类MHC分子重链，其中非经典I类MHC分子重链可以包括HLA-E重链、HLA-F重链和HLA-G重链。
在本申请中，术语“MHC样分子”通常是指与I类MHC分子具有类似的构象，而与不同类型的配体和细胞表面受体结合的分子。与I类MHC分子一样，MHC样分子可以包括重链和轻链，其中MHC样分子重链可以包括人类白细胞抗原(HLA-1)、新生儿Fc受体(FcRn)、遗传性血色病蛋白(HFE)、分化簇1(CD1)、γδT细胞受体配体(Τ22)、锌-α2-糖蛋白(ZAG)、MHC相关蛋白1(MR1)、UL18、UL16结合蛋白(ULBP)和MH
在本申请中，术语“免疫细胞”通常是指在功能上参与先天和/或适应性免疫应答的起始和/或执行的细胞。所述买内衣细胞可以是造血来源的。所述免疫细胞可以是树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞，或者选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞的T细胞。细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和来自肿瘤，如肿瘤浸润淋巴细胞。例如，所述免疫细胞可以来自健康供体，来自诊断患有癌症的患者或来自诊断患有感染的患者。
在本申请中，术语“连接子”通常是指接合或连接2个或更多个离散的分开的单体域的部。本申请的连接子可以是肽连接子，包括天然和/或合成来源的肽连接子。所述连接子可以由线性的氨基酸链组成，其中20个天然存在的氨基酸是单体构件。连接子可以具有1-50个氨基酸的长度，例如，可以在1至28个氨基酸之间，例如，可以在3和25个氨基酸之间。连接子可以包含重复的氨基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有绞合部功能的多肽。通过允许肽正确的折叠和适当的呈递，接头可以实施其生物学活性，所述接头具有使B2M蛋白与MHC分子重链连接的功能。例如，连接子可以被设计为富含甘氨酸、谷氨酸和/或丝氨酸残基。这些残基排列成例如多达5个氨基酸的小重复单元，如GGGGS(SEQ ID NO:71)、QQQQG(SEQ ID NO:72)或SSSSG(SEQ ID NO:73)。该小重复单元可以重复2-5次，形成多聚单元。在多聚单元的氨基-和/或羧基末端，可以添加多达6个额外的任意的、天然存在的氨基酸。其它的合成肽连接子包括单个氨基酸，其重复在10-20次之间，并可以在氨基-和/或羧基-末端包括多达6个额外的任意的、天然存在的氨基酸。例如，所述连接子可以包括但不限于SEQ ID NO:71-99中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“特异性靶向”通常是指识别某一核酸序列而不识别不是该核酸序列的序列，或者，识别某一核酸序列比识别不是该核酸序列的能力强。
在本申请中，术语“序列特异性试剂”通常是指具有特异性识别基因组基因座上的所选定的靶序列的能力的任何活性分子。例如，所述序列特异性试剂可以是序列特异性的核酸酶试剂。可以被序列特异性试剂识别的核酸序列称为“靶序列”。
在本申请中，术语“核酸酶试剂”通常是指通过本身或作为复合物的亚基(如指导RNA/Cas9)有助于靶细胞中的核酸酶催化反应(例如，核酸内切酶反应)的核酸分子。
在本申请中，术语“Cas蛋白”也称为“CRISPR相关蛋白”通常是指与CRISPR序列互补的一类酶，能够使用CRISPR序列作为指导(guide)，从而识别和切割特定的DNA链。Cas蛋白的非限制性实例包括：Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csxl2)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，和/或他们的同系物、或其修饰形式。在一些实施例中，该Cas蛋白是Cas9蛋白。
在本申请中，术语“Cas9蛋白”或“Cas9核酸酶”，也称为Csn1或Csx12，通常是指II型CRISPR/Cas系统中一类既参与crRNA生物合成又参与摧毁入侵DNA的蛋白质。Cas9蛋白通常包括RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域，分别切割双链DNA分子的两条不同的链。Cas9蛋白可以源自嗜热链球菌(S.thermophiles)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)和化脓性链球菌。例如，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白，其氨基酸序列参见SwissProt数据库登录号Q99ZW2；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号A1IQ68；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号Q03LF7；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号J7RUA5。
在本申请中，术语“指导RNA”通常是指CRISPR中包含的RNA组分，也可称为guide RNA(gRNA)。指导RNA一般包含指导序列和骨架序列，这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。指导RNA的作用可以为指导Cas9蛋白切割与指导序列互补的DNA位点，也即靶序列。一般而言，指导序列是与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交、并且指导CRISPR复合物与该靶序列特异性结合的任何多核苷酸序列。指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％或更多。一般一个指导序列的长度为约或多于约12个核苷酸。骨架序列为指导RNA中必须的，除指导序列之外的其余序列，一般包含tracr序列和 tracr配偶序列，这些序列一般不会因为靶序列的变化而改变。该术语包括单链指导RNA(sgRNA)以及由crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)组成的双链指导RNA。
在本申请中，术语“信号肽”通常是指存在于蛋白前体形式的N-端的肽。信号肽的功能可以是促进连接至内质网的表达多肽的易位。信号肽通常在蛋白表达至表面过程中被切除。信号肽对于用于产生多肽的生物体可以是异源的或同源的。B2M蛋白的信号肽的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:16所示。
在本申请中，术语“合成受体”通常是指细胞表面蛋白或蛋白复合物，其可包含(1)可以特异性结合靶分子的靶结合域，和(2)可以激活信号传导途径的功能域。在合成受体中，靶结合域可包含细胞外结构域，激活信号传导途径的功能域可包含细胞内结构域。合成受体还可包括跨膜序列。合成受体可以是蛋白质复合物，其包含从外源核酸表达的蛋白质。合成受体也可以是蛋白质复合物，其包含至少一种外源表达的蛋白质和至少一种内源表达的蛋白质。在某些实施方案中，合成受体可以选自：嵌合抗原受体(CAR)，T细胞受体(TCR)，嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)，T细胞抗原偶联剂(TAC)，抗体TCR受体(AbTCR)和嵌合CD3ε受体。在一些实施方案中，合成受体可以是CAR。在一些实施方案中，合成受体可以是TCR。在一些实施方案中，合成受体可以是CAAR。在一些实施方案中，合成受体可以是TRuC。在一些实施方案中，合成受体可以是TAC。在一些实施方案中，合成受体可以是AbTCR。在一些实施方案中，合成受体可以是嵌合CD3ε受体。
在本申请中，术语“分离的”通常是指大体上不含其天然存在的环境中通常伴随或与之相互作用的组分的生物材料(例如病毒、核酸或蛋白质)。所述分离的生物材料任选地包含在其天然环境(例如，细胞或野生型病毒)中所述生物材料未发现具有的另外的材料。例如，如果所述材料处于其天然环境(例如细胞)中，所述材料可能已经置于对在那种环境中发现的这种材料来说非天然的细胞中的一个部位(例如基因组或基因成分)。例如，如果通过非天然存在的方式将天然存在的核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)引入至对该核酸来说非天然的基因组(例如，载体(例如质粒或病毒载体)或扩增子)的基因座，那么所述天然存在的核酸被分离。此类核酸也被称为“异源”核酸。分离的病毒处于不同于野生型病毒的天然环境(例如，感染个体的鼻咽部)的环境中(例如细胞培养系统或从细胞培养物中纯化)。
在本申请中，所述“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将 插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“质粒”通常是指细菌、酵母菌等生物中染色体或拟核以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其能够在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在遗传工程研究中被用作基因的载体。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指以允许活性成分的生物学活性有效的形式的制剂，并且其不含有对所述制剂待施用的受试者有不可接受的毒性的另外成分。
在本申请中，术语“未经所述修饰的细胞”通常是指未插入本申请所述编码呈递肽的多核苷酸的细胞。未经所述修饰的细胞可以经过其他化学或生物修饰，例如一个或多个基因的上调或下调、表达其他非呈递肽的外源分子或糖基化修饰等。
在本申请中，术语“增加异体移植相容性”通常是指在异体移植中，增加受体免疫系统对异体移植物的接受程度，或者，减少受体免疫系统对异体移植物的攻击或消除的反应。
除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。
术语“功能性变体”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。
在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。
在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。
通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包 括使用非天然存在的类似物。
用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
在本申请中，术语“同源物”通常是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
一方面，本申请提供一种经修饰的细胞，所述细胞包含编码呈递肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸处于内源B2M基因的转录调控下。在本申请中，所述多核苷酸的表达可以由所述内源B2M基因转录调控。在本申请中，所述多核苷酸的表达可以由所述内源B2M基因座中的调控元件调控。在本申请中，所述多核苷酸的表达可以由所述内源B2M基因座中的启动子、增强子、终止子、polyA、信号肽和/或kozak序列调控。在本申请中，所述多核苷酸的表 达可以与所述内源B2M基因座中的启动子、增强子、终止子、polyA、信号肽和/或kozak序列可操作地连接。
在本申请中，所述多核苷酸和B2M基因的表达可以由同一个启动子调控，例如，由B2M基因的内源启动子调控。在本申请中，所述多核苷酸和B2M基因的表达可以由同一个增强子调控，例如，由B2M基因的内源增强子调控。在本申请中，所述多核苷酸和所述内源B2M基因的表达可以由同一个poly A调控，例如，由B2M基因的内源poly A调控。在本申请中，所述多核苷酸可和所述内源B2M基因的表达以由同一个终止子调控，例如，由B2M基因的内源终止子调控。在本申请中，所述多核苷酸处于所述内源B2M基因的基因座中，由B2M基因的内源启动子调控。在本申请中，所述多核苷酸与B2M基因的内源启动子可以可操作地连接。在本申请中，所述多核苷酸可以位于B2M基因的内源启动子下游。在本申请中，所述多核苷酸可以位于编码B2M基因的内源信号肽的核酸分子和编码B2M成熟蛋白的核酸分子之间。
B2M
在本申请中，基于多核苷酸插入位点和插入序列的特殊设计，所述经修饰的细胞可以表达B2M蛋白。在本申请中，所述经修饰的细胞可以在细胞表面表达B2M蛋白。在本申请中，所述经修饰的细胞可以在细胞表面表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白的至少一部分可以由内源B2M基因表达。在本申请中，所述经修饰的细胞可以在细胞表面表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白的至少一部分(例如，至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多)可以由内源B2M基因表达。在本申请中，所述经修饰的细胞可以在细胞表面表达B2M蛋白，且编码所述B2M蛋白的基因的至少一部分(例如，至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多)可以来自内源B2M基因。当细胞包含的多核苷酸包含编码B2M蛋白片段时，表达出来的完整B2M蛋白中的一部分由所述多核苷酸表达，其余一部分由内源B2M基因表达。这种情况下，可以是细胞的B2M基因的一部分缺失(可以采用已知的各种使得基因缺失的方法，例如基因编辑)，缺失的部分由外源多核苷酸的插入得以补齐。此时，外源多核苷酸被插入至B2M基因缺失处。此时，外源多核苷酸和未缺失的内源B2M共同表达完整的B2M蛋白。
在本申请中，所述经修饰的细胞可以在细胞表面表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白基本上可以由内源B2M基因表达。例如，所述B2M蛋白的全部可以由内源B2M基因表达。例 如，编码所述B2M蛋白的基因可以全部来自内源B2M基因。此时，插入的外源多核苷酸中不包含完整的B2M编码区。或者，插入的外源多核苷酸可以不包含编码全长B2M蛋白的核酸分子。
在本申请中，与未经所述修饰的细胞相比，所述B2M蛋白在细胞表面的表达和/或活性可以基本上不下调。在本申请中，与未经所述修饰的细胞相比，所述B2M蛋白在细胞表面的表达和/或活性可以下调不超过约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或更少。在本申请中，在细胞中插入所述多核苷酸基本上不影响所述B2M蛋白在细胞表面的表达。在本申请中，在细胞中插入所述多核苷酸使所述B2M蛋白在细胞表面的表达下调不超过约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或更少。
MHC分子重链
在本申请中，所述经修饰的细胞可以表达呈递肽，所述呈递肽可以与B2M蛋白共价连接形成融合蛋白，所述融合蛋白可以与细胞表面的MHC分子重链形成复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述MHC分子重链的肽结合沟中。
通过将不同类型的呈递肽插入细胞，可以获得具有不同的功能的经修饰的细胞。可以根据所需要的功能，选择MHC分子重链的类型，从而选择该MHC分子的限制性呈递肽。在本申请中，插入细胞的所述多核苷酸可以不包含编码MHC分子重链的核酸分子。例如，有些复合物可以抑制免疫细胞激活。在本申请中，所述复合物可以通过与免疫细胞表面的抑制性受体结合，从而抑制免疫细胞参与免疫应答。所述抑制免疫细胞参与免疫应答可以包括抑制免疫细胞分化、增殖或分泌细胞因子。
在本申请中，所述MHC分子重链可以是非经典I类MHC分子重链和/或MHC样分子重链。
在本申请中，呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合非经典I类MHC分子重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。所述非经典I类MHC分子重链可以选自HLA-E重链、HLA-F重链和HLA-G重链。
在本申请中，所述非经典I类MHC分子重链可以是HLA-E重链。在本申请中，呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合HLA-E重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述HLA-E重链的肽结合沟中。在本申请中，插入细胞的所述多核苷酸可以不包含编码HLA-E重链的核酸分子。人类HLA-E重链是多态的。例如，人HLA-E重链的一种等位基因形式的氨基酸序列可参见Uniprot登录号Q6DU50。
在本申请中，所述非经典I类MHC分子重链可以是HLA-F重链。在本申请中，呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合HLA-F重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述HLA-F重链的肽结合沟中。在本申请中，插入细胞的所述多核苷酸可以不包含编码HLA-F重链的核酸分子。人类HLA-F重链是多态的。例如，人HLA-F重链的一种等位基因形式的氨基酸序列可参见Uniprot登录号P30511。
在本申请中，所述非经典I类MHC分子重链可以是HLA-G重链。在本申请中，呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合HLA-G重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述HLA-G重链的肽结合沟中。在本申请中，插入细胞的所述多核苷酸可以不包含编码HLA-G重链的核酸分子。人类HLA-G重链是多态的。例如，人HLA-G重链的一种等位基因形式的氨基酸序列可参见Uniprot登录号P17693。
在本申请中，呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合MHC样分子重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。所述MHC样分子重链可以选自HLA-E重链、HLA-F重链和HLA-G重链可以选自CD1、MR1、FcRN和UL18。
在本申请中，所述MHC样分子重链可以是CD1重链。在本申请中，呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合CD1重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述CD1重链的肽结合沟中。在本申请中，插入细胞的所述多核苷酸可以不包含编码CD1重链的核酸分子。人类CD1重链可以包括CD1a重链、CD1b重链、CD1c重链、CD1d重链和CD1e重链。例如，人CD1a重链的氨基酸序列可参见NCBI登录号NP_001754.2。例如，人CD1b重链的氨基酸序列可参见NCBI登录号XP_011508421.1。例如，人CD1c重链的氨基酸序列可参见NCBI登录号XP_005245636.1。例如，人CD1d重链的氨基酸序列可参见NCBI登录号NP_001358692.1。例如，人CD1e重链的氨基酸序列可参见Uniprot登录号P15812。
在本申请中，所述MHC样分子重链可以是MR1重链。在本申请中，呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合MR1重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述MR1重链的肽结合沟中。在本申请中，插入细胞的所述多核苷酸可以不包含编码MR1重链的核酸分子。例如，人MR1重链的氨基酸序列可参见Uniprot登录号Q95460。
在本申请中，所述MHC样分子重链可以是FcRn重链。在本申请中，呈递肽可以和B2M 蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合FcRn重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述FcRn重链的肽结合沟中。在本申请中，插入细胞的所述多核苷酸可以不包含编码FcRn重链的核酸分子。例如，人FcRn重链的氨基酸序列可参见Uniprot登录号P55899。
在本申请中，所述MHC样分子重链可以是UL18重链。在本申请中，呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合UL18重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述UL18重链的肽结合沟中。在本申请中，插入细胞的所述多核苷酸可以不包含编码UL18重链的核酸分子。例如，人UL18重链的氨基酸序列可参见Uniprot登录号Q0QIE0。
抑制性受体
在本申请中，所述B2M和呈递肽的融合蛋白，以及MHC分子重链形成的复合物，可以与免疫细胞表面的抑制性受体结合。例如，所述抑制性受体可以是T细胞的抑制性受体，或是NK细胞的抑制性受体。例如，所述抑制性受体可以是选自下组中的一种或多种：NKG2A/KLRD1(CD159a/CD94)、NKG2B、KIR2DL1(CD158a)、KIR2DL2(CD158b)、KIR2DL3(CD158d)、KIR2DL5(CD158f)、KIR3DL1(CD158e1)、KIR3DL2(CD158k)、KIR3DL3、ILT2/LIR-1(CD85J)、LAG-3(CD223)和/或KIR2DL4(CD158d)。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体可以是NKG2A。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的NKG2A受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人NKG2A的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号P26715。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体可以是KIR受体。例如，所述KIR受体可以选自KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是KIR2DL1。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的KIR2DL1受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人KIR2DL1的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号A0A191URJ7。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是KIR2DL2。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的KIR2DL2受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人KIR2DL2的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号Q6H2H0。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是KIR2DL3。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的KIR2DL3受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人KIR2DL3的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号E3NZD8。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是KIR2DL4。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的KIR2DL4受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人KIR2DL4的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号Q99706。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是KIR2DL5。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的KIR2DL5受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人KIR2DL5的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号B0L653。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是KIR3DL1。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的KIR3DL1受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人KIR3DL1的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号P43629。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是KIR3DL2。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的KIR3DL2受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人KIR3DL2的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号P43630。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是KIR3DL3。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的KIR3DL3受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人KIR3DL3的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号Q8N743。
在本申请中，所述免疫细胞的抑制性受体是白细胞免疫球蛋白样受体1“LIR1”。所述呈递肽可以与B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以和MHC分子重链形成复合物，所述复合物可以结合免疫细胞的LIR1受体，从而抑制免疫细胞激活。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。例如，所述免疫细胞可以是NK细胞。人LIR1的氨基酸序列可以参见Uniprot登录号Q96500。
呈递肽
在本申请中，所述呈递肽可以和B2M蛋白形成融合蛋白，所述融合蛋白可以结合MHC分子重链，以形成结合免疫细胞的抑制性受体的复合物。在复合物中，呈递肽可以结合至所述MHC分子重链的肽结合沟中。
在本申请中，所述呈递肽可以源自病毒、原核生物、真核生物或哺乳动物。例如，所述呈递肽可以源自病毒。例如，所述呈递肽可以源自原核生物。例如，所述呈递肽可以源自真核生物。例如，所述呈递肽可以源自哺乳动物。例如，所述呈递肽可以源自人。所述呈递肽可以具有5-30、5-25、5-20、7-20、7-18、7-15、8-12或8-10个氨基酸。例如，所述呈递肽可以具有5-30个氨基酸。例如，所述呈递肽可以具有5-25个氨基酸。例如，所述呈递肽可以具有5-20个氨基酸。例如，所述呈递肽可以具有7-20个氨基酸。例如，所述呈递肽可以具有7-18个氨基酸。例如，所述呈递肽可以具有7-15个氨基酸。例如，所述呈递肽可以具有8-12个氨基酸。例如，所述呈递肽可以具有8-10个氨基酸。
在本申请中，所述呈递多肽可以衍生自病毒蛋白，例如CMV,EBV,HIV等。在一些实施方案中，呈递肽是CMV的片段。在一些实施方案中，呈递肽是EBV的片段。在一些实施方案中，呈递肽是HIV的片段。例如，所述呈递肽可以源自ATP结合盒转运蛋白。例如，所述呈递肽可以源自多药耐药相关蛋白7。例如，所述呈递肽可以源自麦醇溶蛋白(gliadin)。例如，所述呈递肽可以源自HSP60保守区。例如，所述呈递肽可以源自GroEL保守区。
在本申请中，所述呈递肽可以源自I类MHC分子或其片段的信号肽。在本申请中，所述呈递肽可以是I类MHC分子的信号肽的片段。所述I类MHC分子的信号肽可以具有13-80个氨基酸。所述I类MHC分子的信号肽可以具有20-50个氨基酸。
在本申请中，所述呈递肽可以是HLA-E的限制性呈递肽。在本申请中，所述呈递肽可以源自I类MHC分子或其片段的信号肽。在本申请中，所述呈递肽可以源自HLA-A分子或其片段的信号肽。在本申请中，所述呈递肽可以源自HLA-B分子或其片段的信号肽。在本申请中，所述呈递肽可以源自HLA-C分子或其片段的信号肽。在本申请中，所述呈递肽可以源自HLA-G分子或其片段的信号肽。在本申请中，所述呈递肽可以源自HLA-F分子或其片段的信号肽。在本申请中，所述呈递肽可以源自选自下组蛋白或其片段的信号肽：HLA-Al、HLA-A2、HLA-A*02、HLA-A*0203、HLA-A*0210、HLA-A3、HLA-A*23、HLA-A*24、HLA-A*2403、HLA-A*2410、HLA-A*2502、HLA-A*2501、HLA-A*26、HLA-A*66(01,02)、HLA-A9、HLA-A*6603、HLA-A10、HLA-A*11、HLA-A19、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*32、HLA-A*33、HLA-A*74、HLA-A*7403、HLA-A28、HLA-A36、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A*3401、HLA-A*80、HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA- B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-B22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-B41、HLA-B42、HLA-B46、HLA-B47、HLA-B48、HLA-B49、HLA-B50、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B53、HLA-B54、HLA-B55、HLA-B56、HLA-B57、HLA-B58、HLA-B59、HLA-B60、HLA-B61、HLA-B62、HLA-B63、HLA-B64、HLA-B65、HLA-B67、HLA-B70、HLA-B71、HLA-B73、HLA-B75、HLA-B76、HLA-B77、HLA-B78、HLA-B81、HLA-B82、HLA-B83、HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7、HLA-Cw8、HLA-Cw9、HLA-Cw10、HLA-Cw*0809、HLA-Cw7、HLA-Cw*1701、Cwx、HLA-G和HLA-F。
作为I类MHC分子的信号肽或其片段的呈递肽可以具有5-30个氨基酸。例如，所述呈递肽可以是I类MHC分子的信号肽或其片段，可具有5-25个氨基酸，5-20个氨基酸，7-18个氨基酸，7-15个氨基酸，8个氨基酸，12个氨基酸或8-10个氨基酸。例如，所述呈递肽可以是I类MHC分子的信号肽的片段或其片段，可具有8-10个氨基酸。
例如，所述呈递肽可以是I类MHC分子或其片段的信号肽，并具有以下氨基酸序列：X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8L，其中X 1是V或I；X 2是T，A，M或L；X 3是A，P，K或N；X 4是P，L或T；X 5是R，Q或K；X 6是T或A；X 7是L，I，V或P；X 8是V，L，I，F或T(SEQ ID NO:17)。
例如，所述呈递肽可以源自I类MHC分子的信号肽或其片段，并且氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:18-70中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述呈递肽可以包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
连接子
在本申请中，所述多核苷酸还可以包含编码连接子的核酸分子。所述呈递肽可以通过连接子与B2M蛋白共价连接。所述连接子可以连接所述呈递肽和B2M蛋白，并提供足够的柔韧性，使得所述呈递肽和所述B2M融合蛋白的融合蛋白可以与MHC分子重链形成稳定的复合物。例如，所述连接子可以位于所述呈递肽的C端。例如，在所述经修饰的细胞表面表达后，从N末端到C末端，所述呈递肽、连接子和B2M蛋白可以依次连接。例如，所述连接子可以位于所述呈递肽的N端。例如，在所述经修饰的细胞表面表达后，从N末端到C末端，所述B2M、连接子和呈递肽蛋白可以依次连接。
在本申请中，所述连接子可具有约5至50个氨基酸，并包含以下五个氨基酸中的至少一种：Gly，Ala，Pro，Val和Leu，以及八个氨基酸中的至少一个：Ser、Thr、Glu、Lys、Asn、 Gln、Asp和Arg。例如，所述连接子可以具有5至30个氨基酸。
在本申请中，所述连接子的氨基酸序列可以是(EAAAK) n，其中n＝1、2、3、4或5。在本申请中，所述连接子的氨基酸序列可以是(EAAAK) n，其中n＝3、4或5。在本申请中，所述连接子的氨基酸序列可以是(GGGGS) n，其中n＝1、2、3、4或5。在本申请中，所述连接子的氨基酸序列可以是(GGGGS) n，其中n＝3、4或5。
在本申请中，所述连接子的氨基酸序列是(G)nS，其中n＝1、2、3、4或5。在本申请中，所述连接子的氨基酸序列是((G) nS) m，其中n＝1、2、3、4或5，m＝1、2、3、4或5。m＝1、2、3、4或5。例如，所述连接子的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:71-99中任一项所示。
在本申请中，所述多核苷酸可以包含编码呈递肽的核酸分子。在本申请中，所述多核苷酸可以包含编码呈递肽的核酸分子和编码连接子的核酸分子。在本申请中，所述多核苷酸可以包含编码呈递肽的核酸分子、编码连接子的核酸分子和编码B2M蛋白片段的核酸分子。
例如，所述多核苷酸可以编码如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。例如，所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。例如，所述多核苷酸可以包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。例如，所述多核苷酸可以包含与SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的核苷酸序列。
细胞
另一方面，本申请提供了一种经修饰的免疫细胞。例如，所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达可以下调(例如，与未经所述修饰的免疫细胞相比，可以下调至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高)，且非经典I类MHC分子的表达可以为阳性。例如，所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达可以下调(例如，与未经所述修饰的免疫细胞相比，可以下调至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高)，且非经典I类MHC分子的表达可以基本不下调。例如，所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达可以下调(例如，与未经所述修饰的免疫细胞相比，可以下调至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高)，且非经典I类MHC分子的表达可以上调(例如，与未经所述修饰的免疫细胞相比，可以上调至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、 至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高)。
在本申请中，所述经修饰的免疫细胞可以包含表达和/或活性被下调的T细胞受体α恒定区蛋白(TRAC)、T细胞受体β恒定区蛋白(TRBC)、CD3ε、CD3γ、CD3δ和/或DC3ζ。
在本申请中，所述经修饰的细胞可以包含编码嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)、T细胞抗原偶联剂(TAC)、抗体TCR受体(AbTCR)、嵌合CD3ε受体和/或至少一种其他合成受体的核酸分子。
在本申请中，所述经修饰的细胞可以表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)、T细胞抗原偶联剂(TAC)、抗体TCR受体(AbTCR)、嵌合CD3ε受体和/或至少一种其他合成受体。
在本申请中，所述经修饰的细胞可以是免疫细胞。所述免疫细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括T淋巴细胞。所述T淋巴细胞可包括胸腺细胞、天然T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。所述T细胞可以是辅助T细胞(Th)，例如辅助T细胞1(Th1)或辅助T细胞2(Th2)细胞。所述T淋巴细胞可以是CD4+辅助T细胞(HTL；CD4 +T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8 +T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8 +T细胞)、CD4+/CD8 +T细胞、CD4-/CD8 -T细胞或任何其他T淋巴细胞亚型。在某些情形中，所述经修饰的细胞是人类T细胞。
在某些情形中，所述免疫细胞可包括B细胞。在某些情形中，所述B细胞可包括效应B细胞(浆细胞)、记忆B细胞。所述B细胞可包括B2细胞、B1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括巨噬细胞。所述B细胞可包括I型巨噬细胞(M1)、II型巨噬细胞(如M2a、M2B、M2c)。在某些情形中，所述免疫细胞可包括NK细胞。在某些情形中，所述NK细胞可包括CD56bright和CD56dim。在某些情形中，所述NK细胞可包括NK1和NK2。在某些情形中，所述NK细胞可包括A-NK和NA-NK。
本申请的经修饰的免疫细胞可以在任何修饰步骤之前或之后被活化和扩增。免疫细胞可以在体外或体内扩增。
在扩增和遗传修饰本申请的细胞之前，可以通过各种非限制性方法从受试者，例如患者，获得细胞来源。免疫细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些情形中，可以使用本领域技术人员可利用的和已知的任何数量的免疫细胞系。在另一些情形中， 所述细胞可以源自健康供体、源自确诊患有癌症的患者或获自确诊感染的患者。在另一些情形中，所述细胞是存在不同表型特性的细胞的混合群体的一部分。在某些情形中，所述免疫细胞可以是衍生自对象的自体细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可以衍生自异体细胞，例如源自与所述对象人类白细胞抗原(HLA)相容的供体。
制备方法
另一方面，本申请提供了制备经修饰的细胞的方法，所述方法包括将所述编码呈递肽的多核苷酸插入细胞，所述插入通过导入包含所述多核苷酸的载体进行。例如，所述插入可以包括将包含所述多核苷酸的载体与所述细胞接触。例如，所述包含所述多核苷酸的载体可以不包含完整的B2M基因编码区。例如，所述包含所述多核苷酸的载体可以不包含编码MHC分子重链的核酸分子。例如，所述包含所述多核苷酸的载体还可以包括同源臂。例如，所述包含所述多核苷酸的载体可以包括上游同源臂、所述编码呈递肽的多核苷酸和下游同源臂。
例如，所述包含所述多核苷酸的载体可以包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。例如，所述包含所述多核苷酸的载体可以包括与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的核苷酸序列。
可以使用基于CRISPR系统的基因编辑技术进行所述修饰。在本申请中，所述方法包括向所述免疫细胞施用CRISPR/Cas系统，所述系统可包括RNA组分，有时被称为指导RNA(gRNA)。
本申请所述的指导RNA可包括单链指导RNA(sgRNA)以及由crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)组成的双链指导RNA。在某些实施方式中，指导RNA是由一条crRNA和一条tracrRNA组成的双链结构。在某些实施方式中，指导RNA为单链分子，该单链分子可包含指导序列、tracr配偶序列和tracr序列。
在某些情形中，本申请所述的指导RNA可以与靶核酸(例如，所述内源B2M基因)互补。在另一些情形中，所述的指导RNA可以与靶核酸相同(当说到相同时，由于编码RNA和DNA的碱基的区别，RNA中的“U”对应于DNA中的胸腺嘧啶“T”)。在另一些情形中，编码所述指导RNA的核酸序列(例如，DNA)可以与靶核酸相同或互补。所述指导RNA可以由编码其的序列进行转录或复制得到，例如，所述指导RNA可通过编码其的DNA序列转录得到。在一些情形中，指导RNA与靶核酸(例如，所述内源B2M基因)之间的互补百分比可为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约 98％、至少约99％，或100％。在一些情形中，指导RNA与靶核酸例如，所述内源B2M基因)之间的互补百分比可以为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％，或100％。
本申请的方法包括提供靶向免疫细胞基因组(例如，所述内源B2M基因)的核酸，其可以将相关活性多肽(例如Cas蛋白)引导至靶核酸(例如，所述内源B2M基因)内的特定靶序列。靶向基因组的核酸可以是RNA。
在本申请中，靶向内源B2M基因的核酸分子的指导RNA可以包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。例如，靶向内源B2M基因的核酸分子的指导RNA可包含与SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
所述方法还可包括下调T细胞受体α恒定区蛋白(TRAC)、T细胞受体β恒定区蛋白(TRBC)、CD3ε、CD3γ、CD3δ和/或DC3ζ的表达和/或活性。例如，所述方法可以包括向所述细胞施用靶向编码所述TRAC的核酸分子的指导RNA。在本申请中，靶向TRAC基因的核酸分子的指导RNA可以包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。例如，靶向内源B2M基因的核酸分子的指导RNA可包含与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
在某些情形中，所述指导RNA可包含骨架序列，骨架序列不影响所述sgRNA对靶序列的识别，因此，骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。骨架序列一般包含tracr配偶序列和tracr序列。例如，所述骨架序列可包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本申请的指导RNA还可包含修饰(例如，化学修饰)，例如，核苷酸的缺失、插入、转位、失活和/或激活。所述修饰可包括引入一个或多个突变(包括单个或多个碱基对改变)、增加发夹的数目、交联、断开具体的核苷酸段以及其他修饰。
在某些实施方式中，本申请的所述方法可包括向宿主细胞(例如，免疫细胞)施用一种或多种所述Cas蛋白。
另一方面，本申请提供了一种CRISPR酶。在一些情形中，所述CRISPR酶可以是II型CRISPR系统酶。在某些情形中，所述CRISPR酶可以是Cas9蛋白。在某些实施例中，所述Cas9蛋白可以是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9蛋白，并且可包括源自于这些 生物体的突变的Cas9蛋白。所述Cas蛋白还可以是一种Cas9蛋白的同系物或直向同源物。本申请所述系统可包括所述的Cas蛋白。所述Cas蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到Cas蛋白上的蛋白质的实例包括但不限于，表位标签、报告基因、以及具有下列活性的一者或多者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。
本申请的CRISPR系统可以通过本领域已知的方法转入免疫细胞，例如：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)等。例如，可以使用点转的方法将所述CRISPR系统(例如，Cas蛋白和/或指导RNA)导入免疫细胞。电转方法请参见文献Schumann et al.PNAS 2015.112:10437-10442。
另一方面，本申请提供了核酸组合，所述核酸组合包含所述的分离的核酸分子，以及所述的方法中的指导RNA。
另一方面，本申请提供了载体，所述载体包含所述的分离的核酸分子和/或所述的核酸组合。在某些实施方式中，所述载体为病毒载体。在某些实施方式中，所述载体为慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
另一方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含所述的分离的核酸分子、所述的指导RNA、所述的核酸组合和/或所述的载体。
另一方面，本申请提供了细胞群，其包含至少30％的所述经修饰的细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述宿主细胞和/或所述细胞群，以及任选地药学上可接受的载体(carrier)。本申请所述的“药学上可接受的载剂”可包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在某些情形中，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。所述“有效量”通常是指施用于受试者之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或细胞的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
另一方面，本申请提供了所述的分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述细胞、所述细胞群和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于异体移植。
另一方面，本申请提供了异体移植的方法，其包括向受试者施用所述分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述细胞、所述细胞群和/或 所述药物组合物。
另一方面，本申请提供了增加异体移植相容性的方法，其包括使用所述制备经修饰的细胞的方法。
另一方面，本申请提供了所述的分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述细胞、所述细胞群和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或缓解肿瘤。
另一方面，本申请提供了治疗或缓解肿瘤的方法，其包括向受试者施用所述分离的核酸分子、所述指导RNA、所述核酸组合、所述载体、所述经修饰的细胞、所述细胞、所述细胞群和/或所述药物组合物。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1靶向B2M的gRNA设计
利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑实现HLA-E限制性肽段定向敲入于B2M蛋白，使得定向敲入后所形成的新蛋白结构为“信号肽-呈递肽段-连接子-B2M成熟蛋白”，示例性的最终翻译的蛋白结构如图1B所示。
为设计导向RNA(guide RNA,gRNA)实现高效准确的定向敲入，我们搜索了B2M基因的编码外显子1和外显子2，结合NGG的位置，靶序列插入的位置和两端同源臂的序列，综合分析后，确定gRNA序列，示例性的gRNA序列如图1A，其靶向B2M基因外显子1的反义链，靶向的序列按照5’-3’的方向为SEQ ID NO:1：CTCACGCTGGATAGCCTCC(SEQ ID NO:1)。
实施例2 CRISPR/Cas9RNP+DNA同源重组模板系统的制备
Cas9蛋白来源：类型来自于Streptococcus pyogenes化脓链球菌的野生型(SpCas9)、带有核定位信号(nuclear localization signal,NLS)，采购于Integrated DNA Technologies公司(货号：1074181)。
gRNA来源：实施例中的CRISPR/Cas9系统来自化脓链球菌，单链导向RNA(sgRNA)由两部分构成，5’端的第一部分含有与靶序列对应的19个碱基的指导序列(序列与PAM的5’端前紧接的19个碱基相同，但为RNA链，即将SEQ ID NO:1所示的核苷 酸序列中的T换成U，得到的指导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14)，连接着第二部分的骨架序列为：
5’GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 3’(SEQ ID NO:2)。骨架序列末尾的U碱基的个数可以变化。本实施例中采用的sgRNA序列为SEQ ID NO:3:
5’cucacgcuggauagccuccGUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 3’
其中，小写字母代表gRNA，大写字母代表骨架序列。该序列合成来自南京金斯瑞生物科技有限公司。
同源重组DNA来源：同源重组插入片段采用经PCR扩增后的双链DNA(double strand DNA，dsDNA)，或采用腺相关病毒(AAV)递送DNA模板。同源重组片段包括上游同源臂-插入序列-下游同源臂，如图1A，插入序列包括HLA-E限制性呈递肽和连接子，插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，插入序列表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。基因全合成后，作为PCR模板，PCR引物如下表：
表1.扩增同源重组DNA的PCR引物
引物名称 序列
上游F: 5’ATCTTAATCTTCTGGGTTTCCG3’(SEQ ID NO:11)
下游R: 5’TCTAAGGGAAGCAGAGCCGCAG3’(SEQ ID NO:12)
PCR扩增反应，聚合酶选择KOD FX Neo(TOYOBO，cat#636200)，反应条件如下表2：
表2.扩增同源重组PCR反应条件
1 95℃3min
2 95℃20s
3 58℃20s
4 68℃50s
5 72℃2min
6 2-5循环32次。
7 4℃保存
实施例3在原代T细胞的B2M基因座定向敲入HLA-E限制性呈递肽
原代T细胞来自从健康人供者的外周血单个核细胞(PBMC)。T细胞培养基是完全培养 基：ImmunoCult TM-XF T Cell Expansion Medium(Stem Cell Technology，cat#10981)加入300IU/ml IL2(Cayan，cat#HEILP-0201c)。
PBMC激活与培养：
(1)对复苏后的PBMC进行计数：将PBMC细胞悬液，用1ml移液器吹打5-6下，充分混匀，取出20μl细胞悬液，补加180μl PBS(Gibco，cat#C10010500BT)用细胞计数仪NC200进行计数。
(2)取5E6细胞，按照1:3的比例加入CD3/CD28激活磁珠Dynabeads(Thermo,cat#11141D)，即需要磁珠1.5E7。充分混合后加入完全培养基于6孔细胞培养板，细胞培养密度为1.5E6/ml，即体积为3.3ml培养基中，置于37度二氧化碳培养箱中培养。
(3)培养至第3天，去除磁珠。
(4)培养至第5天，进行定向插入的基因编辑实验。
CRISPR/Cas9介导的基因定向插入：
(1)准备细胞：取待电转的细胞用opti-MEM培养基(Gibco,cat#31985-070)洗2遍，计数并调整浓度为3.4E7/ml，取6ul用于电转(约2E5个细胞)；
(2)sgRNA和Cas9蛋白准备：sgRNA用ddH2O调整浓度为200ng/ul，2μL用于电转；Cas9蛋白用opti-MEM调整浓度为500ng/μl，取2μL电转用；同源重组DNA用ddH2O调整浓度为100ng/μl，2μL用于电转；先把sgRNA和Cas9先混在一起，室温孵育10min，再与同源重组DNA、细胞混合在一起；用opti-MEM培养基体积补足至10μl；
(3)电转：采用Neon转染系统(Thermo Fisher Scientific)进行电转，电转参数：1500V，10ms，3次，电转完后加入到200μL完全培养基中于96U型板中培养。
(4)各组别设计如表3。
表3.CRISPR/Cas9介导的基因定向插入试验设计
实施例4原代T细胞定向插入效率检测(流式细胞术蛋白层面检测)
B2M是HLA-ABC和HLA-E复合体中的小亚基，与HLA-A/B/C重链、HLA-E重链、或其他HLA一类分子的重链结合形成复合物。B2M的正常表达是HLA-ABC和HLA-E复合体正常表达的保证，当B2M缺失功能时，细胞无法表达HLA-ABC或HLA-E。经CRISPR/Cas9切割后，细胞会通过两种途径修复DNA损伤，非同源性末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组修复(Homology directed repair，HDR)，其会产生3种结果，如表4。编号3的情况下，表示编码HLA-E限制性呈递肽的核酸分子成功定点插入到B2M内源基因位点中的编码B2M信号肽和B2M成熟蛋白的核酸之间，与B2M内源基因使用相同的读码框，这种情况下，细胞会表达该HLA-E限制性呈递肽和B2M的融合蛋白，而非B2M野生型蛋白，导致B2M和HLA重链复合体中结合的呈递肽不再具有多样性，而是固定为HLA-E限制性呈递肽，因此细胞表面只有HLA-E复合体，由于HLA-ABC重链无法与HLA-E限制性呈递肽结合形成复合体。因此通过检测细胞的HLA-ABC和HLA-E的表达即可判断基因定向插入效率。
表4.基因编辑后细胞表型的类别
电转后继续培养5天，即该实验的第10天，取出少量细胞，加入1mL PBS(Gibco，cat#C10010500BT)清洗细胞1遍，用100μL PBS重悬，加入3μL抗HLA-A/B/C-APC(R&D，cat#FAB7098A)抗体和抗anti-HLA-E-PE(Biolegend，cat#342604)抗体，4℃孵育30min，加入1mL PBS清洗细胞，300g离心3min，去上清。用200μL PBS重悬细胞，清洗后用流式细胞仪上机检测。
检测结果如图2，未加同源重组DNA的组别产生了基因敲除的效率，HLA-ABC阴性达81.3％且无HLA-E表达，加入同源重组DNA的组别可以检测到HLA-ABC阴性的同时HLA-E阳性的细胞群，随DNA加入剂量增加，HLA-ABC -HLA-E +的细胞分别是11.70％，16.63％ 和19.86％。结果说明，经基因编辑后，通过一步电转递送，可以实现HLA-E限制性呈递肽的定向插入，使得细胞在HLA-A、HLA-B和HLA-C缺失表达的同时完成HLA-E特异性表达。
实施例5原代T细胞定向插入验证(DNA测序，基因层面检测)
为进一步验证HLA-E限制性呈递肽的定向插入，我们在基因层面进行DNA测序。考虑到定向插入的效率在10％-20％之间，我们对靶细胞进行了富集，对更纯的细胞亚群进行DNA提取和测序分析。流式细胞术分选图3A中箭头所示的细胞亚群，即HLA-ABC -HLA-E +的细胞亚群。
测序引物序列为SEQ ID NO:5：5’AGCAAACTCACCCAGTCTAGT3’。测序结果如图3B，显示目标DNA序列已整合到B2M基因靶位点，读码框正确。
实施例6经基因敲入表达HLA-E的T细胞抵抗NK细胞杀伤能力的评估
HLA-E通过与NKG2A/CD94相互作用，向NK细胞传递抑制性信号，进而抑制NK细胞的激活和对靶细胞的杀伤。为从功能上验证经基因敲入表达HLA-E的T细胞是否具备抵抗NK细胞杀伤的能力，我们采用被编辑细胞和NK92细胞共培养的方法进行评估。NK92是NK细胞来源的模式细胞株，被广泛用于评估NK细胞介导的杀伤试验。
被杀伤的靶细胞来源于实施例3制备的经基因编辑的T细胞，如图3A所示，该细胞中同时包含HLA-ABC -HLA-E +细胞(左上，代表基因敲入亚群)和HLA-ABC -HLA-E -细胞(左下，代表基因敲除亚群)。两类细胞同时存在，当于NK92培养后，两群细胞比例的变化会暗示被NK92杀伤的强弱。NK92杀伤弱的细胞群经共培养后比例会明显提高。
NK-92细胞杀伤流式细胞仪检测方法：
培养基为ImmunoCultTM，购自STEMCELL公司。效应细胞NK-92细胞购自中科院上海细胞研究所。靶细胞来源于实施例3制备的经基因编辑的T细胞。靶细胞终浓度为2×10 4/ml。NK92细胞共培养前用细胞染料标记(PB450,Thermo Fisher Scientific,cat#C34557)。NK-92细胞：靶细胞＝1：1混合，96孔培养板，每孔100μL，37℃培养箱共培养24小时。
流式细胞仪检测，如图4A，在P1门中，细胞染料PB450可区分NK92细胞和靶细胞，选择PB450阴性的靶细胞P2进一步分析。靶细胞受基因编辑作用，会分为HLA-ABC阴性亚群P3和阳性亚群，HLA-ABC阴性代表被成功编辑的细胞(包括敲除和敲入)。进一步，在P3亚群中，通过HLA-E的表达情况可以区分基因敲入亚群P5和仅编辑未敲入的亚群P4。对比P4和P5细胞亚群在NK92细胞杀伤后的变化可以判断对杀伤的情况。
如图4B，在共培养前HLA-ABC -HLA-E -亚群P4和HLA-ABC -HLA-E +亚群P5的比例分别是49.28％和44.79％，经共培养杀伤后，变为32.14％和63.25％。在相同的共培养条件中，HLA-E +细胞比例显著上升，暗示该亚群细胞具备更强的抵抗NK92细胞杀伤的能力。
进一步，我们分选和纯化出HLA-ABC -HLA-E -和HLA-ABC -HLA-E +的细胞，分别与NK92细胞共培养，计算杀伤率，定量判断基因敲入细胞亚群抵抗NK细胞杀伤的活性。细胞来源于实施例3中制备的基因编辑细胞，其中HLA-ABC -HLA-E -来源表3中编号为2的组别，记为RNP组，HLA-ABC -HLA-E +来源表3中编号为5的组别(对应于图3A中箭头所示细胞)，记为RNP-KI(Knock In，敲入)组。共培养方法同本实施例上述方法，组别如表5所示：
表5.NK92杀伤试验设计
杀伤率(％)＝(1-NK92共培养组平均值/靶细胞单独培养组的平均值)×100％
(统计方法采用T-test，双尾，等样本方差假设的方法)
结果如图5，在各效靶比的条件下，经基因插入亚群(HLA-ABC -HLA-E +)对NK的抵抗活性显著高于未表达HLA-E的亚群(HLA-ABC -HLA-E -)。
实施例7利用AAV递送同源重组模板进行基因敲入的方法建立
本实施例利用腺相关病毒AAV递送单链DNA作为同源重组模板，进行基因敲入。
AAV病毒制备：
(1)包装质粒包括AAV核心质粒pAAV，骨架源于质粒Addgene ID：#51905，包装辅助质粒pRepCap6源于质粒Addgene ID：#110770和pHelper源于质粒Addgene ID：#112867，AAV血清型选择AAV6，在HEK293T细胞(购自中科院上海细胞研究所)中进行病毒包装。外源同源重组DNA序列为SEQ ID NO:6，全基因合成后通过NdeI/HpaI双酶切连入pAAV载体中，用于后续AAV包装制备。
(2)HEK293T准备
提前一天分HEK 293T细胞，包装时细胞密度85％-90％且细胞分布均匀，状态良好(即：显微镜下观察，培养基中无杂质，无细胞悬浮或有少量细胞悬浮，细胞饱满，在培养皿中贴壁均匀)。
包装：提前一到两个小时给细胞换液，换成无血清的DMEM(Merck，cat#D5546)培养基(1％HEPES和1％P/S)。
转染：以5个15cm培养皿的量为例，向15ml离心管中依次加入DMEM：9ml，pHelper：124μg，pRepCap6：76μg，pAAV：65.1μg，PEI：1ml，振荡混匀后室温静置30min。将上述静置后的液体平均加到5盘HEK293T细胞中并做好标记，贴壁缓慢加入，避免将细胞吹起，加入后摇晃混匀至于37℃，5％CO 2培养箱中培养。
收毒：72小时后，将细胞吹起，连同培养基一并收到50ml离心管中，每5盘细胞收集到3个50ml离心管中，平均每管45ml，3500rpm(2100g)常温离心7min。将培养基上清转移到新管中，PEG8000(Merck，cat#P2139-500G)沉淀过夜(每100mL加入2.33g NaCl+8.5g PEG8000)，第二天离心3500g、4℃离心30min，弃掉上清用2ml PBS+0.001％PF68重悬。将细胞沉淀用5ml的PBS+0.001％PF68重悬，冻融一次后加入5M Nacl(高压灭菌)2ml，涡旋混匀。将B的重悬液与C的重悬液混合，振荡混匀后超声至超声重复不再粘稠。将超声后的液体3500g、4℃离心30min，将上清转移至新的离心管中。
超速离心纯化：采用碘克沙醇密度梯度离心纯化。按表6信息配置不同浓度的碘克沙醇(CAS:92339-11-2)。用灭菌水配制60％碘克沙醇w/v，并用0.2μm的滤膜过滤至灭过菌的瓶中。
表6.碘克沙醇溶液配比
取一个超离管(超离管和盖子均高压灭菌后使用)，逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60％层4.2ml，再加入40％层5ml，其次加入25％层6ml，后加入15％层9ml。加入不同浓度的碘克沙醇时要倾斜离心管并缓慢推入，避免串层。整个操作需要在生物安全柜里进行。将处理好的粗病毒液加入到上层，加入病毒时尤其开始要小心缓慢加入，并将管盖盖好。超 速离心，48000rpm 4℃离心2.5h。用100μl PBS重悬浓缩的AAV病毒放至4℃冰箱。
基于AAV递送同源重组模板的原代T细胞基因敲入：
流程如图6A所示。原代T细胞来源于健康人志愿者的外周血(PBMC)。所用培养基为完全培养基，ImmunoCult TM-XF T Cell Expansion Medium(Stem Cell Technology，cat#10981)+300IU/ml IL2(Cayan，cat#HEILP-0201c)。利用Dynabeads(Thermo，cat#11141D)激活T细胞，Dynabeads：细胞＝3：1。T细胞被激活24小时后形态上明显聚团、变大。T细胞激活后48h，取3E5个细胞于24孔培养板，利用磁力架去除激活磁珠。激活后第4天进行RNP电转，sgRNA/Cas9和电转方法同实施例3，电转后2小时，加入不同剂量的AAV递送同源重组模板。MOI(Multiplicity of Infection，感染复数，病毒量与细胞数的比值)依次为0，1E5，3E5，1E6。细胞培养至第9天后，进行基因编辑和外源基因插入检测。取出少量细胞，加入1mL PBS(Gibco，cat#C10010500BT)清洗细胞1遍，用100μL PBS重悬，加入1mL PBS(Gibco，cat#C10010500BT)清洗细胞1遍，用100μL PBS重悬，加入3μL抗HLA-ABC-APC(R&D，cat#FAB7098A)抗体和抗anti-HLA-E-PE(Biolegend，cat#342604)抗体，4℃孵育30min，加入1mL PBS清洗细胞，300g离心3min，去上清。用200μL PBS重悬细胞，清洗后用流式细胞仪上机检测。
检测结果如图6B，T细胞对照组，仅电穿孔组和仅AAV-donor递送同源重组模板组，均未检测到基因敲除和定点插入。MOI＝0未加同源重组模板组产生了基因敲除，HLA-ABC阴性达80.03％且无HLA-E表达，加入同源重组AAV模板的组别可以检测到HLA-ABC阴性且HLA-E阳性的细胞群，如箭头所示，随MOI增加，HLA-ABC -HLA-E +的细胞分别是46.86％，70.61％和75.36％。结果说明，以AAV做同源重组模板，经基因编辑后，可以实现HLA-E限制性呈递肽的定向插入，使得细胞在HLA-A、HLA-B和HLA-C缺失表达的同时完成HLA-E特异性表达，且存在剂量效应，效率高于DNA为模板的方法(实施例4)。
实施例8基于AAV递送的通用型CAR-T(UCAR-T)细胞的制备和检测
本实施例利用已建立的CRISPR/Cas9-AAV递送方法，通过基因定向插入，使CAR-T细胞通过一步基因编辑，同时实现TCR/CD3复合体敲除、HLA-ABC的敲除和HLA-E过量表达。
CRISPR/Cas9系统：来源同实施例3。即Cas9蛋白来自于Streptococcus pyogenes化脓链球菌的野生型(SpCas9)、带有核定位信号(nuclear localization signal,NLS)，采购于Integrated DNA Technologies公司(货号1074181)。靶向TRAC的gRNA序列如SEQ ID NO:7所示，靶向B2M的gRNA序列同实施例3，如SEQ ID NO:3所示。递送同源重组模板的AAV同实 施例7，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
递送CAR的慢病毒包装体系：采用三质粒系统：慢病毒目的表达质粒(Addgene ID：#12252)，包装辅助质粒psPAX2(Addgene ID：#12260)和pMD2.G(Addgene ID：#12259)。构建靶向CD19的CAR序列命名为CJP，序列为SEQ ID NO:8。CJP全基因合成后通过BamHI/SalI酶切连入病毒表达质粒(Addgene ID：#12252)。
在HEK293T细胞(购自中科院上海细胞研究所)中进行病毒包装。制备流程如下：将冻存的工作细胞中的HEK293T细胞复苏，用DMEM培养基(+10％FBS+1％P/S)(Cellgro 10-013-CMR)置于10cm培养皿培养，复苏第2天后换液。待细胞长满后开始传代(通常1个培养皿长满之后可传至5个培养皿)，将细胞传代4代后可进行质粒转染。我们系统优选的转染采用PEI作为转染试剂，PEI：质粒(质量比)＝2:1的条件转染。将质粒与PEI的混合物加入到Opti-MEM培养基(Gibco,cat#31985-070)中，再将此混合溶液加入到传代至第4代的HEK293T细胞中。转染6小时后用2％FBS的新鲜培养基换液，之后继续培养至72小时，收集HEK293T细胞上清。收集的病毒上清采用超离的方式(82200g，4-8℃离心2小时)进行浓缩，浓缩好的病毒用0.22μm滤膜过滤除菌后重悬待用。
基于AAV递送同源重组模板的UCAR-T细胞制备：
细胞制备流程如图7所示。其中，图7A，CAR采用慢病毒递送方式，于T细胞激活后48h递送，HLA-E的递送采用CRIPSR/Cas9-AAV定向插入的方法，于T细胞激活后3-5天递送于此同时进行TCR/CD3的敲除。另一种策略，图7B，CAR和HLA-E均采用CRIPSR/Cas9-AAV定向插入的方法，CAR被定向插入到TRAC基因位点，HLA-E被定向插入于B2M基因位点，通过一步电转，同步实现TCR/CD3的敲除和双位点基因的整合表达。
原代T细胞来源于健康人志愿者的外周血(PBMC)。所用培养基为完全培养基，ImmunoCult TM-XF T Cell Expansion Medium(Stem Cell Technology，cat#10981)+300
IU/ml IL2(Cayan,cat#HEILP-0201c)。利用Dynabeads(Thermo,cat#11141D)激活T细胞，Dynabeads：细胞＝3：1。T细胞被激活24小时后形态上明显聚团、变大。T细胞激活后48h，利用磁力架去除激活磁珠，取3E5个细胞于24孔培养板，以细胞数的3倍量加入制备好的慢病毒，即MOI＝3，补充培养基至500μL。24h后补充培养基至1mL，以利于细胞生长。激活后第4天进行RNP电转，sgRNA/Cas9和电转方法类似实施例3，本实施例，除添加靶向B2M的sgRNA外，需额外添加等剂量的靶向TRAC的sgRNA。电转后2小时，加入不同剂量的AAV递送同源重组模板。MOI依次为0，1E5，3E5，1E6，进行培养，本实施例优选1E6。
细胞培养至第9天后，进行基因编辑和外源基因插入检测。取出少量细胞，加入1mL PBS(Gibco，cat#C10010500BT)清洗细胞1遍，用100μL PBS重悬，加入1mL PBS(Gibco，cat#C10010500BT)清洗细胞1遍，用100μL PBS重悬，加入3μL抗FMC63的抗体一抗(检测CAR19)，4℃孵育30min，加入1mL PBS清洗细胞，300g离心3min，去上清。用100μL PBS重悬细胞，加入0.5μL检测CAR19的二抗、3μL抗HLA-ABC抗体、3μL抗体CD3抗体(检测基因编辑效率)和3μL抗HLA-E抗体至细胞中，混合均匀，4℃孵育30min。清洗后再用流式细胞仪上机检测。
也可使用基于DNA递送同源重组模板制备UCAR-T细胞，制备流程如图8所示。
实施例9不同方法制备UCAR-T细胞的比较
对进行基因敲除的UCAR-T细胞使用常规慢病毒转染的制备方法：参考专利WO2021/027758A1的实施例7.3只表达CAR的UCAR-T记作制备方法1(UCART)，共表达CAR和抵抗排异的嵌合体CM(HLA-E限制性呈递肽-B2M)的UCAR-T记作制备方法2(UCART-CM)。
制备方法简述如下，原代T细胞来源于健康人志愿者的外周血(PBMC)。利用Dynabeads激活T细胞，Dynabeads：细胞＝3：1。T细胞激活后48h，利用磁力架去除激活磁珠，取3E5个细胞于24孔培养板，以细胞数的3倍量加入制备好的慢病毒，即MOI＝3。慢病毒递送的是CAR19或CAR19共表达CM。加入慢病毒后，补充培养基至500μL。24h后补充培养基至1mL，以利于细胞生长。激活后第4天进行RNP电转，利用靶向TRAC和B2M的sgRNA，同时敲除TCR/CD3复合体和HLA-ABC/B2M复合体。最终产生表达CAR或表达CAR19/HLA-E，同时TCR和HLA-ABC双阴性的UCAR-T细胞。
同时利用本专利实施例8的方法制备基于CRISPR/Cas9定向插入的方法制备通用型CAR-T细胞(记为AAV定点整合：UCART-KI)。同时制备“未基因编辑对照：CAR-T”对照组细胞，只对T细胞进行CAR的慢病毒转染而没有基因编辑步骤。各组头对头比较，评估不同方法制备UCAR-T细胞CAR、HLA-E表达效率。
功能评价前细胞表型检测(第14天)结果如图9，不同制备的UCAR-T中，CD3/HLA-ABC实现双基因敲除的比例相似，方法1是70.8％，方法2是72.5％，本发明的AAV定向整合法是70.9％(第二排)；而对CAR和HLA-E共表达效率的比较，本发明的AAV定向整合法制备的细胞是32.2％显著高于其他组别，方法1是0.4％，方法2是16.3％。值得关注的是，对HLA-E表达的丰度，本发明的AAV定向整合法明显更强，流式细胞术检测具备明显的分 群，右上群箭头所指(第三排)。如上结果表面本发明的AAV定向整合法制备的细胞CAR和HLA-E的表达效率更高，丰度更大，暗示具备更强抵抗排异能力。
本实施例中获得的UCART培养至14天后，继续开展实施例10、11的功能评价。
实施例10抵抗异体PBMC杀伤能力检测
本实施例检测被编辑的UCAR-T细胞在异体PBMC环境下的扩增能力，该环境中，即存在异体免疫排异(不仅仅来源NK细胞)，也存在靶细胞(肿瘤Raji细胞)。
UCAR-T细胞来源于实施例9制备的各组细胞。细胞共培养，UCAR-T细胞：肿瘤Raji细胞：异体PBMC＝1：5：20。UCAR-T细胞的CAR阳性细胞数为5E4/ml，其它细胞按比例类推，24孔培养板，37℃培养，在不同时间点记录不同组别CAR阳性细胞的数目。异体PBMC和Raji细胞共培养前用Dye eFluorTM 670染色，用于区分通用型CAR-T细胞：将细胞密度调至1E7/ml，加入终浓度为10μM的e670染料，室温避光孵育5min，培养基洗涤三遍后，用于实验。共培养的第0、3、5、7、9天对细胞进行取样，流式细胞术检测，统计CAR阳性细胞扩增或存留数目。
如图10，方法1制备的UCAR-T细胞，由于HLA-ABC是阴性的，且无HLA-E表达(图9，在异体PBMC共培养体系中无法扩增，细胞数逐渐减少，暗示遭到强烈的异体PBMC排斥；方法2制备的UCAR-T细胞，表达一定比例的HLA-E，前5天具备扩增能力，而后细胞数逐渐减少，暗示其具备一定的抵抗排异活性，但效果有限；本发明AAV定向整合制备的UCAR-T细胞，在相同条件下，表现出更强的扩增能力，至第9天仍保持10倍以上的扩增数量，提示该方法制备的细胞具备更强的抵抗排异能力和扩增能力。
实施例11肿瘤细胞杀伤活性检测
本实施例是实施例10的延续，如图11，异体PBMC共培养的第10天，投入2E5个Raji肿瘤细胞，模拟肿瘤复发，检测各组对肿瘤细胞的杀伤能力。在起始肿瘤细胞相似的情况下，经过24小时的杀伤，AAV定向整合方法制备的UCART-KI组显示出更强的肿瘤杀伤活性，从开始的17.2％到0.64％，而方法1和方法2制备的UCART和UCART-CM组对肿瘤细胞的杀伤有限，分别是15.6％到5.11％和17.5到8.05％，无UCAR-T的对照组杀伤最弱21.6％到17.0％。上述数据反应出AAV定向整合方法制备的UCART-KI组在经历10天的异体PBMC杀伤后，仍具备有效的存续能力，可对肿瘤细胞进行高效的杀伤，抗排异和杀伤肿瘤活性具备明显优势。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本 申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims (160)

  1. 经修饰的细胞，其包含编码呈递肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸处于内源B2M基因的转录调控下。
  2. 根据权利要求1所述的经修饰的细胞，所述多核苷酸处于内源B2M基因的基因座中。
  3. 根据权利要求1-2中任一项所述的经修饰的细胞，其能够表达B2M蛋白。
  4. 根据权利要求3所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽能够与所述B2M蛋白共价结合。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的经修饰的细胞，其能够表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白的至少一部分由所述内源B2M基因编码。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的经修饰的细胞，其能够表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白基本上由所述内源B2M基因编码。
  7. 根据权利要求3-6中任一项所述的经修饰的细胞，其中与未经所述修饰的细胞相比，所述B2M蛋白在细胞表面的表达和/或活性基本上不下调。
  8. 根据权利要求3-7中任一项所述的经修饰的细胞，其中与未经所述修饰的细胞相比，所述B2M蛋白在细胞表面的表达和/或活性下调不超过约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或更少。
  9. 根据权利要求3-8中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸还包含编码所述B2M蛋白片段的核酸分子。
  10. 根据权利要求1-9中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸不包含完整的B2M基因编码区。
  11. 根据权利要求1-10中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸不包含编码MHC分子重链的核酸分子。
  12. 根据权利要求1-11中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸与所述内源B2M基因处于同一个读码框中。
  13. 根据权利要求1-12中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸与所述内源B2M基因的启动子可操作地连接。
  14. 根据权利要求1-13中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸位于编码信号肽的核酸分子和编码B2M成熟蛋白的核酸分子之间。
  15. 根据权利要求1-14中任一项所述的经修饰的细胞，其中与未经所述修饰的细胞相比，所述经修饰的细胞具有降低的异体排异反应。
  16. 根据权利要求3-15中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽能够与所述B2M蛋白和MHC分子重链形成复合物。
  17. 根据权利要求16所述的经修饰的细胞，其中所述复合物能够抑制免疫细胞激活。
  18. 根据权利要求17所述的经修饰的细胞，其中所述免疫细胞选自下组：天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
  19. 根据权利要求17-18中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述免疫细胞为天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和/或T淋巴细胞。
  20. 根据权利要求17-19中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述抑制免疫细胞激活包括抑制免疫细胞参与免疫应答。
  21. 根据权利要求17-20中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述抑制免疫细胞激活包括与所述免疫细胞的抑制性受体结合。
  22. 根据权利要求21所述的经修饰的细胞，其中所述免疫细胞的抑制性受体选自下组：NKG2A、NKG2B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3。
  23. 根据权利要求11-22中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述MHC分子重链包括非经典I类MHC分子重链和/或MHC样分子重链。
  24. 根据权利要求23所述的经修饰的细胞，其中所述非经典I类MHC分子重链包括HLA-E重链、HLA-F重链和/或HLA-G重链。
  25. 根据权利要求23-24中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述MHC样分子重链包括CD1重链、MR1重链、FcRn重链和/或UL18重链。
  26. 根据权利要求23-25中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述MHC分子重链为HLA-E重链。
  27. 根据权利要求16-26中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽能够结合至所述MHC分子重链的肽结合沟(peptide binding groove)中。
  28. 根据权利要求1-27中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽源自病毒、原核生物、真核生物或哺乳动物。
  29. 根据权利要求1-28中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽源自人类。
  30. 根据权利要求1-29中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽包括非经典I类MHC限制性呈递肽和/或MHC样分子限制性呈递肽。
  31. 根据权利要求1-30中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽为非经典I类MHC限制性呈递肽。
  32. 根据权利要求1-30中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽为HLA-E限制性呈 递肽。
  33. 根据权利要求1-32中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽源自选自下组的蛋白：ATP结合盒转运蛋白、多药耐药相关蛋白7、麦醇溶蛋白(gliadin)、HSP60保守区和GroEL保守区。
  34. 根据权利要求1-33中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽源自I类MHC分子的信号肽或其片段。
  35. 根据权利要求1-34中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽源自选自下组蛋白的信号肽：HLA-Al、HLA-A2、HLA-A*02、HLA-A*0203、HLA-A*0210、HLA-A3、HLA-A*23、HLA-A*24、HLA-A*2403、HLA-A*2410、HLA-A*2502、HLA-A*2501、HLA-A*26、HLA-A*66(01,02)、HLA-A9、HLA-A*6603、HLA-A10、HLA-A*11、HLA-A19、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*32、HLA-A*33、HLA-A*74、HLA-A*7403、HLA-A28、HLA-A36、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A*3401、HLA-A*80、HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-B22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-B41、HLA-B42、HLA-B46、HLA-B47、HLA-B48、HLA-B49、HLA-B50、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B53、HLA-B54、HLA-B55、HLA-B56、HLA-B57、HLA-B58、HLA-B59、HLA-B60、HLA-B61、HLA-B62、HLA-B63、HLA-B64、HLA-B65、HLA-B67、HLA-B70、HLA-B71、HLA-B73、HLA-B75、HLA-B76、HLA-B77、HLA-B78、HLA-B81、HLA-B82、HLA-B83、HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7、HLA-Cw8、HLA-Cw9、HLA-Cw10、HLA-Cw*0809、HLA-Cw7、HLA-Cw*1701、HLA-G和HLA-F。
  36. 根据权利要求1-35中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽具有5-30个氨基酸长度。
  37. 根据权利要求1-36中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽具有7-20个氨基酸长度。
  38. 根据权利要求1-37中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽具有8-10个氨基酸长度。
  39. 根据权利要求1-38中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
  40. 根据权利要求1-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽包含SEQ ID NO:18- 70中任一项所示的氨基酸序列。
  41. 根据权利要求1-40中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述呈递肽包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
  42. 根据权利要求1-41中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸还包含编码连接子的核酸分子。
  43. 根据权利要求42所述的经修饰的细胞，在其表达产物中，所述呈递肽与所述B2M蛋白之间通过所述连接子连接。
  44. 根据权利要求42-43中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述连接子包括刚性连接子和/或柔性连接子。
  45. 根据权利要求42-44中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述连接子包含如下所示的氨基酸序列：(EAAAK) n，其中n为3、4或5。
  46. 根据权利要求42-45中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述连接子包含如下所示的氨基酸序列：(GGGGS) n，其中n为3、4或5。
  47. 根据权利要求42-46中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述连接子包含如SEQ ID NO:71-99中任一项所示的氨基酸序列。
  48. 根据权利要求42-46中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述连接子包含如SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列。
  49. 根据权利要求42-47中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述连接子位于所述呈递肽的C端。
  50. 根据权利要求1-49中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸不包含编码B2M蛋白或其片段的核酸分子。
  51. 根据权利要求1-50中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
  52. 根据权利要求1-51中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
  53. 根据权利要求1-52中任一项所述的经修饰的细胞，其用于细胞移植、组织移植和/或器官移植。
  54. 根据权利要求1-53中任一项所述的经修饰的细胞，其包括哺乳动物细胞。
  55. 根据权利要求1-54中任一项所述的经修饰的细胞，其包括干细胞和/或体细胞。
  56. 根据权利要求1-55中任一项所述的经修饰的细胞，其包括血液细胞、肌肉细胞、神经细胞和/或免疫细胞。
  57. 根据权利要求1-56中任一项所述的经修饰的细胞，其包括选自下组的免疫细胞：天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
  58. 根据权利要求1-57中任一项所述的经修饰的细胞，其为天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和/或T淋巴细胞。
  59. 根据权利要求1-58中任一项所述的经修饰的细胞，其细胞表面的经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达为阳性。
  60. 根据权利要求1-59中任一项所述的经修饰的细胞，其细胞表面经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达基本不下调。
  61. 根据权利要求1-60中任一项所述的经修饰的细胞，其细胞表面经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达上调。
  62. 根据权利要求1-61中任一项所述的经修饰的细胞，其T细胞受体α恒定区蛋白(TRAC)的表达和/或活性被下调。
  63. 根据权利要求1-62中任一项所述的经修饰的细胞，其还包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)、T细胞抗原偶联剂(TAC)、抗体TCR受体(AbTCR)、嵌合CD3ε受体和/或至少一种合成受体。
  64. 制备经修饰的细胞的方法，所述方法包括：
    将编码呈递肽的多核苷酸插入细胞，使得所述多核苷酸处于内源B2M基因的转录调控下。
  65. 根据权利要求64所述的方法，其中所述经修饰的细胞能够表达B2M蛋白。
  66. 根据权利要求64-65中任一项所述的方法，其中所述呈递肽能够与所述B2M蛋白共价结合。
  67. 根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其所述经修饰的细胞能够表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白的至少一部分由所述内源B2M基因编码。
  68. 根据权利要求64-67中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞能够表达B2M蛋白，且所述B2M蛋白基本上由所述内源B2M基因编码。
  69. 根据权利要求65-68中任一项所述的方法，其中与未经所述修饰的细胞相比，所述插入基本上不下调所述B2M蛋白在所述经修饰的细胞的表面的表达和/或活性。
  70. 根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中与未经所述修饰的细胞相比，所述插入使所述B2M蛋白在所述经修饰的细胞的表面的表达和/或活性下调不超过80％、约 70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或更少。
  71. 根据权利要求65-70中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸还包含编码所述B2M蛋白片段的核酸分子。
  72. 根据权利要求64-71中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸不包含完整的B2M基因编码区。
  73. 根据权利要求64-72中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸不包含编码MHC分子重链的核酸分子。
  74. 根据权利要求64-73中任一项所述的方法，其中所述插入包括将所述多核苷酸插入至所述内源B2M基因的基因座。
  75. 根据权利要求64-74中任一项所述的方法，其中所述插入包括将所述多核苷酸插入与所述内源B2M基因的读码框中。
  76. 根据权利要求64-75中任一项所述的方法，其中所述插入使得所述多核苷酸与所述内源B2M基因的启动子可操作地连接。
  77. 根据权利要求64-76中任一项所述的方法，其中所述插入包括将所述多核苷酸插入至编码信号肽的核酸分子和编码B2M成熟蛋白的核酸分子之间。
  78. 根据权利要求64-77中任一项所述的方法，其中与未经所述修饰的细胞相比，所述经修饰的细胞具有降低的异体排异反应。
  79. 根据权利要求65-78中任一项所述的方法，其中所述呈递肽能够与所述B2M蛋白和MHC分子重链形成复合物。
  80. 根据权利要求79所述的方法，其中所述复合物能够抑制免疫细胞激活。
  81. 根据权利要求80所述的方法，其中所述免疫细胞选自下组：天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
  82. 根据权利要求80-81中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞为天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和/或T淋巴细胞。
  83. 根据权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述抑制免疫细胞激活包括抑制免疫细胞参与免疫应答。
  84. 根据权利要求80-83中任一项所述的方法，其中所述抑制免疫细胞激活包括与所述免疫细胞的抑制性受体结合。
  85. 根据权利要求84所述的方法，其中所述免疫细胞的抑制性受体选自下组：NKG2A、 NKG2B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3。
  86. 根据权利要求73-85所述的方法，其中所述MHC分子重链包括非经典I类MHC分子重链和/或MHC样分子重链。
  87. 根据权利要求86所述的方法，其中所述非经典I类MHC分子重链包括HLA-E重链、HLA-F重链和/或HLA-G重链。
  88. 根据权利要求86-87中任一项所述的方法，其中所述MHC样分子重链包括CD1重链、MR1重链、FcRn重链和/或UL18重链。
  89. 根据权利要求86-88中任一项所述的方法，其中所述MHC分子重链为HLA-E重链。
  90. 根据权利要求64-89中任一项所述的方法，其中所述呈递肽能够结合至所述MHC分子重链的肽结合沟(peptide binding groove)中。
  91. 根据权利要求64-90中任一项所述的方法，其中所述呈递肽源自病毒、原核生物、真核生物或哺乳动物。
  92. 根据权利要求64-91中任一项所述的方法，其中所述呈递肽源自人类。
  93. 根据权利要求64-92中任一项所述的方法，其中所述呈递肽包括非经典I类MHC限制性呈递肽和/或MHC样分子限制性呈递肽。
  94. 根据权利要求64-93中任一项所述的方法，其中所述呈递肽为非经典I类MHC限制性呈递肽。
  95. 根据权利要求64-94中任一项所述的方法，其中所述呈递肽为HLA-E限制性呈递肽。
  96. 根据权利要求64-95中任一项所述的方法，其中所述呈递肽源自选自下组的蛋白：ATP结合盒转运蛋白、多药耐药相关蛋白7、麦醇溶蛋白(gliadin)、HSP60保守区和GroEL保守区。
  97. 根据权利要求64-96中任一项所述的方法，其中所述呈递肽源自I类MHC分子的信号肽或其片段。
  98. 根据权利要求64-97中任一项所述的方法，其中所述呈递肽源自选自下组蛋白的信号肽：HLA-Al、HLA-A2、HLA-A*02、HLA-A*0203、HLA-A*0210、HLA-A3、HLA-A*23、HLA-A*24、HLA-A*2403、HLA-A*2410、HLA-A*2502、HLA-A*2501、HLA-A*26、HLA-A*66(01,02)、HLA-A9、HLA-A*6603、HLA-A10、HLA-A*11、HLA-A19、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*32、HLA-A*33、HLA-A*74、HLA-A*7403、HLA-A28、HLA-A36、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A*3401、HLA-A*80、HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、 HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-B22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-B41、HLA-B42、HLA-B46、HLA-B47、HLA-B48、HLA-B49、HLA-B50、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B53、HLA-B54、HLA-B55、HLA-B56、HLA-B57、HLA-B58、HLA-B59、HLA-B60、HLA-B61、HLA-B62、HLA-B63、HLA-B64、HLA-B65、HLA-B67、HLA-B70、HLA-B71、HLA-B73、HLA-B75、HLA-B76、HLA-B77、HLA-B78、HLA-B81、HLA-B82、HLA-B83、HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7、HLA-Cw8、HLA-Cw9、HLA-Cw10、HLA-Cw*0809、HLA-Cw7、HLA-Cw*1701、HLA-G和HLA-F。
  99. 根据权利要求64-98中任一项所述的方法，其中所述呈递肽具有5-30个氨基酸长度。
  100. 根据权利要求64-99中任一项所述的方法，其中所述呈递肽具有7-20个氨基酸长度。
  101. 根据权利要求64-90中任一项所述的方法，其中所述呈递肽具有8-10个氨基酸长度。
  102. 根据权利要求64-101中任一项所述的方法，其中所述呈递肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
  103. 根据权利要求62-102中任一项所述的方法，其中所述呈递肽包含SEQ ID NO:18-70中任一项所示的氨基酸序列。
  104. 根据权利要求62-103中任一项所述的方法，其中所述呈递肽包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
  105. 根据权利要求64-104中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸还包含编码连接子的核酸分子。
  106. 根据权利要求105所述的方法，在所述经修饰的细胞的表达产物中，所述呈递肽与所述B2M蛋白之间通过所述连接子连接。
  107. 根据权利要求105-106中任一项所述的方法，其中所述连接子包括刚性连接子和/或柔性连接子。
  108. 根据权利要求105-107中任一项所述的方法，其中所述连接子包含如下所示的氨基酸序列：(EAAAK) n，其中n为3、4或5。
  109. 根据权利要求105-108中任一项所述的方法，其中所述连接子包含如下所示的氨基酸序列：(GGGGS) n，其中n为3、4或5。
  110. 根据权利要求105-109中任一项所述的方法，其中所述连接子包含如SEQ ID NO: 71-99中任一项所示的氨基酸序列。
  111. 根据权利要求105-110中任一项所述的方法，其中所述连接子包含如SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列。
  112. 根据权利要求105-111中任一项所述的方法，其中所述连接子位于所述呈递肽的C端。
  113. 根据权利要求64-112中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸不包含编码B2M蛋白或其片段的核酸分子。
  114. 根据权利要求64-113中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
  115. 根据权利要求64-114中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
  116. 根据权利要求64-115中任一项所述的方法，其中所述插入通过导入包含所述多核苷酸的载体进行。
  117. 根据权利要求116所述的方法，其中所述插入包括将包含所述多核苷酸的载体与所述细胞接触。
  118. 根据权利要求116-117中任一项所述的方法，其中所述包含所述多核苷酸的载体不包含完整的B2M基因编码区。
  119. 根据权利要求116-118中任一项所述的方法，其中所述包含所述多核苷酸的载体不包含编码MHC分子重链的核酸分子。
  120. 根据权利要求116-119中任一项所述的方法，其中所述包含所述多核苷酸的载体还包括同源臂。
  121. 根据权利要求116-120中任一项所述的方法，其中所述包含所述多核苷酸的载体包括上游同源臂、所述编码呈递肽的多核苷酸和下游同源臂。
  122. 根据权利要求116-121中任一项所述的方法，其中所述包含所述多核苷酸的载体包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
  123. 根据权利要求64-122中任一项所述的方法，其还包括向所述细胞引入特异性靶向所述内源B2M基因的基因座的至少一种序列特异性试剂。
  124. 根据权利要求123所述的方法，其中所述序列特异性试剂包括核酸酶试剂。
  125. 根据权利要求123-124中任一项所述的方法，其中所述序列特异性试剂包括RNA和/或DNA引导的核酸内切酶。
  126. 根据权利要求125所述的方法，其中所述核酸内切酶包括Cas蛋白。
  127. 根据权利要求126所述的方法，其中所述Cas蛋白包括Cas9蛋白。
  128. 根据权利要求123-127中任一项所述的方法，其中所述序列特异性试剂还包括指导RNA(gRNA)。
  129. 根据权利要求128所述的方法，其中所述gRNA为单链指导RNA。
  130. 根据权利要求128-129中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
  131. 根据权利要求128-130中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含5’-(X)n-SEQ ID NO:13-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。
  132. 根据权利要求128-131中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
  133. 根据权利要求64-132中任一项所述的方法，其中所述细胞包括哺乳动物细胞。
  134. 根据权利要求64-133中任一项所述的方法，其中所述细胞包括干细胞和/或体细胞。
  135. 根据权利要求64-134中任一项所述的方法，其中所述细胞包括血液细胞、肌肉细胞、神经细胞和/或免疫细胞。
  136. 根据权利要求64-135中任一项所述的方法，其中所述细胞包括选自下组的免疫细胞：天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
  137. 根据权利要求64-136中任一项所述的方法，其中所述细胞为天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和/或T淋巴细胞。
  138. 根据权利要求64-137中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达为阳性。
  139. 根据权利要求64-138中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达基本不下调。
  140. 根据权利要求64-139中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞的细胞表面的经典I类MHC分子的表达下调，且非经典I类MHC分子的表达上调。
  141. 根据权利要求64-140中任一项所述的方法，其还包括下调T细胞受体α恒定区蛋白(TRAC)、T细胞受体β恒定区蛋白(TRBC)、CD3ε、CD3γ、CD3δ和/或DC3ζ的表达和/或活性。
  142. 根据权利要求64-141中任一项所述的方法，其还包括向所述细胞施用靶向编码所述TRAC的核酸分子的指导RNA。
  143. 根据权利要求64-142中任一项所述的方法，其中所述靶向编码所述TRAC的核酸分子的指导RNA包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
  144. 根据权利要求1-143中任一项所述的方法，其还包括使所述经修饰的细胞表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)、T细胞抗原偶联剂(TAC)、抗体TCR受体(AbTCR)、嵌合CD3ε受体和/或至少一种其他合成受体。
  145. 根据权利要求1-144中任一项所述的方法，其还包括将编码嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、TCR受体融合构建体(TRuC)、T细胞抗原偶联剂(TAC)、抗体TCR受体(AbTCR)、嵌合CD3ε受体和/或至少一种合成受体的核酸分子导入所述经修饰的细胞。
  146. 根据权利要求64-145中任一项所述的方法制备得到的经修饰的细胞。
  147. 分离的核酸分子，其包含权利要求1-63中任一项所述的方法中的多核苷酸。
  148. 权利要求128-145中任一项所述的方法中的指导RNA。
  149. 核酸组合，其包含权利要求147所述的分离的核酸分子，以及权利要求148所述的指导RNA。
  150. 载体，其包含权利要求147所述的分离的核酸分子，权利要求148所述的指导RNA和/或权利要求149所述的核酸组合。
  151. 根据权利要求150所述的载体，其为病毒载体。
  152. 根据权利要求150-151中任一项所述的载体，其为慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
  153. 细胞，其包含权利要求147所述的分离的核酸分子、权利要求148所述的指导RNA、权利要求149所述的核酸组合和/或权利要求150-152中任一项所述的载体。
  154. 细胞群，其包含至少30％的权利要求1-63中任一项所述的经修饰的细胞。
  155. 药物组合物，其包含权利要求1-63和153中任一项所述的经修饰的细胞、权利要求147所述的分离的核酸分子、权利要求148所述的指导RNA、权利要求149所述的核酸组合、权利要求150-152中任一项所述的载体、权利要求153所述的细胞和/或权利要求154所述的细胞群，以及可选地药学上可接受的载体。
  156. 权利要求1-63和146中任一项所述的经修饰的细胞、权利要求147所述的分离的核酸分子、权利要求148所述的指导RNA、权利要求149所述的核酸组合、权利要求150-152中任一项所述的载体、权利要求153所述的细胞、权利要求154所述的细胞群和/或权利要求155所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于异体移植。
  157. 异体移植的方法，其包括向受试者施用权利要求1-63和146中任一项所述的经修饰的细胞、权利要求147所述的分离的核酸分子、权利要求148所述的指导RNA、权利要求149所述的核酸组合、权利要求150-152中任一项所述的载体、权利要求153所述的细胞、权利要求154所述的细胞群和/或权利要求155所述的药物组合物。
  158. 增加异体移植相容性的方法，其包括使用权利要求64-145中任一项所述的方法。
  159. 权利要求1-63和146中任一项所述的经修饰的细胞、权利要求147所述的分离的核酸分子、权利要求148所述的指导RNA、权利要求149所述的核酸组合、权利要求150-152中任一项所述的载体、权利要求153所述的细胞、权利要求154所述的细胞群和/或权利要求155所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或缓解肿瘤。
  160. 治疗或缓解肿瘤的方法，其包括向受试者施用权利要求1-63和146中任一项所述的经修饰的细胞、权利要求147所述的分离的核酸分子、权利要求148所述的指导RNA、权利要求149所述的核酸组合、权利要求150-152中任一项所述的载体、权利要求153所述的细胞、权利要求154所述的细胞群和/或权利要求155所述的药物组合物。
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