KR20210101270A - 돌연변이 피기백 트랜스포사제 - Google Patents

돌연변이 피기백 트랜스포사제 Download PDF

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KR20210101270A
KR20210101270A KR1020217021154A KR20217021154A KR20210101270A KR 20210101270 A KR20210101270 A KR 20210101270A KR 1020217021154 A KR1020217021154 A KR 1020217021154A KR 20217021154 A KR20217021154 A KR 20217021154A KR 20210101270 A KR20210101270 A KR 20210101270A
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cell
piggybac transposase
piggybac
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KR1020217021154A
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니라즈 제이. 아그라왈
크리스틴 엠. 다리스
제니트 엘. 스티븐스
후옹 티 응옥 레
노엘리아 블랑코 탈라반
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암젠 인크
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Abstract

세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제. 조작된 피기백 트랜스포사제는 다른 용도 중에서도 안정적인 세포 형질전환, 세포주 개발, 게놈 변형, 및 재조합 단백질의 역가 개선에 유용하다.

Description

돌연변이 피기백 트랜스포사제
본 출원은 2018년 12월 10일 출원된 미국 가출원 62/777,325호 및 2019년 10월 24일 출원된 미국 가출원 62/925,516호의 이익을 주장하며, 이들 전문은 본원에 완전히 제시된 것처럼 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제, 및 다른 용도 중에서도 안정적인 세포 형질감염, 세포주 개발, 게놈 변형, 및 재조합 단백질의 역가 개선을 위한 조작된 피기백 트랜스포사제의 용도에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록(파일명: A-2320-WO-PCT_Sequence.txt, 2019년 11월 5일 생성, 64 KB 크기)을 본 개시의 별도의 일부로서 포함하며, 그 전체는 참조로 포함된다.
생물의약품은 광범위한 용도로 인해 치료 및 진단과 같은 다양한 응용분야에서 전 세계적으로 사용된다. 현재, 승인된 생물의약품의 약 51%가 포유류 세포를 이용해 생산되며, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포가 주요 세포 공장이다(Zhou and Kantardjeff, Mammalian cell cultures for biologics manufacturing, Springer, Heidelberg, New York, 2014). 그 결과, 바이오제약 산업은 빠른 패러다임 전환을 겪고 있다. 이제 시장 출시 속도와 비용 효율성이 그 어느 때보다 중요해졌다. 바이오 의약품에 대한 높은 R&D 비용과 긴 개발 리드 타임으로 인해 의약품 개발, 더 중요하게는 제조에서의 지연과 비효율성을 제거하는 것이 필수적이 되었다. 동시에, 제품 파이프라인이 점점 더 복잡해지고 다양해지고 있으며, 바이오제약 회사는 이제 공여체 세포에서 유래된 맞춤 치료법으로부터 연간 수 그램에서 수백 킬로그램에 이르는 양의 생물의약품 생산에 이르기까지 요구 사항이 다양한 여러 양상을 수용할 수 있는 인프라를 필요로 한다.
따라서, 숙주세포로부터의 재조합 단백질 생산을 증가시키고 장기적인 발현 안정성을 향상시킬 필요가 있다. 이러한 목표를 달성하는 한 가지 방법은 세포 발현 시스템에 의해 발현되는 단백질의 역가를 개선하는 것이다. 본원에 기재된 발명은 숙주세포에서 발현되는 피기백 트랜스포사제의 안정성 증가에 기여하는 돌연변이를 제공한다. 이러한 돌연변이로 조작된 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제는 조작된 피기백 트랜스포사제를 포함하는 세포에서 발현된 재조합 단백질의 역가를 야생형 피기백 트랜스포사제를 포함하는 세포 또는 피기백 트랜스포사제를 포함하지 않는 세포에서 발현된 재조합 단백질의 역가에 비해 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 일 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가는 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 세포에 의해 발현된 동일한 관심 단백질의 역가에 비해 개선된다. 일 구현예에서, 관심 재조합 단백질은 항원 결합 단백질이다.
일 양태에서, 본 발명은 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제로서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 벡터는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 관심 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 벡터로 형질감염된 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 세포는 서열번호 17 또는 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된다. 일 구현예에서, 세포는 숙주세포이다. 일 구현예에서, 세포는 CHO 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 면역세포이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 또한 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 세포에 의해 발현된 동일한 관심 단백질의 역가에 비해 개선된, 본원에 기재된 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 이러한 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질이 제공된다. 관련 구현예에서, 관심 재조합 단백질을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가를 개선하는 방법으로서, 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작하는 단계; 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 숙주세포를 공동 형질감염시키는 단계; 및 세포를 배양하여 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하되, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된, 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염된다.
다른 양태에서, 본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포 배양물에서 재조합 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서, 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 숙주세포를 사용하여 생물반응기에 세포 배양물을 마련하는 단계; 및 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하되, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된, 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 숙주세포는 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 것이다. 일 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염된다.
다른 양태에서, 본 발명은 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서, 관심 재조합 단백질을 발현하는 숙주세포(세포주는 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 공동 형질감염되었음)를 사용하여 생물반응기에 세포 배양물을 마련하는 단계; 세포를 배양하여 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 관심 재조합 단백질을 채취하는 단계; 하나 이상의 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 처리하는 단계; 및 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 세포주는 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 것이다. 일 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 단위 조작은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 포획 크로마토그래피 단계이다. 관련 구현예에서, 적어도 하나의 단위 조작은 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 폴리싱 크로마토그래피 단계이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 단위 조작은 바이러스 불활성화, 바이러스 여과, 심층 여과, 및 UF/DF로부터 선택된다. 일 구현예에서, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가는 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된다. 일 구현예에서, 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질이 제공된다. 관련 구현예에서, 단리된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터; 및 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열이 삽입된 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소를 포함하는 벡터를 포함하는 세포 형질감염용 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 비바이러스성 유전자 변형 세포를 생성하는 방법으로서, (a) 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 마련하는 단계; (b) 공여체 또는 대상체로부터 천연 면역세포를 단리하는 단계; (b) 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열 및 상기 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계; 및 (c) 세포 배양에 의해 세포를 더 많은 비바이러스성 유전자 변형 세포 집단으로 증식시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로, 그리고 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된다.
일 양태에서, 본 발명은 비바이러스성 유전자 변형 세포로 대상체를 치료하는 방법으로서, (a) 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 마련하는 단계; (b) 대상체 또는 공여체로부터 천연 면역세포를 단리하는 단계; (c) 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열 및 상기 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계; (d) 세포 배양에 의해 세포를 더 많은 유전자 변형 세포 집단으로 증식시키는 단계; (e) 형질전환된 세포를 세포 배양물에서 단리하여 유전자 변형 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계; 및 (f) 비바이러스성 유전자 변형 세포를 대상체에게 재도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로, 그리고 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 천연 면역세포는 단핵세포이다. 일 구현예에서, 천연 면역세포는 T세포이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 관심 단백질은 항원 수용체, T세포 수용체, 또는 키메라 항원 수용체이다. 일 구현예에서, 세포는 자살 유전자 또는 유도성 온 또는 가속기 스위치, 또는 둘 다를 암호화하는 핵산 분자로도 형질감염된다. 일 구현예에서, 비바이러스성 유전자 변형 세포, 세포 집단, 또는 세포 배양물이 제공된다. 일 구현예에서, 유전자 변형 세포 또는 세포 집단을 포함하는 제형이 제공된다. 다른 구현예에서, 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 공여체 또는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유전자 변형 세포 또는 세포 집단의 유효량을 공여체 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
도 1: 예측된 2차 구조. 바는 예측된 알파-나선 영역을 나타내고, 화살표는 예측된 베타 시트 영역을 나타낸다.
도 2: 단클론 항체 AB1 및 AB2의 경우, WT 피기백 트랜스포사제 또는 피기백 트랜스포사제 부재 대조군과 비교하여, 조작된 피기백 트랜스포사제 세포주에 대한 개선되거나 유사한 역가.
도 3: 융합 단백질을 발현하는 세포주의 경우, WT 피기백 트랜스포사제 또는 피기백 트랜스포사제 부재 대조군과 비교하여, 조작된 피기백 트랜스포사제 세포주에 대한 개선된 역가.
도 4: 이중특이적 T세포 관여 분자의 경우, WT 피기백 트랜스포사제 또는 피기백 트랜스포사제 부재 대조군과 비교하여, 조작된 피기백 트랜스포사제 세포주에 대한 유사한 역가.
도 5: 피기백 트랜스포사제 이중 "ILT" 또는 삼중 돌연변이 "LLT" 트랜스포사제로 형질감염된 풀은 MSX 처치를 받지 않은 트랜스포사제 풀(0 μM MSX)에 비해 발현의 증가를 나타냈다. 트랜스포사제가 첨가되지 않은(없음) 풀의 경우, MSX를 첨가해도 발현이 증가하지 않았다. BiTE® 헤테로Fc, IgGscFV, 및 mAb를 시험하였다. 형질감염시(25) 또는 초기 DNA 트랜스포사제로 형질감염된 풀의 회복 후(0-25) 첨가된 MSX.
도 6a 및 도 6b: 전기천공 또는 지질-기반 방법을 이용해 형질감염된 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" DNA 또는 mRNA와 관련된 풀 발현 수준.
도 6a: DNA 트랜스포사제와 mRNA 트랜스포사제를 비교한 전기천공-기반 형질감염 방법. mRNA 트랜스포사제의 증가로 발현이 개선되었다. 1) 0 μg 트랜스포사제, 20 μg mAb DNA; 2) 이중 돌연변이 "ILT" DNA: 20 μg mAb DNA, 5 μg 트랜스포사제, 비율 4:1; 3) 이중 돌연변이 "ILT" mRNA 20 μg mAb DNA, 5 μg 트랜스포사제, 비율 4:1; 4) 이중 돌연변이 "ILT" mRNA 20 μg mAb DNA, 10 μg 트랜스포사제, 비율 2:1; 5) 이중 돌연변이 "ILT" mRNA 20 μg mAb DNA, 20 μg 트랜스포사제, 비율 1:1; 11) 이중 돌연변이 "ILT" mRNA 14 μg mAb DNA, 100 μg 트랜스포사제, 비율 7:1; 12) 이중 돌연변이 "ILT" mRNA 28 μg mAb DNA, 200 μg 트랜스포사제, 비율 7:1.
도 6b: DNA 트랜스포사제와 mRNA 트랜스포사제를 비교한 지질-기반 형질감염 방법. mRNA 트랜스포사제의 증가로 발현이 개선되었다. 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" DNA 2 μg mAb DNA, 0.5 μg 트랜스포사제, 비율 4:1; 2 μg mAb DNA, 2 μg 트랜스포사제, 비율 1:1; 4 μg mAb DNA, 4 μg 트랜스포사제, 비율 1:1; 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" mRNA 2 μg mAb DNA, 0.5 μg 트랜스포사제, 비율 4:1; 2 μg mAb DNA, 2 μg 트랜스포사제, 비율 1:1; 4 μg mAb DNA, 4 μg 트랜스포사제, 비율 1:1.
도 7: 전기천공으로부터의 형질감염된 풀의 발현 수준. 이중 돌연변이 트랜스포사제 "ILT" DNA 및 두 mRNA의 형질감염. 합성 mRNA(PB syn mRNA) 및 mRNA(PB mRNA) 형질감염된 풀은 DNA(PB DNA) 트랜스포사제 풀과 유사한 역가를 나타냈고, 트랜스포사제 부재 대조군 풀보다 높은 역가를 나타냈다. 아래쪽 화살표는 최소, 위쪽 화살표는 최대, 흰색 바는 중앙값이다.
도 8a 및 도 8b: 형질감염된 세포주 풀에서 DNA 및 mRNA의 게놈과 전사체 수준에서의 통합.
도 8a: 이중 돌연변이 "ILT", DNA 트랜스포사제로 형질감염된 모든 풀 세포주는 게놈 수준에서 통합된 반면, mRNA로 형질감염된 것들은 게놈 수준에서 통합되지 않았다. 약 1.7 kb의 밴드는 세포주의 게놈에 트랜스포사제가 존재함을 나타낸다. 레인 1: 래더. 레인 2~4: 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" DNA. 레인 5: 형질감염되지 않음. 레인 6~11: 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" mRNA. 레인 12: 플라스미드 DNA 대조군.
도 8b: RNA 수준에서 전사를 확인하기 위한 RT PCR 분석의 겔 이미지. 이중 돌연변이 "ILT", DNA 트랜스포사제로 형질감염된 모든 풀 세포주는 RNA 수준에서 전사를 나타낸 반면, mRNA로 형질감염된 것들은 RNA 수준에서 전사를 나타내지 않았다. 약 1.7 kb의 밴드는 트랜스포사제 전사체의 존재를 나타낸다. 레인 1: 래더. 레인 2~3: 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" mRNA. 레인4: 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" DNA. 레인 5: 플라스미드 DNA 대조군.
도 9: 풀은 카피 수가 적었고, 트랜스포사제가 통합되지 않은 클론을 포함했다.
도 10: 비바이러스성 유전자 전달 및 피기백 트랜스포사제를 사용하여 생성된 TCR-T세포는 시험관 내에서 강력한 기능을 나타낸다. (A) T세포는 이중 돌연변이 ILT를 사용하여 TCR을 발현하도록 성공적으로 조작된다. (B) 표적 세포 용해 및 (C) 항원-제시 세포와 5일간 공동 인큐베이션한 후 피기백-조작 TCR-T세포의 증식.
DNA 트랜스포존 또는 전치성 요소(transposable element)는 숙주 게놈의 한 위치에서 다른 위치로 이동할 수 있는 유전 요소이다. 전치성 요소는 일반적으로 두 가지 부류로 구분되며, 클래스 1은 레트로트랜스포존으로 표시되고, 클래스 2는 "잘라 붙이기(cut-and-paste)" DNA 트랜스포존을 포함한다.
클래스 2 DNA 트랜스포존은 2개의 말단 역위 반복에 의해 플랭킹된 DNA 분절을 포함하는 트랜스포존, 및 트랜스포존의 이동성을 촉진시키는 트랜스포사제라는 두 가지 구성요소를 특징으로 한다. 트랜스포사제는 역위 반복을 결합하고, 말단 역위 반복에 의해 플랭킹된 DNA 분절을 절제(자르기)하고, 분절을 새 위치로 재통합(붙이기)함으로써 작용한다.
피기백 트랜스포존은 클래스 2 트랜스포존이며, 원래 Trichoplusia ni(양배추은무늬나방)로부터 단리되었지만, 접근 가능한 염색질 구조를 선호하는 포유류 세포에서 활발하게 전치하는 것으로 나타났다(Li et al., Molecular and Cellular Biology 33(7): 1317-1330, 2013; Yoshida et al., Scientific Reports Article number 43613 (2017)). 외인성 DNA를 게놈에 도입하고 안정적인 이식유전자 발현을 촉진하는 능력으로 인해, 피기백 트랜스포존 시스템은 포유류 세포의 유전자 조작에 유용한 도구이며, 일반적으로 개방 염색질 영역 및 활발히 전사되는 영역과 관련된 인식 모티프로 인해, 포유류 세포의 안정적인 형질감염의 촉진, 안정적이고 높은 생산량의 다클론 포유류 세포 배양물의 생성, 형질감염된 세포의 다종 집단으로부터의 신속한 재조합 단백질 생산, 및 세포주 개발을 위한 클론의 개발에 사용되어 왔다(미국 특허 출원 공개 US 2010/0311116호; Ding et al., Cell 122(3):473-483, 2005; Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(4) 15008-13, 2006, Matasci et al., Biotechnology & Bioengineering 108(9): 2141-50, 2011; Matasci et al., BMC Proceedings 5(SUPPL.8) p. 34, 2011; Balasubramanian et al., J. Biotechnology 200:61-9, 2015; Balasubramanian et al., Biotechnology Progress 32(5):1308-1317, 2016; Balasubramanian et al., Biotechnology & Bioengineering 113(6):1234-43, 2016; Ahmadi et al., PLoS ONE 12(6):e0179902, 2017; Rajendra et al., Biotechnology Progress 33(2):534-540, 2017; 및 Rajendra et al., Biotechnology Progress 33(6): 1436-1448, 2017).
트랜스포사제에 대한 변형을 통해 몰 기준 피기백 효율을 향상시켜 절제 빈도를 높이기 위해 디스플레이 라이브러리 접근법을 사용하고/하거나 다른 종의 동족체와 서열 비교를 수행하고 과잉활성 트랜스포사제를 생성하는 시도가 이루어져 왔다(예를 들어 문헌[미국 특허 8,399,643호;미국 특허 9,670,503호; 미국 특허 9,783,790호; 미국 특허 9,546,382호; 및 Yusa et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(4):1531-36, 2011] 참조).
피기백 트랜스포사제의 구조에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 피기백 트랜스포사제 아미노산 서열은 대부분 알파 나선 단백질인 것으로 분석되었다. 세포에 도입된 피기백 트랜스포사제의 안정성 향상을 위한 시도로, 알파 나선 및 추정 N-연결 글리코실화 부위(즉, NXS/t 모티프) 내에 돌연변이가 만들어졌으며, 이는 본원에 기재된 바와 같이 역가를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 단일 돌연변이 또는 돌연변이의 조합을 포함한 조작된 피기백 트랜스포사제 버전을 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질과 함께 세포에 형질주입하고, Trichoplusia ni의 야생형, 돌연변이되지 않은 피기백 트랜스포사제(서열번호 2)로 형질감염된 유사한 세포 및 피기백 트랜스포사제를 함유하지 않는 세포와 비교하여 관심 단백질의 발현에 대해 평가하였다. 안정성을 높이도록 조작된 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제는 조작된 피기백 트랜스포사제를 포함하는 세포에서 발현된 재조합 단백질의 역가를 야생형 피기백 트랜스포사제를 포함하는 세포 또는 피기백 트랜스포사제를 포함하지 않는 세포에서 발현된 재조합 단백질의 역가에 비해 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
본원에서 사용되는 용어 "피기백 트랜스포존" 또는 "피기백 전치성 요소"는 공여체 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 벡터)로부터 절제되어 표적 부위, 예를 들어 세포의 게놈 또는 염색체외 DNA에 통합될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, Trichoplusia ni의 피기백 전치성 요소는 길이가 2472 bp이며, 5' 13-bp 말단 반복과 5' 19-bp 내부 반복 사이의 3-bp 스페이서와 3' 13-bp 말단 반복과 3' 19-bp 내부 반복 사이의 31-bp 스페이서를 갖는 비대칭 말단 반복 구조, 및 기능적 트랜스포사제를 암호화하는 단일 2.1-kp 오픈 리딩 프레임을 포함하는 짧은 역위 반복을 갖고 있다(Li et al., Mol. Genet. Genomics (2001) 266: 190-198; Cary et al., Virology (1989) 172: 156-169).
본원에서 사용되는 바와 같이, 피기백 트랜스포존의 5' 및 3' 역위 반복 요소는 피기백 트랜스포존 표적 TTAA 부위, 말단 반복 스페이서, 및 내부 반복을 포함하는 5' 및 3' 분절을 지칭하며, T. ni의 경우, 이들은 표적 TTAA 부위, 3-bp 스페이서를 사이에 둔 5' 13-bp 말단 반복과 5' 19-bp 내부 반복, 및 31-bp 스페이서를 사이에 둔 3' 13-bp 말단 반복과 3' 19-bp 내부 반복을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "피기백 트랜스포사제"는 공여체 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 벡터)로부터의 피기백 트랜스포존의 절제 및 표적 세포의 게놈 또는 염색체외 DNA로의 피기백 트랜스포존의 후속 통합을 촉진시키는 폴리펩티드를 지칭한다. 피기백 트랜스포사제는 잘라 붙이기 메커니즘을 사용하여, 삽입시 복제되고 삽입 후 정확하게 절제되는 TTAA 표적 부위에 삽입하고, 공여체 부위를 트랜스포존 이전 상태로 복원한다(Elick et al., Genetica 98: 33-41, 1996. Fraser et al., Insect Mol. Biol. 5: 141-151, 1996. Wang and Fraser, Insect Mol. Biol. 1: 109-116, 1993). 피기백 트랜스포사제는 폴리펩티드로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 피기백 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로서 피기백 트랜스포사제가 존재하는 경우, 조작된 핵산 분자는 피기백 트랜스포존을 포함하는 동일한 벡터에(즉, 시스로) 존재할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 조작된 핵산 분자는 트랜스포존과 별개인 제2 벡터에(즉, 트랜스로) 존재할 수 있다. 본원에 기재된 조작된 피기백 트랜스포사제는 조작된 피기백 트랜스포사제를 포함하는 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제를 포함하거나 피기백 트랜스포사제를 포함하지 않는 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된다는 점에서 특이하다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 명세서 전체에서 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드 및 단백질은 또한, 천연 서열, 즉 자연 발생적 비재조합 세포에 의해 생산된 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 잔기에 대한 하나 이상의 결실, 삽입, 및/또는 치환을 갖는 거대분자를 포함하거나; 유전자 조작된 세포 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 천연 단백질의 아미노산 서열의 아미노산 잔기에 대한 하나 이상의 결실, 삽입, 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 폴리펩티드 및 단백질은 또한, 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생적 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 폴리펩티드 및 단백질은 또한, 글리코실화, 지질 부착, 황화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화, 및 ADP-리보실화를 포함하나 이에 한정되지 않는 변형을 포함한다.
본원에 기재된 피기백 트랜스포사제는 야생형 Trichoplusia ni(양배추은무늬나방) 피기백 트랜스포사제(서열번호 2)와 비교하여 아미노산 잔기의 하나 이상의 삽입, 결실, 또는 치환, 또는 이들의 임의의 조합뿐만 아니라 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환 이외의 변형을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 의미이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환"은 언급된 위치 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개에서의 치환을 의미한다. 일부 구현예에서, "위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환"은 언급된 위치 중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개에서의 치환을 의미한다. 일부 구현예에서, "위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환"은 언급된 위치 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개에서의 치환을 의미한다. 일부 구현예에서, "위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환"은 언급된 위치 중 1, 2, 3, 또는 4개에서의 치환을 의미한다. 일부 구현예에서, "위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환"은 언급된 위치 중 1, 2, 또는 3개에서의 치환을 의미한다. 일부 구현예에서, "위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환"은 언급된 위치 중 1 또는 2개에서의 치환을 의미한다.
본 발명은 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 일 구현예에서, 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가는 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 세포에 의해 발현된 동일한 관심 단백질의 역가에 비해 개선된다.
본 발명은 또한 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제로서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
야생형 및 돌연변이 피기백 트랜스포사제의 아미노산 서열
서열번호 ID 서열
2 WT MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFIDE
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10 LLT(I247L I147L S533T) MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFIDE
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12 ILT(I247 I147L S533T)
 MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFIDE
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14 LIT(I247L I147 S533T) MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFIDE
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TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLF
DRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDL
FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMCD
SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFT
SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGP
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PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF
16 LLS(I247L I147L S533) MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFIDE
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TNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLF
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FIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMCD
SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFT
SIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGP
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PVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자", 또는 "조작된 핵산 분자"는 명세서 전체에서 상호교환적으로 사용되며, 단일가닥 핵산 및 이중가닥 핵산을 모두 포함하고, 게놈 DNA, RNA, mRNA, cDNA, 또는 자연에서 일반적으로 발견되는 서열과 관련되지 않은 이들의 일부 조합 또는 합성 기원을 포함한다. 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드", "단리된 핵산 분자", 또는 "단리된 조작된 핵산 분자"는 구체적으로 합성 기원 서열 또는 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 서열을 지칭한다. 명시된 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자는 명시된 서열 외에, 최대 10개 또는 심지어 최대 20개의 다른 단백질에 대한 암호화 서열 또는 이들의 일부를 포함할 수 있거나, 언급된 핵산 서열의 암호화 영역의 발현을 제어하는 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 변형은 브로모우리딘 및 이노신 유도체와 같은 염기 변형, 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드간 연결 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 "단리된"이란 용어는 (i) 일반적으로는 함께 발견되는 적어도 일부의 다른 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 없거나, (ii) 동일한 공급원, 예컨대 동일한 종의 다른 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 본질적으로 없거나, (iii) 자연에서 관련이 있는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되거나, (iv) 자연에서 관련이 없는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동 가능하게 관련되거나, (v) 자연에서 발생되지 않음을 의미한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
야생형 및 돌연변이 피기백 트랜스포사제의 핵산 서열
서열번호 ID 핵산 서열
1 WT ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAG
AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGCGACCA
CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATCGACG
AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGACGAG
CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGAATCCT
GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTGGTCCA
CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGTGCGG
AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCCCTGCT
GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTGAAGT
GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCGGCGCC
ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCT
GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGT
TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGACAGA
TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCAGACC
CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGGGACC
TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCTGACC
ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAATGTA
CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCG
ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAGAGGC
ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAG
CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGGTTCA
CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCTGACC
ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTGCTGAA
GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGACGGCC
CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTG
CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCAAGCC
CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACACCCTGG
ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCC
ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCAT
CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGA
AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCATGAGA
AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAG
CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG
AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATC
AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATCTGCCG
GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC
3 I147L ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAG
AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGCGACCA
CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATCGACG
AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGACGAG
CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGAATCCT
GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTGGTCCA
CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGTGCGG
AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCCCTGCT
GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTGAAGT
GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCGGCGCC
ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCT
GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGT
TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGACAGA
TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCAGACC
CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGGGACC
TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCTGACC
ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAATGTA
CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCG
ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAGAGGC
ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAG
CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGGTTCA
CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCTGACC
ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTGCTGAA
GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGACGGCC
CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTG
CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCAAGCC
CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACACCCTGG
ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCC
ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCAT
CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGA
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AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAG
CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG
AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATC
AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATCTGCCG
GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC
5 I247L ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAG
AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGCGACCA
CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATCGACG
AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGACGAG
CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGAATCCT
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AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCCCTGCT
GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTGAAGT
GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCGGCGCC
ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCT
GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGT
TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGACAGA
TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCAGACC
CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGGGACC
TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCTGACC
ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAATGTA
CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCG
ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAGAGGC
ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAG
CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGGTTCA
CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCTGACC
ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTGCTGAA
GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGACGGCC
CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTG
CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCAAGCC
CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACACCCTGG
ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCC
ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCAT
CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGA
AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCATGAGA
AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAG
CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG
AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATC
AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATCTGCCG
GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC
7 S533T ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAG
AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGCGACCA
CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATCGACG
AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGACGAG
CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGAATCCT
GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTGGTCCA
CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGTGCGG
AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCCCTGCT
GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTGAAGT
GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCGGCGCC
ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCT
GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGT
TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGACAGA
TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCAGACC
CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGGGACC
TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCTGACC
ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAATGTA
CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCG
ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAGAGGC
ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAG
CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGGTTCA
CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCTGACC
ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTGCTGAA
GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGACGGCC
CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTG
CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCAAGCC
CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACACCCTGG
ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCC
ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCAT
CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGA
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AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAC
CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG
AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATC
AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATCTGCCG
GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC
9 LLT(I247L I147L S533T) ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAG
AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGCGACCA
CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATCGACG
AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGACGAG
CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGAATCCT
GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTGGTCCA
CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGTGCGG
AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCCCTGCT
GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGCTGGTGAAGT
GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCGGCGCC
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GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGT
TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGACAGA
TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCAGACC
CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGGGACC
TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCTGACC
ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAATGTA
CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCG
ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAGAGGC
ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAG
CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGGTTCA
CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCTGACC
ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTGCTGAA
GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGACGGCC
CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTG
CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCAAGCC
CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACACCCTGG
ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCC
ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCAT
CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGA
AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCATGAGA
AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAC
CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG
AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATC
AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATCTGCCG
GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC
11 ILT(I147 I247L S533T)
 ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAG AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGCGACCA CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATCGACG AGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGACGAG CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGAATCCT GACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTGGTCCA CCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGTGCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCCCTGCT GTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTGAAGT GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCGGCGCC ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCT GGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGT TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGACAGA TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCAGACC CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGCTGTGGGACC TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCTGACC ATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAATGTA CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCG ACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAGAGGC ACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAG CAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGGTTCA CCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCTGACC ATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTGCTGAA GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGACGGCC CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTG CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCAAGCC CCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACACCCTGG ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCC ATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCAT CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGA AGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCATGAGA AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAC CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATCTGCCG GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC
13 LIT(I147L I247 S533T) ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAG
AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGCGACCA
CGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATCGACG
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CACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGGGACC
TGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCTGACC
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CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCG
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AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAC
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GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC
15 LLS(I147L I247L S533S) ATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAG
AGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGATCAGCGACCA
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CAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGAATCCT
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GGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCGGCGCC
ACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCT
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TCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGACAGA
TTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCAGACC
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CATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCG
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GAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGACGGCC
CCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTG
CTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCAAGCC
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ACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCC
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CATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGA
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AAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAG
CAACATCCTGCCCAACGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG
AACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATC
AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATCTGCCG
GGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTAGC
17 ILT(I147I I247L S533T)
RNA
 AUGGGCUCUAGCCUGGACGACGAGCACAUCCUGAGCGCCCUGCUGCAG AGCGACGACGAACUGGUGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGAUCAGCGACCA CGUGUCCGAGGACGACGUGCAGUCCGACACCGAGGAAGCCUUCAUCGACG AGGUGCACGAAGUGCAGCCUACCAGCAGCGGCUCCGAGAUCCUGGACGAG CAGAACGUGAUCGAGCAGCCUGGCAGCUCCCUGGCCAGCAACAGAAUCCU GACCCUGCCCCAGAGAACCAUCAGAGGCAAGAACAAGCACUGCUGGUCCA CCUCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGUGUCCGCCCUGAACAUCGUGCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAAUGUGCAGAAACAUCUACGACCCCCUGCU GUGCUUCAAGCUGUUCUUCACCGACGAGAUCAUCAGCGAGAUCGUGAAGU GGACCAACGCCGAGAUCAGCCUGAAGAGGCGGGAGAGCAUGACCGGCGCC ACCUUCAGAGACACCAACGAGGACGAGAUCUACGCCUUCUUCGGCAUCCU GGUGAUGACCGCCGUGAGAAAGGACAACCACAUGAGCACCGACGACCUGU
UCGACAGAUCCCUGAGCAUGGUGUACGUGUCCGUGAUGAGCAGAGACAGA UUCGACUUCCUGAUCAGAUGCCUGAGAAUGGACGACAAGAGCAUCAGACC CACCCUGCGGGAGAACGACGUGUUCACCCCCGUGCGGAAGCUGUGGGACC UGUUCAUCCACCAGUGCAUCCAGAACUACACCCCUGGCGCCCACCUGACC AUCGAUGAGCAGCUGCUGGGCUUCAGAGGCAGAUGCCCCUUCAGAAUGUA CAUCCCCAACAAGCCCAGCAAGUACGGCAUCAAGAUCCUGAUGAUGUGCG ACAGCGGCACCAAGUACAUGAUCAACGGCAUGCCCUACCUGGGCAGAGGC ACCCAGACAAACGGCGUGCCCCUGGGCGAGUACUACGUGAAAGAACUGAG CAAGCCUGUGCAUGGCAGCUGCAGGAACAUCACCUGCGACAACUGGUUCA CCAGCAUCCCCCUGGCCAAGAACCUGCUGCAGGAACCCUACAAGCUGACC AUCGUGGGCACCGUGCGGAGCAACAAGCGGGAGAUCCCAGAGGUGCUGAA GAACAGCAGAUCCAGACCUGUGGGAACAAGCAUGUUCUGCUUCGACGGCC CCCUGACCCUGGUGUCCUACAAGCCCAAGCCCGCCAAGAUGGUGUACCUG CUGUCCAGCUGCGACGAGGACGCCAGCAUCAACGAGAGCACCGGCAAGCC CCAGAUGGUGAUGUACUACAACCAGACCAAGGGCGGCGUGGACACCCUGG ACCAGAUGUGCAGCGUGAUGACCUGCAGCAGAAAGACCAACAGAUGGCCC AUGGCCCUGCUGUACGGCAUGAUCAAUAUCGCCUGCAUCAACAGCUUCAU CAUCUACAGCCACAACGUGUCCAGCAAGGGCGAGAAGGUGCAGAGCCGGA AGAAAUUCAUGCGGAACCUGUACAUGAGCCUGACCUCCAGCUUCAUGAGA AAGAGACUGGAAGCCCCCACCCUGAAGAGAUACCUGCGGGACAACAUCAC CAACAUCCUGCCCAACGAAGUGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG AACCCGUGAUGAAGAAGAGGACCUACUGCACCUACUGUCCCAGCAAGAUC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCUGCAAGAAAUGCAAAAAAGUGAUCUGCCG
GGAGCACAACAUCGACAUGUGCCAGAGCUGUUUCUAGC
18 LLT(I147L I247L S533T)
RNA		 AUGGGCUCUAGCCUGGACGACGAGCACAUCCUGAGCGCCCUGCUGCAG AGCGACGACGAACUGGUGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGAUCAGCGACCA CGUGUCCGAGGACGACGUGCAGUCCGACACCGAGGAAGCCUUCAUCGACG AGGUGCACGAAGUGCAGCCUACCAGCAGCGGCUCCGAGAUCCUGGACGAG CAGAACGUGAUCGAGCAGCCUGGCAGCUCCCUGGCCAGCAACAGAAUCCU GACCCUGCCCCAGAGAACCAUCAGAGGCAAGAACAAGCACUGCUGGUCCA CCUCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGUGUCCGCCCUGAACAUCGUGCGG AGCCAGAGGGGCCCCACCAGAAUGUGCAGAAACAUCUACGACCCCCUGCU GUGCUUCAAGCUGUUCUUCACCGACGAGAUCAUCAGCGAGCUGGUGAAGU GGACCAACGCCGAGAUCAGCCUGAAGAGGCGGGAGAGCAUGACCGGCGCC ACCUUCAGAGACACCAACGAGGACGAGAUCUACGCCUUCUUCGGCAUCCU GGUGAUGACCGCCGUGAGAAAGGACAACCACAUGAGCACCGACGACCUGU UCGACAGAUCCCUGAGCAUGGUGUACGUGUCCGUGAUGAGCAGAGACAGA UUCGACUUCCUGAUCAGAUGCCUGAGAAUGGACGACAAGAGCAUCAGACC CACCCUGCGGGAGAACGACGUGUUCACCCCCGUGCGGAAGCUGUGGGACC UGUUCAUCCACCAGUGCAUCCAGAACUACACCCCUGGCGCCCACCUGACC AUCGAUGAGCAGCUGCUGGGCUUCAGAGGCAGAUGCCCCUUCAGAAUGUA CAUCCCCAACAAGCCCAGCAAGUACGGCAUCAAGAUCCUGAUGAUGUGCG ACAGCGGCACCAAGUACAUGAUCAACGGCAUGCCCUACCUGGGCAGAGGC ACCCAGACAAACGGCGUGCCCCUGGGCGAGUACUACGUGAAAGAACUGAG CAAGCCUGUGCAUGGCAGCUGCAGGAACAUCACCUGCGACAACUGGUUCA CCAGCAUCCCCCUGGCCAAGAACCUGCUGCAGGAACCCUACAAGCUGACC AUCGUGGGCACCGUGCGGAGCAACAAGCGGGAGAUCCCAGAGGUGCUGAA GAACAGCAGAUCCAGACCUGUGGGAACAAGCAUGUUCUGCUUCGACGGCC CCCUGACCCUGGUGUCCUACAAGCCCAAGCCCGCCAAGAUGGUGUACCUG CUGUCCAGCUGCGACGAGGACGCCAGCAUCAACGAGAGCACCGGCAAGCC CCAGAUGGUGAUGUACUACAACCAGACCAAGGGCGGCGUGGACACCCUGG ACCAGAUGUGCAGCGUGAUGACCUGCAGCAGAAAGACCAACAGAUGGCCC AUGGCCCUGCUGUACGGCAUGAUCAAUAUCGCCUGCAUCAACAGCUUCAU CAUCUACAGCCACAACGUGUCCAGCAAGGGCGAGAAGGUGCAGAGCCGGA AGAAAUUCAUGCGGAACCUGUACAUGAGCCUGACCUCCAGCUUCAUGAGA AAGAGACUGGAAGCCCCCACCCUGAAGAGAUACCUGCGGGACAACAUCAC CAACAUCCUGCCCAACGAAGUGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGG AACCCGUGAUGAAGAAGAGGACCUACUGCACCUACUGUCCCAGCAAGAUC AGAAGAAAGGCCAACGCCAGCUGCAAGAAAUGCAAAAAAGUGAUCUGCCG
GGAGCACAACAUCGACAUGUGCCAGAGCUGUUUCUAGC
관심 폴리펩티드 및 단백질은 단백질-기반 치료제를 포함하여 과학적 또는 상업적 관심 대상일 수 있다. 관심 단백질은 특히 분비 단백질, 비분비 단백질, 세포내 단백질, 또는 막결합 단백질을 포함한다. 관심 폴리펩티드 및 단백질은 세포 배양 방법을 사용하여 재조합 동물 세포주에 의해 생산될 수 있으며, "재조합 단백질"로 지칭될 수 있다. 발현된 단백질(들)은 세포 내에서 생산되거나, 배양 배지 내로 분비되어 회수 및/또는 수집될 수 있다. 용어 "단리된 단백질" 또는 "단리된 재조합 단백질"은 치료, 진단, 예방, 연구, 또는 기타 사용을 방해하는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 기타 오염 물질로부터 분리 정제된 관심 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 관심 단백질은 표적, 특히 하기 열거된 것들(이들로부터 유래된 표적, 이들과 관련된 표적, 및 이들의 변형을 포함함) 중의 표적에 결합하여 치료 효과를 발휘하는 단백질을 포함한다.
관심 단백질은 "항원 결합 단백질"을 포함한다. 항원 결합 단백질은 결합하는 다른 분자(항원)에 대해 친화성을 갖는 항원 결합 영역 또는 항원 결합 부분을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 항원 결합 단백질은 항체, 펩티바디, 항체 단편, 항체 유도체, 항체 유사체, 융합 단백질(단쇄 가변 단편(scFv) 및 이중쇄(2가) scFv 포함), 뮤테인, 및 Xmab를 포함한다. 또한, 이중특이적 T세포 관여자(BiTE®), 반감기 연장과 같은 연장을 갖는 이중특이적 T세포 관여자, 예를 들어 HLE BiTE, 헤테로Ig BITE 등, 키메라 항원 수용체(CAR, CAR T), 및 T세포 수용체(TCR)가 포함된다.
scFv는 함께 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 갖는 단쇄 항체 단편이다. 미국 특허 7,741,465호 및 6,319,494호, 뿐만 아니라 문헌[Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136] 참조. scFv는 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 모항체의 능력을 보유한다.
용어 "항체"는 임의의 동형 또는 하위부류의 글리코실화 및 비글리코실화 면역글로불린 모두에 대한 언급, 또는 특이적 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁하는 항원 결합 영역에 대한 언급을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체는 인간, 인간화, 키메라, 다중특이적, 단클론, 다클론, 헤테로IgG, 이중특이적, 및 올리고머 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 항체는 lgG1-, lgG2-, lgG3-, 또는 lgG4-유형을 포함한다. 또한, 표적 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디, Fd, dAb, 맥시바디, 단쇄 항체 분자, 단일 도메인 VHH, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 폴리펩티드와 같은 항원 결합 단편 또는 영역을 갖는 단백질이 포함된다.
또한, 인간에게 투여되었을 때 크게 해로운 면역 반응을 일으키지 않는 인간, 인간화, 및 기타 항원 결합 단백질, 예컨대 인간 항체 및 인간화 항체가 포함된다.
또한, 비공유 결합, 공유 결합, 또는 공유 및 비공유 결합에 의해 화학적으로 변형된 단백질과 같은 변형된 단백질이 포함된다. 또한, 세포 변형 시스템에 의해 이루어질 수 있는 하나 이상의 번역후 변형 또는 효소적 및/또는 화학적 방법에 의해 생체외 도입되거나 다른 방식으로 도입된 변형을 추가로 포함하는 단백질이 포함된다.
관심 단백질은 또한, 예를 들어 류신 지퍼, 이중 코일(coiled coil), 면역 글로불린의 Fc 부분 등과 같은 다량체화 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 분화 항원(CD 단백질이라고 함) 또는 이의 리간드 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 유사한 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질이 포함된다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자를 포함할 수 있다. 이러한 G-CSF 제제는 Neupogen®(필그라스팀) 및 Neulasta®(페그필그라스팀)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 적혈구생성 자극제(ESA), 예컨대 Epogen®(에포에틴 알파), Aranesp®(다베포에틴 알파), Dynepo®(에포에틴 델타), Mircera®(메티옥시 폴리에틸렌 글리콜-에포에틴 베타), Hematide®, MRK-2578, INS-22, Retacrit®(에포에틴 제타), Neorecormon®(에포에틴 베타), Silapo®(에포에틴 제타), Binocrit®(에포에틴 알파), 에포에틴 알파 헥살, Abseamed®(에포에틴 알파), Ratioepo®(에포에틴 세타), Eporatio®(에포에틴 세타), Biopoin®(에포에틴 세타), 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 에포에틴 제타, 에포에틴 세타, 및 에포에틴 델타, 에포에틴 오메가, 에포에틴 이오타, 조직 플라스미노겐 활성제, GLP-1 수용체 작용제, 뿐만 아니라 이들의 분자 또는 변이체 또는 유사체, 및 이들 중 임의의 것의 바이오시밀러가 포함된다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 하나 이상의 CD 단백질, HER 수용체 패밀리 단백질, 세포 부착 분자, 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 전환 성장 인자(TGF), 인슐린-유사 성장 인자, 골유도 인자, 인슐린 및 인슐린 관련 단백질, 응고 및 응고 관련 단백질, 콜로니 자극 인자(CSF), 기타 혈액 및 혈청 단백질 혈액형 항원, 수용체, 수용체 관련 단백질, 성장 호르몬, 성장 호르몬 수용체, T세포 수용체, 신경영양 인자, 뉴로트로핀, 릴렉신, 인터페론, 인터류킨, 바이러스 항원, 지단백질, 인테그린, 류마티스 인자, 면역독소, 표면 막단백질, 수송 단백질, 호밍 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 및 면역어드헤신에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 다음 중 하나 이상에 단독으로 또는 임의의 조합으로 결합한다: CD 단백질(CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD40, CD70, CD123, CD133, CD138, CD171, 및 CD174를 포함하나 이에 한정되지 않음), HER 수용체 패밀리 단백질(예를 들어 HER2, HER3, HER4, 및 EGF 수용체 포함), EGFRvIII, 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 및 알파 v/베타 3 인테그린, 성장 인자(예를 들어 혈관 내피 성장 인자("VEGF"), VEGFR2, 성장 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 뮬러관-억제 물질, 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파), 에리트로포에틴(EPO), NGF-베타와 같은 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들어 aFGF 및 bFGF 포함), 표피 성장 인자(EGF), 크립토, 특히 TGF-α 및 TGF-β(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함)를 포함하는 전환 성장 인자(TGF), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 및 골유도 인자를 포함하나 이에 한정되지 않음), 인슐린 및 인슐린 관련 단백질(인슐린, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 프로인슐린, 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않음), 응고 및 응고 관련 단백질, 예를 들어 특히, 인자 VIII, 조직 인자, 폰빌레브란트 인자, 단백질 C, 알파-1-항트립신, 플라스미노겐 활성제, 예를 들어 유로키나제 및 조직 플라스미노겐 활성제("t-PA"), 봄바진, 트롬빈, 트롬보포이에틴, 및 트롬보포이에틴 수용체, 콜로니 자극 인자(CSF)(특히 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF 포함), 기타 혈액 및 혈청 단백질(알부민, IgE, 및 혈액형 항원을 포함하나 이에 한정되지 않음), 수용체 및 수용체 관련 단백질(예를 들어 flk2/flt3 수용체, 비만(OB) 수용체, 성장 호르몬 수용체, 및 T세포 수용체 포함), 신경영양 인자(골-유래 신경영양 인자(BDNF) 및 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6)을 포함하나 이에 한정되지 않음), 릴렉신 A-사슬, 릴렉신 B-사슬, 및 프로릴렉신, 인터페론(예를 들어 인터페론-알파, -베타, 및 -감마 포함), 인터류킨(IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-23, IL-12/IL-23, IL-2Ra, IL1-R1, IL-6 수용체, IL-4 수용체 및/또는 수용체에 대한 IL-13, IL-13RA2, 또는 IL-17 수용체, IL-1RAP, 바이러스 항원(AIDS 외피 바이러스 항원을 포함하나 이에 한정되지 않음), 지단백질, 칼시토닌, 글루카곤, 심방나트륨이뇨 인자, 폐 계면활성제, 종양괴사인자-알파 및 -베타, 엔케팔리나제, BCMA, Ig카파, ROR-1, ERBB2, 메소텔린, RANTES(Regulated on Activation Normally T-cell Expressed and Secreted), 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드, DNA 분해효소, FR-알파, 인히빈, 및 액티빈, 인테그린, 단백질 A 또는 D, 류마티스 인자, 면역독소, 골형성 단백질(BMP), 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 표면 막단백질, 분해 가속 인자(DAF), AIDS 외피, 수송 단백질, 호밍 수용체, MIC(MIC-a, MIC-B), ULBP 1-6, EPCAM, 어드레신, 조절 단백질, 면역어드헤신, 항원 결합 단백질, 소마트로핀, CTGF, CTLA4, 에오탁신-1, MUC1, CEA, c-MET, Claudin-18, GPC-3, EPHA2, FPA, LMP1, MG7, NY-ESO-1, PSCA, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GM2, BAFF, OPGL(RANKL), 마이오스타틴, Dickkopf-1(DKK-1), Ang2, NGF, IGF-1 수용체, 간세포 성장 인자(HGF), TRAIL-R2, c-Kit, B7RP-1, PSMA, NKG2D-1, 세포예정사 단백질 1 및 리간드, PD1 및 PDL1, 만노스 수용체/hCGβ, C형 간염 바이러스, 메소텔린 dsFv-PE38 접합체, 레지오넬라-뉴모필라(lly), IFN 감마, 인터페론 감마 유도 단백질 10(IP10), IFNAR, TALL-1, 흉선 기질상 림포포이에틴(TSLP), 프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 타입 9(PCSK9), 줄기세포 인자, Flt-3, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), OX40L, α4β7, 혈소판 특이적(혈소판) 당단백질 Iib/IIIb(PAC-1), 전환 성장 인자 베타(TFGβ), 투명대 정자-결합 단백질 3(ZP-3), TWEAK, 혈소판-유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα), 스클레로스틴, 및 이들 중 임의의 것의 생물학적 활성 단편 또는 변이체.
다른 구현예에서, 관심 단백질은 압식시맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 애플리버셉트, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아나킨라, 아타시셉트, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 비오소주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 칸투주맙 메르탄신, 카나키누맙, 세툭시맙, 세르톨리주맙 페골, 코나투무맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에타너셉트, 에볼로쿠맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 젬투주맙, 골리무맙, 이브리투모맙 튜세탄, 인플릭시맙, 이필리무맙, 레르델리무맙, 루밀릭시맙, 익세키주맙, 마파투무맙, 모테사닙 디포스페이트, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 네시리티드, 니모투주맙, 니볼루맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오프렐베킨, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 라니비주맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로미플로스팀, 로모소주맙, 사그라모스팀, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 비실리주맙, 볼로식시맙, 자놀리무맙, 잘루투무맙, 및 이들 중 임의의 것의 바이오시밀러를 포함한다.
본 발명에 따른 관심 단백질은 전술한 모든 것을 포함하며, 상기 임의의 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 포함하는 항체를 추가로 포함한다. 또한, 관심 단백질의 기준 아미노산 서열과 아미노산 서열이 70% 이상, 특별히 80% 이상, 더 특별히 90% 이상, 훨씬 더 특별히 95% 이상, 구체적으로는 97% 이상, 더 구체적으로는 98% 이상, 훨씬 더 구체적으로는 99% 이상 동일한 영역을 포함하는 변이체가 포함된다. 이와 관련하여 동일성은 쉽게 이용 가능하고 잘 알려진 다양한 아미노산 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 선호되는 소프트웨어는 서열 검색 및 정렬 문제에 대한 만족스러운 솔루션으로 간주되는 Smith-Waterman 알고리즘을 구현하는 소프트웨어를 포함한다. 특히 속도가 중요한 고려 사항인 경우 다른 알고리즘도 사용될 수 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 DNA, RNA, 및 폴리펩티드의 정렬 및 상동성 매칭을 위해 일반적으로 사용되는 프로그램은 FASTA, TFASTA, BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLASTN, PROSRCH, BLAZE, 및 MPSRCH를 포함하며, 후자는 MasPar에서 만든 대규모 병렬 프로세서에서 실행하기 위한 Smith-Waterman 알고리즘의 구현이다.
관심 단백질은 또한 키메라 항원 수용체(CAR 또는 CAR-T)와 같은 유전자 조작된 수용체뿐만 아니라, 이러한 표적화된 항원과 상호작용하는 항원 결합 분자를 포함하는 다른 단백질을 포함할 수 있다. CAR은 이러한 표적화된 항원과 상호작용하는 항원 결합 분자를 통합함으로써 항원(예컨대, 세포-표면 항원)에 결합하도록 조작될 수 있다. CAR은 일반적으로 하나 이상의 공동자극("신호전달") 도메인 및 하나 이상의 활성화 도메인과 일렬로 항원 결합 도메인(예컨대 scFv)을 포함한다.
바람직하게, 항원 결합 분자는 이의 항체 단편이고, 더 바람직하게는 하나 이상의 단쇄 항체 단편("scFv")이다. scFv는 다른 CAR 구성요소와 함께 단쇄의 일부로서 발현되도록 조작될 수 있기 때문에 키메라 항원 수용체에서 사용하기에 바람직하다. 문헌[Krause et al., J. Exp. Med., 188(4): 619-626, 1998; Finney et al., Journal of Immunology, 161: 2791-2797, 1998] 참조.
키메라 항원 수용체는 효능을 높이기 위해 하나 이상의 공동자극(신호전달) 도메인을 포함한다. 미국 특허 7,741,465호 및 6,319,494호, 뿐만 아니라 상기 Krause 등 및 Finney 등의 문헌, 문헌[Song et al., Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011); 및 Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)] 참조. 적합한 공동자극 도메인은 다른 공급원 중에서도, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3(알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타), CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD 33, CD37, CD40, CD 45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1(CDl la/CD18)), CD247, CD276(B7-H3), LIGHT(종양괴사인자 수퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 클래스 I 분자, TNF, TNFr, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl-ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl-la, LFA-1, ITGAM, CDl-lb, ITGAX, CDl-lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, 41-BB, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 리간드, 또는 이들의 단편 또는 조합으로부터 유래될 수 있다. 공동자극 도메인은 세포외 부분, 막관통 부분, 및 세포내 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
CAR은 또한 하나 이상의 활성화 도메인을 포함한다. CD3 제타는 천연 T세포 상의 T세포 수용체의 요소이며, CAR에서 중요한 세포내 활성화 요소인 것으로 나타났다.
CAR은 막관통 단백질이며, 세포외 도메인을 포함하고, 관심 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질을 일반적으로 함유하고, 또한 "힌지" 영역을 포함한다. 또한 막관통 도메인 및 세포내(세포질) 도메인이 있다.
세포외 도메인은 신호전달에 유리하고 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 유리하다. 본원에 기재된 임의의 단백질 또는 이들의 임의의 조합으로부터. 세포외 도메인은 합성 또는 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 단백질로부터 유래될 수 있다. 세포외 도메인은 대개 힌지 부분을 포함한다. 이는 때로는 "스페이서" 영역으로 지칭되는, 세포외 도메인의 일부이다. 힌지는 본원에 기재된 단백질, 특히 상기 공동자극 단백질뿐만 아니라 면역글로불린(Ig) 서열 또는 다른 적합한 분자에서 유래되어 표적 세포로부터 목적하는 특정 거리를 달성할 수 있다.
막관통 도메인은 CAR의 세포외 도메인에 융합될 수 있다. 유사하게 막관통 도메인은 CAR의 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 막관통 도메인은 합성 또는 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 단백질, 특히 상기 공동자극 단백질로부터 유래될 수 있다.
세포내(세포질) 도메인은 막관통 도메인에 융합될 수 있으며, 면역세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 제공할 수 있다. T세포의 이펙터 기능은 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 세포내 도메인은 본원에 기재된 단백질, 특히 CD3으로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 숙주세포, 면역세포, 조성물 등을 제조하는 데 다양한 공지 기술이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같은 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 발현 시스템 및 작제물이 또한 본원에 제공되며, 이러한 발현 시스템 또는 작제물을 포함하는 숙주세포도 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 단백질 암호화 정보를 숙주세포 내로 그리고/또는 숙주세포 내의 특정 위치 및/또는 구획으로 전달 및/또는 수송하는 데 사용하기에 적합한 임의의 분자 또는 개체(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 바이러스 캡시드, 비리온, 네이키드(naked) DNA, 복합 DNA 등)를 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터, 및 비에피솜 포유류 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 종종 발현 벡터, 예를 들어 재조합 발현 벡터 및 클로닝 벡터로 지칭된다. 벡터는 벡터 자체의 복제가 가능하도록 숙주세포에 도입되어, 벡터 안에 포함된 폴리뉴클레오티드의 카피를 증폭시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 복제 원점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 및 선별 마커를 제한 없이 일반적으로 포함하는 서열 구성요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
벡터는 숙주세포의 형질전환에 유용하며, 벡터에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 암호화 영역의 발현을 (숙주세포와 함께) 지시 및/또는 제어하는 핵산 서열을 포함한다. 발현 작제물은 전사와 번역을 제어하거나 이에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있고, 인트론이 존재하는 경우에는 발현 작제물에 작동 가능하게 연결된 암호화 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. "작동 가능하게 연결된"이란 이 용어가 적용된 구성요소들이 이들의 고유 기능을 수행할 수 있도록 하는 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 단백질 암호화 서열에 "작동 가능하게 연결된" 벡터 내의 제어 서열, 예를 들어 프로모터는 제어 서열의 정상적인 활성이 단백질 암호화 서열의 전사를 유도하여, 암호화된 단백질의 재조합 발현을 나타내도록 배열된다.
벡터는 사용되는 특정 숙주세포에서 기능하도록 선택될 수 있다(즉, 벡터는 숙주세포 기구에 적합하여 유전자의 증폭 및/또는 발현이 일어날 수 있도록 한다). 일부 구현예에서, 디하이드로폴레이트 환원효소와 같은 단백질 리포터를 이용한 단백질-단편 상보성 분석법을 채용한 벡터가 사용된다(예를 들어, 미국 특허 6,270,964호 참조). 적합한 발현 벡터는 당업계에 알려져 있고, 또한 상업적으로 입수 가능하다.
일반적으로, 임의의 숙주세포에 사용되는 벡터는 플라스미드 유지와 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 다음의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 원점, 전사 및 번역 제어 서열, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 스플라이스 부위를 포함하는 완전한 인트론 서열, 글리코실화 또는 수율을 개선하기 위한 다양한 프리- 또는 프로-서열, 폴리펩티드 분비를 위한 천연 또는 이종 신호 서열(리더 서열 또는 신호 펩티드), 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열, 발현 증강 서열 요소(EASE), 아데노바이러스 2의 3부 리더(tripartite leader, TPA) 및 VA 유전자 RNA, 발현될 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 폴리링커 영역, 및 선별 마커 요소. 벡터는 상업적으로 입수 가능한 벡터와 같은 개시 백터로부터 구성될 수 있으며, 추가 요소들은 개별적으로 수득되어 벡터에 결찰될 수 있다. 각각의 구성요소를 수득하기 위해 사용되는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
벡터 구성요소는 상동성(즉, 숙주세포와 동일한 종 및/또는 균주에서 유래), 이종성(즉, 숙주세포 종 또는 균주 이외의 종에서 유래), 혼성(즉, 2개 이상의 공급원에서 유래된 플랭킹 서열의 조합), 합성적 또는 천연적일 수 있다. 벡터에 유용한 구성요소의 서열은 매핑 및/또는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 이전에 확인된 것과 같이, 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한, 이들은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득될 수 있고/있거나 적합한 프로브로 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 수득될 수 있다.
리보솜-결합 부위는 일반적으로 mRNA의 번역 개시에 필요하며, Shine-Dalgarno 서열(원핵세포) 또는 Kozak 서열(진핵세포)을 특징으로 한다. 이 요소는 일반적으로 프로모터의 3' 및 발현될 폴리펩티드의 암호화 서열의 5'에 위치한다.
복제 원점은 숙주세포에서의 벡터의 증폭에 도움이 된다. 이들은 상업적으로 입수 가능한 원핵세포 벡터의 일부로서 포함될 수 있고, 기존에 알려진 서열을 기반으로 화학적으로 합성되어 벡터에 결찰될 수도 있다. 다양한 바이러스 기원(예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 또는 HPV 또는 BPV와 같은 유두종 바이러스)이 포유류 세포에서 벡터를 클로닝하는 데 유용하다.
포유류 숙주세포 발현 벡터에 대한 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 게놈으로부터 절제될 수 있다. 일반적으로 사용되는 프로모터 및 인핸서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40(SV40), 및 인간 거대세포바이러스(CMV)로부터 유래된다. 예를 들어, 조기 발현 유전자(immediate early gene) 1의 인간 CMV 프로모터/인핸서가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Patterson et al. (1994), Applied Microbiol. Biotechnol. 40:691-98] 참조. SV40 바이러스 게놈에서 유래된 DNA 서열, 예를 들어 SV40 기원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스, 및 폴리아데닐화 부위가 포유류 숙주세포에서 구조적 유전자 서열의 발현을 위한 다른 유전 요소를 제공하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 초기 및 후기 프로모터는 둘 다 바이러스 게놈에서 단편으로서 쉽게 얻어지고 바이러스 복제 원점을 포함할 수도 있기 때문에 특히 유용하다(Fiers et al. (1978), Nature 273:113; Kaufman (1990), Meth. in Enzymol. 185:487-511). Hind III 부위에서 복제 부위의 SV40 바이러스 기원에 위치한 Bgl I 부위로 연장되는 약 250 bp의 서열이 포함된다면, 더 작거나 더 큰 SV40 단편도 사용될 수 있다.
전사 종결 서열은 일반적으로 폴리펩티드 암호화 영역 말단의 3'에 위치하며 전사를 종결시키는 역할을 한다. 일반적으로, 원핵세포의 전사 종결 서열은 폴리-T 서열이 이어지는 G-C 풍부 단편이다. 서열은 라이브러리로부터 쉽게 클로닝되거나 벡터의 일부로서 상업적으로 구입되기도 하지만, 당업자에게 알려진 핵산 합성 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수도 있다.
선별 마커 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장한 숙주세포의 생존과 성장에 필요한 단백질을 암호화한다. 전형적인 선별 마커 유전자는 (a) 원핵 숙주세포에 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린, 또는 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 단백질; (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하는 단백질; 또는 (c) 복합 또는 한정 배지에서 이용할 수 없는 중요 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다. 특정 선별 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유리하게는, 원핵 숙주세포 및 진핵 숙주세포 모두에서의 선별을 위해 네오마이신 내성 유전자가 또한 사용될 수 있다.
발현될 유전자를 증폭시키기 위해 다른 선별 유전자가 사용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존에 중요한 단백질의 생산에 필요한 유전자가 연속 세대의 재조합 세포의 염색체 내에서 일렬로 반복되는 과정이다. 포유류 세포에 적합한 선별 마커의 예는 글루타민 신타제(GS)/메티오닌 설폭시민(MSX) 시스템, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 및 프로모터 없는 티미딘 키나제 유전자를 포함한다. 포유류 세포 형질전환체는 벡터에 존재하는 선별 유전자에 의해 형질전환체만이 생존하도록 특유하게 적응되는 선별 압력 하에 놓인다. 형질전환된 세포를 배지 내 선별제의 농도가 연속적으로 증가하는 조건에서 배양함으로써 선별 압력을 가하여, 관심 단백질을 암호화하는 DNA와 선별 유전자 모두를 증폭시킨다. 그 결과, 증폭된 DNA로부터 증가된 양의 관심 폴리펩티드가 합성된다.
진핵 숙주세포 발현 시스템에서 글리코실화가 요구되는 경우와 같은 일부 경우에, 글리코실화 또는 수율을 개선하기 위해 다양한 프리- 또는 프로-서열을 조작할 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 펩티드의 펩티다제 절단 부위를 변경하거나, 프로서열을 추가할 수 있으며, 이 또한 글리코실화에 영향을 미칠 수 있다. 최종 단백질 산물은 (성숙 단백질의 제1 아미노산에 대한) -1 위치에, 완전히 제거되지 않았을 수 있는, 발현에 따른 하나 이상의 추가 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들어, 최종 단백질 산물은 아미노 말단에 부착된, 펩티다제 절단 부위에서 발견되는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 대안적으로, 일부 효소 절단 부위를 사용하면 효소가 성숙 폴리펩티드 내의 이러한 영역에서 절단하는 경우 목적하는 폴리펩티드의 약간 절단된 형태를 얻을 수 있다.
일반적으로 발현 및 클로닝은 숙주 유기체에 의해 인식되어 관심 단백질을 암호화하는 분자에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 구조적 유전자의 전사를 제어하는 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내의) 구조적 유전자의 개시 코돈의 상류(즉, 5')에 위치하는 전사되지 않은 서열이다. 프로모터는 통상적으로 유도성 프로모터와 항시성 프로모터의 두 가지 부류 중 하나로 분류된다. 유도성 프로모터는 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도 변화와 같은 배양 조건의 일부 변화에 반응하여 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 반면, 항시성 프로모터는 작동 가능하게 연결된 유전자를 균일하게 전사한다(즉 유전자 발현에 대한 제어가 거의 없거나 전혀 없음). 다양한 잠재적 숙주세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다.
효모 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터도 당업계에 잘 알려져 있다. 효모 인핸서는 유리하게는 효모 프로모터와 함께 사용된다. 포유류 숙주세포와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 잘 알려져 있으며, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 시미안 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 포유류 프로모터는 이종 포유류 프로모터, 예를 들어 열충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
관심 대상이 될 수 있는 추가의 프로모터는 SV40 초기 프로모터(Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV 프로모터(Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); Rous 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복에 포함된 프로모터(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH); 메탈로티오닌 유전자의 프로모터 및 조절 서열(Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 및 원핵세포 프로모터, 예컨대 베타-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75:3727-3731); 또는 tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 조직 특이성을 나타내고 유전자이식 동물에서 사용되었던 하기 동물 전사 제어 영역도 관심의 대상이다: 췌장 선방세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 림프세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 고환, 유방, 림프, 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역(PPinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); 간에서 활성인 알파-페토-단백질 유전자 제어 영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); 골수세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역(Sani, 1985, Nature 314:283-286); 및 시상하부에서 활성인 생식선자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
고등 진핵세포에 의한 전사를 증가시키기 위해 인핸서 서열이 벡터에 삽입될 수 있다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는, DNA의 시스-작용 요소로서, 일반적으로 길이가 약 10~300 bp이다. 인핸서는 상대적으로 배향 및 위치 독립적이며, 전사 단위의 5' 및 3' 위치 모두에서 발견된다. 포유류 유전자에서 얻을 수 있는 여러 인핸서 서열이 알려져 있다(예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질, 및 인슐린). 그러나, 일반적으로 바이러스의 인핸서가 사용된다. 당업계에 알려진 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 예시적 강화 요소이다. 인핸서는 벡터에서 암호화 서열의 5' 또는 3'에 위치할 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
관심 단백질의 세포외 분비를 촉진시키기 위해, 적절한 천연 또는 이종 신호 서열을 암호화하는 서열(리더 서열 또는 신호 펩티드)이 발현 벡터에 포함될 수 있다. 신호 펩티드 또는 리더의 선택은 관심 단백질이 생산되는 숙주세포의 유형에 따라 달라지며, 이종 신호 서열이 천연 신호 서열을 대체할 수 있다. 포유류 숙주세포에서 기능하는 신호 펩티드의 예는 다음을 포함한다: 미국 특허 4,965,195호에 기재된 인터류킨-7에 대한 신호 서열; 문헌[Cosman et al., 1984, Nature 312:768]에 기재된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; EP 특허 0367 566호에 기재된 인터류킨-4 수용체 신호 펩티드; 미국 특허 4,968,607호에 기재된 I형 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드; EP 특허 0 460 846호에 기재된 II형 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드.
포유류 발현 벡터로부터 이종 유전자의 발현을 개선하는 것으로 나타난 추가의 제어 서열은 CHO 세포에서 유래된 발현 증강 서열 요소(EASE)(Morris et al., Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); 미국 특허 6,312,951 B1호, 6,027,915호, 및 6,309,841 B1호) 및 아데노바이러스 2의 3부 리더(TPL) 및 VA 유전자 RNA(Gingeras et al. (1982), J. Biol. Chem. 257:13475-13491)와 같은 요소를 포함한다. 바이러스 기원의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 디시스트론 mRNA가 효율적으로 번역될 수 있도록 한다(Oh and Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2697-2700).
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 벡터는 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 외인성 핵산 분자 서열에 대한 삽입 부위를 포함하는 피기백 트랜스포존을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 여러 관심 단백질이 외인성 핵 분자(들)에 의해 발현된다. 일 구현예에서, 벡터는 여러 관심 단백질을 암호화하는 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제 및 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 외인성 핵산 서열에 대한 삽입 부위를 포함하는 트랜스포존을 포함하는 단일 벡터가 세포에 형질주입될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일 구현예에서, 여러 관심 단백질이 외인성 핵 분자(들)에 의해 발현된다. 일 구현예에서, 벡터는 여러 관심 단백질을 암호화하는 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 작제물을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 분자에 대한 삽입 부위를 포함하는 피기백 트랜스포존을 포함하는 제2 벡터를 제공하며, 상기 두 벡터는 세포에 공동 형질주입될 수 있다. 관련 구현예에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소를 포함한다. 일 구현예에서, 여러 관심 단백질이 외인성 핵 분자(들)에 의해 발현된다. 일 구현예에서, 벡터는 여러 관심 단백질을 암호화하는 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 작제물을 포함한다.
작제 후, 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위한 적합한 세포에 하나 이상의 벡터가 삽입될 수 있다. 발현 벡터의 선택된 세포로의 형질전환은 형질감염, 감염, 인산칼슘 공침, 전기천공, 핵감염, 미량주입, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 전달, 리포솜 매개 형질감염, 미립자 충격, 수용체 매개 유전자 전달, 폴리리신, 히스톤, 키토산, 및 펩티드에 매개되는 전달을 비롯한 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로는 사용될 숙주세포의 유형에 따를 것이다. 이러한 방법 및 기타 적합한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 매뉴얼 및 기타 기술 출판물, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)]에 명시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환"은 세포의 유전자 특성의 변화를 지칭하며, 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 포함하도록 변형되었을 때 형질전환된 것이다. 예를 들어, 세포는 형질감염, 형질도입, 또는 다른 기법을 통해 새로운 유전자 물질을 도입함으로써 천연 상태로부터 유전자 변형되는 경우에 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합되어 세포의 DNA와 재조합될 수 있거나, 복제되지 않고 일시적으로 에피솜 요소로서 유지될 수 있거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제할 수 있다. 형질전환 DNA가 세포 분열과 함께 복제될 때 세포는 "안정적으로 형질전환"된 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 지칭한다. 다수의 형질감염 기법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197] 참조.
본원에서 사용되는 용어 "형질도입"은 외래 DNA가 바이러스 벡터를 통해 세포에 도입되는 프로세스를 지칭한다. 문헌[Jones et al., (1998) Genetics: principles and analysis. Boston: Jones & Bartlett Publ.] 참조.
"세포" 또는 "세포들"은 임의의 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 세포는 생체외, 시험관내, 또는 생체내 분리되거나, 조직 또는 기관과 같은 상위 구조의 일부로 존재할 수 있다. 세포는 상업적 또는 과학적 관심 대상인 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 조작되는 "세포주"라고도 하는 "숙주세포"를 포함한다. 일반적으로 숙주세포는 무한한 시간 동안 배양에 유지될 수 있는 1차 배양물에서 발생하는 계통으로부터 유래된다. 숙주세포의 유전자 조작은 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 이용한 세포의 형질감염, 형질전환, 또는 형질도입, 및/또는 그 외에 숙주세포가 목적 재조합 폴리펩티드를 발현하도록 유도하는 (예를 들어, 상동 재조합 및 유전자 활성화 또는 재조합 세포와 비재조합 세포의 융합에 의한) 변경을 포함한다. 관심 폴리펩티드를 발현하도록 세포 및/또는 세포주를 유전자 조작하기 위한 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1990, and quarterly updates); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture,1990, pp. 15-69]에 설명되어 있다.
숙주세포는 임의의 원핵세포(예를 들어, E. coli) 또는 진핵세포(예를 들어, 효모, 곤충, 또는 동물 세포(예를 들어, CHO 세포))일 수 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵세포 또는 진핵세포에 도입될 수 있다. 원핵 숙주세포는 진정세균, 예컨대 그램-양성 또는 그램-음성 유기체, 예를 들어 장내세균, 예컨대 에셰리키아, 예를 들어 E. coli, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움, 세라티아, 예를 들어 세라티아 마르세센스, 및 시겔라, 뿐만 아니라 바실러스, 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스, 슈도모나스, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 사카로마이세스, 또는 일반적인 제빵용 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 균주, 예컨대 피키아, 예를 들어 P. 파스토리스, 스키조사카로마이세스 폼베; 클루이베로마이세스, 야로위아; 칸디다; 트리코더마 리시아; 뉴로스포라 크라사; 슈반니오마이세스, 예컨대 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스; 및 사상 진균, 예컨대 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움, 및 아스페르길루스 숙주, 예컨대 니둘란스 및 니게르가 일반적으로 이용 가능하고 본원에서 유용하다.
동물 세포주는 원세포가 다세포 동물에서 유래된 세포로부터 유래된다. 동물 세포주의 한 유형은 포유류 세포주이다. 배양에서의 성장에 적합한 매우 다양한 포유류 세포주는 미국 ATCC(Manassas, Va.) 및 상업적 공급업체로부터 입수 가능하다. 업계에서 일반적으로 사용되는 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVl 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 293 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포(Graham et al, J. Gen Virol. 36: 59, 1977); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 : 243-251, 1980); 원숭이 신장 세포(CVl ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383 : 44-68, 1982); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 포유류 골수종 세포, 및 다수의 다른 세포주 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다. CHO 세포는 복합 재조합 단백질을 생산하는 데 널리 사용된다. 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)-결핍 돌연변이 세포주(Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 및 DG-44는 효율적인 DHFR 선별 및 증폭 가능한 유전자 발현 시스템을 통해 이들 세포에서 높은 수준의 재조합 단백질 발현이 가능하므로 바람직한 CHO 숙주 세포주이다(Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). 글루타민 합성효소(GS)-기반 메티오닌 설폭시민(MSX) 선별을 사용하는 글루타민 신타제(GS)-녹아웃 CHOK1SV 세포주가 또한 포함된다. CHOK1 세포(ATCC CCL61)도 포함된다. 또한, 이들 세포는 부착 또는 현탁 배양물로 조작하기 용이하고, 비교적 우수한 유전자 안정성을 나타낸다. CHO 세포 및 이들 세포에서 재조합 발현된 단백질은 광범위하게 특성화되었으며, 규제 기관에 의해 임상적 상용 제조에서의 사용에 대해 승인받았다.
세포는 또한 단핵세포, 말초 혈액 단핵세포, 골수 유래 단핵세포, 제대혈 유래 단핵세포, 림프구, 단핵구, 수지상 세포, 대식세포, T세포, 나이브 T세포, 기억 T세포, CD28+ 세포, CD4+ 세포, CD8+ 세포, CD45RA+ 세포, CD45RO+ 세포, 자연살해 세포, 조혈 줄기세포, 만능 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특히, 유전자 변형하여 공여체 또는 대상체에게 세포를 재도입할 목적으로 세포를 공여체 또는 대상체로부터 수집할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포가 제공된다. 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염된 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염된 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염된 세포를 제공한다. 관련 구현예에서, 세포는 세포주이다. 관련 구현예에서, 세포는 숙주세포이다. 관련 구현예에서, 세포는 CHO 세포이다. 관련 구현예에서, 세포는 면역세포이다. 관련 구현예에서, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가는 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작하는 단계; 및 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계를 제공하며, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가는 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작하는 단계; 및 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 세포를 공동 형질감염시키는 단계를 제공하며, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가는 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된다.
또한, 관심 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질감염되어 적절한 조건에서 배양될 때 관심 단백질을 발현하는 숙주세포가 제공된다. 발현된 단백질은 이후 (숙주세포가 이를 배지에 분비할 경우) 배양 배지로부터 수집되거나, (분비되지 않는 경우) 이를 생산하는 숙주세포로부터 직접 수집될 수 있다. 적절한 숙주세포의 선택은 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩티드 변형(예컨대, 글리코실화 또는 인산화), 및 생물학적 활성 분자로의 접힘 용이성과 같은 다양한 인자에 따라 달라진다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로서 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 벡터로 형질감염된 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염된 세포 숙주에 의해 발현된 관심 재조합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로서 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
"배양"은 다세포 유기체 또는 조직 외부에서의 세포 성장 및 증식을 의미한다. 포유류 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 알려져 있다. 세포 배양 배지 및 조직 배양 배지는 시험관내 세포 배양 중에 숙주세포의 성장에 적합한 배지를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 세포 배양 배지에는 버퍼, 염, 에너지원, 아미노산, 비타민, 및 미량 필수 원소가 포함되어 있다. 배양에서 적절한 숙주세포의 성장을 지속시킬 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다. 특정 배양된 숙주세포에서 세포 성장, 세포 생존력, 및/또는 재조합 단백질 생산을 최대화하기 위해 다른 성분이 추가로 보충될 수 있는 세포 배양 배지는 상업적으로 입수 가능하며, 특히 미국 ATCC 또는 SAFC Biosciences, 및 다른 공급업체로부터 입수할 수 있는 RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM), 최소 필수 배지 Eagle, F-12K 배지, Ham F12 배지, Iscove의 변형된 Dulbecco 배지, McCoy 5A 배지, Leibovitz L-15 배지, 및 EX-CELL™ 300 시리즈와 같은 무혈청 배지를 포함한다. 세포 배양 배지는 무혈청, 무단백질, 무성장인자, 및/또는 무펩톤 배지일 수 있다. 세포 배양은 또한 영양소의 첨가에 의해 강화될 수 있고, 보통의 권장 농도보다 높은 농도로 사용될 수 있다.
예를 들어, 한 단계(예: 성장 단계 또는 기간)에서 다른 단계(예: 생산 단계 또는 기간)로의 전환을 용이하게 하고/하거나 세포 배양 중의 조건(예: 관류 배양 중에 제공되는 농축된 배지)을 최적화하기 위해 배양 수명 동안 다양한 배지 제형이 사용될 수 있다. 세포 성장을 촉진하고 단백질 발현을 최소화하기 위해 성장 배지 제형이 사용될 수 있다. 최소한의 새로운 세포 성장으로 관심 단백질의 생산 및 세포의 유지를 촉진하기 위해 생산 배지 제형이 사용될 수 있다. 활성 배양물, 특히 유가식, 반관류식, 또는 관류식으로 조작되는 배양물을 보충하고 유지하기 위해 영양공급 배지, 일반적으로 세포 배양의 생산기 과정 중에 소비되는 영양소 및 아미노산과 같은 보다 농충된 성분을 함유한 배지가 사용될 수 있다. 이러한 농축된 영양공급 배지는 세포 배양 배지의 대부분의 성분을, 예를 들어 정상량의 약 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 12배, 14배, 16배, 20배, 30배, 50배, 100배, 200배, 400배, 600배, 800배, 또는 심지어 약 1000배로 함유할 수 있다.
성장기는 생산기보다 더 높은 온도에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 성장기는 약 35℃ 내지 약 38℃의 제1 온도에서 발생할 수 있고, 생산기는 약 29℃ 내지 약 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 약 36℃ 또는 약 30℃ 내지 약 34℃의 제2 온도에서 발생할 수 있다. 예를 들어 카페인, 부티레이트, 및 헥사메틸렌 비스아세트아미드(HMBA)와 같은 단백질 생산의 화학적 유도제가 온도 변화 이전, 이후, 및/또는 온도 변화와 동시에, 또는 온도 변화 대신에 첨가될 수 있다. 유도제가 온도 변화 후에 첨가되는 경우, 유도제는 온도 변화 1시간 내지 5일 후, 선택적으로 온도 변화 1일 내지 2일 후에 첨가될 수 있다.
숙주세포는 현탁액에서 배양되거나, 고체 기질에 부착된 부착 형태로 배양될 수 있다. 세포 배양물은 유동층 생물반응기, 중공섬유 생물반응기, 롤러병, 진탕 플라스크, 또는 교반탱크 생물반응기에 마련될 수 있으며, 미립담체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
세포 배양은 회분식, 유가식, 연속식, 반연속식, 또는 관류식으로 조작될 수 있다. CHO 세포와 같은 포유류 세포는 100 ml 미만 내지 1000 ml 미만의 소규모, 용량이 2,000 리터를 초과하는 보다 중간 범위의 규모, 및 용량이 20,000 리터를 초과할 수 있는 대규모의 생물반응기에서 배양될 수 있다. 단백질 치료제의 임상적 및/또는 상업적 규모의 바이오제조와 같은 중대형 규모의 세포 배양은 세포가 목적 단백질(들)을 생산하는 동안 수 주 내지 심지어 수개월 간 유지될 수 있다.
이렇게 얻어진 발현된 재조합 단백질은 이어서 세포 배양 배지로부터 채취될 수 있다. 현탁 세포로부터 단백질을 채취하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 산 침전, 응집과 같은 가속 침강, 중력을 이용한 분리, 원심분리, 음파 분리, 여과(한외여과기, 마이크로필터, 접선 유동 필터, 대체 접선 유동 필터, 심층 필터, 및 충적 필터를 이용한 막여과 포함)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 원핵세포에 의해 발현된 재조합 단백질은 당업계에 알려진 산화환원 폴딩 공정 포함하는 공정에 의해 세포질 내 봉입체로부터 회수된다.
채취된 단백질은 이어서 하나 이상의 단위 조작을 이용해 잔여 세포 배양 배지, 세포 추출물, 원치 않는 성분, 숙주세포 단백질, 부적절하게 발현된 단백질 등과 같은 임의의 불순물로부터 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다. 용어 "단위 조작"은 관심 재조합 단백질을 정제하는 공정의 일부로서 수행되는 기능적 단계를 지칭한다. 예를 들어, 단위 조작은 관심 재조합 단백질의 포획, 정제, 바이러스 불활성화, 바이러스 여과, 농축, 및/또는 제형화와 같은 단계를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 단위 조작은 단일 목표 또는 다중 목표, 예컨대 포획 및 바이러스 불활성화 단계를 달성하도록 설계될 수 있다. 단위 조작은 또한 처리 단계 사이에 유지 또는 저장 단계를 포함할 수 있다.
포획 단위 조작은 관심 재조합 단백질에 결합할 제제를 함유한 수지 및/또는 막을 사용하는 포획 크로마토그래피, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 등을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 당업계에 알려져 있으며 상업적으로 입수 가능하다. 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L-결합과 같은 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메커니즘을 사용할 수 있다. 관심 재조합 단백질은 폴리히스티딘 태그로 태깅된 후, 이미다졸 또는 에피토프, 예컨대 FLAG®를 사용하여 IMAC로부터 정제되고, 이후 이러한 에피토프에 대한 특이적 항체를 사용하여 정제될 수 있다.
바이러스 오염 물질의 불활성화, 감소, 및/또는 제거를 포함하는 단위 조작은 환경 및/또는 여과를 조작하는 공정을 포함할 수 있다. 바이러스 불활성화를 달성하기 위한 한 가지 방법은 낮은 pH(예를 들어 4 미만의 pH), 또는 바이러스 불활성화를 달성하기 위한 온도 또는 화학 조성과 같은 다른 용액 조건에서 인큐베이션하는 것이다. 낮은 pH 바이러스 불활성화 다음에, 바이러스 불활성화된 용액을 후속 단위 조작의 요건에 더 적합한 pH로 재조정하는 중화 단위 조작이 이어질 수 있다. 또한, 임의의 생성된 탁도 또는 침전을 제거하기 위해 심층 여과와 같은 여과가 이어질 수 있다. 바이러스 여과는 마이크로- 또는 나노-필터, 예컨대 Asahi Kasei(Plavona®) 및 EDM Millipore(VPro®)에서 입수 가능한 필터를 사용하여 수행될 수 있다.
폴리싱 단위조작은 관심 단백질의 정제, DNA, 숙주세포 단백질과 같은 오염 물질과 불순물의 제거, 및 생성물-특이적 불순물, 변이 생성물 및 응집체, 바이러스 흡착 등의 제거를 위한 다양한 크로마토그래피 방법을 사용할 수 있다. 폴리싱 크로마토그래피 단위 조작은 "관류 방식(flow-through mode)"(관심 단백질이 용리액에 포함되어 있고 오염물질과 불순물이 크로마토그래피 매질에 결합되어 있음) 또는 "결합 및 용리 방식"(관심 단백질이 크로마토그래피 매질에 결합되어 있고 오염물질과 불순물이 크로마토그래피 매질을 통해 흐르거나 세척된 후에 관심 단백질이 용리됨)으로 사용될 수 있는 제제를 함유한 수지 및/또는 막을 사용한다. 이러한 크로마토그래피 방법의 예는 몇 가지만 예로 들면 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 및 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)와 같은 이온 교환 크로마토그래피(IEX); 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC); 혼합모드 또는 다중모드 크로마토그래피(MM), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(HA); 역상 크로마토그래피 및 겔 여과를 포함한다.
생성물의 농축 및 관심 단백질을 원료 의약품의 대량 저장에 바람직한 제형 버퍼로 버퍼 교환하는 것은 한외여과 및 정용여과에 의해 달성될 수 있다.
제조 중 각 단계의 성능에 대한 결정을 더 잘 알리기 위해 임계 속성 및 성능 매개변수가 측정될 수 있다. 이러한 임계 속성 및 매개변수는 실시간으로, 거의 실시간으로, 그리고/또는 사후에 모니터링될 수 있다. 소비되는 배지 성분(예: 글루코스), 축적되는 대사 부산물(예: 락테이트 및 암모니아)의 수준, 및 세포 유지와 생존과 관련된 것(예: 용존 산소 함량)과 같은 주요 임계 매개변수가 측정될 수 있다. 비생산성(specific productivity), 생존 세포 밀도, pH, 삼투압, 외형, 색상, 응집, 백분율 수율, 및 역가와 같은 임계 속성이 공정 중 및 후에 모니터링될 수 있다. 모니터링 및 측정은 알려진 기법 및 상용 장비를 사용하여 수행될 수 있다.
역가는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 역가는 단백질 A가 컬럼 지지체에 고정된 친화성 크로마토그래피를 사용하는 역상 HPLC 분석으로 측정될 수 있다. 중성 pH에서, 항체 분자는 Fc 영역을 통해 단백질 A에 결합하는 반면, 숙주세포 단백질, 조절된 배지 성분, 및 버퍼는 관류식으로 컬럼으로부터 용리된다. 포획된 항체는 산성 pH에서 용리되고 280 nm에서의 UV 흡광도로 검출된다. 선형 회귀 분석을 이용해 범용 항체 표준 및 상응하는 피크 면적으로부터 보정 곡선이 도출될 수 있다. 이어서, 보정 곡선 및 범용 항체 표준과 시험 항체의 흡광 계수비로부터 시험 샘플 중의 항체 농도가 계산된다.
다른 방법은 ELISA; HTRF(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)(Cisbio US, Bedford, MA); 및 Berkley Lights Beacon 플랫폼(Emeryville, CA)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염된 세포 숙주에 의해 발현된 관심 재조합 단백질을 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 이러한 제약 조성물은 제약상 또는 생리학적으로 허용되는 하나 이상의 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 관심 단백질, 또는 관심 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어 CAR 및 TCR을 발현하는 면역세포를 포함한다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 버퍼; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산(예를 들어, 글리신); 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 아쥬반트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다.
제약 조성물(용액, 현탁액 등)은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예컨대 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노- 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트와 같은 버퍼; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성(tonicity) 조절제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기, 또는 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가를 개선하는 방법으로서, 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작하는 단계; 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 숙주세포를 공동 형질감염시키는 단계; 및 세포를 배양하여 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하되, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된, 방법을 제공한다. 관련 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로 형질감염된다. 관련 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포 배양물에서 재조합 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서, 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 숙주세포를 사용하여 생물반응기에 세포 배양물을 마련하는 단계; 및 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하되, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된, 방법을 제공한다. 관련 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로 형질감염된다. 관련 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서, 관심 재조합 단백질을 발현하는 숙주세포(세포주는 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 공동 형질감염되었음)를 사용하여 생물반응기에 세포 배양물을 마련하는 단계; 세포를 배양하여 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 관심 재조합 단백질을 채취하는 단계; 하나 이상의 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 처리하는 단계; 및 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 관련 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로 형질감염된다. 관련 구현예에서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염된다. 관련 구현예에서, 적어도 하나의 단위 조작은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 포획 크로마토그래피 단계이다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 단위 조작은 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 폴리싱 크로마토그래피 단계이다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 단위 조작은 바이러스 불활성화, 바이러스 여과, 심층 여과, 및 UF/DF로부터 선택된다. 관련 구현예에서, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가는 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된다. 다른 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질이 제공된다. 다른 구현예에서, 단리된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 및 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 삽입된 피기백 트랜스포존의 적어도 최소 역위 반복 요소를 포함하는 벡터를 포함하는 세포 형질감염용 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
본원에 기재된 피기백 트랜스포사제는 유전자 전달; 세포주 생산; 세포의 유전자 변형, 게놈 변형 생성과 같은 유전 공학과 관련된 응용; 생식세포 또는 체세포 돌연변이 유발에서의 사용; 유전자 전달 매개에서의 사용; 유전자 특성화; 유전자 기능 결정; 종양유전자 스크리닝; 유전자 치료; 만능 줄기세포의 생성; 및 비인간 유전자이식 동물을 위한 피기백 트랜스포존 시스템의 일부로서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[US 2013/0209426; US 2010/0311116; Vanden Driessche et al., Blood 114 (8): 1461-1468, 2009; Yusa K, et al., Nat. Methods. 6(5):363-369, 2009; Wilson et al., Mol. Ther. 15(1):139-145, 2007; Landrette et al., PLoS ONE 6(10): 1-12, 2011; Nakanishi et al., Molecular Therapy 18(4): 707-714, 2010); Zhao et al., Transl Lung Cancer Res., 5(1):120-125, 2016; Wilson et al., Molecular Therapy 15(1): 139-145, 2007] 참조).
본원에 기재된 피기백 트랜스포사제는 게놈 편집에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제는 1차 세포 유형 또는 줄기세포로의 통합을 위한 효율적인 비바이러스성 전달을 제공한다는 점에서 유리한 피기백 트랜스포존/트랜스포사제 시스템의 일부로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제는 키메라 항원 수용체(CAR), T세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬을 암호화하는 유전자뿐만 아니라 단백질, 예컨대 사이토카인, 체크포인트 억제제, 및 다른 단백질을 암호화하여 세포를 조작하는 기타 유전자의 비바이러스성 전달을 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 단일 유전자 작제물로 여러 유전자를 전달할 수 있다. 바이러스 형질도입에 비해 장점은 더 큰 유전자 운반물을 수용할 수 있고 트랜스포사제가 비바이러스성 형질감염에서의 통합 효율을 증가시킨다는 것이다. 이러한 시스템은 또한 다른 비바이러스성 게놈 편집 기술, 예컨대 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR)-관련 단백질 9(Cas9), PhiC3 파지 인테그라제와 같은 인테그라제, 전사 활성제-유사 이펙터(TALES), 서열 특이적 재조합효소, 및 Sleeping Beauty와 같은 기타 트랜스포존/트랜스포사제 시스템과 조합하여 사용되어 다양한 세포에서 형질도입을 가능하게 할 수 있다(US 2015/0031132; WO2018/098671; Ivics et al., Cell 91(4): 501-510, 1997; Boch et al., Science 326(5959): 1509-1512, 2009; Christian et al., Genetics 186(2): 757-761, 2010; Wilber et al., Stem Cells Int; Vol: 2011: Article number 717069, 2011; Yusa et al., Nature 478, 20 October, 391-396, 2011; Silva et al., Curr Gene Ther 11(1): 11-27, 2011; Cong et al., Science 339(6121): 819-823, 2013; Mali et al., Science 339(6121): 823-826, 2013. Li et al., Molecular Therapy: Nucleic Acids Vol. 8 September, 64-76, 2017; 및 Ishida et al., www.nature/Scientific Reports 8, Article Number 310, 2018).
본원에 기재된 피기백 트랜스포사제는 CAR, TCR, 및/또는 다른 단백질을 암호화하는 유전자 작제물로 세포를 안정적이고 비바이러스적으로 형질감염시키기 위해 피기백 트랜스포존 시스템의 일부로서 사용될 수 있다. 천연 T세포는 (i) 환자(대상체) 또는 공여체로부터 제거되고, (ii) 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 포함하는 피기백 트랜스포존/트랜스포사제 시스템을 사용하여 유전자 조작되어, 적어도 하나의 관심 항원에 결합하는 하나 이상의 키메라 항원 수용체, T세포 수용체, 및/또는 다른 단백질을 발현하고, (iii) 세포 배양에 의해 더 많은 조작된 T세포 집단으로 증식되어, (iv) 환자에게 재도입될 수 있다. 조작된 T세포는 환자에게 재도입된 후, 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 매개한다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 7,741,465호 및 6,319,494호; 미국 특허 공개 2017/0355957호; Nakazawa et al., J. Immunotherapy 32(8): 826-836; 2009; Nakazawa et al., Molecular Therapy 19(12): 2133-2143, 2011; Eshhar et al. Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136; Finney et al., Journal of Immunology, 161: 2791-2797, 1998; Krause et al., J. Exp. Med., 188(4): 619-626, 1998] 참조. 이 면역 반응은 T세포에 의한 IL-2 및 다른 사이토카인의 분비, 항원을 인식하는 T세포의 클론 증식, 및 표적-양성 세포의 T세포-매개 특이적 사멸을 포함한다. 문헌[Hombach et al., Journal of Immun. 167: 6123-6131 (2001)] 참조.
면역세포는 대상체로부터 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 면역세포는 T세포를 포함한다. T세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 여러 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 구현예에서, T세포는 FICOLLTM 분리와 같은, 당업자에게 알려진 여러 기법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻을 수 있다. 세포는 바람직하게는 성분채집술에 의해 개체의 순환 혈액으로부터 얻을 수 있다. 일반적으로 성분채집술 생성물은 T세포, 단핵구, 과립구, B세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함하여 림프구를 포함한다. 특정 구현예에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 세척될 수 있고, 후속 처리를 위해 적절한 버퍼 또는 배지에 배치될 수 있다. 세포는 PBS로 세척될 수 있다. 이해되는 바와 같이, 세척 단계는 예를 들어 CobeTM 2991 세포 처리기, Baxter CytoMateTM 등과 같은 반자동 관류 원심분리기를 사용하여 수행될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체 적합성 버퍼에 재현탁되거나, 버퍼가 있거나 없는 다른 식염수 용액에 재현탁될 수 있다. 특정 구현예에서, 성분채집술 샘플의 원치 않는 성분은 제거될 수 있다.
특정 구현예에서, 적혈구를 용해하고, 예를 들어 PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리를 이용해 단핵구를 고갈시켜 PBMC로부터 T세포가 단리된다. 당업계에 알려진 양성 또는 음성 선별 기법에 의해 CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T세포와 같은 T세포의 특정 하위집단이 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 음성 선별에 의한 T세포 집단의 농축은 음성적으로 선별된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 본원에 사용하기 위한 한 가지 방법은 음성적으로 선별된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선별이다. 예를 들어, 음성 선별에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 일반적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 유세포 분석 및 세포 분류는 또한 본 발명에 사용하기 위한 관심 세포 집단을 단리하는 데 사용될 수 있다.
PBMC는 본원에 기재된 방법을 이용한 유전자 작제물(예컨대, CAR 또는 TCR)에 의한 유전자 변형에 직접 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, PBMC의 단리 후, T 림프구가 추가로 단리될 수 있고, 세포독성 T림프구 및 헬퍼 T 림프구 모두 유전자 변형 및/또는 증식 전 또는 후에 나이브 T세포, 기억 T세포, 및 이펙터 T세포의 하위집단으로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 CD8+ 세포의 각각의 유형과 관련된 세포 표면 항원을 식별함으로써 나이브 세포, 중심 기억 세포, 이펙터 세포로 추가로 분류된다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T세포의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T세포이다. 일부 구현예에서, 이펙터 T세포는 CD62L, CCR7, CD28, 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, CD4+ T세포는 하위집단으로 추가로 분류된다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별함으로써 나이브 세포, 중심 기억 세포, 및 이펙터 세포로 분류될 수 있다.
T세포와 같은 면역세포는 피기백 트랜스포존/트랜스포사제 시스템의 일부로서의 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제 및 하나 이상의 CAR을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 이용한 단리 후 유전자 변형될 수 있다. 비바이러스성 유전자 변형된 면역세포는 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 CAR, TCR, 및/또는 다른 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로 세포를 형질감염시켜 얻을 수 있다. 유전자 변형된 면역세포는 또한, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 CAR, TCR, 및/또는 다른 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로 면역세포를 공동 형질감염시켜 얻을 수 있다. 벡터는 전기천공 또는 핵감염과 같은, 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 숙주세포에 도입될 수 있다. 추가 구현예에서, 서로 다른 발현 벡터의 혼합물이 면역 이펙터 세포의 공여체 집단을 유전자 변형하는 데 사용될 수 있으며, 각각의 벡터는 서로 다른 CAR, TCR, 또는 다른 관심 단백질을 암호화한다. 이렇게 얻어진 형질전환된 면역 이펙터 세포는 둘 이상의 서로 다른 CAR, TCR, 및/또는 다른 관심 단백질을 발현하는 조작된 세포의 비율로, 조작된 세포의 혼합된 집단을 형성한다.
이상사례를 최소화하기 위해, 세포자멸사의 활성화에 유리하거나 세포 증식을 억제하는 기능적 활성 독성 생성물을 유도하는 효소를 암호화함으로써 전구약물 투여시 변형 세포의 선택적 제거를 가능하게 하는 자살 유전자가 또한 포함된다. 유도성 "온" 또는 "가속기" 스위치가 또한 포함될 수 있다. 적합한 기법은 세포가 CAR 또는 TCR 작제물로 형질감염되기 전이나 후에, 또는 그와 동시에 유도성 카스파제-9(미국 공개 출원 2011/0286980) 또는 티미딘 키나제를 사용하는 것을 포함한다. 자살 유전자 및/또는 "온" 스위치를 도입하기 위한 추가적인 방법은 TALENS, 징크 핑거, RNAi, siRNA, shRNA, 안티센스 기술, 및 당업계에 알려진 다른 기법을 포함한다.
면역세포는 유전자 변형되기 전에 시험관 내에서 활성화되고 증식(또는 원세포의 경우 분화)될 수 있다. T세포를 활성화하고 증식시키는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 6,905,874호; 미국 특허 6,867,041호; 미국 특허 6,797,514호; 및 PCT WO2012/079000에 기재되어 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 Il-2와 같은 적절한 사이토카인이 있는 배양 배지에서 PBMC 또는 단리된 T세포를 일반적으로 비드 또는 다른 표면에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체와 같은 자극제 및 공동자극제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체 "대체" 항원 제시 세포(APC)로서 작용한다. 일례는 인간 T세포의 생리학적 활성화를 위한 CD3/CD28 활성제/자극제 시스템인 Dynabeads® 시스템이다.
다른 구현예에서, T세포는 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,040,177호; 미국 특허 5,827,642호; 및 WO2012129514에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 영양 세포 및 적절한 항체 및 사이토카인에 의해 증식되도록 활성화되고 자극될 수 있다.
PBMC는 NK세포, NKT세포, 또는 조혈 줄기세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 키메라 수용체의 암호화 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여체 T세포, NK세포, NKT세포, 단핵구, 또는 조혈 줄기세포의 집단에 도입될 수 있다.
CAR 또는 TCT를 발현하는 세포를 인간 대상체에서 사용하기 위해 저장 및/또는 제조하기 위한 동결보존을 위해 표준 절차가 사용된다. 이는 해동시 세포가 생존을 유지하도록 면역세포를 동결보존하는 것을 수반한다. CAR을 발현하는 면역세포의 분획은 악성종양을 앓고 있는 환자의 향후 치료를 위해 이러한 세포의 영구적 공급원을 제공하도록 당업계에 알려진 방법에 의해 동결보존될 수 있다. 필요한 경우, 동결보존된 형질전환 면역세포는 더 많은 이러한 세포를 위해 해동되고 성장되고 증식될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "동결보존"은 0도 미만의 온도, 예컨대 (일반적으로) 77 켈빈 온도 또는 -196℃로 냉각하여 세포를 보존하는 것을 의미한다. 보존되는 세포가 저온에서의 냉동 또는 실온으로의 가온으로 인해 손상되는 것을 방지하기 위해 0도 미만의 온도에서 동결보존제가 종종 사용된다. 동결보존제 및 최적의 냉각 속도는 세포 손상으로부터 보호할 수 있으며 당업계에 알려져 있다. 동결보존제는 디메틸 설폭사이드(DMSO)(Lovelock & Bishop, Nature (1959); 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature (1961); 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘(Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1960); 85: 576), 및 폴리에틸렌 글리콜(Sloviter & Ravdin, Nature (1962); 196: 48)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이어서, 세포는 대상체에게 재도입하기 위해 제형화된다. 세포는 먼저 배양 배지로부터 세포를 채취한 후, 배지 및 치료 유효량의 투여에 적합한 용기 시스템("제약상 허용되는" 담체)에서 세포를 세척하고 농축하여 제형화된다. 적합한 주입 배지는 임의의 등장성 배지 제형, 일반적으로 생리식염수, NormosolTM R(Abbott) 또는 Plasma-LyteTM A(Baxter)일 수 있지만, 물 중의 5% 덱스트로스 또는 링거 락테이트도 사용될 수 있다. 주입 배지는 인간 혈청 알부민으로 보충될 수 있다.
조성물 중의 세포의 목적하는 치료량은 일반적으로 적어도 2가지 세포(예를 들어, 적어도 하나의 CD8+ 중심 기억 T세포 및 적어도 하나의 CD4+ 헬퍼 T세포 하위세트)이거나, 더 일반적으로는 102개 초과의 세포, 최대 106개의 세포, 최대 108개 또는 109개 이상의 세포이며, 1010개 초과의 세포일 수 있다. 세포의 수는 조성물의 목적하는 용도 및 조성물에 포함된 세포의 유형에 따라 달라진다. 세포는 치료를 받고 있는 환자에 대해 자가유래성, 동종이계, 또는 이종성일 수 있다.
세포 집단을 발현하는 CAR, TCR, 및/또는 다른 관심 단백질은 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 IL-2와 같은 다른 성분 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합된 제약 조성물로서 투여될 수 있다.
병태, 질환, 또는 장애를 치료하기 위한 조작된 세포의 사용 방법이 제공된다. 이러한 병태, 질환, 또는 장애는 암, 종양, 고형 종양, 혈액 장애, 백혈병, 림프종, 바이러스 감염, 염증성 질환 또는 장애, 및/또는 자가면역 질환 또는 장애를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 T세포 매개 면역 반응을 생성하는 것에 관한 것으로서, 본 출원의 조작된 면역세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T세포 매개 면역 반응은 표적 세포 또는 세포들에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역세포는 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR), T세포 수용체(TCR), 및/또는 다른 관심 단백질을 발현하는 유전자 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 일부 양태에서, 본 발명은 악성종양의 치료 또는 예방 방법을 포함하며, 상기 방법은 악성종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 적어도 하나의 단리된 항원 결합 분자의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 악성종양의 치료 또는 예방 방법을 포함하며, 상기 방법은 악성종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 적어도 하나의 면역세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 면역세포는 본원에 기재된 적어도 하나의 키메라 항원 수용체, T세포 수용체, 및/또는 단리된 항원 결합 분자를 암호화하는 유전자 작제물을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 염증성 및/또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 이식된 조직/기관 상의 불일치 HLA 분자에 대한 세포 요법과 같은 이식 절차를 지원하는 방법의 사용을 제공한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 췌장섬이다.
일 구현예에서, 본 발명은 비바이러스성 유전자 변형 세포를 생성하는 방법으로서, (a) 피기백 트랜스포사제의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 마련하는 단계; (b) 공여체 또는 대상체로부터 천연 면역세포를 단리하는 단계; (b) 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로 세포를 공동 형질감염시키는 단계; 및 (c) 세포 배양에 의해 세포를 더 많은 비바이러스성 유전자 변형 세포 집단으로 증식시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로, 그리고 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 비바이러스성 유전자 변형 세포로 대상체를 치료하는 방법으로서, (a) 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작하여 벡터에 삽입하는 단계; (b) 대상체 또는 공여체로부터 천연 면역세포를 단리하는 단계; (c) 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킨된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로 세포를 공동 형질감염시키는 단계; (d) 세포 배양에 의해 세포를 더 많은 유전자 변형 세포 집단으로 증식시키는 단계; (e) 형질전환된 세포를 세포 배양물에서 단리하여 유전자 변형 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계; 및 (f) 비바이러스성 유전자 변형 세포를 대상체에게 재도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11, 서열번호 13, 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 13의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
일 구현예에서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 피기백 트랜스포사제는 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제가 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제를 제공한다.
관련 구현예에서, 천연 면역세포는 단핵세포이다. 관련 구현예에서, 천연 면역세포는 T세포이다. 다른 구현예에서, 관심 단백질은 항원 수용체, T세포 수용체, 또는 키메라 항원 수용체이다. 다른 구현예에서, 세포는 자살 유전자 또는 유도성 온 또는 가속기 스위치, 또는 둘 다를 암호화하는 핵산 분자로도 형질감염된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자가 제공된다.
일 구현예에서, 천연 면역세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포사제의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된다.
일 구현예에서, 천연 면역세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포사제의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염된다.
일 구현예에서, 벡터는 여러 관심 단백질을 암호화하는 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 작제물을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 비바이러스성 유전자 변형 세포, 세포 집단, 또는 세포 배양물을 제공한다. 또한, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 유전자 변형 세포 또는 세포 집단을 포함하는 제형이 제공된다.
또한, 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 공여체 또는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 유전자 변형 세포 또는 세포 집단의 유효량을 공여체 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 단리되고 정제된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본 출원에서 사용된 용어는 당업계의 표준이지만, 청구범위의 의미에 대한 명료성과 명확성을 보장하기 위해 특정 용어의 정의가 본원에서 제공된다. 단위, 접두사, 및 기호는 SI 허용 형식으로 표시될 수 있다. 본원에서 언급된 수치 범위는 범위를 한정하는 수치를 포함하며, 한정된 범위 내의 각각의 정수를 포함하고 뒷받침한다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법 및 기법은 달리 명시되지 않는 한, 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)] 참조. 특허 출원, 소논문, 서적, 및 논문을 포함하되 이에 한정되지 않는, 본 출원에서 인용되는 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 명백히 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 한 양태 또는 구현예에 기재된 것은 본 발명의 다른 양태 및/또는 구현예와 조합될 수 있다.
본 발명의 개별 양태의 단일 예시로서 의도된 본원에 기재된 특정 구현예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 구성요소는 본 발명의 범위에 속한다. 실제로, 본원에 나타내고 설명된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형예가 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변형예는 첨부된 청구범위의 범위에 속하는 것이다.
실시예
실시예 1 돌연변이 확인 및 시험
피기백 트랜스포사제 및 다른 관련 트랜스포사제의 구조는 아직 알려지지 않았다. 본 발명자들은 DSC라는 인실리코(in silico) 방법(King, RD et al., Protein Sci. 5(11): 2298-2310, 1996)을 이용해 야생형 Trichoplusia ni 피기백 트랜스포사제(서열번호 2)의 2차 구조 모티프를 예측했다. 도 1 참조. 본 발명자들은 피기백 트랜스포사제가 대부분 알파 나선 단백질임을 확인하였다. 본 발명자들은 트랜스포사제의 전반적인 안정성을 향상시켜 트랜스포사제의 발현에 긍정적인 영향을 줄 수 있는 알파 나선을 안정화시킬 수 있는 돌연변이를 고안했다. 본 발명자들은 피기백 트랜스포사제의 알파 나선의 안정성을 향상시키도록 잠재적으로 돌연변이될 수 있는 잔기로서 I147, I176, I221, I247을 확인하였다.
본 발명자들은 또한 트랜스포사제 서열에서 추정 N-연결 글리코실화 부위(즉, NXS/T 모티프)를 확인하였다. 일반적으로 NXT 모티프는 NXS 모티프에 비해 더 완전한 글리코실화를 거치므로, 본 발명자들은 NXS 모티프를 NXT 모티프로 돌연변이시키면 피기백에서의 전반적인 글리코실화가 개선되어 트랜스포사제의 안정성이 향상될 수 있다는 가설을 세웠다. N-연결 글리코실화 부위인 N427ES, N531IS, 및 N571AS에서, Ser에서 Thr로의 돌연변이를 고안하였다. N531IS 부위는 소수성 스트레치로 존재하므로, 개선된 글리코실화시 가장 큰 안정성 향상을 제공할 수 있다. 피기백 트랜스포사제가 글리코실화되는지 또는 활성화에 필요한지는 현재 알려지지 않았다.
야생형 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 하나의 핵산 서열 및 단일, 이중, 또는 삼중 돌연변이를 암호화하는 핵산 서열을 가진 7개의 트랜스포사제를 포함한 총 8개의 플라스미드를 생성하였다(표 3 참조). 복제된 트랜스포사제 플라스미드는 돌연변이된 서열을 제외하고 동일한 DNA 코돈을 공유했다. 트랜스포사제 플라스미드를 세포주로 형질전환하고, 콜로니를 선택하여 스케일업하고 서열을 확인하였다.
서열번호 돌연변이
DNA 단백질
1 2 WT Trichoplusia ni피기백 트랜스포사제
3 4 I147L 이소류신에서 류신으로
5 6 I247L 이소류신에서 류신으로
7 8 S533T 세린에서 트레오닌으로
9 10 LLT (I247L I147L S533T)
11 12 ILT (I247 I147L S533T)
13 14 LIT (I247L I147 S533T)
15 16 LLS (I247L I147L S533)
4개의 관심 단백질, 즉 2개의 단클론 항체(AB1 및 AB2), 1개의 융합 단백질, 및 1개의 이중특이적 T세포 관여자를 시험하였다. 관심 단백질을 암호화하는 각각의 유전자를 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소를 포함하는 개별 플라스미드로 복제하였다. 이 4개의 플라스미드를 스케일업하고 서열을 확인하였다.
4개의 단백질 중 하나를 암호화하는 유전자를 포함하는 원형 플라스미드 중 하나와 함께 원형 돌연변이 트랜스포사제 플라스미드를 전기천공을 이용해 글루타민 신타제 녹아웃 CHO 세포에 공동 형질주입하였다. 트랜스포사제 대 관심 단백질 플라스미드의 비는 1:4였다. 글루타민이 없는 선택적 배지로 변경하기 전에, 세포를 36℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 글루타민이 보충된 배지에서 회복시켰다. 90% 초과의 생존율로 회복될 때까지 36℃ 및 5% CO2의 선택적 배지에서 세포를 3~4일마다 계대 배양하였다.
안정한 세포주로부터 발현된 단백질의 발현을 평가하기 위해 24-딥웰 플레이트에서 유가식 생산을 실시하였다. 글루타민이 없는 기본 생산 배지에 1x106개 세포/mL로 배양물을 접종하고, 3일, 6일, 및 8일차에 추가 영양소를 공급하였다. 배양물을 10일차에 채취하고 상청액을 역가에 대해 분석하였다.
단백질 A가 20 ug의 표적 로드로 컬럼 지지체에 고정된 친화성 UPLC 크로마토그래피로 역가를 측정하였다. 중성 pH에서, 시험 샘플의 단백질은 Fc 영역을 통해 단백질 A에 결합한 반면, 숙주세포 단백질, 조절된 배지 성분, 및 버퍼는 관류식으로 컬럼으로부터 용리되었다. 포획된 단백질을 산성 pH 1.9 1X DPBS에서 용리시키고 280 nm에서의 UV 흡광도로 검출하였다. 선형 회귀 분석을 이용해 범용 항체 표준 및 상응하는 피크 면적으로부터 보정 곡선을 도출하였다. 이어서, 보정 곡선 및 범용 항체 표준과 시험 샘플의 흡광 계수비로부터 시험 샘플 중의 단백질 농도를 계산하였다.
돌연변이된 트랜스포사제의 사용은 시험된 단클론 항체 및 융합 단백질의 경우 WT 트랜스포사제 또는 트랜스포사제가 없는 대조군에 대해 개선되거나 유사한 역가를 나타냈다. 이중특이적 T세포 관여자는 대체로 단클론 항체보다 낮은 역가를 나타내며, 또한 이 시스템에 사용되었을 때 대체로 높은 수준으로 발현되지 않았다. 이 특정 분자의 경우, 발현 병목 현상은 전사 또는 유전자 통합 부위와 관련이 없으며 오히려 단백질 분비 병목 현상이 관련이 있을 수 있다. 다른 이중특이적 T세포 관여자는 발현에서 동일한 자극이 없다면 다른 결과를 나타낼 수 있으므로, 이중특이적 T세포 관여자 분자를 갖는 다른 스캐폴드를 사용하면 더 나은 역가가 발생할 가능성이 높다.
실시예 2 MSX의 첨가에 따른 GS KO 숙주세포에서 이중 및 삼중 트랜스포사제 돌연변이의 발현
글루타민 신타제 녹아웃 CHO 세포(GSKO 세포)를 전기천공(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용해 1) 이중 돌연변이 "ILT" DNA 피기백 트랜스포사제(ITR, 서열번호 11), 2) 삼중 돌연변이 "LLT", DNA 피기백 트랜스포사제(LLT, 서열번호 9), 및 3) 피기백 트랜스포사제 부재(없음)를 암호화하는 원형 플라스미드로(이들 모두 관심 유전자 및 Trichoplusia ni 피기백 트랜스포존의 5' 및 3' 역위 반복 요소를 포함하는 원형 플라스미드와 조합됨) 형질감염시켰다. 3개의 관심 유전자, 즉 이중특이적 T세포 관여자 헤테로Fc, IgG-scFv, 및 단클론 항체(mAb)를 시험하였다.
메티오닌 설폭시민(MSX)(EDM Millipore, Burlington, MA) 25 μM을, 형질감염 3일 후(25), 초기 풀을 90% 초과의 생존율로 회복시킨 후(0-25) 첨가하거나, 전혀 첨가하지 않았다(0). 글루타민 합성효소의 억제제인 메티오닌 설폭시민(MSX)의 첨가는 GSKO CHO 세포주에서 관심 유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용된다.
MSX 처리된 세포가 회수되면, 안정한 세포주로부터 발현된 단백질의 발현을 평가하기 위해 24-딥웰 플레이트 또는 스핀 튜브에서 소규모 유가식 생산을 실시하였다. 글루타민이 없는 기본 생산 배지에 1x106개 세포/mL로 배양물을 접종하고, 3일, 6일, 및 8일차에 추가 영양소를 공급하였다. 배양물을 10일차에 채취하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 상청액을 역가에 대해 분석하였다.
돌연변이 트랜스포사제(ILT 또는 LLT)로 형질감염된 풀은 MSX 처치를 받지 않은 트랜스포사제 풀(0 μM MSX)에 비해 발현의 증가를 나타냈다. 트랜스포사제가 첨가되지 않은(없음) 풀의 경우, MSX를 첨가해도 발현이 증가하지 않았다.
트랜스포존은 게놈에서의 활성 전사 영역인 개방 염색질을 표적화하는 반표적(semi-targeted) 형질감염 메커니즘을 부여한다. 트랜스포존이 트랜스포사제와 함께 통합되는 경우, 트랜스포존의 5' 및 3' 역위 반복 요소 사이의 전체 벡터 서열이 통합된다. 트랜스포사제 없이 트랜스포존을 형질감염시키면 염색체에 무작위로 통합되고, 결과적으로 트랜스포존의 5' 및 3' 역위 반복 요소 사이의 전체 벡터 서열이 활성 부위에 통합되지 않을 수 있다. 또한, 트랜스포사제가 없으면, 완전한 통합이 보장되지 않으므로, 관심 유전자와 선별 마커(이 경우 글루타민 신타제) 사이의 연결이 끊어질 수 있으며, 이러한 MSX는 관심 유전자의 발현에 영향을 미치지 않을 것이다.
시험된 벡터 시스템의 맥락에서, 조작된 트랜스포사제는 트랜스포사제가 없는 대조군과 비교하여 MSX의 첨가 유무에 관계없이 발현을 증가시키는 추가 이점을 갖는다(도 5). 피기백으로부터 증가된 카피 수는 MSX를 통한 개선된 선별에 기여할 수도 있다.
실시예 3 DNA 또는 mRNA 피기백 트랜스포사제에 의한 형질감염
관심 유전자의 통합에 사용되는 트랜스포사제는 DNA 또는 mRNA 기반일 수 있다. DNA 전사된 트랜스포사제의 사용에 대한 한 가지 관심사는 트랜스포사제 유전자가 게놈에 통합될 가능성이며, 이는 형질감염된 세포주에서 트랜스포사제의 활성 전사/번역을 발생시킬 수 있다. 이는 잠재적인 암호화된 트랜스포사제 인식 부위에서의 트랜스포사제 활성로 인해 게놈 불안정성을 초래할 가능성이 있다. 형질감염을 위해 mRNA를 사용하면 게놈에 통합되지 않으므로 대안이 된다.
야생형 염기를 사용한 비변형 mRNA, 뿐만 아니라 슈도-U 및 5-메틸-C 캡핑의 25% 치환을 갖는 변형된 합성 mRNA 전사체를 이중 돌연변이 "ILT", 및 삼중 돌연변이 "LLT", 피기백 트랜스포사제에 대해 제조하였다.
형질감염으로부터 mRNA 번역-트랜스포사제를 평가하기 위해 두 세트의 실험을 수행하였다. 첫 번째 실험에서는, 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이(ILT, 서열번호 17) 및 삼중 돌연변이(LLT, 서열번호 18)에 대한 mRNA 전사체를 시험하였다. 두 번째 실험에서는, mRNA 전사체 외에도, 슈도-U 및 5-메틸-C 캡핑의 25% 치환을 갖는 이중 돌연변이 "ILT"에 대한 합성 mRNA 전사체를 시험하였다.
단클론 항체를 암호화하는 유전자 및 Trichoplusia ni 피기백 트랜스포존의 5' 및 3' 역위 반복 요소를 포함하는 원형 플라스미드와 함께 mRNA 및 합성 mRNA 전사체를 전기천공 또는 지질-기반 형질감염 방법을 이용해 GSKO 세포주에 형질감염시켰다.
전기천공의 경우, 동일한 중량의 선형화 트랜스포사제와 트랜스포존 벡터 DNA를 큐벳의 배지에 현탁된 2 x 107개 세포에 첨가하였다. DNA 세포 혼합물은 Bio-Rad 전기천공기(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 전기천공되었다. 이어서, 전기천공된 세포를 따뜻한 성장 배지에 첨가하고 37℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션한 후, 세포를 선택적 배지에 재현탁시켜 안정한 풀을 마련하였다. 지질 형질감염의 경우, 사용된 시약은 리포펙타민 LTX(Gibco/ThermoFisher, Waltham, MA)이었다. 형질감염 전날, 세포를 1e6개 세포/mL로 접종하고 현탁액에서 진탕하였다. 형질감염 당일, 세포를 형질감염 배지에서 6웰 플레이트에 접종하였다. Mab DNA/트랜스포사제/리포펙타민 LTX 복합체를 제조하고 인큐베이션하였다. 이어서, 복합체를 세포에 첨가하고 5~8시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 성장 배지를 첨가하고, 세포를 2~3일 동안 회복시켰다. 스티킹(sticking)이 있는 경우 트립신을 사용하여 세포를 탈리시키고, 세포를 원심분리하고 선택적 배지에 재현탁시켜 안정한 풀을 마련하였다.
mRNA 형질감염을 대조군 조건, 즉 트랜스포사제를 암호화하는 상응하는 DNA로 형질감염된 GSKO 세포주와 비교하였다. 단클론 항체를 포함하는 Trichoplusia ni 피기백 트랜스포존의 5' 및 3' 역위 말단 반복 요소를 포함하는 원형 플라스미드와 함께, 이중 돌연변이(ILT, 서열번호 11) 또는 삼중 돌연변이(LLT, 서열번호 9)를 암호화하는 DNA를 포함하는 원형 플라스미드를 mRNA와 동일한 조건에서 형질주입하였다.
최적 조건에 대해 시험하기 위해 mRNA 및 DNA 트랜스포사제의 양, 관심 유전자, 관심 유전자 DNA 또는 RNA 대 트랜스포사제의 비, 및 형질감염된 세포의 수를 변화시켰다(표 4).
전기천공 및 리포펙션에 대한 조건.
트랜스포사제 Mab DNA (μg) 트랜스포사제 DNA 또는 mRNA (μg) Mab 대 트랜스포사제의 비
실험 1 전기천공 2e7개 숙주세포
DNA 대조군 20 5 4:1
없음 20 0
mRNA 20 5 4:1
mRNA 20 10 2:1
mRNA 20 20 1:1
mRNA 14 100 1:7
mRNA 28 200 1:7
실험 2 리포펙타민 LXT 1.2e6개 숙주세포
DNA 대조군 2 0.5 4:1
DNA 대조군 2 2 1:1
DNA 대조군 4 4 1:1
mRNA 2 0.5 4:1
mRNA 2 2 1:1
mRNA 4 4 1:1
실험 3 전기천공 2e7개 숙주세포
DNA 대조군 30 15 2:1
mRNA 30 15 2:1
합성 mRNA 30 15 2:1
글루타민이 없는 선택적 배지로 변경하기 전에, 형질감염된 세포를 36℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 글루타민이 보충된 배지에서 회복시켰다. 90% 초과의 생존율로 회복될 때까지 36℃ 및 5% CO2의 선택적 배지에서 세포를 3~4일마다 계대 배양하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 역가에 대해 분석하였다.
mRNA에 의한 형질감염은 전기천공-기반 또는 지질-기반 형질감염 방법을 이용하여, 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT"에 대한 DNA를 사용한 형질감염과 유사한 발현 수준을 달성하였다. 도 6은 전기천공 또는 지질-기반 방법을 이용해 이중 돌연변이 "ILT", 트랜스포사제 DNA 또는 mRNA로 형질감염된 세포로부터의 단클론 항체의 발현 수준을 보여준다. 도 6a는 전기천공을 이용한 형질감염 결과를 보여준다. mRNA의 양이 증가함에 따라 DNA 대조군에 비해 발현이 개선되었다. 삼중 돌연변이 "LLT"도 유사한 결과를 나타냈지만 데이터는 표시하지 않았다. 도 6b는 지질-기반 방법을 이용한 형질감염 결과를 보여준다. 단클론 항체의 발현 수준은 DNA 대조군에 비해 더 우수하거나 적어도 비슷했다.
mRNA 합성 버전의 결과를 전기천공을 이용한 mRNA와 비교하였다. 두 버전 모두 트랜스포사제로 형질감염되지 않은(-) 대조군보다 더 높은 발현을 나타냈다.
도 7은 전기천공으로부터의 이중 돌연변이 트랜스포사제 "ILT" DNA 및 두 mRNA 형질감염된 풀의 발현과 관련된 단클론 항체의 발현 수준을 보여준다. 합성 mRNA 및 mRNA 형질감염된 풀은 DNA-기반 트랜스포사제 풀과 유사한 역가를 나타냈고, 트랜스포사제 부재 대조군 풀보다 높은 역가를 나타냈다.
게놈 DNA 수준에서 트랜스포사제 유전자의 통합에 대한 분석.
게놈 DNA 수준에서 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" 및 삼중 돌연변이 "LLT" 유전자의 통합도 분석되었다. 트랜스포사제 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 대한 올리고 프라이머를 사용해 약 1.7 kb의 단편을 증폭하여 트랜스포사제가 존재하는지 확인하였다. mRNA 또는 DNA로 형질감염된 회복된 세포주로부터 1e7개의 세포에서 수집된 세포 펠릿으로부터 혈액 및 세포 배양 DNA Maxi 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA가 양성 대조군으로서 포함되었다. NanoDrop 분광광도계(ThermoFisher, Waltham, MA)를 사용하여 260/280 흡광도 비율로 게놈 DNA를 정량화하고 품질을 확인하였다(1.8 이상은 우수한 품질임). ProFlex PCR 시스템(Life Technologies, Carlsburg, CA)에서 New England Biolabs(Ipswich, MA)의 Q5 High Fidelity Polymerase를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 시각화를 위해 아가로스 겔에서 반응을 실행하였다.
cDNA 수준에서 트랜스포사제 유전자의 통합에 대한 분석
전사체 수준에서 피기백 트랜스포사제 이중 돌연변이 "ILT" 유전자의 통합도 분석되었다. 상기 올리고 프라이머를 다시 사용해 약 1.7 kb의 단편을 증폭하여 트랜스포사제 전사체가 세포에 존재하는지 확인하였다. mRNA 또는 DNA 트랜스포사제를 첨가하여 형질감염된 회복된 세포주로부터 1e7개의 세포에서 수집된 세포 펠릿으로부터 RNeasy 미니키트(Qiagen)를 사용하여 mRNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA가 대조군으로서 포함되었다. NanoDrop 분광광도계를 사용하여 260/280 흡광도 비율로 mRNA를 정량화하고 품질을 확인하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라, cDNA 합성을 수행하는 Platinum Taq High Fidelity DNA Polymerase(ThermoFisher) 및 ProFlex PCR 시스템(Life Technologies)에서의 표적 서열(즉, 트랜스포사제)의 후속 증폭이 포함된 SuperScript III One-Step RT-PCR 시스템을 사용하여 전사체 수준에서 트랜스포사제를 확인하였다. 시각화를 위해 아가로스 겔에서 반응을 실행하였다.
DNA 및 mRNA 형질감염된 세포주 풀을 게놈 및 전사체 수준 모두에서 통합에 대해 확인하였다(도 8). 약 1.7 kb 밴드의 존재는 세포주의 게놈에 트랜스포사제가 존재함을 나타냈다(도 8a). 이중 돌연변이 "ILT", DNA 트랜스포사제로 형질감염된 모든 풀 세포주는 전사체 수준에서 통합된 반면, mRNA로 형질감염된 것들은 게놈 또는 전사체 수준에서 통합되지 않았다(도 8b).
카피 수에 대한 ddPCR 분석
카피 수를 분석하기 위해, DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen)를 사용하여 각각의 클론 및 풀에 대해 5x106개의 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라, 프로브용 ddPCR Supermix(dUTP 없음) 키트(Bio-Rad)를 사용하여 디지털 액적 PCR을 수행하였다. 각 반응에는 1 단위의 HindIII, 10 ng의 주형 DNA, 900 nm 정방향 및 역방향 프라이머, 및 표적 이중 돌연변이 "ILT" 암호화 서열 및 내인성 CHO 참조 유전자 Gcg에 대해 설계된 250 nm의 형광 프로브가 포함되었다. AutoDG 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 액적을 생성하고, 95℃에서 10분에 이어, 30초 동안 94℃, 1분 동안 60℃, 이어 10분 동안 98℃의 40 사이클의 열사이클 조건으로 ProFlex PCR 시스템(Life Technologies)에서 PCR 증폭을 수행하였다. QX200 액적 판독기 시스템(Bio-Rad)에서 액적을 판독하고, Quantasoft 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 카피 수 데이터 분석을 수행하였다.
풀 내의 모든 클론에 트랜스포사제가 통합되었는지 확인하기 위해, DNA 트랜스포사제로 형질감염된 풀을 단일 세포 클로닝하고 게놈 DNA(gDNA) 수준에서 통합에 대해 확인하였다. 또한 ddPCR을 사용하여 풀 및 클론을 트랜스포사제의 카피 수에 대해 분석하였다.
풀은 카피 수가 적었고, 트랜스포사제가 통합되지 않은 클론을 포함했다. 전술한 바와 같이 PCR 기반 방법을 사용하여 클론을 스크리닝하여 트랜스포사제 통합이 없는 클론을 확인하였다. 트랜스포사제가 통합되지 않은 클론이 풀 집단에 존재하였다(도 9).
실시예 4 피기백 트랜스포사제를 사용한 TCR-T세포의 생성
이중 돌연변이된 피기백 트랜스포사제 "ILT"를 사용하여, T세포 수용체(TCR)를 발현하도록 1차 T세포를 성공적으로 변형시켰다(도 10의 A). 피기백으로 생성된 TCR-T세포는 표적의 강력한 사멸뿐만 아니라 항원-특이적 증식을 나타냈다(도 10의 B 및 C).
Ficoll-Paque(GE Healthcare, Chicago, IL) 분리를 통해 건강한 공여체 류코팩으로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 먼저 단리하고, 이어서 EasySep 인간 T세포 단리 키트(Stemcell Technologies, Vancouver, Canada)를 사용하여 PBMC로부터 T세포를 단리하였다. 이어서, T세포를 활성화하고 활성화 2일 후, 4-D Nucleofector 시스템(Lonza, Greenwood, SC)을 사용하여 T세포를, TCR-IRES-EGFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 피기백 트랜스포존의 5' 및 3' 역위 말단 반복 요소를 포함하는 플라스미드 및 이중 돌연변이 "ILT" 트랜스포사제를 암호화하는 mRNA(서열번호 18)로 공동으로 전기천공하였다. 2~3일마다 IL2 사이토카인을 세포에 보충하였다.
TCR 통합의 확인
활성화 후 7일째에, TCR을 인식하는 덱스트라머 항체(Immudex, Copenhagen, Denmark)뿐만 아니라 CD3, CD4, 및 CD8 형광단-결합 항체(Biolegend, San Diego, CA)로 세포를 표면 염색하여 T세포를 TCR 발현 및 세포 표현형에 대해 평가하였다. 샘플을 BD LSRII 유세포 분석기에 적용하여 발현에 대해 분석하였다.
기능 분석
활성화 후 9~14일째에 기능 분석을 위해 T세포를 계수하고 수집하였다.
세포 용해 및 증식 분석
1E5 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)으로 염색된 T세포를 96웰 U자형 바닥 플레이트의 150 μL 배지에서 5e4개의 표적 세포와 함께 5일 동안 공동 인큐베이션하였다. CellTrace Violet 희석을 통해 표적 세포 용해 및 T세포 증식을 평가하고 BD LSRFortessa 유세포 분석기(Liberty Lake, WA)에 샘플을 적용하여 정량화하였다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> Mutated piggyBac Transposases <130> IPA210737-US <150> US 62/777,325 <151> 2018-12-10 <150> US 62/925,516 <151> 2019-10-24 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1786 <212> DNA <213> Trichoplusia ni <400> 1 atgggctcta gcctggacga cgagcacatc ctgagcgccc tgctgcagag cgacgacgaa 60 ctggtgggcg aggacagcga cagcgagatc agcgaccacg tgtccgagga cgacgtgcag 120 tccgacaccg aggaagcctt catcgacgag gtgcacgaag tgcagcctac cagcagcggc 180 tccgagatcc tggacgagca gaacgtgatc gagcagcctg gcagctccct ggccagcaac 240 agaatcctga ccctgcccca gagaaccatc agaggcaaga acaagcactg ctggtccacc 300 tccaagagca ccaggcggag cagagtgtcc gccctgaaca tcgtgcggag ccagaggggc 360 cccaccagaa tgtgcagaaa catctacgac cccctgctgt gcttcaagct gttcttcacc 420 gacgagatca tcagcgagat cgtgaagtgg accaacgccg agatcagcct gaagaggcgg 480 gagagcatga ccggcgccac cttcagagac accaacgagg acgagatcta cgccttcttc 540 ggcatcctgg tgatgaccgc cgtgagaaag gacaaccaca tgagcaccga cgacctgttc 600 gacagatccc tgagcatggt gtacgtgtcc gtgatgagca 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ggaacaagca tgttctgctt cgacggcccc 1200 ctgaccctgg tgtcctacaa gcccaagccc gccaagatgg tgtacctgct gtccagctgc 1260 gacgaggacg ccagcatcaa cgagagcacc ggcaagcccc agatggtgat gtactacaac 1320 cagaccaagg gcggcgtgga caccctggac cagatgtgca gcgtgatgac ctgcagcaga 1380 aagaccaaca gatggcccat ggccctgctg tacggcatga tcaatatcgc ctgcatcaac 1440 agcttcatca tctacagcca caacgtgtcc agcaagggcg agaaggtgca gagccggaag 1500 aaattcatgc ggaacctgta catgagcctg acctccagct tcatgagaaa gagactggaa 1560 gcccccaccc tgaagagata cctgcgggac aacatcagca acatcctgcc caacgaagtg 1620 ccaggaacaa gcgacgacag caccgaggaa cccgtgatga agaagaggac ctactgcacc 1680 tactgtccca gcaagatcag aagaaaggcc aacgccagct gcaagaaatg caaaaaagtg 1740 atctgccggg agcacaacat cgacatgtgc cagagctgtt tctagc 1786 <210> 16 <211> 594 <212> PRT <213> Trichoplusia ni <400> 16 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe 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255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe <210> 17 <211> 1786 <212> RNA <213> Trichoplusia ni <400> 17 augggcucua gccuggacga cgagcacauc cugagcgccc ugcugcagag cgacgacgaa 60 cuggugggcg aggacagcga cagcgagauc agcgaccacg uguccgagga cgacgugcag 120 uccgacaccg aggaagccuu caucgacgag gugcacgaag ugcagccuac cagcagcggc 180 uccgagaucc uggacgagca gaacgugauc gagcagccug gcagcucccu ggccagcaac 240 agaauccuga cccugcccca gagaaccauc agaggcaaga acaagcacug cugguccacc 300 uccaagagca ccaggcggag cagagugucc gcccugaaca ucgugcggag ccagaggggc 360 cccaccagaa ugugcagaaa caucuacgac ccccugcugu gcuucaagcu guucuucacc 420 gacgagauca ucagcgagau cgugaagugg accaacgccg agaucagccu gaagaggcgg 480 gagagcauga ccggcgccac cuucagagac accaacgagg acgagaucua cgccuucuuc 540 ggcauccugg ugaugaccgc cgugagaaag gacaaccaca ugagcaccga cgaccuguuc 600 gacagauccc ugagcauggu guacgugucc gugaugagca gagacagauu cgacuuccug 660 aucagaugcc ugagaaugga cgacaagagc aucagaccca cccugcggga gaacgacgug 720 uucacccccg ugcggaagcu gugggaccug uucauccacc agugcaucca gaacuacacc 780 ccuggcgccc accugaccau cgaugagcag cugcugggcu ucagaggcag augccccuuc 840 agaauguaca uccccaacaa gcccagcaag uacggcauca agauccugau gaugugcgac 900 agcggcacca aguacaugau caacggcaug cccuaccugg gcagaggcac ccagacaaac 960 ggcgugcccc ugggcgagua cuacgugaaa gaacugagca agccugugca uggcagcugc 1020 aggaacauca ccugcgacaa cugguucacc agcauccccc uggccaagaa ccugcugcag 1080 gaacccuaca agcugaccau cgugggcacc gugcggagca acaagcggga gaucccagag 1140 gugcugaaga acagcagauc cagaccugug ggaacaagca uguucugcuu cgacggcccc 1200 cugacccugg uguccuacaa gcccaagccc gccaagaugg uguaccugcu guccagcugc 1260 gacgaggacg ccagcaucaa cgagagcacc ggcaagcccc agauggugau guacuacaac 1320 cagaccaagg gcggcgugga cacccuggac cagaugugca gcgugaugac cugcagcaga 1380 aagaccaaca gauggcccau ggcccugcug uacggcauga ucaauaucgc cugcaucaac 1440 agcuucauca ucuacagcca caacgugucc agcaagggcg agaaggugca gagccggaag 1500 aaauucaugc ggaaccugua caugagccug accuccagcu ucaugagaaa gagacuggaa 1560 gcccccaccc ugaagagaua ccugcgggac aacaucacca acauccugcc caacgaagug 1620 ccaggaacaa gcgacgacag caccgaggaa cccgugauga agaagaggac cuacugcacc 1680 uacuguccca gcaagaucag aagaaaggcc aacgccagcu gcaagaaaug caaaaaagug 1740 aucugccggg agcacaacau cgacaugugc cagagcuguu ucuagc 1786 <210> 18 <211> 1786 <212> RNA <213> Trichoplusia ni <400> 18 augggcucua gccuggacga cgagcacauc cugagcgccc ugcugcagag cgacgacgaa 60 cuggugggcg aggacagcga cagcgagauc agcgaccacg uguccgagga cgacgugcag 120 uccgacaccg aggaagccuu caucgacgag gugcacgaag ugcagccuac cagcagcggc 180 uccgagaucc uggacgagca gaacgugauc gagcagccug gcagcucccu ggccagcaac 240 agaauccuga cccugcccca gagaaccauc agaggcaaga acaagcacug cugguccacc 300 uccaagagca ccaggcggag cagagugucc gcccugaaca ucgugcggag ccagaggggc 360 cccaccagaa ugugcagaaa caucuacgac ccccugcugu gcuucaagcu guucuucacc 420 gacgagauca ucagcgagcu ggugaagugg accaacgccg agaucagccu gaagaggcgg 480 gagagcauga ccggcgccac cuucagagac accaacgagg acgagaucua cgccuucuuc 540 ggcauccugg ugaugaccgc cgugagaaag gacaaccaca ugagcaccga cgaccuguuc 600 gacagauccc ugagcauggu guacgugucc gugaugagca gagacagauu cgacuuccug 660 aucagaugcc ugagaaugga cgacaagagc aucagaccca cccugcggga gaacgacgug 720 uucacccccg ugcggaagcu gugggaccug uucauccacc agugcaucca gaacuacacc 780 ccuggcgccc accugaccau cgaugagcag cugcugggcu ucagaggcag augccccuuc 840 agaauguaca uccccaacaa gcccagcaag uacggcauca agauccugau gaugugcgac 900 agcggcacca aguacaugau caacggcaug cccuaccugg gcagaggcac ccagacaaac 960 ggcgugcccc ugggcgagua cuacgugaaa gaacugagca agccugugca uggcagcugc 1020 aggaacauca ccugcgacaa cugguucacc agcauccccc uggccaagaa ccugcugcag 1080 gaacccuaca agcugaccau cgugggcacc gugcggagca acaagcggga gaucccagag 1140 gugcugaaga acagcagauc cagaccugug ggaacaagca uguucugcuu cgacggcccc 1200 cugacccugg uguccuacaa gcccaagccc gccaagaugg uguaccugcu guccagcugc 1260 gacgaggacg ccagcaucaa cgagagcacc ggcaagcccc agauggugau guacuacaac 1320 cagaccaagg gcggcgugga cacccuggac cagaugugca gcgugaugac cugcagcaga 1380 aagaccaaca gauggcccau ggcccugcug uacggcauga ucaauaucgc cugcaucaac 1440 agcuucauca ucuacagcca caacgugucc agcaagggcg agaaggugca gagccggaag 1500 aaauucaugc ggaaccugua caugagccug accuccagcu ucaugagaaa gagacuggaa 1560 gcccccaccc ugaagagaua ccugcgggac aacaucacca acauccugcc caacgaagug 1620 ccaggaacaa gcgacgacag caccgaggaa cccgugauga agaagaggac cuacugcacc 1680 uacuguccca gcaagaucag aagaaaggcc aacgccagcu gcaagaaaug caaaaaagug 1740 aucugccggg agcacaacau cgacaugugc cagagcuguu ucuagc 1786

Claims (56)

  1. 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 및 247번 위치 중 하나 이상에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환 및/또는 서열번호 2의 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함하는 피기백 트랜스포사제.
  6. 제4항에 있어서, 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신의 아미노산 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함하는 피기백 트랜스포사제.
  7. 제4항에 있어서, 서열번호 2의 147번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 서열번호 2의 247번 위치에서 이소류신에 대한 류신 치환, 및 서열번호 2의 533번 위치에서 세린에 대한 트레오닌 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제.
  8. 제1항에 있어서, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 세포에 의해 발현된 동일한 관심 단백질의 역가에 비해 개선된, 피기백 트랜스포사제.
  9. 제8항에 있어서, 관심 재조합 단백질은 항원 결합 단백질인, 피기백 트랜스포사제.
  10. 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제로서, 서열번호 2의 147, 176, 221, 247, 429, 533, 및 573번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 피기백 트랜스포사제.
  11. 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 피기백 트랜스포사제.
  12. 제1항, 제10항, 또는 제11항에 따른 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자.
  13. 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제.
  14. 제12항 또는 제13항에 따른 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 추가로 포함하는, 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 관심 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  17. 제13항에 따른 핵산 서열에 의해 암호화된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포.
  18. 제14항에 따른 벡터로 형질감염된 세포.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 숙주세포인 세포.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, CHO 세포인 세포.
  21. 제17항 또는 제18항에 있어서, 면역세포인 세포.
  22. 제13항에 따른 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 세포.
  23. 제14항에 따른 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 세포.
  24. 제14항에 따른 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 세포.
  25. 제17항, 제18항, 제22항, 제23항, 또는 제24항에 있어서, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포에 의해 발현된 관심 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 세포에 의해 발현된 동일한 관심 단백질의 역가에 비해 개선된, 세포.
  26. 제25항에 따른 세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질.
  27. 제26항에 따른 관심 재조합 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  28. 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가를 개선하는 방법으로서,
    피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자를 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작하는 단계;
    피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 숙주세포를 공동 형질감염시키는 단계; 및
    세포를 배양하여 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하되,
    조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로 형질감염되는, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염되는, 방법.
  31. 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포 배양물에서 재조합 단백질 생산을 증가시키는 방법으로서,
    숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 분자로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 공동 형질감염된 숙주세포를 사용하여 생물반응기에 세포 배양물을 마련하는 단계; 및
    관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하되,
    조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로 형질감염되는, 방법.
  33. 제29항에 있어서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염되는, 방법.
  34. 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    관심 재조합 단백질을 발현하는 숙주세포(세포주는 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 공동 형질감염되었음)를 사용하여 생물반응기에 세포 배양물을 마련하는 단계;
    세포를 배양하여 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계;
    관심 재조합 단백질을 채취하는 단계;
    하나 이상의 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 처리하는 단계; 및
    단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자를 포함하는 제1 벡터로, 그리고 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터로 형질감염되는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 숙주세포는 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 조작된 핵산 분자 및 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단일 벡터로 형질감염되는, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 적어도 하나의 단위 조작은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 포획 크로마토그래피 단계인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 적어도 하나의 단위 조작은 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 폴리싱 크로마토그래피 단계인, 방법.
  39. 제34항에 있어서, 적어도 하나의 단위 조작은 바이러스 불활성화, 바이러스 여과, 심층 여과, 및 UF/DF로부터 선택되는, 방법.
  40. 제34항에 있어서, 조작된 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가가 야생형 피기백 트랜스포사제로 형질감염된 숙주세포 또는 피기백 트랜스포사제로 형질감염되지 않은 숙주세포에 의해 발현된 관심 재조합 단백질의 역가에 비해 개선된, 방법.
  41. 제34항에 따른 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질.
  42. 제41항에 따른 단리된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  43. 숙주세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열; 및
    적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열이 삽입된 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소를 포함하는 벡터
    를 포함하는 세포 형질감염용 키트.
  44. 비바이러스성 유전자 변형 세포를 생성하는 방법으로서,
    (a) 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 마련하는 단계;
    (b) 공여체 또는 대상체로부터 천연 면역세포를 단리하는 단계;
    (c) 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열 및 상기 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계; 및
    (d) 세포 배양에 의해 세포를 더 많은 비바이러스성 유전자 변형 세포 집단으로 증식시키는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로, 그리고 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염되는, 방법.
  46. 제42항에 있어서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염되는, 방법.
  47. 비바이러스성 유전자 변형 세포로 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 마련하는 단계;
    (b) 대상체 또는 공여체로부터 천연 면역세포를 단리하는 단계;
    (c) 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열 및 상기 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계;
    (d) 세포 배양에 의해 세포를 더 많은 유전자 변형 세포 집단으로 증식시키는 단계;
    (e) 형질전환된 세포를 세포 배양물에서 단리하여 유전자 변형 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계; 및
    (f) 비바이러스성 유전자 변형 세포를 대상체에게 재도입하는 단계를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터로, 그리고 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 세포는 피기백 트랜스포존의 적어도 5' 및 3' 역위 반복 요소에 의해 플랭킹된 적어도 하나의 관심 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 세포 내에서의 안정성을 높이도록 조작된 피기백 트랜스포사제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염되는, 방법.
  50. 제48항에 있어서, 천연 면역세포는 단핵세포인, 방법.
  51. 제48항에 있어서, 천연 면역세포는 T세포인, 방법.
  52. 제48항에 있어서, 적어도 하나의 관심 단백질은 항원 수용체, T세포 수용체, 또는 키메라 항원 수용체인, 방법.
  53. 제48항에 있어서, 세포는 자살 유전자 또는 유도성 온 또는 가속기 스위치, 또는 둘 다를 암호화하는 핵산 분자로도 형질감염되는, 방법.
  54. 제48항에 따른 비바이러스성 유전자 변형 세포, 세포 집단, 또는 세포 배양물.
  55. 제48항의 유전자 변형 세포 또는 세포 집단을 포함하는 제형.
  56. 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 공여체 또는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제48항의 유전자 변형 세포 또는 세포 집단의 유효량을 공여체 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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