CN116133681A

CN116133681A - 用于刺激细胞的组合物、系统和方法

Info

Publication number: CN116133681A
Application number: CN202180059823.XA
Authority: CN
Inventors: E·欧莱特; A·柯卡吉
Original assignee: StemCell Technologies Inc
Current assignee: StemCell Technologies Inc
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2023-05-16
Also published as: EP4172318A1; US20230250194A1; WO2022000082A1; EP4172318A4

Abstract

提供了包含与核酸聚合物缀合的靶细胞结合部分的组合物，所述核酸聚合物的特征在于(其二级结构的)预测解链温度范围和/或(自杂交的)预测自由能范围。所述组合物可与一种或多种互补寡核苷酸、竞争寡核苷酸、抗竞争寡核苷酸等一起包括在试剂盒或系统中。所述组合物、试剂盒和系统可用于刺激细胞、淬灭细胞刺激、调节细胞刺激或标记(刺激或未刺激的)待分析细胞的方法。

Description

用于刺激细胞的组合物、系统和方法

相关申请

本申请要求2020年6月29日提交的美国临时专利申请第63/045,589号的权益；其全部内容特此以引用方式整体并入。

技术领域

本公开涉及细胞生物学，并且更具体地涉及用于刺激培养细胞的组合物和方法。

背景技术

宿主耐受性、先天免疫和适应性免疫是人类健康的复杂而重要的组成部分。淋巴细胞是执行这些功能的重要细胞类型。T淋巴细胞包括各种亚群，包括：调节性T细胞，它们在维持宿主耐受性中起主要作用；和效应子亚群，例如CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞，它们根据环境刺激进行免疫反应。B淋巴细胞包括各种亚群，包括浆细胞和记忆B细胞，它们产生抗体或可被刺激以产生抗体。自然杀伤(NK)细胞对先天免疫系统至关重要，并且除其它功能外，已知对感染作出快速反应以及对肿瘤形成作出反应。

淋巴细胞体外生长和繁殖的方法基于许多不同的方法。在一些情况下，它们可通过使用辅助细胞和外源生长因子，例如抗原呈递细胞和细胞因子/生长因子来活化和扩增。这需要在活化和/或扩增过程中存在和补充辅助细胞和细胞因子/生长因子。

或者，用于活化和扩增淋巴细胞的试剂包括将活化抗体直接或间接固定在固相表面(例如板)或磁珠上的组合。除了固定化抗体提供的初级活化信号外，可能还需要辅助抗体提供的次级共刺激信号。也可添加外源生长因子或细胞因子，例如IL-2以增强细胞增殖。

针对淋巴细胞表面抗原的抗体是许多细胞刺激方案中的关键组成部分。对于人T淋巴细胞的活化，Dixon等人首先证明，固定化抗CD3抗体可在没有T细胞受体识别同源抗原的情况下介导人T细胞活化和扩增。抗CD3通过交联T细胞表面上T细胞受体复合物的组分启动活化和增殖信号传导级联；因此它们需要固定。随后Baroja等人表明，与固定化抗CD3组合，完全活化T细胞需要来自固定化或可溶性抗CD28刺激物的第二信号。通过粘附配体，例如CD2、LFA-1和其它TNF家族成员，例如CD137(4-1BB)提供的额外共刺激信号可为T细胞提供额外的增殖或存活信号(Smith-Garvin等人)。

为了活化骨髓衍生的“B”淋巴细胞(通常称为B细胞)，其B细胞受体(BCR)结合可溶性或膜结合抗原，从而形成触发下游信号传导级联的BCR微团簇。T细胞依赖性B细胞活化涉及这两个淋巴细胞的相互作用，通过结合CD40形成稳定的吸引力。Banchereau等人首先证明当IL-4和CD40单克隆抗体以交联方式呈递在经人Fc受体FCyRII/CDw32转染的小鼠成纤维细胞系上时，可实现B细胞的持续增殖。鉴于T细胞在T细胞依赖性B细胞活化中的重要作用，各种T细胞衍生的细胞因子通常是促进B细胞生长和分化所必需的。例如，IL-2、IL-4和IL-5已被证明支持原始B细胞成熟为抗体分泌细胞。

对于NK细胞的活化，其表面上的一系列抑制和活化受体参与靶细胞的识别，并且在达到足够的信号阈值时可触发靶细胞裂解。WO2004/056392公开了通过用可溶性抗NK细胞受体抗体，例如NKp30和NKp46处理来增殖PBMC衍生的人NK细胞。此外，美国专利第5,919,700号描述了IL-16诱导NK细胞增殖的作用。Bryceson等人(2006,Blood,107:159-166)也表明在不存在外源性细胞因子的情况下，静息NK细胞的活化可通过活化受体，例如NKp46(CD335)和CD2的组合来诱导。

鉴于淋巴细胞在免疫的各个方面的重要作用，需要低成本、温和且有效的策略来强有力地活化此类细胞。此外，原位调节淋巴细胞活化的能力将为研究此现象提供一种新方法，同时扩大治疗的可能性。

发明概述

本公开涉及用于刺激细胞样品中的靶细胞的组合物和方法。

在本公开的一个方面，提供了细胞刺激组合物，其包含能够结合靶抗原的第一结合部分；和直接或间接与第一结合部分缀合的第一核酸聚合物。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的序列具有或包含约60℃或更低的(一种或多种)预测二级结构的解链温度。

在一个实施方案中，第一结合部分为抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下自杂交的预测自由能在约+1kcal/mol与-10kcal/mol之间。在一个实施方案中，第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下的预测自由能为负值。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物的(一种或多种)预测二级结构的解链温度在约50℃和20℃之间或更低。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物为至少10个核苷酸。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物或其互补区与第二核酸聚合物互补。

在一个实施方案中，第二核酸聚合物直接或间接与第二结合部分缀合。

在一个实施方案中，结合部分的双特异性复合物通过第一核酸聚合物和第二核酸聚合物的杂交形成。

在一个实施方案中，第一结合部分和第二结合部分结合相同的靶抗原。在一个实施方案中，第一结合部分和第二结合部分结合不同的靶抗原。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物通过亲核取代、亲电取代、烷基化、氧化、缩合、环加成或施陶丁格(Staudinger)连接反应与第一结合部分缀合。在一个实施方案中，第二核酸聚合物通过亲核取代、亲电取代、烷基化、氧化、缩合、环加成或施陶丁格连接反应与第二部分缀合。

在一个实施方案中，细胞刺激物为可溶的。在相同或不同的实施方案中，与第二结合部分缀合的第二核酸聚合物是可溶的。

在一个实施方案中，靶抗原为T细胞受体复合物的组分。在一个实施方案中，T细胞受体复合物的组分为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ。

在本公开的另一方面，提供了刺激细胞样品中的靶细胞的方法，所述方法包括使细胞样品与直接或间接与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分接触，所述第一结合部分能够结合靶细胞上的靶抗原，其中直接或间接与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分形成细胞刺激组合物，以及培育已由细胞刺激组合物的第一结合部分结合的靶细胞。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括在细胞刺激组合物之前、与细胞刺激组合物同时或在细胞样品与细胞刺激组合物接触之后使细胞样品与能够结合靶细胞上的共刺激抗原的共刺激结合部分接触。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物包含约60℃或更低的预测二级结构的解链温度。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的预测二级结构的解链温度在约50℃和20℃之间或更低。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物为至少10个核苷酸。

在一个实施方案中，靶细胞为T细胞、NK细胞或B细胞。

在一个实施方案中，T细胞的(靶细胞的)第一靶抗原为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ。

在一个实施方案中，NK细胞的(靶细胞的)第一抗原为NKp30、NKp44和NKp46、C型凝集素样受体例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α。

在一个实施方案中，B细胞的(靶细胞的)第一靶抗原为CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b。

在一个实施方案中，方法还包括增加靶细胞的增殖，例如在使靶细胞与细胞刺激复合物和/或共刺激结合部分和/或第二结合部分接触之后。

在一个实施方案中，共刺激结合部分为抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。

在一个实施方案中，T细胞的共刺激抗原为CD28、CD137、CD2、CD134、CD152、CD278、CD27或CD279。

在一个实施方案中，NK细胞的共刺激抗原为以下中的不同抗原(相对于第一抗原)：NKp30、NKp44和NKp46、C型凝集素样受体例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α。

在一个实施方案中，B细胞的共刺激抗原为以下中的不同抗原(相对于第一抗原)：CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b。

在一个实施方案中，方法进一步使第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区杂交。在一个实施方案中，第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区的互补性在约40％与100％之间。

在一个实施方案中，使第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区杂交在使细胞样品与第二结合部分接触之前、与此同时或在此之后，会淬灭或调节靶细胞刺激的水平。

在一个实施方案中，方法还包括通过与竞争核酸聚合物竞争而从第一核酸聚合物或其互补区置换第二核酸聚合物，所述竞争核酸聚合物对第二核酸聚合物的互补性程度高于第二核酸聚合物对第一核酸聚合物或其互补区的互补性程度。

在一个实施方案中，第二核酸聚合物直接或间接与第二结合部分缀合。在一个实施方案中，第二结合部分与第一结合部分相同。

在一个实施方案中，方法还包括通过第一核酸聚合物与第二核酸聚合物之间的相互作用(例如杂交)形成结合部分的双特异性复合物。

在一个实施方案中，细胞刺激组合物为可溶的。在相同或不同的实施方案中，与第二结合部分缀合的第二核酸聚合物是可溶的。

在本公开的另一方面，提供了标记待分析的细胞样品中的靶细胞以获得生物分子特征的方法，所述方法包括使靶细胞与直接或间接与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分接触，所述第一结合部分能够结合靶细胞上的靶抗原，其中直接或间接与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分形成细胞刺激组合物；以及通过使第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区杂交来抑制由细胞刺激组合物结合的靶细胞的刺激。

在一个实施方案中，使第二核酸聚合物杂交在使靶细胞与细胞刺激组合物接触之前或与此同时进行。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物为至少10个核苷酸。

在一个实施方案中，靶细胞为T细胞、NK细胞或B细胞。

在一个实施方案中，T细胞的(靶细胞上的)第一抗原为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ。

在一个实施方案中，NK细胞的(靶细胞上的)第一抗原为NKp30、NKp44和NKp46、C型凝集素样受体例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α。

在一个实施方案中，B细胞的(靶细胞上的)第一抗原为CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b。

在一个实施方案中，细胞刺激组合物为可溶的。

在本公开的另一方面，提供了包含如本文所述的细胞刺激组合物的试剂盒。在一个实施方案中，本公开的试剂盒还包含本文所述的任何其它组分，例如以下中的一者或多者：第二核酸聚合物(无论是否与第二结合部分缀合)、共刺激结合部分、竞争寡核苷酸、抗竞争寡核苷酸(竞争所述竞争寡核苷酸)；以及用于复原前述任何一者或多者的缓冲液。在一个实施方案中，试剂盒还包含适合于培养细胞样品和/或包括于细胞样品内的(一个或多个)靶细胞的培养基。

本公开主题的其它特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而应理解，虽然详细描述和具体实施例指明所公开主题的优选实施方案，但它们仅通过说明的方式给出，因为根据此详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

图1显示了细胞刺激组合物或包括细胞刺激组合物的系统的各种实施方案的图示。在一个实施方案中，对靶抗原“A”具有特异性的结合部分“B”直接或间接与第一核酸聚合物“C”缀合(A)。(A)的细胞刺激组合物的第一核酸聚合物或其互补区可与第二核酸聚合物(或者在一些实施方案中，竞争核酸聚合物)“C'”杂交(B)。在一个实施方案中，第二核酸聚合物可直接或间接与对靶抗原“E”具有特异性的第二结合部分“D”缀合(C)。在一些实施方案中，第一结合部分“B”和第二结合部分“D”结合相同的靶抗原，而在其它实施方案中，它们结合不同的靶抗原。

图2显示了通过阴性选择分离的T细胞的代表性流式细胞术图。通过流式细胞术从活的CD45+门分析T细胞的富集前(A)和富集后(B)纯度(通过其CD3标志物)。另外，对表达CD4或CD8或两者的各种T细胞亚群进行流式分析(C)证实了它们在分离后的保留(D)。

图3显示了使用APC缀合的抗CD3抗体和不同浓度(0μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL和5μg/mL)的本公开的可溶性细胞刺激组合物与外周血单核细胞样品中的细胞结合的竞争分析的流式细胞术直方图。图(A)显示使用不与核酸聚合物缀合的抗人CD3 IgG单克隆抗体的柱状图，并且图(B)显示使用与核酸聚合物缀合的抗人CD3 IgG单克隆抗体(即细胞刺激组合物)的柱状图。

图4显示了T细胞活化的条形图。在用不同浓度的可溶性细胞刺激组合物和可溶性抗CD28 IgG单克隆抗体共刺激后的第3天，在不同的T细胞亚群中测定CD25表达水平。包括未刺激的细胞(无抗体处理)、未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝2。

图5显示了T细胞活化的条形图。在用可溶性细胞刺激组合物或对照组合物和可溶性抗CD28 IgG单克隆抗体共刺激后的第2天(A)或第3天(B)在不同T细胞亚群中测定CD25表达水平。包括未刺激的细胞(无抗体处理)、未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体、单独或与未缀合的抗CD3 IgG一起的游离核酸聚合物和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝1。

图6显示了T细胞活化的条形图。在使用包含不同抗体(如所指示)和可溶性抗人CD28 IgG单克隆抗体的可溶性细胞刺激组合物共刺激后的第3天在不同T细胞亚群中测定CD25表达水平。包括未刺激的细胞(无抗体处理)、未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝1。

图7显示了淬灭的T细胞活化的条形图。第3天在不同的T细胞亚群中测定CD25表达水平。用所指示的细胞刺激组合物和抗CD28 IgG单克隆抗体共刺激的T细胞的活化可通过预杂交与细胞刺激组合物的核酸聚合物的至少一部分互补的核酸聚合物来淬灭。包括未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝1。

图8显示了调节的T细胞活化的条形图。第3天在不同的T细胞亚群中测定CD25表达水平。用所指示的细胞刺激组合物和抗CD28 IgG单克隆抗体共刺激的培养中T细胞的反应可通过原位杂交与细胞刺激组合物的核酸聚合物的至少一部分互补的核酸聚合物来调节。包括未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝1。

图9显示了T细胞活化的条形图。在使用不同的可溶性细胞刺激组合物(如所指示)和可溶性抗CD28 IgG单克隆抗体共刺激后的第3天，在不同的T细胞亚群中测定CD25表达水平。(A)测试的细胞刺激组合物包括寡核苷酸A的变体，所述变体已通过点突变进行工程改造以改变其预测二级结构的解链温度。包括未刺激的细胞(无抗体处理)、未缀合的抗CD3IgG单克隆抗体和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝1。对于测试的细胞刺激组合物变体A(B)、A_var1(C)和A_var2(D)，还包括在初始刺激后72小时拍摄的活化T细胞的光学显微照片。

图10显示了T细胞活化的条形图。在使用不同的可溶性细胞刺激组合物(如所指示)和可溶性抗CD28 IgG单克隆抗体共刺激后的第3天，在不同的T细胞亚群中测定CD25表达水平。(A)不同的细胞刺激组合物包括寡核苷酸B的变体，所述变体已通过点突变进行工程改造以改变其预测二级结构的解链温度。包括未刺激的细胞(无抗体处理)、未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝2。对于测试的细胞刺激组合物变体B(B)、B_var1(C)和B_var2(D)，还包括在初始刺激后72小时拍摄的活化T细胞的光学显微照片。

图11显示了T细胞活化的条形图。在使用不同的可溶性细胞刺激组合物(如所指示)和可溶性抗CD28 IgG单克隆抗体共刺激后的第3天，在不同的T细胞亚群中测定CD25表达水平。(A)不同的细胞刺激组合物包括寡核苷酸C的变体，所述变体已通过点突变进行工程改造以改变其预测二级结构的解链温度。包括未刺激的细胞(无抗体处理)、未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝2。对于测试的细胞刺激组合物变体C(B)、C_var1(C)和C_var2(D)，还包括在初始刺激后72小时拍摄的活化T细胞的光学显微照片。

图12显示使用与细胞刺激组合物的不同区域具有互补性的不同寡核苷酸减少T细胞活化。图A中的条形图总结了用细胞刺激组合物(CD3-寡核苷酸C)和抗CD28 IgG单克隆抗体处理后不同T细胞亚群中的CD25表达水平。CD3-寡核苷酸C分别与5种不同的互补寡核苷酸(CC-1、CC-3、CC-12、CC-23以及CC-1和CC-3)预杂交，并且在第3天评估T细胞活化水平。包括未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体和Dynabeads^TM作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝1。图B中的条形图总结了T细胞在基本上如上所述进行处理后的直径，除了CD3-寡核苷酸C被以下两种其它细胞刺激组合物取代：C_var1和C_var2(均与抗人CD3 IgG复合)。还使用了抗人CD3 IgG(不与寡核苷酸缀合)的额外对照。

图13显示了使用不同细胞刺激组合物的T细胞活化结果，以及互补寡核苷酸对淬灭T细胞活化的影响。图A中的条形图总结了用不同细胞刺激组合物(C_var2、C2x、C3x和C4x)和抗CD28 IgG单克隆抗体处理后的第3天，不同T细胞亚群中的CD25表达水平。未处理的细胞和未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体用作阴性对照，并且包括C_var2和Dynabeads^TM作为阳性对照。图B中的条形图总结了不同浓度的与细胞刺激组合物(与寡聚C4x缀合的抗人CD3 IgG)具有互补性的寡核苷酸(CC-3)对淬灭T细胞活化的影响。未处理的细胞和未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体用作阴性对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝1。

图14显示了T细胞活化的条形图。第3天在不同T细胞亚群中测定CD25表达水平。T细胞使用可溶性细胞刺激组合物(单独或组合的CD3-寡核苷酸D和CD3-寡核苷酸DC)和可溶性抗CD28 IgG单克隆抗体进行共刺激。CD3-寡核苷酸D和CD3-寡核苷酸DC均包含相同的抗人CD3 IgG，但因与互补寡核苷酸对的每个成员的缀合而不同。包括未刺激的细胞和未缀合的抗CD3 IgG单克隆抗体作为对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝2。

图15显示了总结在用本公开的细胞刺激组合物处理后的第2天或第3天的小鼠T细胞活化的图。小鼠T细胞与缀合至C4x或C-var2核酸聚合物和抗小鼠CD28 IgG的抗小鼠CD3IgG接触。将前述细胞刺激组合物的T细胞活化水平与使用以下各者的T细胞活化进行比较：未缀合的可溶性抗小鼠CD3 IgG；未缀合、板结合的抗小鼠CD3IgG；和Dynabeads(1:2珠/细胞比)。包括未处理的细胞作为阴性对照。数据代表CD25⁺细胞的平均值±SD频率，n＝1。

具体实施方式

下面的描述涉及用于刺激细胞样品中的靶细胞的组合物和方法。

在本文中使用的术语“细胞刺激组合物”是指当置于与细胞接近和/或接触时引起靶细胞的刺激反应的手段。根据细胞刺激组合物的性质和靶细胞的类型，刺激反应可包括活化、增殖、细胞因子或趋化因子分泌、抗体产生或靶细胞杀伤中的一者或多者。在一些情况下，另外使用一种或多种共刺激因子可能是可选的或甚至是必要的，所述共刺激因子可与细胞刺激组合物同时使用或按顺序使用，以引发刺激反应或增强刺激反应。在优选实施方案中，本公开的细胞刺激组合物为可溶的。在另一优选实施方案中，本公开的细胞刺激组合物包括结合部分和核酸聚合物中的至少一者。在一个实施方案中，本公开的细胞刺激组合物包括一种结合部分和一种核酸聚合物。在一个实施方案中，本公开的细胞刺激组合物包括一种结合部分和多于一种核酸聚合物，或多于一种结合部分和一种核酸聚合物。

在本文中使用的术语“结合部分”是指对一种或多种靶标(例如靶抗原)具有亲和力和特异性的生物或化学组合物。在优选实施方案中，生物或化学组合物对单个靶标或一类相关靶标具有特异性。生物或化学组合物可以可逆或不可逆地结合(一个或多个)靶标。结合部分的实例可包括抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。在一个实施方案中，结合部分为抗体或其片段。

在本文中使用的术语“靶抗原”是指存在于细胞内或细胞(例如靶细胞)表面上的抗原或其表位。在本公开的上下文中，一种或多种靶抗原通过细胞刺激复合物的结合(连同不同靶抗原通过共刺激因子的必要或任选的结合)引起靶细胞的刺激反应。

在本文中使用的术语“核酸聚合物”是指结构单元单体的单链聚合物。在一个实施方案中，聚合物由单一类别的单体，例如脱氧核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成。在一个实施方案中，聚合物由多于一类单体，例如脱氧核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成。在一个实施方案中，聚合物可为锁核酸或肽核酸。在优选实施方案中，核酸聚合物由脱氧核苷酸组成。在一些实施方案中，核酸聚合物可包括单体的修饰变体。在一个实施方案中，核酸聚合物为寡核苷酸。

组合物

在本公开的一个方面，描述了可与细胞样品一起使用或添加至细胞样品中的细胞刺激组合物。本公开的细胞刺激组合物还可用于刺激靶细胞的方法，如下文进一步详细描述。

本公开的细胞刺激组合物将包含能够结合靶抗原的第一结合部分和直接或间接与第一结合部分缀合的第一核酸聚合物。

本公开的细胞刺激组合物还应该是可溶的，尽管这不是绝对要求，因为固定在表面上的细胞刺激组合物也可能是有效的。更具体地，如果细胞刺激组合物是可溶的，则它们应该可溶于用于清洗包括靶细胞的细胞样品的液体中。

第一结合部分可为能够结合靶标的任何类型的生物或化学组合物。第一结合部分的实例可包括抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。

在一个实施方案中，第一结合部分为抗体或抗体片段。抗体或其片段可为单克隆的或多克隆的，但在许多情况下，优选抗体或其片段为单克隆的。

第一结合部分对其靶抗原的所需亲和力可被认为是以小于100nM的平衡解离常数(KD)结合。优选地，第一结合部分对其靶抗原的亲和力低于10nM。在其它情况下，对于第一结合部分的单个亚基，可能需要对靶抗原的较弱结合亲和力，其共同为第一结合部分提供大约前述的高亲和力结合。此外，靶抗原与第一结合部分之间的结合应为高度特异性的。

靶抗原可为存在于靶细胞内或存在于靶细胞表面上的任何抗原或其表位。靶抗原最重要的特征之一是其为可接近的，并且对细胞刺激组合物，并且更具体地，其第一结合部分的结合呈现出有限的空间位阻。在一个实施方案中，靶抗原或其表位包含于一个实体中，或包含于呈递在细胞外表面上的实体复合物的一个实体，例如蛋白质、肽或糖蛋白中。

在一个实施方案中，靶抗原可为T细胞受体复合物的组分。例如，T细胞受体复合物的组分可为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ中的一者。因此，本公开的细胞刺激组合物对T细胞受体复合物的组分的结合(以及随后多种组分的紧密缔合)可引起T细胞或不同T细胞亚群的刺激反应。在一个实施方案中，T细胞或其亚群的刺激反应可为靶T细胞的活化，其可导致此类T细胞或T细胞亚群的增殖，和/或此类T细胞或T细胞亚群分泌细胞因子或趋化因子。另外，刺激一种T细胞亚群，例如CD4⁺T细胞可反过来导致刺激不同的T细胞亚群，例如CD8⁺T细胞。

在一个实施方案中，靶抗原可为B细胞呈递的组分。例如，B细胞呈递的组分可包括CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b中的一者。因此，本公开的细胞刺激组合物对B细胞受体复合物的组分的结合(以及随后多种组分的紧密缔合)可引起B细胞或不同B细胞亚群的刺激反应，例如靶B细胞的活化，其可导致此类B细胞或B细胞亚群的增殖，和/或由此类B细胞或B细胞亚群产生抗体。另外，对一个B细胞亚群的刺激可反过来导致对不同B细胞亚群的刺激。

在一个实施方案中，靶抗原可为NK细胞呈递的组分。例如，NK细胞呈递的组分可包括以下中的一者：NKp30、NKp44和NKp46、C型凝集素样受体例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α。因此，本公开的细胞刺激组合物对由NK细胞呈递的组分的结合(以及随后多种组分的紧密缔合)可引起NK细胞或不同NK细胞亚群的刺激反应，例如靶NK细胞的活化，其可导致此类NK细胞或NK细胞亚群的增殖，和/或由此类NK细胞或NK细胞亚群杀死靶细胞。另外，对一个NK细胞亚群的刺激可反过来导致对不同NK细胞亚群的刺激。

本发明人出乎意料地发现，包含直接或间接与第一结合部分缀合的第一核酸聚合物的细胞刺激组合物可用于刺激靶细胞，而无需在与靶细胞接触之前将两种此类细胞刺激组合物彼此预复合。事实上，第一核酸聚合物的一个重要特征似乎是第一核酸聚合物不能或能力有限地在典型细胞培养条件(例如适当的培养基和/或培育条件)下以可观的稳定性水平自我折叠(即自杂交)。

可使用任何已知反应将第一结合部分与第一核酸聚合物缀合，条件是这些组分的构成在(一个或多个)结合反应期间没有受到负面影响。在一个实施方案中，第一核酸聚合物可通过亲核取代、亲电取代、烷基化、氧化、缩合、环加成或施陶丁格连接反应中的一者与第一结合部分缀合。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物可通过一个或多个共价键与第一结合部分缀合，所述共价键包括腙、肟、酰亚胺、砜、三嗪或经由选自包含巯基、胺、羧基、羟基、酰肼、醛或聚糖的基团的官能团的其它共价连接。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物可间接与第一结合部分缀合。在一个实施方案中，间接缀合可通过生物素和亲和素/链霉亲和素或任何类似类型的配合对修饰的组分之间的相互作用来实现。

不管所采用的具体缀合方法，本领域技术人员将容易知道或知道在哪里能找到进行缀合反应的精确方案。

由于本公开的细胞刺激组合物令人惊讶地显示出刺激靶细胞而不需要将两种这样的细胞刺激组合物彼此预复合，可能重要的是修饰第一核酸聚合物的序列，使得其预测二级结构的解链温度为约60℃或更低。在一个实施方案中，第一核酸聚合物包含其中预测二级结构的解链温度在约50℃与10℃之间或更低的序列。在一个实施方案中，工程化或以其它方式的第一核酸聚合物包括其中预测二级结构的解链温度在约40℃与20℃之间的序列。

第一核酸聚合物的不一定相互排斥的特征可与其自由能有关。在一个实施方案中，第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下的预测自由能在约+1kcal/mol与-10kcal/mol之间。在一个实施方案中，第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下的预测自由能为负值。

取决于使用细胞刺激组合物的应用，可能希望第一核酸聚合物的序列不含已知触发细胞反应，例如刺激反应的基序。例如，富含CpG基序的第一核酸聚合物可通过Toll样受体(TLR)9识别来引发促炎反应。或者，对于范围介于50至80bp之间的片段，也可通过细胞溶质免疫感应受体cGAS或通过AIM-1以与序列无关的方式识别含有鸟苷的具有未配对端(Y型)的双链DNA聚合物。此外，三磷酸化(5'ppp)双链核糖核酸(RNA)聚合物也可通过RIG-1或在长度超过40bp时通过TLR3引发免疫反应。含有polyU或富含G/U的序列的那些也可被例如TLR7识别。含有polyU/UC基序的单链RNA聚合物也可通过RIG-1信号传导引发免疫反应。

第一核酸聚合物的另一重要特征可为其长度。由于二级结构的可能性通常随着单链第一核酸聚合物的长度而增加，因此在大多数实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约100个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约90个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约80个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约70个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约60个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约50个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约40个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约30个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约20个单体或更少。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为至少约10个单体。在一个实施方案中，第一核酸聚合物的长度为约5个单体或更少。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物(或其互补区)与第二核酸聚合物互补。第二核酸聚合物可直接或间接与至少一个第二结合部分缀合，或不与至少一个第二结合部分缀合。

类似于第一结合部分，第二结合部分可为抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。类似于第一结合部分，第二结合部分可为可溶的或固定在表面上。在一个实施方案中，第二结合部分为可溶的。在一个实施方案中，细胞刺激组合物和第二结合部分均为可溶的。

在第二核酸聚合物不与至少一个第二结合部分缀合的实施方案中，当其第一核酸聚合物与第二核酸聚合物杂交时，细胞刺激组合物的活性可被淬灭。在此类实施方案中，可控制刺激的时间。或者，与本公开的细胞刺激组合物相似或相同的组合物可用于某些下一代测序方法，并且可防止或限制对靶向测序的细胞的不知情或不期望的刺激。

在一个实施方案中，在细胞刺激组合物与细胞样品(和其中的靶细胞)接触之前，第二核酸聚合物与第一核酸聚合物(或其互补区)预杂交。在此类实施方案中，靶细胞对细胞刺激组合物的刺激反应最初可被淬灭。此类“无活性”细胞刺激组合物可在适当的时间被竞争核酸聚合物“活化”，其中第二核酸聚合物对竞争核酸聚合物的杂交偏好高于对第一核酸聚合物的杂交偏好。

在一个实施方案中，与细胞刺激组合物与细胞样品(和其中的靶细胞)接触同时或在此之后，第二核酸聚合物与第一核酸聚合物(或其互补区)杂交。在此类实施方案中，细胞刺激组合物最初可引发靶细胞的刺激反应。在适当的时间，靶细胞对细胞刺激组合物的刺激反应可用第二核酸聚合物淬灭。在稍后的适当时间，可用竞争核酸聚合物重新活化刺激反应，其中第二核酸聚合物对竞争核酸聚合物的杂交偏好高于对第一核酸聚合物的杂交偏好。

在第二核酸聚合物与至少一个第二结合部分缀合的实施方案中，可以本领域技术人员已知或可获得的任何方式进行缀合。例如，可使用任何已知反应将第二结合部分与第二核酸聚合物缀合，前提是这些组分的构成在(一个或多个)缀合反应期间没有受到负面影响。在一个实施方案中，第二核酸聚合物可通过亲核取代、亲电取代、烷基化、氧化、缩合、环加成或施陶丁格连接反应中的一者与第二结合部分缀合。

在一个实施方案中，第二核酸聚合物可通过一个或多个共价键与第二结合部分缀合，所述共价键包括腙、肟、酰亚胺、砜、三嗪或经由选自包含巯基、胺、羧基、羟基、酰肼、醛或聚糖的基团的官能团的其它共价连接。

在一个实施方案中，第二核酸聚合物可间接与第二结合部分缀合。在一个实施方案中，间接缀合可通过生物素和亲和素/链霉亲和素或任何类似类型的配合对修饰的组分之间的相互作用来实现。

在一个实施方案中，细胞刺激组合物可包含于结合部分的双特异性复合物中。结合部分的双特异性复合物可通过杂交第一核酸聚合物和第二核酸聚合物(各自直接或间接分别与第一和第二结合部分缀合)形成。在一个实施方案中，第一结合部分和(可溶性)第二结合部分结合相同的靶抗原。在一个实施方案中，第一结合部分和(可溶性)第二结合部分结合不同的靶抗原。在一个实施方案中，靶抗原(分别由第一结合部分和第二结合部分结合)在相同的靶细胞类型上。在一个实施方案中，靶抗原(分别由第一结合部分和第二结合部分结合)在不同的靶细胞类型上。

在一个实施方案中，在结合部分的双特异性复合物与细胞样品(和其中的靶细胞)接触之前，第二核酸聚合物与第一核酸聚合物(或其互补区)预杂交。在此类实施方案中，结合部分的双特异性复合物可最初引发靶细胞的刺激反应。在适当的时间，靶细胞对结合部分的双特异性复合物的刺激反应可用一种或多种竞争核酸聚合物淬灭，其中(一种或多种)竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物和/或第二核酸聚合物的杂交偏好高于第一核酸聚合物对第二核酸聚合物的杂交偏好。在稍后的适当时间，可用抗竞争核酸聚合物重新活化刺激反应，其中抗竞争核酸聚合物对竞争核酸聚合物的杂交偏好高于竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物或第二核酸聚合物的杂交偏好。

在一个实施方案中，结合部分的双特异性复合物的形成最初可能受到竞争核酸聚合物与第一核酸聚合物和/或第二核酸聚合物中的一者或两者的杂交的干扰，其中(一种或多种)竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物和/或第二核酸聚合物的杂交偏好高于第一核酸聚合物对第二核酸聚合物的杂交偏好。因此，靶细胞的刺激反应可最初被淬灭。此类结合部分的“无活性”双特异性复合物可在适当的时间与一种或多种抗竞争核酸聚合物一起变得“有活性”，其中(一种或多种)抗竞争核酸聚合物对(一种或多种)竞争核酸聚合物高于(一种或多种)竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物和/或第二核酸聚合物的杂交偏好。

如果在使用应用中担心结合部分的双特异性复合物的未复合组分可能单独触发靶细胞中的刺激反应，则这可根据本文的教导来控制。例如，第一和/或第二核酸聚合物的序列可被修饰或工程化以具有失效的二级结构(即具有高于50℃或60℃或更高的解链温度)。另举一例，结合部分的双特异性复合物的未复合组分可用与第一和第二核酸聚合物杂交的适当中和或失效核酸聚合物“中和”或“失效”。

因此，虽然本公开的细胞刺激组合物令人惊讶地显示出刺激靶细胞而不需要将两种此类细胞刺激组合物彼此预复合，但在一些情况下它仍可能是合乎需要的。

因此，除了组合物之外，本公开还考虑了包含细胞刺激组合物和第二核酸聚合物的系统。在一些实施方案中，系统可进一步包含竞争核酸聚合物。在一些实施方案中，系统可进一步包含抗竞争核酸聚合物。在一些实施方案中，系统可进一步包含中和或失效核酸聚合物。在一些实施方案中，此类系统的组分可包装在一个或多个试剂盒中。

方法

在本公开的另一方面，描述了使用如前文所述的此类细胞刺激组合物来刺激细胞样品中的靶细胞的方法。或者，本公开的组合物可用于特异性结合或标记靶细胞的方法(用于感兴趣的下游分析)，既不会无意中触发靶细胞的刺激，也不会特异性地意图触发靶细胞的刺激。例如，此类组合物可用于蛋白质转录组学分析，但评估处于活化或未活化(即经刺激与未经刺激)状态的目标调用的转录组可能是所需的或非所需的。在此类应用中，将清楚如何基于以上提供的关于本公开的组合物的(一种或多种)描述来实施适当的方法。简而言之，此类方法可包括用本公开的组合物标记或结合(一个或多个)靶细胞并获得(一个或多个)靶细胞的生物分子(例如转录组)特征。在此类方法中使用的组合物可在所述组合物结合(一个或多个)靶细胞之前、之时或之后与第二核酸聚合物杂交。在一些实施方案中，可能需要比较用本公开的组合物刺激的靶细胞群与被本公开的组合物(结合)但未用其刺激的靶细胞群的转录组特征。

(一个或多个)靶细胞可为任何物种的任何类型的细胞，条件是它呈递靶抗原并且此类靶抗原通过本公开的细胞刺激组合物的结合实现细胞的刺激反应。

靶抗原可为存在于靶细胞内或存在于靶细胞表面上的任何抗原或其表位。靶抗原最重要的特征之一是其为可接近的，并且对细胞刺激组合物，并且更具体地其第一结合部分的结合呈现出有限的空间位阻。在一个实施方案中，靶抗原或其表位包含于一个实体中，或包含于呈递在细胞外表面上的实体复合物的一个实体，例如蛋白质、肽或糖蛋白中。

在一个实施方案中，靶细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，靶细胞为人细胞。在一个实施方案中，靶细胞为啮齿动物细胞。

在一个实施方案中，靶细胞为淋巴细胞，例如T细胞、NK细胞或B细胞。在一个实施方案中，靶细胞为人T细胞、NK细胞或B细胞。在一个实施方案中，靶细胞为小鼠T细胞、NK细胞或B细胞。

在靶细胞为T细胞的实施方案中，靶抗原可为T细胞受体复合物的组分。例如，T细胞受体复合物的组分可为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ中的一者。因此，本公开的细胞刺激组合物对T细胞受体复合物的组分的结合可引起T细胞或不同T细胞亚群的刺激反应，例如靶T细胞的活化，其可导致此类T细胞或T细胞亚群的增殖，和/或由此类T细胞或T细胞亚群分泌细胞因子或趋化因子。另外，刺激一种T细胞亚群，例如CD4⁺T细胞可反过来导致刺激不同的T细胞亚群，例如CD8⁺T细胞。

在一个实施方案中，靶抗原可为B细胞呈递的组分。例如，B细胞呈递的组分可包括CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b中的一者。因此，本公开的(一种或多种)细胞刺激组合物对B细胞受体复合物的组分的结合(以及随后多种组分的紧密缔合)可引起B细胞或不同B细胞亚群的刺激反应，例如靶B细胞的活化，其可导致此类B细胞或B细胞亚群的增殖，和/或由此类B细胞或B细胞亚群产生抗体。另外，对一个B细胞亚群的刺激可反过来导致对不同B细胞亚群的刺激。

在一个实施方案中，靶抗原可为NK细胞呈递的组分。例如，NK细胞呈递的组分可包括以下中的一者：NKp30、NKp44和NKp46、C型凝集素样受体例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α。因此，本公开的(一种或多种)细胞刺激组合物对由NK细胞呈递的组分的结合(以及随后多种组分的紧密缔合)可引起NK细胞或不同NK细胞亚群的刺激反应，例如靶NK细胞的活化，其可导致此类NK细胞或NK细胞亚群的增殖，和/或由此类NK细胞或NK细胞亚群杀死靶细胞。另外，对一个NK细胞亚群的刺激可反过来导致对不同NK细胞亚群的刺激。

因此，刺激细胞样品中的靶细胞的方法包括使细胞样品与至少一个直接或间接与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分(即细胞刺激组合物)接触，所述第一结合部分能够结合靶细胞上的靶抗原。在一个实施方案中，第一核酸聚合物被工程化为具有约60℃或更低的预测二级结构的解链温度(参见上文关于解链温度的更详细描述)。

如上文所述，第一结合部分可为能够结合靶抗原的任何类型的生物或化学组合物。第一结合部分的实例可包括抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。

与用于接触细胞样品的第一核酸聚合物缀合的第一结合部分(即细胞刺激组合物)的浓度不应为有毒的。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的细胞刺激组合物的浓度在约100μg/mL与0.001μg/mL之间。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的细胞刺激组合物的浓度在约10μg/mL与0.01μg/mL之间。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的细胞刺激组合物的浓度在约5μg/mL与0.05μg/mL之间。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的细胞刺激组合物的浓度在约2μg/mL与0.02μg/mL之间。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的细胞刺激组合物的浓度为约0.5μg/mL或约1μg/mL。

方法还包括培育已由第一结合部分(例如可溶性细胞刺激组合物)结合的靶细胞。

已由第一结合部分结合的靶细胞的培育持续时间通常将取决于靶细胞的性质。例如，如果靶细胞是T细胞，则应将已由细胞刺激组合物(更具体地，被其第一结合部分)和任何必需或期望的第二结合部分或共刺激结合部分结合的T细胞培育任何不会对细胞产生负面影响的时间量。在一些实施方案中，将已由第一结合部分结合的T细胞培育至多14天可能是合适的。在一个实施方案中，培育结合的T细胞少于14天，例如13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天。在一个优选实施方案中，培育已由第一结合部分结合的T细胞约2天或约3天。

如果靶细胞是B细胞，则应将已由细胞刺激组合物(更具体地，被其第一结合部分)和任何必需或期望的共刺激结合部分或辅助信号结合的B细胞培育任何不会对细胞产生负面影响的时间量。在一些实施方案中，可能适当的是将已由至少一个第一结合部分结合的B细胞培育2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，或更短时间。

如果靶细胞是NK细胞，则应将已由细胞结合组合物(更具体地，由其第一结合部分)和任何必需或期望的共刺激结合部分或辅助信号结合的NK细胞培育任何不会对细胞产生负面影响的时间量。在一些实施方案中，可能适当的是将已由至少一个第一结合部分结合的NK细胞培育2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，或更短时间。

由于刺激细胞样品中的靶细胞令人惊讶地显示使用与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分(即细胞刺激组合物)而不需要将两种此类缀合物彼此预复合，可能重要的是修饰或工程改造第一核酸聚合物的序列，以使其预测二级结构的解链温度为约60℃或更低。在一个实施方案中，第一核酸聚合物包含其中预测二级结构的解链温度在约50℃与10℃之间或更低的序列。在一个实施方案中，第一核酸聚合物包含其中预测二级结构的解链温度在约40℃与20℃之间的序列。

取决于细胞刺激组合物的应用，可能希望第一核酸聚合物的序列不含已知触发细胞反应，例如刺激反应的基序。例如，富含CpG基序的第一核酸聚合物可通过Toll样受体(TLR)9识别来引发促炎反应。或者，对于范围介于50至80bp之间的片段，也可通过细胞溶质免疫感应受体cGAS或通过AIM-1以与序列无关的方式识别含有鸟苷的具有未配对端(Y型)的双链DNA聚合物。此外，三磷酸化(5'ppp)双链核糖核酸(RNA)聚合物也可通过RIG-1或在长度超过40bp时通过TLR3引发免疫反应。含有polyU或富含G/U的序列的那些也可被例如TLR7识别。含有polyU/UC基序的单链RNA聚合物也可通过RIG-1信号传导引发免疫反应。

在一个实施方案中，方法可任选地包括在与至少一个第一结合部分(与第一核酸聚合物缀合)之前或同时，或在使细胞样品与至少一个第一结合部分(与第一核酸聚合物缀合)接触之后使细胞样品与至少一个第二结合部分和/或能够结合第二靶抗原的共刺激结合部分和/或靶细胞上的共刺激抗原接触。

类似于第一结合部分，第二结合部分和/或共刺激结合部分可为抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。类似于第一结合部分，第二结合部分和/或共刺激结合部分可为可溶的或固定在表面上。在一个实施方案中，第二结合部分和/或共刺激结合部分为可溶的。在一个实施方案中，细胞刺激组合物和第二结合部分和/或共刺激结合部分是可溶的。

用于接触细胞样品的第二结合部分(和/或共刺激结合部分)的浓度不应为有毒的。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的第二结合部分(和/或共刺激结合部分)的浓度介于约100μg/mL与0.001μg/mL之间。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的第二结合部分(和/或共刺激结合部分)的浓度介于约10μg/mL与0.01μg/mL之间。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的第二结合部分(和/或共刺激结合部分)的浓度介于约5μg/mL与0.05μg/mL之间。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的第二结合部分(和/或共刺激结合部分)的浓度介于约2μg/mL与0.02μg/mL之间。在一个实施方案中，用于接触细胞样品的第二结合部分(和/或共刺激结合部分)的浓度为约0.5μg/mL或约1μg/mL。

已由第一结合部分结合的靶细胞的培育持续时间通常将取决于靶细胞的性质。例如，如果靶细胞是T细胞，则应将已由细胞刺激组合物(更具体地，由其第一结合部分)和任何必需或期望的第二结合部分和/或共刺激结合部分结合的T细胞培育任何不会对细胞产生负面影响的时间量。在一些实施方案中，将已由第一结合部分结合的T细胞培育至多14天可能是合适的。在一个实施方案中，培育结合的T细胞少于14天，例如13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天。在一个优选实施方案中，培育已由第一结合部分结合的T细胞约2天或约3天。

如果靶细胞是B细胞，则应将已由细胞刺激组合物(更具体地，由其第一结合部分)和任何必需或期望的第二结合部分和/或共刺激结合部分结合的B细胞培育任何不会对细胞产生负面影响的时间量。在一些实施方案中，可能适当的是将已由至少一个第一结合部分结合的B细胞培育2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，或更短时间。

如果靶细胞是NK细胞，则应将已由细胞结合组合物(更具体地，由其第一结合部分)和任何必需或期望的第二结合部分和/或共刺激结合部分结合的NK细胞培育任何不会对细胞产生负面影响的时间量。在一些实施方案中，可能适当的是将已由至少一个第一结合部分结合的NK细胞培育2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，或更短时间。

在一个实施方案中，方法可进一步包括在培育步骤期间增加(或增加的)靶细胞的增殖，其中靶细胞的增殖在存在细胞刺激组合物(和任何(一种或多种)必需的共刺激分子)的情况下比在不存在细胞刺激组合物(和任何(一种或多种)必需的共刺激分子)的情况下更大。

在一个实施方案中，增加的增殖依赖于使细胞样品与至少一个与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分和至少一个能够结合靶细胞上的第二靶抗原的第二结合部分(和/或和至少一个能够结合靶细胞上的共刺激抗原的共刺激结合部分)接触。例如，如果靶细胞为T细胞，则第一靶抗原可为T细胞受体复合物的组分，例如CD3ε、TCRα或TCRβ，并且第二靶抗原(和/或共刺激抗原)可为以下中的一者或多者：免疫球蛋白超家族的共刺激受体，包括CD28、CD137、CD2、CD134、CD152、CD278、CD27或CD279，或不同的肿瘤坏死受体家族成员。在一个实施方案中，额外信号，例如细胞因子可帮助促进增殖、活化或活性调节。

在靶细胞为B细胞的实施方案中，则第一抗原可为CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b中的一者或多者，并且第二靶抗原(和/或共刺激抗原)可为CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b中不同的一者或多者。在一个实施方案中，例如IL-4、IL-6、IL-10和IL-13(对于人B细胞)中的一者或多者的信号可与第二靶抗原(和/或共刺激抗原)一起使用或代替结合所述抗原。

在靶细胞为NK细胞的实施方案中，则第一抗原可为以下中的一者：NKp30、NKp44和NKp46，以及C型凝集素样受体，例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α，并且第二抗原(和/或共刺激抗原)可为以下中不同的一者或多者：NKp30、NKp44和NKp46，以及C型凝集素样受体，例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α。在一个实施方案中，例如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的一者或多者的信号可与第二靶抗原(和/或共刺激抗原)一起使用或代替结合所述抗原。

在一个实施方案中，第一核酸聚合物或其互补区与第二核酸聚合物互补。第二核酸聚合物可直接或间接与至少一个第二结合部分缀合，或不与至少一个第二结合部分缀合。

在第二核酸聚合物不与至少一个第二结合部分缀合的实施方案中，本文公开的方法还可包括使第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区杂交。在将第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区杂交时，在细胞样品与细胞刺激组合物接触之前或之后，有可能调节靶细胞刺激的水平。换句话说，当第一核酸聚合物或其互补区与第二核酸聚合物杂交时，与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分的活性可被淬灭。

在一个实施方案中，在将细胞样品与直接或间接与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分接触之前，可将第二核酸聚合物与第一核酸聚合物(或其互补区)预杂交。在此类实施方案中，刺激细胞样品中的靶细胞可最初被淬灭，并且因此刺激靶细胞可为可诱导的。例如，可在适当的时间通过添加竞争核酸聚合物来诱导刺激靶细胞，其中第二核酸聚合物对竞争核酸聚合物的杂交偏好高于第一核酸聚合物(或其互补区)。

在一个实施方案中，在将细胞样品与直接或间接与第一核酸聚合物缀合的可溶性第一结合部分接触的同时或之后，可将第二核酸聚合物与第一核酸聚合物(或其互补区)杂交。在此类实施方案中，可最初诱导刺激细胞样品中的靶细胞，并且可随后不诱导刺激靶细胞。例如，通过将第二核酸聚合物与第一核酸聚合物(或其互补区)杂交，可在适当的时间不诱导刺激靶细胞。并且，在稍后的适当时间，可通过添加竞争核酸聚合物来实现重新活化靶细胞刺激，其中第二核酸聚合物对竞争核酸聚合物的杂交偏好高于第一核酸聚合物(或其互补区)。

举例来说，为了说明使用与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分(即细胞刺激组合物)、第二核酸聚合物以及在适用的实施方案中竞争核酸聚合物在细胞样品中诱导和不诱导靶细胞刺激背后的概念。第二核酸聚合物的长度可为20个单体，并且此类第二核酸聚合物可与第一核酸聚合物或其互补区约40％、50％、60％、70％、80％或90％互补。因此，第二核酸聚合物具有足够的互补性以与第一核酸聚合物或其互补区杂交。然而，在包括竞争核酸聚合物的实施方案中，第二核酸聚合物与竞争核酸聚合物之间的互补性高于第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区之间的互补性。例如，如果第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区50％互补，则与第二核酸聚合物约60％、70％、80％、90％或100％互补的竞争核酸聚合物对第二核酸聚合物的杂交偏好将大于第二核酸聚合物对第一核酸聚合物或其互补区的杂交偏好。

在第二核酸聚合物直接或间接与第一结合部分和/或第二结合部分缀合的实施方案中，可以本领域技术人员已知或可获得的任何方式进行缀合。例如，可使用任何已知反应将第一或第二结合部分与第二核酸聚合物缀合，前提是这些组分的构成在(一个或多个)缀合反应期间没有受到负面影响。在一个实施方案中，第二核酸聚合物可通过亲核取代、亲电取代、烷基化、氧化、缩合、环加成或施陶丁格连接反应中的一者与第一或第二结合部分缀合。

在一个实施方案中，第二核酸聚合物可通过一个或多个共价键与第一和/或第二结合部分缀合，所述共价键包括腙、肟、酰亚胺、砜、三嗪或经由选自包含巯基、胺、羧基、羟基、酰肼、醛或聚糖的基团的官能团的其它共价连接。

在第二核酸聚合物与第一和/或第二结合部分缀合的此类实施方案中，本文公开的方法还可包括使此类第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区杂交。在将第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区杂交时，在细胞样品与可溶性第二结合部分接触之前、与此同时或在此之后，有可能形成结合部分的双特异性复合物。在此类实施方案中，结合部分的双特异性复合物为细胞刺激组合物。

在一个实施方案中，在结合部分的双特异性复合物与细胞样品(和其中的靶细胞)接触之前，第二核酸聚合物与第一核酸聚合物(或其互补区)预杂交。在此类实施方案中，结合部分的双特异性复合物可最初引发靶细胞的刺激反应。在适当的时间，靶细胞对结合部分的双特异性复合物的刺激反应可用竞争核酸聚合物淬灭，其中竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物(或其互补区)或第二核酸聚合物(或其互补区)的杂交偏好高于第一核酸聚合物对第二核酸聚合物的杂交偏好。在稍后的适当时间，可用抗竞争核酸聚合物重新活化刺激反应，其中抗竞争核酸聚合物对竞争核酸聚合物的杂交偏好高于竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物(或其互补区)或第二核酸聚合物(或其互补区)的杂交偏好。

在一个实施方案中，结合部分的双特异性复合物的形成最初可能受到竞争核酸聚合物与第一核酸聚合物或第二核酸聚合物或两者的杂交的干扰，其中竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物和/或第二核酸聚合物的杂交偏好高于第一核酸聚合物对第二核酸聚合物的杂交偏好。因此，靶细胞的刺激反应可最初被淬灭。因此，单个组分不能形成结合部分的双特异性复合物，但结合部分的双特异性复合物可通过在适当的时间添加抗竞争核酸聚合物而形成，其中抗竞争核酸聚合物对竞争核酸聚合物的杂交偏好高于竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物和/或第二核酸聚合物的杂交偏好。

举例来说，为了使用以下各者说明在细胞样品中诱导和不诱导靶细胞刺激背后的概念：与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分；与第二核酸聚合物缀合的(不同的第一或)第二结合部分；以及在适用的实施方案中，竞争核酸聚合物和抗竞争核酸聚合物。第二核酸聚合物可与第一核酸聚合物或其互补区约40％、50％、60％、70％或80％互补。因此，第二核酸聚合物具有足够的互补性以与第一核酸聚合物或其互补区杂交。然而，在包括竞争核酸聚合物的实施方案中，第一核酸聚合物或第二核酸聚合物与竞争核酸聚合物之间的互补性高于第一核酸聚合物或其互补区与第二核酸聚合物之间的互补性。例如，如果第二核酸聚合物与第一核酸聚合物或其互补区50％互补，则与第一核酸聚合物其互补区或第二核酸聚合物约例如60％或70％互补的竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物或其互补区或第二核酸聚合物的杂交偏好将大于第二核酸聚合物对第一核酸聚合物或其互补区的杂交偏好。此外，如果抗竞争核酸聚合物与竞争核酸聚合物80％或90％或100％互补，则抗竞争核酸聚合物对竞争核酸聚合物的杂交偏好将大于竞争核酸聚合物对第一核酸聚合物或其互补区或第二核酸聚合物的杂交偏好。因此，随着竞争核酸聚合物与抗竞争核酸聚合物杂交，第二核酸聚合物可与第一核酸聚合物或其互补区杂交。

如果在使用应用中担心结合部分的双特异性复合物的未复合组分可能单独触发靶细胞中的刺激反应，则这可根据本文的教导来控制。例如，第一和/或第二核酸聚合物的序列可被工程化以具有失效的二级结构(即具有高于50℃或60℃或更高的解链温度)。另举一例，结合部分的双特异性复合物的未复合组分可用与第一和第二核酸聚合物杂交的适当中和或失效核酸聚合物“中和”或“失效”。

在一个实施方案中，由第一结合部分结合的靶抗原和由第二结合部分结合的靶抗原在相同的细胞上。在一个实施方案中，由第一结合部分结合的靶抗原和由第二结合部分结合的靶抗原在不同的细胞上。在此类实施方案中，上述系统和方法可适于根据需要使两种靶细胞类型彼此接近。例如，第一结合部分可与第一靶细胞类型结合并且第二结合部分可与第二靶细胞类型结合，并且此类第一结合部分和此类第二结合部分的另外互补的相应核酸聚合物可各自与竞争核酸聚合物杂交。在添加合适的抗竞争核酸聚合物后，可形成允许相应的(第一和第二)核酸聚合物杂交，从而使第一靶细胞类型和第二靶细胞类型接近的竞争:抗竞争双链体。

以下非限制性实施例说明本公开。

表1.本公开中使用的核酸聚合物和对应序列的列表。a：N指定一个随机核苷酸(A、C、G或T)；*指定硫代磷酸键

表2.本公开中使用的组合物和其核酸聚合物的特性。

b：在25℃下150mM单价阳离子浓度的二级结构预测

实施例

实施例1：将核酸聚合物与结合部分缀合

核酸聚合物缀合的(单克隆)抗体一般如图1中所描绘。此类缀合物可通过本领域已知的化学反应，包括基于胺和基于硫醇的缀合方法来产生。

DNA寡核苷酸序列与本公开的单克隆抗人抗体(mAb)的基于胺的共价连接通过中间体二苯并环辛炔-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺(DBCO-PEG4-NHS酯；Click Chemistry Tools目录号：A134)连接分子进行。以下一般描述也适用于其它抗体和替代核酸聚合物序列，例如表1中呈现的那些。本公开内容中使用的组合物列于表2中。

在DMSO中制备DBCO-PEG4-NHS接头的5mg/mL储备溶液。接着将抗CD3 mAb(克隆1；STEMCELL Technologies)于1X PBS中的溶液与180mol过量的接头和1X PBS混合，以达到1mg/mL的最终mAb浓度和低于10％的有效DMSO浓度。将制剂充分混合并在室温下培育90分钟。

mAb修饰后，通过超滤(例如Amicon 30K MWCO，EMD Millipore目录号：UFC503024)通过在1X PBS中交换3X以去除未反应的接头来纯化反应物。纯化产物立即通过紫外-可见光谱进行分析，其中通过测量280nm和310nm的吸光度并使用IgG和DBCO的已知摩尔消光系数进行计算来确定抗体浓度和修饰程度。优选每个IgG的取代度<4DBCO。将二至四摩尔当量的叠氮化物修饰的DNA核酸聚合物(Integrated DNA technologies Inc.)(重悬于1X PBS中)添加至修饰的抗体制剂中，并在4℃下培育过夜(16-24小时)。

在基于胺的缀合反应之后，缀合物通过FPLC使用负载Ni²⁺的固定化金属亲和色谱柱(HiTrap Chelating HP，GE healthcare目录号：17040801)从未反应的游离寡核苷酸中纯化。首先，根据制造商说明书，将0.5柱体积(CV)的0.1M NiCl₂水溶液装载至柱上。用5CV运行缓冲液(0.1M磷酸钠pH 8.0，300mM NaCl)彻底洗涤后，将缀合物注入并允许以1ml/min的流速与柱结合。用10CV运行缓冲液洗涤柱后，保留的缀合物用含有50mM EDTA的运行缓冲液洗脱。收集的含有洗脱缀合物的级分立即通过超滤(例如Amicon 30K MWCO，EMDMillipore目录号UFC503024)处理并在1X PBS、2mM EDTA中交换以在4℃下储存。

DNA寡核苷酸序列与本公开的单克隆抗人抗体(mAb)的基于硫醇的共价连接通过中间体二苯并环辛炔-PEG4-双砜(DBCO-PEG4-双砜；Click Chemistry Tools目录号：1144)连接子进行。以下提供的一般描述也适用于其它抗体和替代核酸聚合物序列，例如表1中呈现的那些。本公开内容中使用的组合物列于表2中。

在DMSO中制备DBCO-PEG4-双砜接头的2mg/mL储备溶液。将100nmol接头与5nmol叠氮化物修饰的寡核苷酸(Integrated DNA technologies Inc.)结合，并添加DMSO以调节至>60％的最终溶剂浓度。将制剂充分混合并在室温下培育3小时。寡核苷酸修饰后，添加适当体积的1X PBS以将DMSO浓度降至低于30％。混合后，一部分未反应的接头会沉淀，并且反应物会出现浑浊。在以10,000g离心2分钟后，收集上清液并通过超滤(Amicon 10K MWCO，EMDMillipore目录号：UFC501024)通过在1X PBS中交换4X来纯化。立即通过紫外-可见光谱(Nanodrop)，通过测量260nm处的吸光度来分析纯化的寡核苷酸。

抗CD3 mAb(克隆1；STEMCELL Technologies Inc.)于1X PBS中的溶液与5mM TCEP混合，最终浓度为1mg/mL，并在室温下培育30分钟以还原链间二硫键。

在基于硫醇的mAb还原后，通过超滤(Amicon 10K MWCO，EMD Millipore，目录号UFC501024)通过在1X PBS、2mM EDTA中交换3X以去除TCEP来纯化反应物。纯化的产物立即通过紫外-可见光谱进行分析，以通过测量280nm处的吸光度来确定抗体浓度。将2至4摩尔当量的先前修饰的DNA核酸聚合物添加至还原的抗体制剂中，并在4℃下培育过夜(16-24小时)。在缀合反应之后，缀合物按照之前的描述进行纯化。

实施例2：细胞的制备

通过阴性选择从样品中富集靶细胞。对于刺激实验，根据制造商说明书，使用免疫磁性阴性T细胞分离方法(EasySep^TM人T细胞分离试剂盒，STEMCELL Technologies，目录号17951)从新鲜PBMC中分离T细胞。

遵循分离方案，使用标准方法确定富集的细胞的浓度。任选地，阴性选择的细胞的纯度可通过流式细胞术来确定(图2)。取决于供体，典型地，在PBMC样品中的活CD45+细胞中，大约60％的此类细胞为CD3+(图2A)。根据此实施例对T细胞进行富集后，典型地会获得包含≥95％纯度的CD3+T细胞的活CD45+细胞群体(图2B)。图2C(富集前)和2D(富集后)显示了表达CD4或CD8或两者的各种T细胞亚群的流式细胞术图，并确认了分离后亚群群体的保留。

实施例3：使用细胞刺激组合物结合靶细胞

测试了根据实施例1制备的组合物(除非商购预缀合)结合实施例2的富集细胞的能力。

对于T细胞，图3显示本公开的组合物能够结合富集的T细胞。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与0μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL或5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)(图3A)或与寡核苷酸A缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)(图3B)一起培育。在室温下培育细胞和抗体组合物大约20分钟后，添加固定浓度(0.5μg/mL)的APC标记的抗人CD3 IgG(Biolegend)以竞争T细胞上可用的抗原结合位点。在与APC标记的抗人CD3 IgG抗体一起培育后，通过连续几轮离心和重悬于染色缓冲液中来洗涤样品。随后通过流式细胞术(CytoFLEX，Beckman Coulter)分析标记的细胞。观察到用未标记的抗人CD3 IgG(克隆1)或抗人CD3 IgG(克隆1)寡核苷酸缀合物的剂量依赖性抗原阻断，表明本公开的组合物结合靶细胞。

实施例4：用细胞刺激组合物和共刺激分子刺激分离的靶细胞

测试了根据实施例1制备的组合物(除非商购预缀合)在实施例2的富集细胞中刺激反应的能力。

对于人T细胞，图4显示本公开的组合物能够刺激T细胞。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与各种组合物接触以在37℃下在加湿的5％CO₂气氛中培育72小时后测试CD25+表达％。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)(仅CD3 IgG条件)接触。第三对照条件还包括以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM(Dynabeads^TM人T活化剂CD3/CD28；ThermoFisher目录号1131D)。在存在1μg/mL抗人CD28IgG的情况下，在培育72小时的持续时间内在37℃下用2X、1X、0.2X、0.1X或0.02X浓度的与寡核苷酸A缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)来研究处理条件。更高浓度的可溶性细胞刺激组合物(即与寡核苷酸A缀合的抗人CD3 IgG(克隆1))将CD4⁺T细胞(黑色条)和CD8⁺T细胞(灰色条)刺激至与使用Dynabeads^TM所获得相当的水平。此外，核酸聚合物的缀合对于刺激很重要，因为未缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)无法引发刺激反应。

对于人T细胞，图5显示当结合部分和核酸聚合物彼此缀合时，本公开的组合物能够刺激T细胞。未缀合形式引发低刺激反应或不引发刺激反应。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与各种组合物接触以测试在37℃下培育48小时(图5A)或72小时(图5B)后的CD25+表达％。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)(仅CD3 IgG条件)接触。第三对照条件包括在CD28 IgG存在下单独的核酸聚合物(仅寡核苷酸条件)。通过将0.5μg/mL未修饰的CD3 IgG与1μM可溶性核酸聚合物D在存在1μg/mL CD28 IgG的情况下共培育，或与0.5μg/mL CD3 IgG:寡核苷酸D缀合物在存在1.0μg/mL CD28 IgG的情况下共培育来处理接种细胞。在培育48或72小时后，分析细胞的CD25活化标志物表达。只有抗人CD3 IgG(克隆1)与寡核苷酸D缀合的情况才会产生刺激反应。

对于人T细胞，图6显示本公开的组合物能够刺激T细胞。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与各种组合物接触以在37℃下培育72小时后测试CD25+表达％。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)(CD3 IgG条件)接触。第三对照条件还包括以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM。接种的细胞用各种抗人IgG缀合物处理，包括0.5μg/mL与寡核苷酸A缀合的抗CD3 IgG(克隆1)；0.5μg/mL与寡核苷酸E缀合的抗CD3 IgG(克隆2)；以及0.5μg/mL与寡核苷酸F缀合的抗TCRαβIgG(克隆1)。所有处理条件还包括在培育72小时的持续时间内与1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)共刺激。CD4+和CD8+T细胞群体上CD25活化标志物表达的流式细胞术分析均揭示了寡核苷酸缀合物与T细胞受体的各种组分结合的介导刺激反应。

实施例5：通过使细胞刺激组合物与互补寡核苷酸反应来淬灭靶细胞的刺激

测试了根据实施例1制备的组合物(除非商购预缀合)在实施例2的富集细胞中刺激和淬灭反应的能力。

对于人T细胞，图7显示使用本公开的组合物对细胞的刺激可使用与缀合至结合部分的核酸聚合物的至少一部分互补的核酸聚合物来淬灭。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与细胞刺激组合物和滴定浓度的互补核酸聚合物接触。对照条件包括用0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)连同1μg/mL CD28 IgG(克隆CD28.2)以及以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM处理接种细胞。用与寡核苷酸A(0.5μg/mL)缀合的各种抗人CD3 IgG(克隆1)制剂处理接种细胞，所述寡核苷酸与1X、10X、100X或1000X浓度的互补寡核苷酸(AC1)预培育。所有处理均包括与1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)共刺激。在培育72小时后，分析细胞的CD25活化标志物表达。受刺激的T细胞的流式细胞术分析揭示，当缀合物与浓度增加的核酸聚合物预培育时活化的剂量依赖性调节，所述核酸聚合物与缀合至细胞刺激组合物的结合部分的核酸聚合物的至少一部分互补。

实施例6：通过对细胞刺激组合物与互补寡核苷酸的杂交进行计时来调节靶细胞的刺激

使用根据实施例1制备的组合物如实施例2中富集的细胞的刺激(除非商购预缀合)可使用与缀合至结合部分的核酸聚合物的至少一部分互补的核酸聚合物来调节。

对于人类T细胞，图8证明了通过定时添加与缀合至结合部分的核酸聚合物的至少一部分互补的核酸聚合物来调节靶细胞刺激的持续时间的可能性。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与细胞刺激组合物接触。初始刺激后，细胞刺激组合物以不同的时间间隔与互补寡核苷酸(AC1)接触，并允许在37℃下继续培育72小时。对照条件包括用未修饰的抗人CD3 IgG(0.5μg/mL；克隆1)连同抗CD28 IgG(1.0μg/mL；克隆CD28.2)处理接种细胞，以及用1:1珠/细胞比率的Dynabeads^TM进行处理。在存在抗CD28 IgG(1μg/mL；克隆CD28.2)的情况下，所有处理孔都与缀合至寡核苷酸A的抗人CD3 IgG(克隆1)接触。通过在用CD28和CD3-寡核苷酸缀合物初始刺激后0、0.5、1、2和4小时向处理过的孔中添加300X浓度的互补核酸聚合物(寡核苷酸AC1)来实现活化调节，并在37℃下培育72小时。也包括省略添加互补寡核苷酸的处理条件(无AC1条件)作为实验的最大活化潜力的基准。CD25标志物表达的流式细胞术分析揭示，使用细胞刺激组合物对靶细胞的刺激可以时间依赖性方式进行调节；越早将细胞刺激组合物暴露于与缀合至细胞刺激组合物的结合部分的核酸聚合物的至少一部分互补的核酸聚合物，测量到总体刺激降低。

实施例7：通过点突变改变细胞刺激组合物的刺激潜力

通过工程化点突变测试改善或恶化的靶细胞刺激(如实施例2中富集)以将预测二级结构的解链温度修改为根据实施例1制备的细胞刺激组合物的核酸聚合物(除非商购预缀合)。

对于人类T细胞，图9至11显示细胞刺激组合物的刺激潜力可通过组分核酸聚合物中的工程化点突变来改变。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与各种组合物接触以在37℃下培育72小时后测试活化(通过CD25标志物表达测量)。所有处理均包括在培育72小时的持续时间内与1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)共刺激。

在图9A中，第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)接触。第三对照条件还包括以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM。接种细胞与以下各者接触：0.5μg/mL与寡核苷酸A(预测二级结构的预测解链温度为约38℃)缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)；0.5μg/mL与寡核苷酸A_var1(预测二级结构的预测解链温度为约52℃)缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)；以及0.5μg/mL与寡核苷酸A_var2(预测二级结构的预测熔化温度为约31℃)缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)。与包括寡核苷酸A或A_var2的细胞刺激组合物相比，包括寡核苷酸A_var1的细胞刺激组合物导致CD4⁺和CD8⁺T细胞群体中的CD25标志物表达显著降低。另外，与针对A(图9B)或A_var2(图9D)观察到的那些相比，针对包括寡核苷酸A_var1(图9C)的细胞刺激组合物观察到减少的T细胞聚集。总的来说，结果表明随着预测二级结构的解链温度降低，T细胞活化的输出增加。

从之前的一组寡核苷酸变体A实验中获得的结果被扩展至包括不同身份的额外核酸聚合物变体。图10展示了当在B_var1的核酸聚合物序列中策略性放置点突变以将B_var2中的预测二级结构的解链温度从约45℃降低至约28℃时，活化输出增强的类似趋势。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)接触。第三对照条件还包括以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM。接种细胞与以下各者接触：0.5μg/mL与寡核苷酸B(已知核苷酸的预测二级结构的预测解链温度为约45℃)缀合的抗人CD3IgG(克隆1)；0.5μg/mL与寡核苷酸B_var1(预测二级结构的预测解链温度为约44℃)或B_var2(预测二级结构的预测熔化温度为约28℃)缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)。在37℃下培育72小时后对CD25标志物表达的流式细胞术分析显示，相对于包括寡核苷酸B_var1或B的细胞刺激组合物，包括寡核苷酸B_var2的细胞刺激组合物在CD4⁺和CD8⁺T细胞群体中的活化水平增强。同样，与针对B(图10B)或B_var1(图10C)观察到的那些相比，还观察到包括寡核苷酸B_var2(图10D)的细胞刺激组合物的T细胞聚集增强。

在图11中测试了第三核酸聚合物变体组。在C_var1的核酸聚合物序列中包括策略性放置的点突变，以将C_var2中预测二级结构的解链温度从约49℃降低至约34℃。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)接触。第三对照条件还包括以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM。将接种细胞与0.5μg/mL抗人CD3 IgG(克隆1)接触，所述克隆与寡核苷酸C_var1、C_var2或C(已知核苷酸的预测二级结构的预测解链温度为约29℃)缀合。在37℃下培育72小时后对CD25标志物表达的流式细胞术分析显示，相对于包括寡核苷酸C或C_var2的细胞刺激组合物，包括寡核苷酸C_var1的细胞刺激组合物在CD4⁺和CD8⁺T细胞群中的活化水平均降低。同样，与针对C(图11B)或C_var2(图11D)观察到的那些相比，针对包括寡核苷酸C_var1(图11C)的细胞刺激组合物也观察到减少的T细胞聚集。

实施例8：通过使细胞刺激组合物与各种互补寡核苷酸反应来淬灭靶细胞的刺激

对于人T细胞，图12显示使用本公开的组合物对细胞的刺激可使用沿着与结合部分缀合的核酸聚合物长度的不同部分具有互补性的各种核酸聚合物来淬灭。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与细胞刺激组合物和互补核酸聚合物接触。对照条件包括用0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)连同1μg/mL CD28 IgG(克隆CD28.2)以及以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM处理接种细胞。用与寡核苷酸C(0.5μg/mL)缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)处理接种细胞，所述寡核苷酸与1μM互补寡核苷酸CC-1、CC-3、CC-12、CC-23或CC-1和CC-3预培育。所有处理均包括与1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)共刺激。在培育72小时后，分析细胞的CD25活化标志物表达(图12A)。受刺激的T细胞的流式细胞术分析揭示，单独的CC-3对淬灭T细胞活化具有最深远的影响，而单独的CC-1似乎对淬灭T细胞活化没有影响。

还评估了C_var1和C_var 2(与抗人CD3 IgG缀合)对1μM互补寡核苷酸CC-1、CC-3、CC-12、CC-23或CC-1和CC-3的反应性。如上所述，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与细胞刺激组合物和互补核酸聚合物接触。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)接触。第三对照条件还包括以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM。用与寡核苷酸C_var1或C_var2(0.5μg/mL)缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)的各种制剂处理接种细胞，所述寡核苷酸与1μM互补寡核苷酸CC-1、CC-3、CC-12、CC-23或CC-1和CC-3预培育。所有处理均包括与1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)共刺激。在培育72小时之后，将每个单独条件下的细胞重悬浮并分析它们的直径，即图12B中报告的群体直径的平均值。与使用抗体缀合的C_var1或C_var2(无阻断)活化的T细胞相比，包括互补寡核苷酸预杂交在内的条件中的直径减小表明T细胞的活化减少。

在图12A中观察到，与抗人CD3抗体缀合的寡核苷酸的最远端部分(与寡核苷酸CC-3互补)最容易淬灭细胞活化。因此，基于与寡核苷酸CC-3互补的序列设计了更多的寡核苷酸并在T细胞活化实验中进行了测试(图13A)。简而言之，连接前述序列的2、3或4个单元，确保在连接中，后一单元相对于前一单元反转(例如CCCATATAAGAAATTTAAAGAATATACCC)，以保持二级结构的有利(低)解链温度。产生的连接被称为C2x、C3x或C4x，并在比较C_var2中进行了测试(每个都与抗人CD3 IgG缀合)。如上所述，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与细胞刺激组合物接触。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)接触。第三对照条件还包括以1:1珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM。用与寡核苷酸C_var2、C2x、C3x或C4x(各0.5μg/mL)缀合的抗人CD3 IgG(克隆1)处理接种细胞。所有处理均包括与1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)共刺激。在此情况下，选择培育48小时，以捕获每个寡核苷酸变体的活化刺激差异。培育48小时后，分析细胞的CD25表达(图13A)。随着连接单元数量的增加，观察到T细胞的活化增加。

由于C4x(与抗人CD3 IgG缀合)导致T细胞的最高活化，因此基本上如上所述在淬灭实验中测试此细胞刺激组合物。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与细胞刺激组合物和滴定浓度的互补核酸聚合物接触。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)和1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)接触。用与寡核苷酸C4x(0.5μg/mL)缀合的各种抗人CD3 IgG(克隆1)制剂处理接种细胞，所述寡核苷酸与1X、100X和500X相对浓度的互补寡核苷酸(CC-3)预培育。所有处理均包括与1μg/mL抗人CD28 IgG(克隆CD28.2)共刺激。在培育72小时后，分析细胞的CD25活化标志物表达(图13B)。受刺激的T细胞的流式细胞术分析揭示，当缀合物与浓度增加的核酸聚合物预培育时活化的剂量依赖性调节，所述核酸聚合物与缀合至细胞刺激组合物的结合部分的核酸聚合物的至少一部分互补。

实施例9：用结合部分的双特异性复合物刺激靶细胞

对于人T细胞，图14显示本公开的组合物能够刺激T细胞。此处，组合物包含与寡核苷酸D缀合的第一抗人抗CD3 IgG(克隆1)抗体和与寡核苷酸DC缀合的第二抗人抗CD3 IgG(克隆1)抗体，主要与寡核苷酸D互补。将五微克的每种抗CD3-寡核苷酸缀合物合并于小瓶中并在室温下培育15分钟以允许缀合物发生杂交，从而形成结合部分的双特异性复合物。简而言之，将1.6×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与细胞刺激组合物接触。对照条件包括未刺激的细胞和用0.5μg/mL未修饰的抗人CD3 IgG(克隆1)连同1μg/mL CD28 IgG(克隆CD28.2)处理接种细胞。用单独的抗人CD3 IgG(克隆1)缀合物(0.5μg/mL寡核苷酸D或DC缀合物)或0.5μg/mL先前杂交的缀合物处理接种细胞。所有处理均包括与1μg/mL抗人CD28IgG(克隆CD28.2)共刺激。在培育72小时后，通过流式细胞术分析细胞的CD25活化标志物表达。单独的抗CD3缀合物导致部分T细胞活化，所述活化在复合与细胞刺激组合物的结合部分缀合的核酸聚合物的一部分时进一步增强。

实施例10：用细胞刺激组合物和共刺激分子刺激分离的靶细胞

根据实施例1制备的组合物(除非商购预缀合)刺激从小鼠脾脏样品中分离的T细胞之间的反应的能力。简而言之，根据动物福利指南从C57Bl/6J小鼠中采集脾脏，并在含有2％胎牛血清(FBS)的PBS中破碎脾脏。使细胞悬浮液穿过70μm网状尼龙过滤器而去除聚集体和碎片。收集的细胞以300x g离心10分钟并以1.0×10⁸个有核细胞/mL重悬，然后根据制造商说明书使用EasySep小鼠T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies Inc.，目录号19851)分离T细胞。

对于小鼠T细胞，图15显示本公开的组合物能够刺激T细胞。此处，组合物包含与寡核苷酸C4x或寡核苷酸C_var2缀合的抗小鼠抗CD3 IgG(克隆4)抗体。简而言之，将2.0×10⁵个细胞接种至96孔板的每个孔中，并与细胞刺激组合物接触。第一对照条件使接种细胞未经处理(仅细胞)，而第二对照条件使接种细胞与0.5μg/mL未修饰的抗小鼠CD3 IgG(克隆4)和2μg/mL抗小鼠CD28 IgG接触。第三对照条件还包括以1:2珠/细胞比率培育的Dynabeads^TM。第四条件测试了板结合的抗小鼠CD3 IgG(克隆4)。用与寡核苷酸C4x或寡核苷酸C_var2缀合的0.5μg/mL抗小鼠CD3 IgG(克隆4)处理接种细胞。所有处理均包括与2μg/mL抗小鼠CD28 IgG的共刺激。在培育48小时或72小时后，通过流式细胞术分析细胞的CD25活化标志物表达。单独的可溶性抗CD3缀合物导致部分T细胞活化，所述活化可在抗CD3抗体与任一测试寡核苷酸缀合时增强。细胞刺激组合物可以与Dynabeads条件和板结合抗CD3抗体条件相当的效率实现细胞活化。

尽管已参考目前被认为是优选的实施例对本发明进行了描述，但应理解，本发明不限于所公开的实施例。与此相反，本公开旨在涵盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等效布置。

所有出版物、专利和专利申请均以引用方式整体并入本文，其程度如同每个单独出版物、专利或专利申请具体地和单独地被指示为以引用方式整体并入。

序列表

<110> 加拿大干细胞技术公司(StemCell Technologies Canada Inc.)

<120> 用于刺激细胞的组合物、系统和方法

<130> 7771-P62063PC00

<150> US 63/045,589

<151> 2020-06-29

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> n为a、c、g或t

<400> 1

ccttggcacc cgagaattcc actcattgta actcctnaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

aggagttaca atgagtggaa ttctcgggtg ccaagg 36

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

ccttggcacc cgagaattcc atatcccttg ggatggaaaa 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

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<210> 5

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(44)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(68)

<223> n为a、c、g或t

<400> 5

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnn nnnnctcatt gtaactcctn 60

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcctcattg taactcctgc tttaaggccg 60

gtcctagcaa 70

<210> 7

<211> 71

<212> DNA

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<223> 合成构建体

<400> 7

gtgattgtag ttcagatgtg tgctcttccg atctctcatt gtaactcctt ctttaagtcc 60

ggtcctagca a 71

<210> 8

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<212> DNA

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<223> 合成构建体

<220>

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<222> (23)..(32)

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<220>

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<222> (48)..(56)

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tataagaaa 69

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

cggagatgtg tataagagac agctcattgt aactcctccc atataagaaa 50

<210> 10

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

cggagatgtg tataagagac agtttttttt ttctcattgt aactcctttt ttttttccca 60

tataagaaa 69

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

ggcttttact tctatctctt tctttaacac tttct 35

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

gaaagtgtta aagaaagaga tagaagtaaa agcctcgata cgta 44

<210> 13

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> n为a、c、g或t

<400> 13

ccttggcacc cgagaattcc atatcccttg ggatggnaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

<210> 14

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> n为a、c、g或t

<400> 14

ccttggcacc cgagaattcc acgtaacgta gagcganaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

ctgtctctta tacacatctc cg 22

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

aggagttaca atgagtttct gtctcttata cacatctccg 40

<210> 17

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

tttcttatat ggg 13

<210> 18

<211> 31

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<220>

<223> 合成构建体

<400> 18

tttcttatat gggtttagga gttacaatga g 31

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 19

cccatataag aaatttaaag aatataccc 29

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 20

cccatataag aaatttaaag aatataccct ttcccatata agaaa 45

<210> 21

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 21

cccatataag aaatttaaag aatataccct ttcccatata agaaatttaa agaatatacc 60

c 61

Claims

1.一种细胞刺激组合物，所述细胞刺激组合物包含：

能够结合靶抗原的第一结合部分；和

直接或间接与所述第一结合部分缀合的第一核酸聚合物，所述第一核酸聚合物的序列包含约60℃或更低的(一种或多种)预测二级结构的解链温度。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一结合部分为抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述靶抗原为T细胞受体复合物的组分。

4.如权利要求3所述的组合物，其中所述T细胞受体复合物的所述组分为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ。

5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下自杂交的预测自由能在约+1kcal/mol与-10kcal/mol之间。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下的所述预测自由能为负值。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸聚合物的(一种或多种)预测二级结构的所述解链温度在约50℃与20℃之间或更低。

8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸聚合物为至少10个核苷酸。

9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸聚合物或其互补区与第二核酸聚合物互补。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述第二核酸聚合物直接或间接与第二结合部分缀合。

11.如权利要求10所述的组合物，其中结合部分的双特异性复合物通过所述第一核酸聚合物与所述第二核酸聚合物的杂交形成。

12.如权利要求10或11所述的组合物，其中所述第一结合部分和所述第二结合部分结合相同的靶抗原。

13.如权利要求10或11所述的组合物，其中所述第一结合部分和所述第二结合部分结合不同的靶抗原。

14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸聚合物通过亲核取代、亲电取代、烷基化、氧化、缩合、环加成或施陶丁格连接反应与所述第一结合部分缀合。

15.如权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中所述第二核酸聚合物通过亲核取代、亲电取代、烷基化、氧化、缩合、环加成或施陶丁格连接反应与所述第二部分缀合。

16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述细胞刺激为可溶的。

17.如权利要求10至16中任一项所述的组合物，其中与所述第二结合部分缀合的所述第二核酸聚合物为可溶的。

18.一种刺激细胞样品中的靶细胞的方法，所述方法包括：

a)使所述细胞样品与直接或间接与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分接触，所述第一结合部分能够结合所述靶细胞上的靶抗原，其中直接或间接与第一核酸聚合物缀合的所述第一结合部分形成细胞刺激组合物；

b)培育已由所述细胞刺激组合物的所述第一结合部分结合的所述靶细胞；以及

c)任选地，在所述细胞刺激组合物之前、与所述细胞刺激组合物同时或在所述细胞样品与所述细胞刺激组合物接触之后使所述细胞样品与能够结合所述靶细胞上的共刺激抗原的共刺激结合部分接触。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一结合部分为抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下自杂交的预测自由能在约+1kcal/mol与-10kcal/mol之间。

21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下的所述预测自由能为负值。

22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述第一核酸聚合物包含约60℃或更低的预测二级结构的解链温度。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一核酸聚合物的预测二级结构的所述解链温度在约50℃与20℃之间或更低。

24.如权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述第一核酸聚合物为至少10个核苷酸。

25.如权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述靶细胞为T细胞、NK细胞或B细胞。

26.如权利要求25所述的方法，其中第一靶抗原：

i.对于T细胞为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ；

ii.对于NK细胞为NKp30、NKp44和NKp46、C型凝集素样受体例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α；并且

iii.对于B细胞为CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b。

27.如权利要求25或26所述的方法，所述方法还包括：

d)在步骤c)之后增加所述靶细胞的增殖。

28.如权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述共刺激结合部分为抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述共刺激抗原：

i.对于T细胞为CD28、CD137、CD2、CD134、CD152、CD278、CD27或CD279；

ii.对于NK细胞为以下中的不同抗原：NKp30、NKp44和NKp46、C型凝集素样受体例如NKG2D、CD335、CD94、CD2、与抗体的Fc区结合的CD16、CD122、CD132、IL-15受体α

iii.对于B细胞为以下中的不同抗原：CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b。

30.如权利要求18至29中任一项所述的方法，所述方法还包括使第二核酸聚合物与所述第一核酸聚合物或其互补区杂交。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述第二核酸聚合物与所述第一核酸聚合物或其互补区的互补性在约40％与100％之间。

32.如权利要求30或31所述的方法，其中在使所述细胞样品与所述第二结合部分接触之前、与此同时或在此之后使所述第二核酸聚合物与所述第一核酸聚合物或其互补区杂交会淬灭或调节靶细胞刺激的水平。

33.如权利要求32所述的方法，所述方法还包括通过与竞争核酸聚合物竞争而从所述第一核酸聚合物或其互补区置换所述第二核酸聚合物，所述竞争核酸聚合物对所述第二核酸聚合物的互补性程度高于所述第二核酸聚合物对所述第一核酸聚合物或其互补区的互补性程度。

34.如权利要求30所述的方法，其中所述第二核酸聚合物直接或间接与第二结合部分缀合。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述第二结合部分与所述第一结合部分相同。

36.如权利要求34或35所述的组合物，所述组合物还包含通过所述第一核酸聚合物与所述第二核酸聚合物之间的相互作用形成结合部分的双特异性复合物。

37.如权利要求18至36中任一项所述的方法，其中所述细胞刺激组合物为可溶的。

38.如权利要求34至37中任一项所述的方法，其中与所述第二结合部分缀合的所述第二核酸聚合物为可溶的。

39.一种标记待分析的细胞样品中的靶细胞以获得生物分子特征的方法，所述方法包括

a)使所述靶细胞与直接或间接与第一核酸聚合物缀合的第一结合部分接触，所述第一结合部分能够结合所述靶细胞上的靶抗原，其中直接或间接与第一核酸聚合物缀合的所述第一结合部分形成细胞刺激组合物；和

b)通过使第二核酸聚合物与所述第一核酸聚合物或其互补区杂交来抑制由所述细胞刺激组合物结合的所述靶细胞的刺激。

40.如权利要求39所述的方法，其中使所述第二核酸聚合物杂交在使所述靶细胞与所述细胞刺激组合物接触之前或与此同时进行。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述第一结合部分为抗体或其片段、肽、适体、亲和体或小分子。

42.如权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下自杂交的预测自由能在约+1kcal/mol与-10kcal/mol之间。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述第一核酸聚合物在150mM单价离子浓度下的所述预测自由能为负值。

44.如权利要求39至43中任一项所述的方法，其中所述第一核酸聚合物被工程化为具有约60℃或更低的预测二级结构的解链温度。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述第一核酸聚合物的预测二级结构的所述解链温度在约50℃与20℃之间或更低。

46.如权利要求39至45中任一项所述的方法，其中所述第一核酸聚合物为至少10个核苷酸。

47.如权利要求39至46中任一项所述的方法，其中所述靶细胞为T细胞、NK细胞或B细胞。

48.如权利要求47所述的方法，其中第一靶抗原：

iii.对于B细胞为CD40、抗免疫球蛋白、CD79a或CD79b。

49.如权利要求39至48中任一项所述的方法，其中所述细胞刺激组合物为可溶的。

50.一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一种如权利要求1至17中任一项所述的细胞刺激组合物，以及至少一种如权利要求9至17中任一项所述的第二核酸聚合物。