CN110184239B

CN110184239B - 一种活性化t淋巴细胞培养液及其活性化t淋巴细胞的制备方法

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Publication number: CN110184239B
Application number: CN201910504262.4A
Authority: CN
Inventors: 杨罕闻
Original assignee: Lanlian Hangzhou Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Lanlian Hangzhou Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2039-06-12
Also published as: CN110184239A

Abstract

一种活性化T淋巴细胞培养液及其活性化T淋巴细胞的制备方法，属于细胞培养技术领域。包括AT细胞的培养和AT细胞的收获两大步骤。上述一种活性化T淋巴细胞培养液及其活性化T淋巴细胞的制备方法，其通过使用Lymactin‑T抗CD3单克隆抗体配合IL‑2，IL‑6的方法，效率极高的激活T淋巴细胞并诱导期快速增殖；并使用PMA和离子霉素配合的方法激活T细胞；该方法具有效率高，纯度高等优点。

Description

一种活性化T淋巴细胞培养液及其活性化T淋巴细胞的制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体为一种活性化T淋巴细胞培养液及其活性化T淋巴细胞的制备方法。

背景技术

T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，T细胞活化技术，是将患者血液抽出体外，在实验室中进行扩增和激活，最后将这些数量高、超高活性的T细胞回输回患者体内，激活全身的体液免疫和细胞免疫系统。现有活性化T淋巴细胞的制备，普遍存在效率低，纯度不高等问题。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种活性化T淋巴细胞培养液及其活性化T淋巴细胞的制备方法的技术方案，其通过使用Lymactin-T抗CD3单克隆抗体配合IL-2，IL-6的方法，效率极高的激活T淋巴细胞并诱导期快速增殖；并使用PMA和离子霉素配合的方法激活T细胞；该方法具有效率高，纯度高等优点。

所述的一种活性化T淋巴细胞培养液，其特征在于由以下物质组成：

5-7ml 的ALyS505N-0；

70-90ul的5x10^5 IU/ml IL-2；

15-25ul的5x10^5 IU/ml IL-6；

3-5ml自体血清。

6ml 的ALyS505N-0；

80ul的5x10^5 IU/ml IL-2；

20ul的5x10^5 IU/ml IL-6；

4ml自体血清。

所述的一种活性化T淋巴细胞培养液的活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将血浆处理后收集白细胞，将1-10ml白细胞移入50ml细胞试管中；

2）准备T75细胞培养瓶,对白细胞进行2小时的PBMCs培养；

3）准备T225细胞培养瓶作为AT 培养瓶，向AT培养瓶里加入10-15ml的5ug/mlLymactin-T，扣上盖子，前后温柔的摇晃AT培养瓶直到液体覆盖整个底部，放在室温静置培养2小时；

4）步骤2）PBMCs的2小时培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部，温柔的前后摇晃T75培养瓶使非黏附的细胞悬浮，转移细胞悬液到50ml试管中备用；使用下记方法洗涤AT培养瓶；用移液器重新使50ml试管中的细胞悬浮，平均的把2-10ml细胞悬液转移到每个AT培养瓶中；

4）在一个50ml试管中配制好AT培养液，AT培养瓶中加入培养液直到40ml；扣上AT培养瓶的盖子，温柔的摇匀，把AT培养瓶放入培养箱培养7天，37℃，5%CO₂；

5）AT细胞的收获：

a．准备新的50ml试管，制备培养液A：室温下向试管中加入43-46ml ALyS505N-0培养液、48-52ul 的2ug/ml 离子霉素和48-52ul的200ng/ml PMA；

b．准备新的250ml试管，用显微镜观察检测所有的AT培养瓶，再次确认内毒素检测结果为阴性，将所有培养液倒入250ml试管中；

c．转移25ml的培养液A到空的AT培养瓶中，放倒培养瓶；

d．离心250ml试管，离心过后，弃用上层液体；

e．将第c中的25ml培养液A转移到250ml试管中，重新使细胞悬浮，转移2-10ml细胞悬浮液到步骤b中重倒出培养液的AT培养瓶；

f．将AT培养瓶放入培养机培养2.8-3.2小时，37℃，5% CO₂；培养结束后，使用移液器上下转移液体几次使细胞悬浮，转移细胞悬液到一个新的250ml试管中；加入8-12mlALyS505N-0到培养瓶中，用移液器使细胞悬浮；转移细胞悬液到250ml试管中；用肉眼和显微镜观察试管底部的黏附细胞；离心250ml试管后，吸取弃用上层液体；用2-10ml的ALyS505N-0使细胞重新悬浮；如果使用了多个试管则转移所有的细胞悬液到其中一个试管内；加入ALyS505N-0直到50ml；用Trypan Blue stain计测细胞数量，计算存活率；离心250ml试管，吸取弃用上层液体，加入50ml ALyS505N-0使细胞悬浮；离心式管，取样用于FACS检测，准备细胞冷冻液暂存在冰上，执行无菌检测，将细胞暂存在冰上，向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀，冷冻保存。

所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤2）中：准备T75细胞培养瓶,加10ml室温下的ALyS505N-0培养液到每个培养瓶中,用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0,重新使细胞悬浮,加入1ml青链霉素双混合液，50ul的200mM L-谷氨酰胺；向每个T75细胞培养瓶里转移5ml细胞悬浊液，扣上培养瓶盖子，慢慢的摇晃瓶子以使细胞悬液均匀，放进培养箱培养2小时，37℃，5% CO₂；

所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤3）中：5ug/mlLymactin-T采用以下制备方法：把50ul的1mg/ml Lymactin-T加入10ml hanks缓冲液制成。

所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤4）中使用下记方法洗涤AT培养瓶，具体包括：

a．吸取，弃用培养瓶里的溶液。

b．向每个培养瓶里加入25ml 生理盐水并前后摇晃。

c．将生理盐水倒入一个无菌容器内，弃用。

d．重复b和c两次。

e．吸取清理培养瓶内和瓶嘴处剩余的溶液。

所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤5）中培养液A：室温下向试管中加入45ml ALyS505N-0培养液、50ul 的2ug/ml 离子霉素和50ul的200ng/ml PMA。

本发明使用的试剂均可以从市场上直接购得。

所述的IL-2是一种白介素，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性。加入IL-2能使T细胞长期持续增殖，因此IL-2曾被命名为T细胞生长因子。

所述的IL-6是一种白细胞介素，可促进T细胞表面IL-2r的表达，使细胞能更好的接受IL-2细胞因子。可有效提高T细胞培养效率。

所述的Lymactin-T是一种抗CD3单克隆抗体，T细胞增殖因子。主要作用是与T淋巴细胞表面的CD3结合，效率极高的激活T淋巴细胞并诱导其快速增值。

所述的PMA能自由透过细胞膜，因此能绕过细胞膜受体直接激活PKC。

所述的离子霉素能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高，使PMA发挥最大效果，提高细胞存活率。

上述一种活性化T淋巴细胞培养液及其活性化T淋巴细胞的制备方法，其通过使用Lymactin-T抗CD3单克隆抗体配合IL-2，IL-6的方法，效率极高的激活T淋巴细胞并诱导期快速增殖；并使用PMA和离子霉素配合的方法激活T细胞；该方法具有效率高，纯度高等优点。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

AT培养步骤：

1.确认血浆袋的吸取管密封。用两张不同的浸泡在70%乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀。

2.用镊子夹住吸取管，剪开管道前端并用镊子控制流速以转移血浆到50ml试管内。记录转移的血浆容量。

3.离心试管（400g，4℃）30分钟以移除血小板。

4.把上层液体倒入一个新的50ml试管。

5.把试管放入恒温水槽内（56℃），培养30分钟。

6.离心式管（400g，4℃）60分钟以移除沉淀的纤维蛋白。

7.把上层液体（自体血清）倒入一个新的50ml试管。再试管上标记病人名字，制备日期，并冷藏（4℃）。

8.确认PBMC袋的吸取管密封。悬挂好PBMC袋。用两张不同的侵泡在70%乙醇的无菌室专用清洁纸擦拭吸取管和剪刀。

9.转移细胞到50ml试管中。记录转移的容量。

10.计算所需的50ml试管的数量，向所有试管中加入15ml 淋巴细胞分离液1077。

11.准备足够的新50ml试管用以2倍稀释样本。向准备的所有50ml试管中倒入25mlhanks缓冲液。用10ml移液器转移25ml细胞悬浊液到各个试管中。向第11步的所有试管中各移入30ml稀释过的细胞悬液。

12.离心所有试管（400g，室温）40分钟。

13.吸取，弃用上层液体直到液面到底层白细胞的距离为1cm。

14.准备新的50ml试管。小心翼翼地用10ml移液器收集白细胞。

15.将每两个试管中的白细胞收集，移入一个新的50ml试管中。

16.准备T75细胞培养瓶。标注日期。加10ml室温下的ALyS505N-0培养液到每个培养瓶中。

17.用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0。重新使细胞悬浮。加入1ml青链霉素双混合液，50ul的200mM L-谷氨酰胺。

18.向每个T75细胞培养瓶里转移5ml细胞悬浊液。

19.扣上培养瓶盖子。慢慢的摇晃瓶子以使细胞悬液均匀。放进培养箱培养2小时（37℃，5% CO₂）。

20.准备T225细胞培养瓶（AT 培养瓶）。

21.准备10ml 的5ug/ml Lymactin-T 用以AT细胞培养。

制备方法：把50ul的1mg/ml Lymactin-T加入10ml hanks缓冲液。

22.向AT培养瓶里加入10ml的5ug/ml Lymactin-T，扣上盖子。

23.前后温柔的摇晃AT培养瓶直到液体覆盖整个底部，放在室温静置培养2小时。

24.在PBMCs的两个小时培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部。

25.温柔的前后摇晃T75培养瓶10次使非黏附的细胞悬浮，转移细胞悬液到50ml试管中备用。

26.使用下记方法洗涤AT培养瓶：

a．吸取，弃用培养瓶里的溶液。

b．向每个培养瓶里加入25ml 生理盐水并前后摇晃。

c．将生理盐水倒入一个无菌容器内，弃用。

d．重复b和c两次。

e．吸取清理培养瓶内和瓶嘴处剩余的溶液。

27.用移液器重新使50ml试管中的细胞悬浮。平均的把细胞悬液转移到每个AT培养瓶中。

28.按照下列步骤准备附加的AT培养液。在一个50ml试管中配制好培养液并转移到培养瓶中。培养瓶的最终容量是40ml。

a.加入6ml 的ALyS505N-0

b.加入80ul的5x10^5 IU/ml IL-2

c.加入20ul的5x10^5 IU/ml IL-6

d.加入4ml自体血清

29.扣上培养瓶的盖子，温柔的摇匀。把培养瓶放入培养箱培养7天（37℃，5%CO₂）。

AT细胞的收获

1.确认要收获的AT细胞培养瓶。

2.确保内毒素检测为阴性。

3.准备新的50ml试管。制备培养液A：向试管中加入45ml ALyS505N-0培养液（室温）。向试管中加入50ul 的2ug/ml 离子霉素和50ul的200ng/ml PMA。

4.准备新的250ml试管。

5.用显微镜观察检测所有的AT培养瓶。再次确认内毒素检测结果为阴性。将所有培养液倒入250ml试管中。

6.转移大约25ml的培养液A到空的培养瓶中，放倒培养瓶。

7.离心试管250ml试管5分钟（1500rpm，室温）

8.离心过后，弃用上层液体到一个干净的容器内在室温下。

9.将第6步的25ml 培养液A转移到试管中，重新使细胞悬浮，转移AT培养瓶内。

10.将AT培养瓶放入培养机培养3小时（37℃，5% CO₂）。

11. 3小时后，使用移液器上下转移液体几次使细胞悬浮。转移细胞悬液到一个新的250ml试管中。加入10ml左右ALyS505N-0到培养瓶中，用移液器使细胞悬浮。转移细胞悬液到250ml试管中。用肉眼和显微镜观察试管底部的黏附细胞。

12.离心试管5分钟（1500rpm，4℃）

13.离心过后，吸取弃用上层液体。用少量的ALyS505N-0使细胞重新悬浮。转移所有的细胞悬液到其中一个试管内。加入ALyS505N-0直到50ml。

14.用Trypan Blue stain计测细胞数量，计算存活率。

15.离心式管5分钟（1500rpm，4℃）

16.吸取弃用上册液体，加入50ml ALyS505N-0使细胞悬浮。

17.离心式管5分钟（1500rpm，4℃）取样用于FACS检测。

18.准备细胞冷冻液（AIM-V，20%自体血清，10% DMSO），暂存在冰上。

19.执行无菌检测

20.将细胞暂存在冰上。

21.向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀。

22.冷冻保存。

以下结合相应的试验数据进一步说明本发明的有益效果。

试验一：采用实施例1所述方法的两袋不同病人血浆的细胞数量，分别采用实施例1-A、实施例1-B表示，见表1。

表1 细胞数量检测表

组别	细胞数
		实施例1-A	1.31x10^7/ml
实施例1-B	1.26x10^7/ml

表1表明：本发明实施例1-A、实施例1-B中的AT细胞增值速度快，细胞饱满健康，细胞数量以及纯度高。现有AT细胞的常规制备其细胞成活率较低，且未被激活的T细胞比例较高，AT细胞培养途中死亡率高。

试验二：细胞表面CD鉴定，采用实施例1所述方法的两袋不同病人血浆，分别采用实施例1-A、实施例1-B表示，结果见表2。

表2表明：实施例1-A、实施例1-B的CD3+CD4+分别为54.67、53.49，常规方法测定结果一般为21-28左右；CD3+CD8+分别为42.84、44.07，常规方法测定结果一般为29-31左右；CD3+CD56+分别为36.35、31.95，常规方法测定结果一般为21-26左右；CD25分别为90.44、88.05，常规方法测定结果一般为72-78。采用本发明所述方法，效果明显高于常规方法。

Claims

1.一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2）准备T75细胞培养瓶,对白细胞进行2小时的PBMCs培养；

4）步骤2）PBMCs的2小时培养结束后，用显微镜确保细胞黏附在培养瓶的底部，温柔的前后摇晃T75培养瓶使非黏附的细胞悬浮，转移细胞悬液到50ml试管中备用；使用下述步骤洗涤步骤3）中Lymactin-T包被的AT培养瓶；

洗涤步骤包括：

a．吸取，弃用培养瓶里的溶液；

b．向每个培养瓶里加入25ml 生理盐水并前后摇晃；

c．将生理盐水倒入一个无菌容器内，弃用；

d．重复b和c两次；

e．吸取清理培养瓶内和瓶嘴处剩余的溶液；

用移液器重新使50ml试管中的细胞悬浮，平均的把2-10ml细胞悬液转移到上述每个AT培养瓶中；

5）在一个50ml试管中配制好AT培养液，步骤4）加入细胞悬液的AT培养瓶中加入AT培养液直到40ml；扣上AT培养瓶的盖子，温柔的摇匀，把AT培养瓶放入培养箱培养7天，37℃，5%CO₂；

所述的AT培养液由以下物质组成：5-7ml 的ALyS505N-0；70-90ul的5x10^5 IU/ml IL-2；15-25ul的5x10^5 IU/ml IL-6；3-5ml自体血清；

6）AT细胞的收获：

c．转移步骤6）a中准备的25ml的培养液A到步骤6）b中的AT培养瓶中，放倒培养瓶；

d．离心步骤6）b的250ml试管，离心过后，弃用上层液体；

e．将步骤6）c中的剩余的全部培养液A转移到步骤6 ）d中的250ml试管中，重新使细胞悬浮，转移所有细胞悬浮液到步骤6）c中的AT培养瓶；

f．将步骤6）e的AT培养瓶放入培养机培养2.8-3.2小时，37℃，5% CO₂；培养结束后，使用移液器上下转移液体几次使细胞悬浮，转移细胞悬液到一个新的250ml试管中；加入8-12mlALyS505N-0到培养瓶中，用移液器使细胞悬浮；转移细胞悬液到250ml试管中；用肉眼和显微镜观察试管底部的黏附细胞；离心250ml试管后，弃用上层液体；用2-10ml的ALyS505N-0使细胞重新悬浮；如果使用了多个试管则转移所有的细胞悬液到其中一个试管内；加入ALyS505N-0直到50ml；用Trypan Blue stain计测细胞数量，计算存活率；离心250ml试管，吸取弃用上层液体，加入50ml ALyS505N-0使细胞悬浮；离心式管，取样用于FACS检测，准备细胞冷冻液暂存在冰上，执行无菌检测，将细胞暂存在冰上，向细胞试管中加入冷冻液，用移液器混匀，冷冻保存。

2.如权利要求1所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤2）中：准备T75细胞培养瓶,加10ml室温下的ALyS505N-0培养液到每个培养瓶中,用10ml移液器向细胞试管中加入10ml ALyS505N-0,重新使细胞悬浮,加入1ml青链霉素双混合液，50ul的200mML-谷氨酰胺；向每个T75细胞培养瓶里转移5ml细胞悬浊液，扣上培养瓶盖子，慢慢的摇晃瓶子以使细胞悬液均匀，放进培养箱培养2小时，37℃，5% CO₂。

3.如权利要求1所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤3）中：5ug/ml Lymactin-T采用以下制备方法：把50ul的1mg/ml Lymactin-T加入10ml hanks缓冲液制成。

4.如权利要求1所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤5）中所述的AT培养液由以下物质组成：6ml 的ALyS505N-0；80ul的5x10^5 IU/ml IL-2；20ul的5x10^5IU/ml IL-6；4ml自体血清。

5.如权利要求1所述的一种活性化T淋巴细胞的制备方法，其特征在于步骤6）中培养液A为：室温下向试管中加入45ml ALyS505N-0培养液、50ul 的2ug/ml 离子霉素和50ul的200ng/ml PMA。