CN109563484A - 用于细胞活化的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本文中提供了活化免疫细胞的方法。该方法包括提供免疫细胞群，并使该免疫细胞群与第一试剂和第二试剂接触。该第一试剂包括连接到第一结合子部分上的免疫细胞激活剂，并且该第二试剂包括至少一种捕获低聚物。该至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子部分缔合。还提供了用于活化免疫细胞的试剂盒。
Description
技术领域
本公开通常涉及用于细胞活化的方法和试剂盒，更具体涉及用于免疫细胞活化的方法和试剂盒。
发明背景
细胞疗法，例如T细胞疗法，已经在治疗血液肿瘤方面显示出显著的成功，并在治疗实体肿瘤方面显示前景。这些疗法通常需要从患者或供体中分离外周血单核细胞（PBMC）或T细胞，并随后活化并增殖以产生治疗剂量。通常，这种类型的个性化疗法包括从癌症患者身上取出血细胞、分离和激活免疫细胞、对其进行基因修饰以识别和攻击癌细胞、扩增基因修饰的免疫细胞并将扩增的免疫细胞再引入患者体内，以使患者的免疫系统可以接管。活化是整个过程的关键组成部分，因为需要有效引入遗传物质以便基因修饰免疫细胞及其鲁棒的扩增。
存在几种用于免疫细胞，尤其是T细胞的激活和扩增的技术平台。例如，抗体共价键合到该表面的超顺磁性、无热原性聚苯乙烯珠粒，例如Dynabeads® CD3/CD28（LifeTechnologies, Beverly, MA）是用于T细胞的分离、激活和扩增的最广泛使用的平台之一。但是，此类基于珠粒的平台当用于细胞群集和细胞活化时受困于显著的细胞损失，这主要是由于需要在细胞扩增完成后移除珠粒。避免珠粒去除问题的替代技术通常对细胞活化无效，特别是在通常进行用于基因修饰的病毒转导时的早期活化阶段。
细胞疗法还可以用其它免疫细胞如获自患者或第三方供体的自然杀伤（NK）细胞，或永生化细胞系来进行。在一些方面，基于NK细胞的疗法包括从患者或供体血液中分离NK细胞，激活并扩增该自然杀伤细胞，并将它们施用到患者体内。用于NK细胞的激活和扩增的大多数现有方案涉及与饲养细胞共同培养。此类饲养细胞体系难以标准化，并可能将不可预测性和污染引入细胞培养物。
因此，需要一种新的技术平台，其能够提供群集免疫细胞受体以便进行免疫细胞活化（例如用于群集细胞表面受体以便进行T细胞活化）的新颖途径并提供共刺激信号以提高增殖。此外，需要无饲养细胞的合成活化系统，其可以设计成实现免疫细胞如T细胞和NK细胞的受控与可再现的活化。
发明概述
一些实施方案涉及激活免疫细胞的方法。该方法包括提供免疫细胞群并使免疫细胞群与第一试剂和第二试剂接触。该第一试剂包括连接到第一结合子（binder）部分上的免疫细胞激活剂，该第二试剂包括至少一种捕获低聚物。所述至少一种捕获低聚物能够与第一结合子部分缔合。
一些实施方案涉及T细胞活化的方法。该方法包括向T细胞群中添加抗CD3抗体、连接到二级抗体上的第一结合子部分和包含至少一种捕获低聚物的第二试剂的步骤。该二级抗体能够与抗CD3抗体连接，并且该至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子部分缔合。随后孵育该T细胞的群以活化该T细胞。
一些实施方案涉及用于免疫细胞活化的试剂盒。该试剂盒包括连接到第一结合子核酸序列上的免疫细胞激活剂，和包含至少一种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物。该至少一种捕获寡核苷酸能够与该第一结合子核酸序列缔合。
附图
当参照附图阅读以下详述时，将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点。
图1A-1E是阳性验证的结合至T细胞的抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act缀合物的代表性流式细胞术直方图。1A：DNA（o20b(+)act）连接抗CD28抗体（抗CD28-o20b(+)act）与T细胞的结合；1B：未连接或未修饰的抗CD28抗体（阳性对照物）与T细胞的结合；1C：DNA（o20b(+)act）连接的抗CD3抗体（抗CD3-o20b(+)act）与T细胞的结合；1D：未连接或未修饰的抗CD3抗体（阳性对照物）与T细胞的结合；以及1E：用FITC-标记的二级抗体孵育的细胞（阴性对照物）。
图2是由单链DNA模板（ssRCA）生成环状DNA模板以便随后生成用于T细胞活化的RCA产物的示意图。
图3A是通过CD25表达测得的在第1和第4天相对于Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28对照物（表示为CD3/CD28 Dynabeads）使用基于DNA的T细胞活化（DBTA）组合物的T细胞活化的图示。所用的DBTA组合物是DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 未修饰的抗CD28]，其包括滚环扩增产物、RCAact、连接到第一结合子DNA序列o20b(+)act上的抗CD3抗体（抗CD3-o20b(+)act）和未修饰的抗CD28抗体。还显示了各种对照物，包括具有滚环扩增（RCA）产物的未修饰抗体、具有游离o20b(+)act的未修饰抗体、单独的未修饰抗体、单独的RCA产物和单独的细胞（不具有活化剂的“仅细胞”对照物）。
图3B是在第4和第7天与图3A相同的培养物的图示，显示了以相对于起始细胞计数的扩增倍数（x倍扩增）表示的细胞扩增。
图4A是显示采用CD25表达测得的用两种不同的DBTA组合物实现的显著激活（相对于“仅细胞”对照物）的图示。所用不同的DBTA组合物是i）DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 未修饰的抗CD28]，和ii）DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]，其包括RCAact、抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act。还显示了对照物Dynabeads® Human T-ExpanderCD3/CD28（Life Technologies, Beverly, MA）（表示为CD3/CD28 Dynabeads）和仅细胞对照物。
图4B是在4和7天后与图4A相同的培养物的图示，显示了以相对于起始细胞计数的扩增倍数表示的细胞扩增。
图5A是显示在向细胞中分别加入DBTA组分并原位缔合时（表示为“原位DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]”）与它们在添加细胞之前预缔合时（表示为“预缔合的DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]”）相比在1天后朝向更高活化的趋势的图示。
图5B是在4天后与图5A相同的培养物，显示了以相对于起始细胞计数的扩增倍数表示的细胞扩增。
图6A是显示以不同抗CD3-o20b(+)act对抗CD28-o20b(+)act比（在图中表示为抗CD3-DNA:抗CD28-DNA）以及通过在所有情况下保持相同的RCAact浓度（67 nM）的不同抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act对RCAact比使用DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]培养1天后由CD25表达测得的T细胞活化的图示。如图中所示：i）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（1:1）表示其中抗CD3-DNA与抗CD28-DNA的浓度均为1 µg/mL（6.7 nM）的研究，ii）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（1:2）表示抗CD3-DNA浓度为1 µg/mL且抗CD28-DNA浓度为2µg/mL；iii）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（0.5:1）表示抗CD3-DNA浓度为0.5 µg/mL且抗CD28-DNA浓度为1 µg/mL；iv）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（0.25:0.5）表示抗CD3-DNA浓度为0.25 µg/mL且抗CD28-DNA浓度为0.5 µg/mL；和v）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（0.25:0.25）表示抗CD3-DNA浓度为0.25 µg/mL且抗CD28-DNA浓度也为0.25 µg/mL。还显示了对照物，Dynabeads®Human T-Expander CD3/CD28（表示为CD3/CD28 Dynabeads）和仅细胞对照物。
图6B是在4和7天后与图6A相同的培养物的细胞扩增的图示，显示了以相对于起始细胞计数的扩增倍数表示的细胞扩增。
图7A是在三种不同条件下培养24小时后由CD25表达测得的T细胞活化的图示，i）在添加RCAact之前细胞与抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act以1:1的抗CD3-o20b(+)act:抗CD28-o20b(+)act比预混合30分钟（表示为“细胞-DBTA预孵育[抗CD3-DNA:抗CD28-DNA(1:1)]”），ii）所有三种DTBA组分（RCAact、抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act）单独添加到细胞中以便以1:1的抗CD3-o20b(+)act:抗CD28-o20b(+)act比原位缔合（表示为“原位DBTA[抗CD3-DNA:抗CD28-DNA(1:1)]”），和iii）所有三种DTBA组分（RCAact、抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act）单独添加到细胞中以便以1:2的抗CD3-o20b(+)act:抗CD28-o20b(+)act比原位缔合（表示为“原位DBTA[抗CD3-DNA:抗CD28-DNA(1:2)]”）。在所有情况下，保持相同的RCAact浓度。结果与作为对照物的Dynabeads® Human T-ExpanderCD3/CD28（表示为CD3/CD28 Dynabeads）和单独的细胞进行比较。
图7B是显示以相对于起始细胞计数的扩增倍数表示的第7天后细胞扩增的与图7A相同的培养物的图示。
图8A是显示使用由含有CpG的RCA模板制得的滚环扩增产物（RCAact）和由不含CpG的RCA模板制得的RCAact在培养条件下培养1天和4天后由CD25表达测得的T细胞活化的图示。对于各种类型的RCAact，以1:1、1:10和1:100的比研究了抗CD3-o20b(+)act:RCAact。该抗CD3-o20b(+)act:RCAact比表示为Ab-DNA:RCA。对于由不含CpG的RCA模板制得的滚环扩增产物，使用下列试验条件：i）Ab-DNA:RCAact的比为1:10（表示为No CpG, 1:10 Ab-DNA:RCA）；ii) Ab-DNA:RCAact的比为1:1（表示为No CpG, 1:1 Ab-DNA:RCA）；和iii）Ab-DNA:RCAact的比为1:100（表示为No CpG, 1:100 Ab-DNA:RCA）。类似地，对于由含有CpG的RCA模板制得的滚环扩增产物，使用下列试验条件：i）Ab-DNA:RCAact的比为1:10（表示为CpG, 1:10 Ab-DNA: RCA）；ii）Ab-DNA:RCAact的比为1:1（表示为CpG, 1:1 Ab-DNA: RCA）；和iii）Ab-DNA:RCAact的比为1:100（表示为CpG, 1:100 Ab-DNA: RCA）。结果与作为对照物的Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28（表示为CD3/CD28 Dynabeads）和单独的细胞进行比较。
图8B是显示在4和7天后以相对于起始细胞计数的扩增倍数表示的细胞扩增的与图8A相同的培养物的图示。
图9A是显示T细胞活化的图示，其中一部分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）序列连接到抗CD3抗体、其互补RCA产物和未修饰的抗CD28抗体上，表示为DBTA[抗CD3-o25b(+)mrsa + 未修饰的抗CD28]。该结果与不同的对照条件进行比较，包括仅RCA产物、未修饰抗体、Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28（表示为CD3/CD28 Dynabeads）和仅细胞。
图9B是显示在4和7天后以相对于起始细胞计数的扩增倍数表示的细胞扩增的与图9A相同的培养物的图示。
图10A是显示当使用更大的滚环扩增（RCA）产物时更高的细胞活化（% CD25表达）的图示。对衍生自MRSA的RCA产物显示了该数据。i）DBTA (MRSA) 16Kb RCA产物表示DBTA[抗CD3-o25b(+)mrsa + 未修饰的抗CD28]，其中该RCA产物预计为~16千碱基（Kb）；ii）DBTA(MRSA) 1.5 Kb RCA产物表示DBTA[抗CD3-o25b(+)mrsa + 未修饰的抗CD28]，其中RCA产物的目标大小（通过超声处理）为1.5 Kb；和iii）DBTA (MRSA) 0.15 Kb RCA产物表示DBTA[抗CD3-o25b(+)mrsa + 未修饰的抗CD28]，其中RCA产物的目标大小（通过超声处理）为0.15Kb。结果与仅含RCA产物的对照物进行了比较。
图10B是在第4天和第7天后与图10A相同的培养物的图示。
图11显示了使用DBTA组合物在1天后由CD25表达测得的T细胞活化，其中通过改变DNA（D）:抗体（P）比（D/P）来制备该抗体-DNA缀合物。i）DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]（D/P 2.8-3.0）表示其中抗CD3:o20b(+)act比为2.8-3.0且抗CD28:o20b(+)act比为2.8-3.0的DBTA组合物；和ii）DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]（D/P 1.5-1.8）表示其中抗CD3:o20b(+)act比为1.5-1.8且抗CD28:o20b(+)act比为1.5-1.8的DBTA组合物。该T细胞活化在较高的D/P比下也较高。该结果与作为对照物的Dynabeads®Human T-Expander CD3/CD28（表示为CD3/CD28 Dynabeads）和单独的细胞进行了比较。图11的数据显示取自8次单独的试验的平均值。
图12A显示了使用抗CD3-o20b(+)act、抗CD28-o20b(+)act以及作为第二试剂的阳离子捕获聚合物（Jet PEI或PLL）在1天后T细胞的活化。DBTA组合物用作对照物。该试验在以下条件下进行：i）DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]；ii）抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act + Jet PEI，其中聚乙烯亚胺（PEI）用作该阳离子捕获聚合物；和iii）抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act + PLL，其中聚-L-赖氨酸（PLL）用作该阳离子捕获聚合物。Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28（表示为CD3/CD28Dynabeads）和仅细胞样品也用作对照物。
图12B是显示在4和7天后以相对于起始细胞计数的扩增倍数表示的细胞扩增的与图12A相同的培养物的图示。
图13A显示了使用DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]经7天扩增期CD4和CD8 T细胞的扩增。
图13B显示了使用在IL-2中的DBTA[抗CD3-o20b(+)act]经7天扩增期CD4和CD8 T细胞的扩增。
图14显示了使用DBTA[抗CD3-o20b(+)act +抗-4-1BB-o20b(+)act]经7天扩增期CD4和CD8 T细胞的扩增。
图15显示了使用包含连接到二级抗体（抗-IgG2a）上的第一结合子DNA序列和/或第二结合子DNA序列（o20b(+)act）、未修饰的抗CD3一级抗体和未修饰的抗CD28一级抗体以及滚环扩增产物（RCAact）的系统的T细胞活化（由CD25表达测得）。所用的不同条件是：i）抗-IgG2a-o20b(+)act)（2 µg/mL）+ RCAact + 未修饰的抗CD3 + 未修饰的抗CD28，其中该二级抗体-DNA缀合物浓度为2 µg/mL，未修饰的一级抗体抗CD3和抗CD28的浓度为1 µg/mL，且RCAact相对于一级抗体抗CD3和抗CD28为10倍摩尔过量；和ii）抗-IgG2a-o20b(+)act)（4µg/mL）+ RCAact + 未修饰的抗CD3 + 未修饰的抗CD28，其中该二级抗体-DNA缀合物的浓度为4 µg/mL，未修饰的一级抗体抗CD3和抗CD28的浓度为1 µg/mL，且RCAact相对于一级抗体抗CD3和抗CD28为10倍摩尔过量。DBTA[抗CD3-o20b(+)act+抗CD28-o20b(+)act]和未修饰的抗CD3（1µg/mL）、抗CD28（1µg/mL）与IgG2-特异性二级抗体（4µg/mL）的混合物用作对照物。Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28（表示为CD3/CD28 Dynabeads）和仅细胞样品用作附加对照物。
图16显示了使用包含连接到二级抗体（抗-IgG1）上的第一结合子DNA序列和/或第二结合子DNA序列（o20b(+)act）、未修饰的一级抗体（抗CD335和抗CD2，或抗CD335和抗CD244）、和滚环扩增产物（RCAact）的系统的NK 细胞活化（由CD25表达测得）。所用的不同条件是：i）抗-IgG1-o20b(+)act) + RCAact + 抗CD335 + 抗CD2；和ii）抗-IgG1-o20b(+)act) + RCAact + 抗CD335 + 抗CD244。仅细胞样品和仅可溶性抗体样品用作阴性对照物。
发明详述
从下列实施例可以更全面地理解本发明的实践，这些实施例在本文中仅为说明而给出，不应解释为限制由所附权利要求限定的本发明的范围。实施例部分中使用的一些缩写扩展如下：“mg”：毫克；“ng”：纳克；“pg”：皮克；“fg”：飞克（femtograms）；“mL”：毫升；“mg/mL”：毫克/毫升；“mM”：毫摩；“mmol”：毫摩尔；“pM”：皮摩；“pmol”：皮摩尔；“μL”：微升；“min.”：分钟，和“h.”：小时。
除非上下文明确地另行规定，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。在说明书和权利要求书通篇中使用的近似语言可用于修饰任何可以允许变化而不会导致与其相关的基本功能改变的任何定量表示。因此，由术语如“大约”修饰的值不限于指定的精确值。除非另行说明，说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质（如分子量）、反应条件等等的所述数字应理解为在所有情况下均被术语“大约”修饰。因此，除非相反地指示，以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据试图通过本发明获得的所需性质而改变。至少各数值参数应至少根据所报道的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
一些实施方案涉及激活免疫细胞的方法。该方法包括提供免疫细胞群并使免疫细胞群与第一试剂和第二试剂接触。该第一试剂包括连接到第一结合子部分上的免疫细胞激活剂，该第二试剂包括至少一种捕获低聚物。所述至少一种捕获低聚物能够与第一结合子部分缔合。
虽然某些实施方案涉及自体细胞疗法，其包括收集、处理和重新插入患者自己的细胞，公开的技术的应用可以包括同种异体细胞。该应用还可以包括修饰的人细胞、永生化细胞系（例如NK92细胞系）或非人细胞。预期与公开技术结合使用的基于细胞的疗法包括但不限于用于器官或组织再生、癌症治疗、血液疾病、免疫治疗、心脏病的疗法或任何其它基于细胞的疗法。在本发明的上下文中，可以采用多种细胞类型，包括例如但不限于免疫细胞类型如B细胞、T细胞（包括肿瘤浸润淋巴细胞）或自然杀伤细胞。该细胞可以从任何组织中分离，如外周血、骨髓或肿瘤组织。一些实施方案涉及从外周血富集的T细胞。可以使用例如Ficoll-PaqueTM或PercollTM梯度（GE Healthcare）通过离心进行富集。一些其它实施方案涉及T细胞的特定亚群，如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞。该细胞可以通过阳性或阴性选择技术来分离。
本文中所用的术语“第一试剂”是指能够与“第二试剂”缔合并激活可活化细胞如免疫细胞的组分。该第一试剂包括连接到“第一结合子部分”上的细胞激活剂。该第一结合子部分是能够与“第二试剂”缔合的分子。该第二试剂是指包含至少一种捕获低聚物的捕获聚合物，其中所述至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子部分缔合。由此，该第一试剂能够经由该第一结合子部分与该第二试剂缔合。
本文中所用的术语“免疫细胞激活剂”是指可以激活后天性或先天性免疫系统的细胞（例如T细胞或自然杀伤细胞）以便增殖、提高细胞毒性潜力和/或转导的任何试剂。
术语“连接”是指本领域中已知的任何连接手段。该连接可以是共价键或非共价相互作用（例如静电或疏水性相互作用）。非共价相互作用也被称为“缔合”。
本文中所用的术语“原位”通常是指事件在原始位置发生。原位，可以是指事件在含有免疫细胞群的介质（如其中发生免疫细胞活化的介质）中发生。在一些实施方案中，“原位”是指事件在细胞培养条件下在免疫细胞培养基中发生。
在一些实施方案中，该细胞激活剂是免疫细胞激活剂，该第一结合子部分是第一结合子核酸序列。由此，该第一试剂包括连接到第一结合子核酸序列上的免疫细胞激活剂。在此类实施方案中，该第二试剂包含至少一种“捕获低聚物”，其能够与该第一结合子核酸序列缔合（即经由非共价相互作用）。在一些实施方案中，该第二试剂是捕获核酸聚合物，并且该捕获低聚物是“捕获寡核苷酸”。在一些实施方案中，该捕获核酸聚合物包含单个捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，该捕获核酸聚合物包含多个捕获寡核苷酸。所述多个捕获寡核苷酸中的捕获寡核苷酸可以均具有相同类型（即所有捕获寡核苷酸均具有相同的核苷酸序列）或不同类型（即各捕获寡核苷酸具有不同的核苷酸序列，或第一组捕获寡核苷酸具有与第二组相比不同的核苷酸序列），条件是至少一种捕获寡核苷酸能够与该第一结合子核酸序列缔合。在一些实施方案中，该第二试剂是滚环扩增产物。可以通过滚环扩增来扩增环状核酸模板以形成多联体从而制造该滚环扩增产物，其中该多联体包含该环状核酸模板序列的重复单元。包含相同类型或不同类型的捕获寡核苷酸的滚环扩增产物可以通过适当设计该核酸模板序列来生成。例如，包含不同类型的捕获寡核苷酸的滚环扩增产物可以通过定制该模板核酸序列以包含目标序列来制造。同样，通过操纵该环状模板和通过使用多种引物，该滚环扩增产物可以定制设计以产生复杂结构。在一些实施方案中，该捕获核酸聚合物中的多种捕获寡核苷酸包括相同核苷酸序列的串联重复序列。在一些实施方案中，捕获核酸聚合物包含至少两种捕获寡核苷酸，其中至少一种捕获寡核苷酸能够与该第一结合子核酸序列缔合，并且其中至少一种其它捕获寡核苷酸能够与第二结合子核酸序列缔合。在一些实施方案中，该捕获核酸聚合物中捕获寡核苷酸的数目大于3，优选大于30，更优选大于300。在某些实施方案中，捕获寡核苷酸的数目大于2000。因此，该捕获核酸聚合物可以包含多个具有相同或不同的核苷酸序列、分子量、几何排列和/或重复模式的捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，该捕获寡核苷酸可以具有大约6个核苷酸至大约12个核苷酸、大约12个核苷酸至大约25个核苷酸、大约25个核苷酸至大约50个核苷酸、大约50个核苷酸至大约100个核苷酸、大约100个核苷酸至大约250个核苷酸、或大约250个核苷酸至大约500个核苷酸的长度。在一些实施方案中，该第二试剂是双链捕获核酸聚合物，而在其它实施方案中，其为单链捕获核酸聚合物。该捕获核酸聚合物可以包括天然或非天然核苷酸（在核酸碱基、糖或磷酸酯骨架上进行修饰）。该第二试剂可以进一步包含具有不同于捕获寡核苷酸的核苷酸数量和/或序列的间隔寡核苷酸序列，或非核酸间隔分子。
该第一结合子核酸序列与至少一种捕获寡核苷酸互补。该第一结合子核酸序列与至少一种捕获寡核苷酸能够经由互补碱基对杂交来缔合。在一些实施方案中，至少一种捕获寡核苷酸的所有核苷酸残基可以与该第一结合子核酸序列中的互补核苷酸杂交。例如，该捕获寡核苷酸可以具有50个核苷酸残基，并且所有这50个核苷酸残基均可以与该第一结合子核酸序列中的互补核苷酸杂交。在一些实施方案中，该捕获寡核苷酸的所有核苷酸在该第一结合子核酸序列中可能没有相应的互补核苷酸。在一些实施方案中，在该捕获寡核苷酸与该第一结合子核酸序列之间存在一个或多个碱基对错配。在再其它实施方案中，该捕获寡核苷酸和/或该第一结合子核酸序列可以包括核酸类似物，具有修饰的碱基如叠氮胸苷、肌苷或尿苷，或修饰的糖（例如2'-O-烷基修饰的呋喃糖苷），或修饰的骨架（例如硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、氨基磷酸酯骨架）。
在另一些实施方案中，该第二试剂是包含至少一种阳离子捕获低聚物的捕获聚合物，含有阳离子单体如组氨酸或赖氨酸的连续延伸。在一些实施方案中，该阳离子捕获聚合物包含多种阳离子捕获低聚物。只要总电荷保持为阳离子，该阳离子捕获聚合物可以进一步包含中性或阴离子间隔基残基。
该第一或第二试剂可以进一步包含非互补间隔核苷酸序列或非核酸间隔分子。在一些实施方案中，该第一结合子部分是阴离子型第一结合子部分，如第一结合子核酸序列、藻酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐或透明质酸盐，并且该第二试剂是包含至少一种阳离子捕获低聚物的阳离子捕获聚合物。该阴离子型第一结合子部分能够经由静电缔合与至少一种阳离子捕获低聚物缔合。在再其它实施方案中，该第一结合子部分是阳离子型第一结合子部分，并且该第二试剂是包含至少一种阴离子型捕获低聚物的阴离子型捕获聚合物。
在一些实施方案中，该免疫细胞激活剂通过共价键连接到该第一结合子部分上。该免疫细胞激活剂可以通过本领域中已知的任何共价键如硫醇/马来酰亚胺或碳二亚胺/胺连接化学作用连接到该第一结合子部分上。在一些实施方案中，该免疫细胞激活剂通过非共价相互作用连接到该第一结合子部分上。在另一些实施方案中，该免疫细胞激活剂经由中间结合子部分通过非共价相互作用连接到该第一结合子部分上，其中该中间结合子部分连接到（经由共价键或非共价相互作用）该第一结合子部分上。在一些实施方案中，该中间结合子部分通过共价键连接到该第一结合子部分上，并且该中间结合子部分能够通过非共价相互作用与该免疫细胞激活剂连接。在一些实施方案中，该中间结合子部分能够直接与该免疫细胞激活剂连接。例如，该中间结合子部分可以是二级抗体，并且该免疫细胞激活剂可以是一级抗体。通常，二级抗体针对一级抗体的物类。例如，当该免疫细胞激活剂是小鼠抗体时，合适的二级抗体可以是对小鼠免疫球蛋白具有特异性的多克隆抗体，如绵羊或山羊衍生的抗-小鼠多克隆抗体或抗-小鼠单克隆抗体，如大鼠衍生的抗小鼠Fc抗体。在另一些实施方案中，该中间结合子部分能够经由接头部分与该免疫细胞激活剂间接连接，其中该接头部分共价连接到该免疫细胞激活剂上。例如，当该接头部分是生物素或其衍生物时，合适的中间结合子部分可以是亲和素或对生物素特异性的抗体。或者，当该接头部分是亲和素时，合适的中间结合子部分可以是生物素或抗亲和素抗体。
在一些实施方案中，在接触免疫细胞群之前将连接到该中间结合子部分上的第一结合子部分与该免疫细胞激活剂混合以形成预先形成或预先缔合的第一试剂。在此类实施方案中，预先形成或预先缔合的第一试剂可以随后添加到免疫细胞群中以活化该免疫细胞。在另一些实施方案中，连接到该中间结合子部分上的第一结合子部分和免疫细胞激活剂单独添加到介质中包含的免疫细胞群中，而不进行预先混合。在此类实施方案中，该第一试剂原位形成。
在一些实施方案中，本公开涉及活化免疫细胞的方法，该方法包括提供免疫细胞群并使该免疫细胞群与第一试剂和第二试剂接触。该第一试剂包含免疫细胞激活剂和第一结合子核酸序列，其中该免疫细胞激活剂经由中间结合子部分连接到该第一结合子核酸序列上。该中间结合子部分通过共价键连接到该第一结合子核酸序列上，并且该中间结合子部分能够通过非共价相互作用与该免疫细胞激活剂连接。该第二试剂包含至少一种捕获低聚物，并且所述至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子核酸序列缔合。在一些实施方案中，该免疫细胞是T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，该免疫细胞激活剂可以是T细胞激活剂。T细胞激活剂的合适实例包括但不限于小有机分子（例如离子霉素、佛波醇肉豆蔻酸酯或乙酸酯）、天然或修饰的肽、蛋白质（例如抗体或亲和体）、非天然肽模拟物、核酸（例如多核苷酸、PNA、DNA、RNA或适体）、多糖（例如凝集素或糖）、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原或半抗原。T细胞激活剂可以通过与T细胞表面受体（如T细胞活化受体）结合来活化T细胞，这导致在T细胞中递送初级激活信号。T细胞活化受体的实例包括但不限于T细胞受体（TCR）或CD3受体。初级激活信号可以通过TCR和结合MHC I类或II类分子而呈现的抗原之间的结合来引发，以便刺激抗原特异性T细胞活化。初级激活信号还可以通过CD3受体与靶向该CD3受体的配体之间的结合来引发，以刺激多克隆T细胞活化。在一些实施方案中，该T细胞激活剂是抗CD3抗体或其片段（例如CD3受体结合片段）。T细胞激活剂的其它实例包括伴刀豆球蛋白A、蛋白激酶C（PKC）活化剂如佛波醇酯（例如佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯）或钙离子载体（例如提高细胞质钙浓度的离子霉素）等等。
一些实施方案涉及活化T细胞的方法，该方法包括提供T细胞群并使该T细胞群与第一试剂和第二试剂接触。该第一试剂包括连接到第一结合子部分上的T细胞激活剂，并且该第二试剂包括至少一种捕获低聚物。所述至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子部分缔合。在一些实施方案中，至少一种捕获低聚物与第一结合子部分之间的缔合使该T细胞激活剂彼此接近，引起T细胞表面受体的群集。在一些实施方案中，该T细胞激活剂是抗CD3抗体。在一些实施方案中，该第一结合子部分是第一结合子核酸序列，并且该第二试剂是包含至少一种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物。在一些实施方案中，该捕获核酸聚合物是滚环扩增产物。在一些实施方案中，该第一结合子部分是第一结合子核酸序列，并且该第二试剂是阳离子捕获聚合物。
在一些实施方案中，活化T细胞的方法包括添加多种类型的第一试剂。例如，在一些实施方案中，活化T细胞的方法可以包括添加包括两种不同类型的激活剂（例如抗CD3抗体和伴刀豆球蛋白A）的第一试剂。例如，一种类型的第一试剂可以包括连接到第一结合子核酸序列上的抗CD3抗体，其它类型的第一试剂可以包括连接到第一结合子核酸序列上的伴刀豆球蛋白A。
在一些实施方案中，活化T细胞的方法进一步包括添加T细胞共刺激分子。T细胞共刺激分子的实例包括但不限于靶向T细胞共刺激分子受体（如CD28、CD2、ICOS、OX40或4-IBB受体）的配体。在一些实施方案中，活化T细胞的方法可以包括添加两种不同类型的T细胞共刺激分子（例如抗CD28抗体和抗-4-IBB抗体）。在一些实施方案中，该T细胞共刺激分子可以连接到第二结合子部分上。在一些实施方案中，该第二结合子部分是第二结合子核酸序列。在此类实施方案中，第二试剂是包含至少两种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物，其中至少一种捕获寡核苷酸能够与该第一结合子核酸序列缔合，并且其中至少一种其它捕获寡核苷酸能够与该第二结合子核酸序列缔合。在一些实施方案中，该第一结合子核酸序列与该第二结合子核酸序列具有相同的核苷酸序列。在此类实施方案中，至少两种捕获寡核苷酸中的捕获寡核苷酸均相同，并与该第一结合子核酸序列和该第二结合子核酸序列互补。在另一些实施方案中，该第一结合子核酸序列与该第二结合子核酸序列具有不同的类型，并且不具有相同的核苷酸序列。在此类实施方案中，该捕获寡核苷酸具有不同的核苷酸序列，条件是至少一种捕获寡核苷酸与该第一结合子核酸序列互补，并且至少一种其它捕获寡核苷酸与该第二结合子核酸序列互补。在另一些实施方案中，该第二试剂是阳离子捕获聚合物，并且该第二结合子部分是阴离子第二结合子部分。在再其它实施方案中，该第二试剂是阴离子型捕获聚合物，该第二结合子部分是阳离子第二结合子部分。
在一些实施方案中，该T细胞激活剂经由中间结合子部分非共价连接到该第一结合子核酸序列上。一些实施方案涉及T细胞活化的方法，其中该第一试剂原位形成。在此类实施方案中，该方法包括向T细胞群中加入T细胞激活剂、连接到中间结合子部分上的第一结合子核酸序列、和包含至少一种捕获低聚物的第二试剂，并孵育该T细胞群以活化该T细胞。该中间结合子部分能够与T细胞激活剂连接，并且所述至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子核酸序列缔合。
在一些实施方案中，该T细胞激活剂是一级抗体，如抗CD3抗体，并且该中间结合子部分是二级抗体。该第一结合子核酸序列经由共价键连接到二级抗体上，并且该二级抗体能够通过非共价相互作用与该一级抗体连接。
一些实施方案涉及T细胞活化的方法，其中该第一试剂、该第二试剂和任选的T细胞共刺激分子（其可以连接或不连接到第二结合子部分上）同时或以任意次序顺序添加到介质中所提供的T细胞群中，以便进行原位缔合。在再其它实施方案中，令该第一试剂、该第二试剂、和任选的连接到第二结合子部分上的T细胞共刺激分子缔合以形成预缔合复合物。随后将该预缔合复合物添加到T细胞群中。在优选实施方案中，令该第一试剂、该第二试剂、和任选的连接到第二结合子部分上的T细胞共刺激分子原位缔合。
在一些实施方案中，足以活化一部分免疫细胞群（如T细胞）的时间可以为大约1分钟至大约14天。在某些实施方案中，该时间段可以为大约24小时至大约8天。在一些实施方案中，活化至少15%的T细胞。在优选实施方案中，活化至少25%的T细胞，在更优选的实施方案中，活化大部分T细胞（大于50%）。该孵育在具有受控的温度、湿度、CO2浓度的环境（例如在37℃和5% CO2下）的生物反应器中进行。在一些实施方案中，该孵育可以在静态生物反应器中进行，其中生物反应器不运动，而在一些其它实施方案中，该孵育可以在放置在摇摆平台上的生物反应器中进行。
在一些实施方案中，本公开提供了从混合的T细胞群中激活并选择性扩增T细胞的特定亚群的方法。这例如可以通过改变T细胞激活剂与T细胞共刺激分子的性质或相对比例来实现。此外，本公开提供了控制T细胞表面受体群集并因此通过调节例如T细胞激活剂与T细胞共刺激分子（其与该第二试剂缔合）的数量或距离来活化的方法。在一个实例中，其中该第二试剂是捕获核酸聚合物，这可以通过控制捕获寡核苷酸的数量和/或长度、和/或间隔基的长度来实现。还可以通过控制该第一试剂与该第二试剂之间的缔合来控制细胞活化的水平，这可以例如通过改变连接到T细胞激活剂上的第一结合子部分的数量来进行。在一些实施方案中，可以通过改变T细胞激活剂与T细胞共刺激分子的性质或相对比例来操纵CD4和CD8 T细胞的相对比例。例如，通过将T细胞共刺激分子由针对CD28受体的抗体变为针对4-1BB受体的抗体，可以提高CD8细胞的比例超过CD4细胞。
本领域中已知的任何方法可用于评估该免疫细胞的活化。在一些实施方案中，某些抗体如CD25的表达可用于测量T细胞的活化。在某些实施方案中，可以通过标记的抗CD25抗体测定CD25受体在T细胞上的表达以列举标记细胞。在某些其它实施方案中，可以通过其它标志物来测量T细胞亚型的活化、扩增以及分化。用于测量T细胞活化、扩增和/或分化的其它标志物包括但不限于CD4、CD8、CD27、CD28、CD3、CD57、CD25、CD45RA、CD45RO、CD127和CD62L。
一些实施方案涉及活化NK细胞的方法，该方法包括提供自然杀伤细胞群并使该自然杀伤细胞群与第一试剂和第二试剂接触。该第一试剂包括连接到第一结合子部分上的NK细胞激活剂，并且该第二试剂包括至少一种捕获低聚物。所述至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子部分缔合。在一些实施方案中，该NK细胞激活剂经由中间结合子部分连接到该第一结合子部分上。在一些实施方案中，该第一结合子部分是第一结合子核酸序列。
一些实施方案涉及NK细胞活化的方法，其中该第一试剂原位形成。在此类实施方案中，该方法包括向NK细胞群中添加自然杀伤细胞激活剂、连接到中间结合子部分上的第一结合子核酸序列、和包含至少一种捕获低聚物的第二试剂，并孵育该NK细胞群以活化该NK细胞。该中间结合子部分能够与自然杀伤细胞激活剂连接，并且所述至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子核酸序列缔合。
在一些实施方案中，该免疫细胞激活剂可以是自然杀伤细胞激活剂。自然杀伤细胞激活剂的合适实例包括靶向激活受体的配体，所述激活受体包括但不限于NKG2D受体，信号传导淋巴细胞活化分子（SLAM）家族受体如CD244（2B4），DNAX辅助分子如CD226，天然细胞毒性受体（NCRs）如NKp30、NKp44、NKp46（CD335）或NKp80，肿瘤坏死因子受体超家族如CD137（4-1BB）、CD134（OX40）或 CD27，或细胞因子受体如Il-2R、Il-15R、Il-18R或Il-21R。自然杀伤细胞激活剂的合适实例包括但不限于小有机分子、天然或修饰的肽、蛋白质（例如抗体或亲和体）、非天然肽模拟物、核酸（例如多核苷酸、PNA、DNA、RNA或适体）、多糖（例如凝集素或糖）或脂质。
在一些实施方案中，活化NK细胞的方法包括添加包含两种不同类型的自然杀伤细胞激活剂（例如抗CD335抗体和抗CD244抗体）的第一试剂。例如，一种类型的第一试剂可以包括连接到第一结合子核酸序列上的抗CD335抗体，其它类型的第一试剂可以包括连接到另一种第一结合子核酸序列上的抗CD244抗体。在再一实例中，一种类型的第一试剂可以包括连接到第一结合子核酸序列上的抗CD335抗体，其它类型的第一试剂可以包括连接到另一种第一结合子核酸序列上的抗CD2抗体。
一些实施方案涉及活化免疫细胞的方法，该方法包括提供免疫细胞群并使该免疫细胞群与第一试剂和第二试剂接触，其中该第一试剂与该第二试剂可溶于任何适于放置细胞的介质。如要理解的那样，适于放置细胞的介质可以包括任何包含细胞培养基的等渗介质。在一些实施方案中，该细胞培养基可以包括本领域中已知的任何免疫细胞培养基，如T细胞培养基。说明性的细胞培养基包括但不限于RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、CellGROTM SCGM。该细胞培养基可以是无血清的，或补充有血清，如人血清或血清补充剂。在一些实施方案中，该细胞培养基进一步补充有额外的生长因子和细胞因子，如白介素-2（Il-2）、白介素-7（Il-7）或白介素-15（IL-15）。
在一些实施方案中，该第一试剂与该第二试剂是可生物降解的。在一些实施方案中，该降解可以通过化学或酶手段发生。在一些实施方案中，其中该第二试剂是捕获核酸聚合物和/或该第一结合子部分是第一结合子核酸序列，该第一结合子部分与该第二试剂可以通过添加核酸酶除去，而不影响T细胞。在一些实施方案中，在至少一部分T细胞群活化后加入核酸酶。在一些实施方案中，在T细胞扩增至少10-100倍后加入降解酶。在再其它实施方案中，在洗涤、浓缩和制造最终制剂之前，在从细胞培养基中收获T细胞前，在培养期结束时加入该核酸酶。应当注意的是，该核酸酶可以在至少一部分T细胞群活化后和在将T细胞施用于患者之前的任何时间加入。在某些实施方案中，在降解后，该第一和第二试剂的降解副产物可以在T细胞的洗涤和浓缩过程中除去，并且不需要额外的纯化步骤。在另一些实施方案中，该第二试剂与该第一试剂是生物相容的并可以在血流中快速降解。在此类情况下，在将T细胞施用于患者前不需要添加降解酶。使用此类可溶的、可生物降解的系统优于基于聚苯乙烯珠粒或其它类似珠粒的方法，因此使用此类可溶的、可生物降解的系统可以避免对附加的纯化步骤（如磁分离）的需要，这些步骤通常导致显著的细胞损失。在包括添加连接到第二结合子部分上的T细胞共刺激分子的实施方案中，该第二结合子部分也可以是可生物降解的。
在一些实施方案中，免疫细胞活化的方法进一步包括添加包含外源基因的载体。例如，该T细胞活化方法进一步包括添加携带外源基因的载体，所述外源基因编码嵌合抗原受体或T细胞受体。在一些实施方案中，该载体是病毒载体如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体。在另一些实施方案中，该载体是质粒载体。在一些实施方案中，该载体与该第一试剂同时添加，而在另一些实施方案中，在活化至少一部分免疫细胞群后添加该载体。
一些实施方案涉及包含连接到第一结合子核酸序列上的免疫细胞激活剂与包含至少一种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物的试剂盒，其中该至少一种捕获寡核苷酸与该第一结合子核酸序列互补。在一些实施方案中，该捕获核酸聚合物是滚环扩增产物。在一些实施方案中，该免疫细胞激活剂经由中间结合子部分连接到该第一结合子核酸序列上。
一些实施方案涉及包含免疫细胞激活剂、共价连接到中间结合子部分上的第一结合子核酸序列、和包含至少一种捕获低聚物的第二试剂的试剂盒。该中间结合子部分能够与该免疫细胞激活剂连接，并且该至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子核酸序列缔合。在一些实施方案中，该第二试剂是捕获核酸序列，如滚环扩增产物。在一些实施方案中，该免疫细胞激活剂是自然杀伤细胞激活剂，如抗CD335抗体、抗CD244抗体、抗CD2抗体或其组合。
一些实施方案涉及包含共价连接到第一结合子核酸序列上的中间结合子部分和包含至少一种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物的试剂盒。该中间结合子部分能够与免疫细胞激活剂连接，并且该至少一种捕获寡核苷酸能够与该第一结合子核酸序列缔合。在一些实施方案中，该中间结合子部分是二级抗体并且该免疫细胞激活剂是一级抗体。在一些实施方案中，该免疫细胞激活剂是自然杀伤细胞激活剂，如抗CD335抗体、抗CD244抗体、抗CD2抗体或其组合。在另一些实施方案中，该免疫细胞激活剂是T细胞激活剂如抗CD3抗体。
一些实施方案涉及包含连接到第一结合子核酸序列上的T细胞激活剂和包含多种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，该T细胞共刺激分子连接到第二结合子核酸序列上。在一些实施方案中，该捕获核酸聚合物是捕获DNA聚合物，该第一结合子核酸序列是第一结合子DNA序列，且该第二结合子核酸序列是第二结合子DNA序列。在具体实例中，该试剂盒是基于DNA的T细胞活化（DBTA）组合物，其包含捕获DNA聚合物如滚环扩增产物，以及T细胞激活剂如连接到第一结合子DNA序列上的抗CD3抗体。在一些实例中，该DBTA组合物进一步包含T细胞共刺激分子如抗CD28抗体或抗-41BB抗体。在一些实例中，该T细胞共刺激分子连接到第二结合子DNA序列上。
实施例：
基于DNA的T细胞活化（DBTA）组合物是代表性的含有捕获核酸聚合物的系统，其引发T细胞群集、活化和随后的扩增。一些可能的DBTA组合物是：A）捕获DNA聚合物和连接到第一结合子DNA序列上的T细胞激活剂；或B）捕获DNA聚合物、连接到第一结合子DNA序列上的T细胞激活剂、和T细胞共刺激分子；或C）捕获DNA聚合物、连接到第一结合子DNA序列上的T细胞激活剂、和连接到第二结合子DNA序列上的T细胞共刺激分子。在其中该T细胞激活剂是抗体和/或该T细胞共刺激分子是抗体的实施例中，连接到第一结合子DNA序列上的T细胞激活剂和/或连接到第二结合子DNA序列上的T细胞共刺激分子一般被称为“抗体-DNA缀合物”或“Ab-DNA”。
实施例1：合成抗体-DNA（Ab-DNA）缀合物以及生成各种DBTA组合物
DBTA组合物之一包括捕获DNA聚合物如衍生自人β-肌动蛋白的滚环扩增产物（RCAact），其包含43-碱基寡核苷酸链段的串联重复，以及以下组分：（1）共价连接到衍生自人β-肌动蛋白的20-碱基DNA序列（o20b(+)act）（SEQ ID No. 4，第一结合子 DNA序列）上的抗-人CD3单克隆抗体（抗CD3，T细胞激活剂），和（2）共价连接到也衍生自人β-肌动蛋白的20-碱基DNA序列（o20b(+)act）（SEQ ID NO. 4，第二结合子DNA序列）上的抗-人CD28单克隆抗体（抗CD28）。此类DBTA组合物表示为“DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]”。另一种DBTA组合物包括该滚环扩增产物（RCAact）和以下组分：（1）共价连接到衍生自人β-肌动蛋白的20-碱基DNA序列（o20b(+)act）（SEQ ID No. 4，第一结合子 DNA序列）上的抗CD3，和（2）抗CD28。此类DBTA组合物表示为“DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 未修饰的抗CD28]”。在下表1中给出了用于生成滚环扩增产物RCAact的RCA模板和引物的序列，以及相应的第一结合子DNA序列和第二结合子DNA序列：
表1：第一结合子 DNA序列、第二结合子DNA序列和用于生成滚环扩增产物RCAact的RCA模板和引物的序列
修饰关键：Phos = 5' 磷酸酯, Mal = 马来酰亚胺官能团, C6 = 己基氨基修饰
| 名称 | 意义 | 长度(碱基(b)) | 序列(5' → 3')包括修饰 | 用途/应用 |
| RCA引物(SEQ ID NO.1) | - | 20 | TGA CTA TTA AGA CTTCCT GT | RCA反应的引物, 衍生自人β-肌动蛋白的序列 |
| RCA模板(CpG)(SEQ ID NO.2) | + | 43 | /Phos/TTA ATA GTCATT CCA AAT ATG AGATGC GTT GTT ACAGGA AGT C | RCA反应的模板, 衍生自人β-肌动蛋白的序列并且含有CpG岛 |
| RCA模板(无-CpG)(SEQ ID NO.3) | + | 43 | /Phos/TTA ATA GTCATT CCA ACA TAT GAGATG GTT GTT ACAGGA AGT C | RCA反应的模板, 衍生自人β-肌动蛋白的序列并且不含CpG岛 |
| o20b(+)act(SEQ ID NO.4) | + | 20 | /MalC6/ACA GGA AGTCTT AAT AGT CA | 经由5'-马来酰亚胺缀合至Ab并且结合到人β-肌动蛋白衍生的RCA产物 |
合成抗CD3-DNA和抗CD28-DNA的缀合物
该第一结合子DNA序列和第二结合子DNA序列与抗CD3和抗CD28抗体（Abs）的共价连接分别经由下述马来酰亚胺-硫醇偶联策略来进行。抗CD3-o20b(+)act（抗CD3-DNA）和抗CD28-o20b(+)act（抗CD28-DNA）缀合物合成、纯化和表征的以下具体描述可以作为一般缀合策略适用于不同的抗体（Ab）克隆以及具有不同长度和组成的不同的第一和第二结合子核酸序列。
制备马来酰亚胺活化的第一结合子DNA序列和第二结合子DNA序列
在该实施例中，该第一结合子DNA序列和该第二结合子DNA序列具有相同的核苷酸序列。该方法已经对第一结合子 DNA序列进行了描述，但是其也适用于第二结合子DNA序列。起始DNA序列（prot-mal-o20b(+)act）（TriLink Biotechnologies, San Diego, CA, USA）包括20-碱基第一结合子DNA序列，其用后接受保护的三环马来酰亚胺部分（prot-mal）的N端C6间隔基封端。经由逆电子需求Diels-Alder脱保护步骤由prot-mal-o20b(+)act生成反应性马来酰亚胺活化衍生物（mal-o20b(+)act）。马来酰亚胺活化的第一结合子DNA序列（mal-o20b(+)act）悬浮在无水甲苯（~1 mg/mL）中并在90℃下加热4小时。使用台式离心沉淀该马来酰亚胺活化的第一结合子DNA序列（mal-o20b(+)act）并除去溶剂。沉淀的mal-o20b(+)act用冷乙醇洗涤（3×1 mL）。在减压下进一步减少残余有机溶剂后，洗涤过的固体产物溶解在100 mM HEPES缓冲液（pH 7.3）中。经由UV-可见光谱法（NanoDropTM Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltam, MA, USA）测定mal-o20b(+)act的最终浓度。所得储备溶液（以DNA计0.5-1 mM）直接用于与硫醇修饰抗体的抗体缀合。剩余的mal-o20b(+)act储备溶液在-20℃下贮存几个月而不发生显著的反应性损失。
制备硫醇修饰抗体中间体
首先在100 mM HEPES缓冲液（pH 7.3）中制备Traut试剂（2-亚氨基硫烷盐酸盐）的10mM储备溶液。随后将抗CD3 Ab（OKT3克隆, eBioscience, Thermo Fisher Scientific,Waltam, MA, USA）或抗CD28 Ab（9.3克隆, GeneTex, USA）在PBS中的1 mg/mL溶液与20×pH 8.5硼酸盐缓冲液（Thermo Fisher Scientific, Waltam, MA, USA）和10-15 mM Traut试剂储备溶液以8:1:1的体积比混合。所得溶液充分混合，并在室温下孵育0.75-1.25小时。Traut混合物的未使用部分可以在-20℃下贮存几个月而不会显著地损失反应性，但是优选新鲜溶液。在抗体活化后，使用常规脱盐柱（例如NAP-5或PD-10, GE Healthcare LifeSciences）将反应混合物纯化，所述脱盐柱已经用100 mM HEPES（pH 7.3）缓冲液平衡。收集的级分随后立即通过UV-可见光谱法（NanoDropTM Spectrophotometer, Thermo FisherScientific, Waltam, MA, USA）进行分析。使用已知的280 nm下的抗体摩尔消光系数测得，该阶段的所得蛋白质回收率通常对抗CD3和抗CD28 抗体均>60%。
马来酰亚胺活化的DNA序列（第一结合子DNA序列和第二结合子DNA序列）与硫醇修饰Ab中间体缀合以生成Ab-DNA缀合物（抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act）
为了生成抗体-DNA缀合物，将一定体积的mal-o20b(+)act添加到新鲜制备的、纯化的硫醇活化抗体的等分试样中以实现10-40:1 o20b(+)act:Ab的目标摩尔输入比。在充分混合后，令所得溶液在25℃下孵育整夜（16-24小时）。使用饱和氯化铵溶液经由Ab的选择性沉淀来实现最终缀合物的纯化。首先，加入等于总反应体积的一定体积的饱和氯化铵，充分混合，并放置在冰上。在15分钟后，样品在10℃下以15,000×g相对离心力（rcf）离心10分钟。移除上清液，随后加入适当的最小体积的0.1 M磷酸钠、0.15 M NaCl、pH 7缓冲液以重新溶解最终的团粒。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific, Waltam, MA,USA）结合用于测定DNA含量（ε = 210,100 M-1 cm-1）的A260测量（NanoDropTM Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltam, MA, USA）测定该抗体- DNA缀合物（Ab-DNA）的最终回收率和标记效率。在这些条件下，可以将一到五个第一结合子DNA序列连接到抗CD3抗体的各分子上和/或可以将一到五个第二结合子DNA序列连接到抗CD28抗体的各分子上。通常以>60%的最终缀合物回收率实现连接。或者，还通过补充参考材料Anal Chem. 2014年4月15日; 86(8): 3869-3875中描述的方法测量了抗体-DNA缀合物标记和产率。使用分析级尺寸排阻色谱法（SEC）对标准蛋白质尺寸校准曲线确定了缀合物纯度的进一步确认。典型的分析SEC条件如下：10 µL样品注入体积，0.5 mL/min流速，30 min运行，使用100 mM磷酸钠、100 mM硫酸钠、0.05%叠氮化钠、pH 6.7缓冲剂在TSK Gel3000SWxL柱（TOSOH Bioscience, Tokyo, Japan）上。典型的分析SEC洗脱时间如下：未标记的Ab = 16.8-17.0 min，未连接的o20b(+)act = 20.0 min，Ab-DNA（Ab-o20b(+)act）缀合物混合物 = 10-15 min。纯化的最终Ab-DNA缀合物（在沉淀和再悬浮后）在SEC分析时显示未结合的DNA中间体或原材料的>95%的去除。
实施例2：验证抗CD3-DNA和抗CD28-DNA缀合物的T细胞结合
为了确保实施例1中制备的Ab-DNA缀合物保持它们对T细胞的特异性细胞结合能力，使用流式细胞术（Cytoflex S, Beckman Coulter）对各缀合物批次进行验证研究。正常外周血（NPB）Pan T细胞（AllCells, USA）在37℃下在10毫升温热的完全X-vivo培养基（参见表2）中解冻并随后在300 × g rcf下离心10分钟。细胞随后重新悬浮在10毫升新鲜的完全培养基中并在Nucleocounter® NC-200系统上分析以测定细胞计数和存活率。在将浓度调节至1×106个细胞/毫升并用PBS洗涤后，该T细胞在PBS中的10%正常山羊血清（NGS）中在4℃下封闭15分钟。在除去封闭溶液后，该细胞用1% NGS/PBS溶液中的抗体和抗体-DNA缀合物在4℃下孵育15分钟。在平行实验中，细胞用抗CD3-DNA（抗CD3-o20b(+)act）或抗CD28-DNA（抗CD28-o20b(+)act）孵育。用未连接或未修饰的抗CD3和抗CD28抗体孵育的细胞用作阳性对照物。在孵育后，该细胞在PBS中洗涤并用抗CD3和抗CD28抗体的对小鼠同种型特异性的荧光团标记的二级抗体的1% NGS/PBS溶液（Jackson ImmunoResearch, PA, USA）孵育。用于二级抗体标记的典型稀释是1:200的1毫克/毫升储备溶液。在4℃下孵育15分钟后，该细胞如前洗涤，重新悬浮在PBS中并通过流式细胞术分析以便相对于与未标记抗体结合的T细胞（阳性对照物）的百分比测定与Ab-DNA缀合物结合的T细胞的百分比。
图1A至1E显示了分别通过抗CD28-o20b(+)act、抗CD28抗体（未标记）、抗CD3-o20b(+)act、抗CD3抗体（未标记）和FITC标记的二级抗体的T细胞结合的代表性流式细胞术直方图。对于这些特定的Ab-DNA缀合物批次（抗CD28-o20b(+)act和抗CD3-o20b(+)act），观察到抗CD3和抗CD28细胞结合的更高百分比（对二者均>85%）。这些结果表明，尽管DNA连接，但是显著部分的抗CD3抗体和抗CD28抗体样品保留了它们的T细胞结合能力。
实施例3：采用滚环扩增制造用于T细胞活化的捕获核酸聚合物
生产滚环扩增产物（例如RCAact）作为用于T细胞活化的第二试剂的单链滚环扩增（ssRCA）方法包括两个步骤：1）连接线性DNA链以生成环状模板，和2）扩增连接的圆环以合成单链多联体。使用T4 DNA连接酶按照制造商方案（New England Biolabs®, MA, USA）完成该连接反应。在该连接反应中存在两种寡核苷酸。一种寡核苷酸（RCAact无-CpG, SEQ IDNO. 3）含有人β-肌动蛋白基因的核苷酸序列的43个碱基，并含有5'-磷酸酯基团。这种43-碱基寡核苷酸在连接反应后形成该环状模板。第二寡核苷酸的长度为20个碱基（RCAact引物）并与43-碱基寡核苷酸的两端互补。该第二寡核苷酸用于在连接反应（43-碱基的寡核苷酸的模板依赖性连接反应）之前形成环并随后在后继的ssRCA反应中扩增该环（参见图2）。对于连接反应，450 pmol的43-碱基寡核苷酸在120 µL体积中与300 pmol的20-碱基寡核苷酸在由10 mM Tris, pH 8和50 mM氯化钠组成的退火缓冲液中混合。该混合物在95℃下加热两分钟，并通过每秒降低该温度0.1℃来冷却至+4℃。在冷却后，该混合物升温至室温，并以480 µL的最终体积将96 µL的该退火反应与含有10 mM ATP和24 µl的T4 DNA连接酶（400单位/微升）的48 µL的10X T4 DNA连接酶缓冲液混合。令该连接反应在23℃下孵育20小时，并随后在65℃下孵育20分钟以便热杀灭该连接酶。
通过将69.3 µL的完成的连接反应混合物与550 µL的2X Phi29反应缓冲液（100mM HEPES缓冲液, pH 8.0, 150 mM氯化钾, 2 mM TCEP, 40 mM氯化镁, 0.02% (v/v)吐温20, 5% (v/v)聚乙二醇和1.6 mM的各dATP、dCTP、dGTP和dTTP）混合来进行该ssRCA反应，最终体积为1.078 mL。在混合后，加入22 µL的1 mg/ml Phi29 DNA聚合酶以启动滚环扩增。扩增混合物在30℃下孵育18小时并随后在65℃下孵育15分钟以便热杀灭该聚合酶。完成的ssRCA反应混合物等分到三根单独的试管中，并通过加入0.1体积3M乙酸钠和2.5体积95%(v/v)乙醇来沉淀。令沉淀物在室温下静置30分钟，随后在高速（>20,000 × g）下离心30分钟。通过抽吸除去上清液，各DNA团粒用500 µL的70%(v/v)乙醇冲洗并随后在高速（>20,000× g）下再次离心5分钟。再次通过抽吸除去上清液，该DNA团粒重新悬浮在TET缓冲液中（10mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA和0.01%(v/v)吐温20）。
通过脉冲场凝胶电泳相对于酵母（S. cerevisiae）或λ DNA分子量阶梯测定滚环扩增产物（RCAact）表观尺寸。此外，为了证实抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act缀合物（实施例1）与RCAact的杂交，采用脉冲场分析或使用非变性琼脂凝胶的凝胶移位测定。
实施例4：使用Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28和DBTA系统（DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]和DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 未修饰的抗CD28]）比较T细胞活化和扩增
来自AllCells的人Pan T细胞（USA, Catalog# PB009-IF）的冷冻等分试样用于所有活化和扩增研究。如实施例2中所述将Pan T细胞解冻和处理，并加入到以下完全X-vivo培养基（Lonza, Basel, Switzerland）中以获得如表2中所示的1×106个细胞/毫升的初始浓度。
表2：完全X-vivo培养基的组分
| 组分 | 供应商 | 目录编号 | 培养基中的最终浓度 | 体积(mL) |
| 人血清(脱凝块) | Valley Biomedical (VA, USA) | HS1017 | 5% | 50 |
| Glutamax 1-CTS | Gibco (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) | A12860-01 | 1% | 10 |
| Pen-Strep | Thermo Fisher Scientific (MA, USA) | 15140-122 | 1% | 10 |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma (Merck, USA) | A9165 | 0.8% | 8 |
| IL-2 | Thermo Fisher Scientific (MA, USA) | 200-02 | 200 IU | 0.152 |
| X-Vivo培养基 | Lonza (Basel, Switzerland) | BE04-743Q | 92% | 1000 |
典型的活化和扩增实验以6孔格式使用每孔2毫升接种体积进行，每种受试条件最少一次附加的重复。根据制造商的说明书制备Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28（Catalog# 111.41D, ThermoFisher, USA）。简而言之，将珠粒等分试样用0.3 mL完全培养基洗涤三次，在样品应用于DynaMag-2永磁体（ThermoFisher Scientific, USA）后除去上清液洗液。在重新悬浮在完全培养基中之后，每孔加入60 µL珠粒浆料等分试样，使得大约3:1珠粒/细胞比用于初始活化条件（从每孔2×106个总细胞开始）。
除非另行规定，DBTA组分（抗CD3-DNA、未修饰的抗CD28或抗CD28-DNA、和RCAact）的等分试样直接由其各自的储备溶液（储存在4℃下）单独和连续地加入到细胞中。可以以任意顺序进行各DBTA组分的添加。DBTA组分的标准初始浓度如下：抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act各自为1 µg/mL（6.7 nM），RCAact为10倍摩尔过量（~67 nM）。RCAact浓度基于重复的43-碱基寡核苷酸的摩尔浓度并与总RCA产物长度或多分散性无关。在加入所有适当的DBTA组分之后，孔内容物用1 mL移液管混合。该板随后在37℃和5% CO2气氛下在静态条件下孵育1-7天或更久，采取周期等分试样，并按需用新鲜培养基进行稀释以便继续进行扩增和分析。通过在24小时孵育（第1天）后使用流式细胞术测量CD25表达来实现细胞活化的证实，如果需要的话随后在第4天和第7天进行附加测量。使用Nucleocounter（ChemoMetec, Allerod, Denmark）在第4天和第7天附加地测量细胞计数、存活率和尺寸（爆发）。基于第4天的细胞计数，用新鲜的完全培养基进行1:4或1:8稀释以便将细胞密度降低至每孔250,000个细胞/毫升。这使得细胞能够在指数期内扩增，而不会过度生长，直到第7天分析。对于阴性对照物（“仅细胞”样品组，其中未加入活化剂），细胞密度维持在最低500,000个细胞/毫升。对所选目标样品，在第7天经由流式细胞术进行进一步的表型分析。所研究的细胞表面标志物小组包括CD4、CD8、CD27、CD28、CD3、CD57、CD25和CD62L。图3A和图3B表明，采用DBTA系统实现了显著的活化和扩增，其中仅抗CD3抗体缀合到o20b(+)act上，并且抗CD28作为未修饰的可溶性抗体（DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 未修饰的抗CD28]）加入。当比较第1天和第4天的CD25表达和在第4天和第7天的x倍细胞扩增时，实验用Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28作为对照物进行。含有未修饰抗体、单独的RCAact、含有未缀合结合子核酸序列的未修饰抗体（游离的o20b(+)act）和细胞的对照物样品如预期那样显示出非常低的活化和扩增水平。图3A和3B包括来自五个单独的实验、七个单独的人T细胞供体和4个不同批次的抗体缀合物的数据。图4A和图4B显示了用其中抗CD3和抗CD28抗体均连接到结合子DNA序列上的DBTA组合物（DBTA [抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]）实现了最佳性能。图4A和图4B的数据表示取自涵盖超过6个单独的人T细胞供体的超过5个单独的实验的平均值。
实施例5：使用Dynabeads®（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）Human T-Expander CD3/CD28和核酸聚合物（RCAact）与Ab-DNA缀合物（抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act）的DBTA系统进行大规模T细胞活化和扩增的比较
除了如实施例4中所示的6-孔板研究之外，进行使用72C VueLife®袋（CellGenixGmbH, Breisgau, Germany）的T细胞活化与扩增效率的大规模比较。与实施例4中所述相同的比率和组分线性缩放以适应32毫升的完全X-vivo培养基中32 × 106个细胞（1 × 106个细胞/毫升）的起始条件。该培养物保持在标准细胞培养箱中的72C VueLife袋（CellGenixGmbH, Breisgau, Germany）中。在第4天，收集细胞，用新鲜的培养基洗涤，计数，在适当的培养基体积中稀释以提供0.5 × 106个细胞/毫升，并在VueLife 72C袋中重新接种。在第6天，细胞在摇动的WAVE 生物反应器TM平台（GE Healthcare, Bio-Sciences）上在该Wave袋中以250毫升稀释并接种以便进一步扩增。到第8天，使用Nucleocounter®（ChemoMetec,Allerod, Denmark）将细胞计数并通过流式细胞术检查各CD表面标志物的表达。下表3-5描绘了Dynabeads®样品和用DBTA活化的那些样品的CD25表达、x倍扩增、细胞尺寸以及存活率的可比较的水平。此外，第8天的流量分析显示对Dynabeads®和DBTA而言整个CD标志物小组的表型表达水平几乎相同。制备和结果显示在下表3-5中。
表3：在第4天和第8天的细胞计数
表4：作为群百分比的细胞存活率
表5：第8天的细胞流式细胞术结果
实施例6：在细胞培养物添加前一起加入预缔合的DBTA组分vs在活化开始时单独加入所有DBTA组分的效果
进行了一系列T细胞活化实验以评估预孵育或预缔合所有DBTA系统组分（例如抗CD3-DNA(抗CD3-o20b(+)act)、抗CD28-DNA(抗CD28-o20b(+)act)和RCAact）并随后向T细胞中加入预缔合复合物的效果。结果与向T细胞中单独添加各单独组分以便原位缔合的标准方案进行比较。对这些预缔合样品，在1.5 mL试管中一起加入与实施例4中所用相同量和比率的DBTA组分，充分混合并在室温下孵育30分钟。预缔合的DBTA混合物随后添加到6孔板中新鲜的T细胞培养基中。平行地，并如实施例4中进行的那样，将未施以预缔合的标准DBTA样品加入到T细胞培养基中。结果与Dynabeads®和仅细胞对照样品（分别为阳性和阴性对照物）进行比较。
图5A和图5B显示无论是在添加（预缔合的DBTA[抗CD3-DNA + 抗CD28-DNA]）前预孵育/预缔合所有DBTA组分（抗CD3-DNA、抗CD28-DNA和RCAact）或单独添加以便原位缔合（原位DBTA[抗CD3-DNA + 抗CD28-DNA]）均可以实现水平相当的早期活化（24小时处的CD25表达）和第4天细胞扩增。图5A显示了在24小时孵育后的CD25表达，图5B显示了4天后的细胞扩增。两组DBTA样品均导致T细胞的显著的活化和扩增。该数据衍生自两个独立的试验，其特点是四种不同的人T细胞供体和四个不同批次的Ab-DNA缀合物。
实施例7：不同的输入DBTA组分（Ab-DNA缀合物和RCAact）量对T细胞活化效率的影响
进行了一系列T细胞活化实验以评估不同比率的抗CD3-DNA:抗CD28-DNA对T细胞活化与扩增的效果。在所有情况下，RCAact浓度保持在67 nM，而检查了1:1 vs 1:2摩尔比的抗CD3-DNA:抗CD28-DNA缀合物。保持实施例4中概述的所有其它方案条件。
图6A和图6B表明，在不同的Ab-DNA和RCAact的输入量下分别实现了足够的T细胞活化（24小时处的CD25表达）和细胞扩增（在第4和第7天）。如图6A和图6B中所示：i）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（1:1）表示其中两种Ab-DNA缀合物的浓度均为1 µg/mL（6.7 nM）的研究，ii）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（1:2）表示抗CD3-DNA浓度为1 µg/mL且抗CD28-DNA浓度为2 µg/mL；iii）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（0.5:1）表示抗CD3-DNA浓度为0.5 µg/mL且抗CD28-DNA浓度为1 µg/mL；iv）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（0.25:0.5）表示抗CD3-DNA浓度为0.25 µg/mL且抗CD28-DNA浓度为0.5 µg/mL；和v）抗CD3-DNA:抗CD28-DNA（0.25:0.25）表示抗CD3-DNA浓度为0.25 µg/mL且抗CD28-DNA浓度也为0.25 µg/mL。用Ab-DNA缀合物（0.25 µg/mL输入或~1.7 nM）和RCAact（~67 nM）的最低输入量（显示为抗CD3-DNA:抗CD28-DNA(0.25:0.25)）实现了最低的CD25表达水平（60%）。但是，这种活化水平仍然超过了仅细胞阴性对照物（20%）。要注意的是，甚至通过使用低于标准输入量的抗CD3-DNA缀合物（0.5 µg/mL）（显示为抗CD3-DNA:抗CD28-DNA (0.5:1)）也实现了显著的活化（在CD25表达方面为90%）。该实施例的数据衍生自三个独立的试验，其特点是五种不同的人T细胞供体和四个不同批次的Ab-DNA缀合物。CD3/CD28 Dynabeads®和仅细胞对照样品分别用作阳性和阴性对照物。
实施例8：在加入用于T细胞活化的RCA聚合物产物之前预孵育DBTA抗体缀合物与T细胞的效果
进行实验以评估在30分钟后单独地二次添加滚环扩增产物（RCAact）之前向T细胞培养基中加入抗CD3-DNA和抗CD28-DNA抗体缀合物以生成Ab-DNA/细胞预孵育样品的效果。用于该研究的抗CD3-DNA:抗CD28-DNA比为1:1。该结果与其中所有DBTA组分单独同时加入以便原位缔合的程序进行比较。对该实验，遵循实施例4中概述的所有其它方案细节和量。对于原位缔合方案，所用的抗CD3-DNA:抗CD28-DNA比为1:1和1:2。
图7A显示了较低的早期活化（24小时处的CD25表达），图7B显示了相对于其中同时加入DBTA组分的程序（表示为原位DBTA[抗CD3-DNA:抗CD28-DNA](1:1)和原位DBTA[抗CD3-DNA:抗CD28-DNA](1:2)）该Ab-DNA/细胞预孵育样品（预孵育的Cells-DBTA[抗CD3-DNA:抗CD28-DNA](1:1)）在第7天减弱的扩增。
实施例9：不同的输入Ab-DNA缀合物与RCA产物之比对T细胞活化效率的影响
进行了一系列T细胞活化实验以评估不同的Ab-DNA:RCAact输入比对T细胞活化效率的影响。在所有情况下，仅使用抗CD3-DNA（抗CD3-o20b(+)act）缀合物，并已经在图8A和图8B中显示为Ab-DNA。各Ab-DNA缀合物样品，特点是相同的用于活化的每孔标准浓度（1 μg/mL输入或6.7 nM），同时研究了三种对数范围的输入RCAact产物（6.7 nM、67 nM和670 nM）。研究了由含有CpG的RCA模板和不含CpG的RCA模板制得的滚环扩增产物（参见实施例1和表1）。使用由不含CpG的RCA模板制得的滚环扩增产物，采用以下实验条件：i）Ab-DNA:RCAact的比为1:10（表示为No CpG, 1:10 Ab-DNA:RCA）；ii) Ab-DNA:RCAact的比为1:1（表示为NoCpG, 1:1 Ab-DNA:RCA）；和iii）Ab-DNA:RCAact的比为1:100（表示为No CpG, 1:100 Ab-DNA:RCA）。类似地，对于由含有CpG的RCA模板制得的滚环扩增产物，采用下列实验条件：i）Ab-DNA:RCAact的比为1:10（表示为CpG, 1:10 Ab-DNA: RCA）；ii）Ab-DNA:RCAact的比为1:1（表示为CpG, 1:1 Ab-DNA: RCA）；和iii）Ab-DNA:RCAact的比为1:100（表示为CpG, 1:100Ab-DNA: RCA）。对两组实验，在1:10的Ab-DNA:RCAact比下实现了最佳T细胞活化（由CD25表达测得）。在较高和较低的Ab-DNA RCA比下均观察到降低的活化效率。但是，所有样品在该实验的第7天显示10倍或更大的细胞扩增。保持实施例4中概述的所有其它方案细节和量。图8A显示培养1天和4天后的%CD25表达，图8B显示了4天和7天后的细胞扩增。
实施例10：使用具有不同序列与长度的捕获寡核苷酸的替代滚环扩增产物证实人T细胞活化与扩增
本公开所有先前的实施例（实施例1-9）和相关附图（图1-8）采用了使用具有衍生自人β-肌动蛋白的序列的滚环扩增产物的DBTA系统（实施例1）。采用包含具有各种核苷酸序列和长度的捕获寡核苷酸的替代捕获核酸聚合物也实现了成功的人T细胞活化与扩增。一种替代实例特点是衍生自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）基因组的滚环扩增产物。相应的互补第一结合子DNA序列和第二结合子DNA序列被称为o25b(+)mrsa（SEQ. ID. No. 7），相应的DBTA产物被称为DBTA[抗CD3-o25b(+)mrsa + 未修饰的抗CD28]或DBTA[抗CD3-o25b(+)mrsa + 抗CD28-o25b(+)mrsa]。这些DBTA组分各自的具体序列信息显示在下表6中：
表6：序列信息.
图9A和图9B显示了DBTA[抗CD3-o25b(+)mrsa + 未修饰的抗CD28]关于第1天和第4天后的CD25表达（图9A）以及第4天和第7天后的x倍细胞扩增（图9B）的显著性能。这些结果与上述实施例中显示的β-肌动蛋白衍生的DBTA系统（DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 未修饰的抗CD28]）相当。还用未修饰抗体、单独的滚环扩增产物（仅RCA产物(MRSA)）和仅细胞阴性对照物进行了对照实验。阴性对照物显示了极低水平的活化与扩增。要注意的是，对Ab-DNA的合成、对滚环扩增方法和对细胞培养程序，包括上文对β-肌动蛋白DBTA所述摩尔量，遵循完全相同的方案。
实施例11：使用特点是裂解的滚环扩增产物的基于MRSA的DBTA组合物DBTA[抗CD3-o25b(+)mrsa + 未修饰的抗CD28]证明人T细胞活化与扩增
使用基于MRSA的DBTA系统（对于用于生成全长RCA产物的一般条件，参见实施例10和实施例3）对使用不同尺寸的滚环扩增（RCA）产物的人T细胞活化和扩增效率进行比较。对于这些实验，对全长RCA产物施以超声处理条件，产生不同的相对尺寸分布。为了产生超声处理的RCA产物，根据制造商推荐的输入条件使用Covaris M220 Focused超声波仪™（Covaris,Woburn, MA）以便从大的基因组DNA片段开始产生1500个碱基（b）和150个碱基（b）大小的片段。目标输入参数包括峰值入射功率、占空因数、每次爆发的周期、处理时间和温度。在超声处理后，根据实施例1的条件使用分析级尺寸排阻色谱法以确认产物的相对尺寸分布。虽然通过该方法无法得知RCA产物的绝对尺寸和分子量测定，但是观察到较小片段的洗脱时间增加的预期总趋势。由此观察到以下洗脱时间：10.1分钟（对应于空隙体积）对~16Kb（理论最大长度）全长RCA产物，10.8分钟对1.5 Kb超声处理RCA产物，14.8分钟对0.15 Kb超声处理RCA产物，19.2分钟对起始43-碱基RCA模板（对照物注入），20.0分钟对未缀合的o25b(+)mrsa（对照物注入），23.7分钟对包括核苷酸的残余小分子。也通过凝胶电泳法测定了1.5Kb超声处理产物的大小，并发现如预期那样含有尺寸为400-1600个碱基的片段（接近1.5Kb的目标范围），因为超声处理不能提供单一长度的产物。
图10A和图10B显示RCA产物越大，在第1天和第4天后的活化（参见图10A的%CD25表达）和扩增就越高。但是，该趋势在研究后期变得不太明显。特别是到第7天，所有三种不同尺寸的RCA产物均产生了水平相当的细胞扩增（图10B）。
实施例12：通过改变连接到各T细胞激活剂和/或T细胞共刺激分子上的结合子DNA序列的量控制T细胞活化
合成连接到第一结合子DNA序列上的抗CD3抗体（抗CD3-o20b(+)act）和连接到第二结合子DNA序列上的抗CD28抗体（抗CD28-o20b(+)act）的实验条件如实施例1中所述，除了制备抗体-DNA缀合物以产生不同的DNA（D）:抗体（P）的比。这样做的目的是控制连接到第一结合子DNA序列上的抗CD3抗体和连接到第二结合子DNA序列上的抗CD28抗体与该滚环扩增产物的杂交水平。图11显示了两种不同的D/P比下DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]的性能。与1.5-1.8的D/P比（表示为DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act] (D/P 1.5-1.8)）相比，通过CD25表达测得的T细胞活化在2.8-3.0的DP比（表示为DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act] (D/P 2.8-3.0)）下更高。观察到的T细胞活化在较高的D/P比下也较高。图11的数据表示取自8个独立实验的平均值。
实施例13：使用Ab-DNA缀合物和阳离子捕获聚合物的T细胞活化与扩增
合成抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act的实验条件已经描述在实施例1中。市售Jet PEI®（VWR International, Pennsylvania, USA, Catalog Number 89129-914）和聚-L-赖氨酸（PLL）（Sigma-Aldrich, Missouri, USA, Catalog Number P9155）用作该实验的第二试剂。该研究中采用的N/P比（阳离子捕获聚合物的胺基团的摩尔数对结合子DNA序列的磷酸酯基团的摩尔数的比）为：Jet PEI®的N/P为3，PLL的N/P为1。该抗CD3-o20b(+)act和抗CD28-o20b(+)act缀合物以1 µg/mL的浓度使用。遵循实施例1中概述的所有方案细节和量。对于T细胞活化，遵循实施例4中描述的方案。图12A和图12B显示了使用抗CD3-o20b(+)act、抗CD28-o20b(+)act和阳离子捕获聚合物（PEI或PLL）的T细胞的活化与增殖。
实施例14：控制CD4:CD8T细胞比
来自AllCells的人Pan T细胞（Catalog# PB009-IF）的冷冻等分试样用于所有活化和扩增研究。如实施例2中所述解冻和处理Pan T细胞，并添加到以下完全X-vivo培养基中以获得1×106个细胞/毫升的初始浓度。
典型的活化和扩增实验以6孔格式使用每孔2毫升接种体积进行，每种受试条件最少一次附加的重复。除非另行规定，将DBTA组分（抗CD3-DNA、抗CD28-DNA和RCAact）的等分试样直接由其各自的储备溶液单独和连续地加入到细胞中。可以以任意顺序进行各DBTA组分的添加。DBTA组分的标准初始浓度如下：抗CD3-DNA和抗CD28-DNA为1 µg/mL（6.7 nM），RCAact为10倍摩尔过量（~67 nM）。RCAact浓度基于重复的43-碱基片段的摩尔浓度并与总RCA产物长度或多分散性无关。抗-4-1BB抗体在一些实验中用作T细胞共刺激分子。通过实施例1中描述的方案合成抗-4-1BB-DNA。抗-4-1BB-DNA以100 ng/mL的浓度使用。在加入所有适当的活化组分之后，孔内容物用1 mL移液管混合。该板随后在37℃和5% CO2气氛下在静态条件下孵育1-7天或更久，采取周期等分试样，并按需用新鲜培养基进行稀释以便继续进行扩增和分析。
在24小时孵育后使用流式细胞术通过CD25表达来测量T细胞活化，如果需要的话随后在第4天和第7天进行附加测量。使用荧光染料缀合的抗CD4和抗CD8抗体通过流式细胞术追踪CD4:CD8 T细胞的比。使用Nucleocounter在第4天和第7天附加地测量细胞计数、存活率和尺寸（爆发）。基于第4天的细胞计数，用新鲜的完全培养基进行1:4或1:8稀释以便将细胞密度降低至每孔250,000个细胞/毫升。这使得细胞能够在指数期内扩增，而不会过度生长，直到第7天分析。对于其中未加入活化剂的阴性对照物（“仅细胞”）样品组，细胞密度维持在最低500,000个细胞/毫升。
图13A和图13B分别显示了使用DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗CD28-o20b(+)act]和DBTA[抗CD3-o20b(+)act]在7天扩增期内CD4和CD8 T细胞的扩增。当在基于IL-2的培养基中使用DBTA[抗CD3-o20b(+)act]时在第7天观察到更高比例的CD8细胞（相对于第1天）。图14显示了通过使用DBTA[抗CD3-o20b(+)act + 抗-4-1BB-o20b(+)act]进一步提高CD8细胞相对于CD4细胞的比例的另一种方法。
实施例15：使用包含连接到二级抗体上的第一结合子DNA序列和/或第二结合子DNA序列（二级Ab-DNA缀合物）和未修饰的抗CD3和抗CD28 抗体的系统的T细胞活化
第一结合子DNA和/或第二结合子DNA序列连接到二级抗体抗体上以生成二级Ab-DNA缀合物：
靶向不同的小鼠 IgG亚型（山羊抗小鼠IgG (H+L), catalog # 115-005-062；山羊抗小鼠IgG1, catalog # 115-005-205；山羊抗小鼠IgG (1+2a+2b+3), catalog # 115-005-164和山羊抗小鼠IgG2a, catalog # 115-005-206）的二级抗体获自JacksonImmunoresearch并如上文在实施例1中对抗CD3和抗CD28缀合物所述那样缀合到结合子DNA序列o20b(+)act上。
使用下列组分如实施例4中所述进行T细胞活化：i）2或4 µg/mL的二级Ab-DNA缀合物（抗-IgG2a-o20b(+)act），ii）1 µg/mL浓度的未修饰的一级抗体抗CD3和抗CD28，和iii）10倍摩尔过量（相对于一级抗体抗CD3和抗CD28）的RCAact。仅细胞和CD3/CD28 Dynabeads®分别用作阴性和阳性对照物。DBTA[抗CD3-o20b(+)act+抗CD28-o20b(+)act]以及未修饰的抗CD3（1µg/mL）、抗CD28（1µg/ml）和IgG2-特异性二级（4µg/mL）抗体的混合物用作两个附加的对照物。图15表明，使用二级Ab-DNA缀合物、未修饰的抗CD3和抗CD28抗体以及RCAact可以实现与使用实施例4的DBTA组合物所实现的类似水平的活化。
实施例16：激活自然杀伤细胞
靶向小鼠IgG1亚型（山羊抗小鼠IgG1, catalog # 115-005-205）的二级抗体获自Jackson Immunoresearch并如上文在实施例1中对抗CD3和抗CD28抗体连接到结合子DNA序列上所述那样连接到结合子DNA序列o20b(+)act上。
外周血CD56+ CD16+自然杀伤细胞（Lonza, Basel, Switzerland, Catalog #2W-501）的冷冻等分试样用于该活化研究。所用培养基是X-Vivo 20（Lonza, Basel,Switzerland, Catalog# 04-448Q），其补充有5%脱凝块人血清（Valley Biomedical, VA,USA, Catalog# HS1017）和500 IU/mL的IL-2（Peprotech, NJ, USA, Catalog# 200-02）。在48孔板中进行活化实验，采用500 µL接种体积和106个细胞/毫升的密度。为了活化，使用一级抗体的两种组合：i）抗CD335 + 抗CD2和ii）抗CD335 + 抗CD244。该抗CD335获自eBioscience™（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, Catalogue # 16-3359-85），抗CD2获自Becton Dickinson（NJ, USA, Catalog No.555323），抗CD244获自eBioscience™（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, Catalog#: 16-5838-85）。采用下列组分进行自然杀伤细胞活化：二级Ab-DNA缀合物（IgG1-o20b(+)act）、未修饰的一级抗体组合（抗CD335 + 抗CD2；或抗CD335 + 抗CD244）和RCAact。对照组具有单独的可溶性抗体或仅细胞样品。用于该研究的抗体浓度显示在表7中。
表7：用于自然杀伤细胞活化研究的组分的浓度
| 组 | RCAact | 抗CD335 | 第二一级抗体 | 第二一级抗体的浓度 | 抗-IgG1-o20b(+)act |
| 抗-IgG1-o20b(+)act + RCAact + 抗CD335+和抗CD2 | 67 nM | 1.0 µg/mL | 抗CD2 | 2.0 µg/mL | 8.0 µg/mL |
| 抗CD335+和抗CD2 | - | 2.5 µg/mL | 抗CD2 | 5.0 µg/mL | - |
| 抗-IgG1-o20b(+)act + RCAact + 抗CD335+和抗CD244 | 67 nM | 2.5 µg/mL | 抗CD244 | 5.0 µg/mL | 20 µg/mL |
| 抗CD335+和抗CD244 | - | 2.5 µg/mL | 抗CD244 | 5.0 µg/mL | - |
在加入所有适当的活化组分后，孔内容物用1毫升移液管混合。该板随后在37℃和5% CO2气氛下在静态条件下孵育24小时。在24小时（第1天）孵育后采用流式细胞术通过CD25表达实现了细胞活化的确认。图15表明与单独的可溶性抗体和细胞相比采用二级抗体-DNA缀合物获得了更高的CD25表达。
序列表
<110> GENERAL ELECTRIC COMPANY
<120> 用于细胞活化的方法和试剂盒
<130> 312704-2
<140>
<141>
<160> 7
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
引物
<400> 1
tgactattaa gacttcctgt 20
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 5' 磷酸酯
<400> 2
ttaatagtca ttccaaatat gagatgcgtt gttacaggaa gtc 43
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 5' 磷酸酯
<400> 3
ttaatagtca ttccaacata tgagatggtt gttacaggaa gtc 43
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 5' 马来酰亚胺官能团和C6间隔基
<400> 4
acaggaagtc ttaatagtca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
引物
<400> 5
atcaatgatg cataacatct 20
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 5' 磷酸酯
<400> 6
catcattgat ttagacactg aaaaagttcg aggagatgtt atg 43
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 5' 马来酰亚胺官能团和C6间隔基
<400> 7
catcattgat ttagacactg aaaaa 25
Claims (21)
1. 活化免疫细胞的方法，该方法包括：
a）提供免疫细胞群；和
b）使该免疫细胞群与第一试剂和第二试剂接触，
其中该第一试剂包含连接到第一结合子部分上的免疫细胞激活剂，
其中该第二试剂包含至少一种捕获低聚物，且
其中该至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子部分缔合。
2.权利要求1的方法，其中该第一结合子部分是第一结合子核酸序列。
3.权利要求2的方法，其中该免疫细胞激活剂经由共价键连接到该第一结合子核酸序列上。
4.权利要求1、2或3的方法，其中该至少一种捕获低聚物是捕获寡核苷酸，并且其中该至少一种捕获寡核苷酸与该第一结合子核酸序列互补。
5.上述权利要求的一项或多项的方法，其中该第二试剂是滚环扩增产物。
6.上述权利要求的一项或多项的方法，其中该免疫细胞是T细胞，该免疫细胞激活剂是T细胞激活剂。
7.权利要求6的方法，其中该T细胞激活剂是抗CD3抗体或其片段。
8.权利要求6或7的方法，进一步包括使T细胞群与T细胞共刺激分子接触，如抗CD28抗体、其片段、抗-4-1BB抗体、其片段、及其组合。
9.权利要求2的方法，其中该免疫细胞激活剂经由中间结合子部分非共价连接到该第一结合子核酸序列上。
10.权利要求9的方法，其中该中间结合子部分选自二级抗体、生物素、亲和素及其组合。
11.权利要求9的方法，其中该中间结合子部分经由共价键连接到该第一结合子核酸序列上。
12.权利要求11的方法，其中该中间结合子部分能够经由非共价相互作用与该免疫细胞激活剂连接。
13.上述权利要求的一项或多项的方法，其中该第一试剂在含有该免疫细胞群的介质中原位形成。
14.上述权利要求的一项或多项的方法，其中该第二试剂是包含至少一种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物，并且其中该至少一种捕获寡核苷酸与该第一结合子核酸序列互补。
15.权利要求1-5、9-14的一项或多项的方法，其中该免疫细胞是自然杀伤细胞，且该免疫细胞激活剂是自然杀伤细胞激活剂，如抗CD335抗体、抗CD244抗体、抗CD2抗体或其组合。
16. 活化T细胞的方法，该方法包括：
a）向T细胞群中加入抗CD3抗体、连接到二级抗体上的第一结合子部分、和包含至少一种捕获低聚物的第二试剂；和
b）孵育T细胞群，
其中该二级抗体能够与抗CD3抗体连接，和
其中该至少一种捕获低聚物能够与该第一结合子部分缔合。
17.权利要求16的方法，其中该第一结合子部分是第一结合子核酸序列。
18.权利要求16或17的方法，其中该第二试剂是包含至少一种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物，并且其中该至少一种捕获寡核苷酸与该第一结合子核酸序列互补。
19.权利要求16、17或18的方法，进一步包括将T细胞共刺激分子添加到T细胞群中。
20. 权利要求20的方法，其中该T细胞共刺激分子选自抗CD28抗体、其片段、抗-4-1BB抗体、其片段、及其组合。
21. 试剂盒，包含
连接到第一结合子核酸序列上的免疫细胞激活剂；和
包含至少一种捕获寡核苷酸的捕获核酸聚合物，
其中该至少一种捕获寡核苷酸能够与该第一结合子核酸序列缔合。
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