KR20240054986A - Igf- 배지에 대한 플랫폼 숙주의 적응 - Google Patents

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크리스틴 마리 다리스
후옹 티 응옥 레
에릭 기슬라손
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Abstract

IGF-1이 결여된 배지에서의 포유동물 세포 배양에서 관심 재조합 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. IGF-1이 결여된 배지에서 성장할 수 있는 포유동물 세포를 생산하는 방법이 또한 제공된다.

Description

IGF- 배지에 대한 플랫폼 숙주의 적응
본 발명은 일반적으로 포유동물 세포주를 감소된 양의 인슐린 유사 성장 인자(Insulin-like Growth Factor)(IGF-1)를 갖는 세포 배지에 적응(adapting)시키는 방법 및 재조합 단백질을 생산하기 위한 이들 세포의 용도에 관한 것이다.
광범위한 용도로 인해서, 생물학적 제제는 치료 및 진단과 같은 다양한 응용분야에서 전 세계적으로 사용된다. 포유동물 세포주는 이러한 생물학적 제제의 주요 발현 시스템이며, 중국 햄스터 난소(CHO; Chinese Hamster Ovary) 세포가 주요 세포 공장이다. 문헌[Lalonde et al.,2017, JBiotechnol251:128-140]을 참조한다. 특히 바이오시밀러의 출현으로 인해서 이제 시장 출시 속도 및 비용 효율성이 그 어느 때보다 중요해졌다.
최적의 세포주의 선택, 생산 세포의 대량 배양, 세포 수거물로부터 목적하는 생물학적 제제의 정제 등을 포함하는 다단계 공정을 활용하는 생산의 복잡성으로 인해 생물학적 제제의 제조 비용은 높다. 생산의 모든 측면에서의 개선으로 이러한 비용이 감소하고 있지만, 최전선 요법으로 광범위하게 채택되는 경우 이의 비용은 여전히 엄청날 수 있다.
환자가 생물학적 치료제에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하기 위해서, 제조 공정에 대한 제품 비용을 줄이는 것이 매력적인 제안이다. 비용이 많이 드는 분야 중 하나는 약물 물질 공정에 사용되는 세포 배양 배지이다. IGF-1은 인슐린-유사 성장 인자/인슐린 수용체(IGFR/IR) 경로의 신호전달을 통해 세포 성장을 지원하는 중요한 단백질 보충제이지만; 이는 배지의 원재료 비용에서 상당한 부분을 차지한다.
따라서, 숙주 세포로부터 재조합 단백질 생산과 관련된 비용을 절감할 필요가 있다. 이 목표를 달성하는 한 가지 방식은 IGF-1과 같은 특정 세포 배양 배지 보충물에 대한 필요성을 줄이거나 제거함으로써 제품 비용을 줄이는 것이다. 향상된 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체(IGF-1R) 발현은 혈소판-유래 성장 인자 BB를 사용한 세포 배양 배지의 보충을 통해 중간엽 줄기 세포에서 나타났다. 미국 특허 출원 공개 제US20200245388호를 참조한다. IGF-1R의 구성적 발현은 또한 발현 벡터를 사용하여 사용되었다. 미국 특허 가출원 제63/108,084호를 참조한다. 숙주 세포주의 점진적 적응(gradual adaption)은 세포를 단백질이 없고 지질이 없는 배지에 적응시키는 데 사용되었다. 미국 특허 제9,340,814호를 참조한다.
성장 및 생산성에 최소한의 영향을 미치면서 재조합 단백질을 생산하는 IGF-1 보충에 대한 요구사항이 감소되거나 요구되지 않는 숙주 세포주에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 이러한 세포주는 생물학적 제제의 공정 개발에 도움이 될 것이다.
본 개시내용은 포유동물 세포 배양으로부터 관심 단백질을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 0.05 ㎎/ℓ 이하의 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1)를 갖는 제2 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 배양하여 관심 단백질을 발현시키는 단계로서, 포유동물 세포는 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 갖는 제1 세포 배양 배지에서 성장하도록 직접 적응되었고(directly adapted), 관심 단백질을 암호화하는 이종 핵산을 포함하는, 단계; 및 (b) 포유동물 세포에 의해서 생산된 관심 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 함유한다. 특정 실시형태에서, 제1 세포 배양 배지는 IGF-1을 함유하지 않는다. 특정 실시형태에서, 제2 세포 배양 배지는 IGF-1을 함유하지 않는다.
특정 실시형태에서, 직접 적응된 포유동물 세포는 직접 적응되지 않은 동일한 계통의 포유동물 세포와 유사한 성장 속도를 갖는다. 예를 들어, 직접 적응된 포유동물 세포는 30시간 미만, 예를 들어, 20 내지 30시간의 배가 시간을 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하면, 발현된 관심 단백질의 역가는 배양 10일차에 적어도 50 ㎎/ℓ이다.
특정 실시형태에서, 관심 단백질은 항원 결합 단백질이다. 특정 실시형태에서, 관심 단백질은 단클론성 항체, 이중특이적 T 세포 관여자, 면역글로불린, Fc 융합 단백질 및 펩티바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 포유동물 세포 배양 공정은 유가식(fed-batch) 배양 공정, 관류(perfusion) 배양 공정 또는 이들의 조합을 활용한다.
특정 실시형태에서, 포유동물 세포 배양은 적어도 100 ℓ의 생물반응기에 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 함유한 무혈청 배양 배지 중의 적어도 0.5Х106 내지 3.0Х106개 세포/㎖를 접종함으로써 확립된다. 본 실시형태의 특정 양태에서, 생물반응기는 적어도 500 ℓ 또는 적어도 2000 ℓ 이다.
특정 실시형태에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 특정 실시형태에서, CHO 세포는 디히드로폴레이트 환원효소가 결핍(DHFR-)되거나 글루타민 합성효소가 넉아웃(GSKO; glutamine synthetase knock-out)되어 있다.
특정 실시형태에서, 회수된 관심 단백질은 정제되고 약제학적으로 허용 가능한 제형으로 제형화된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 제조된 정제되고 제형화된 관심 단백질을 제공한다.
본 개시내용은 또한 포유동물 세포를 IGF- 배지에 직접 적응시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 포함하는 세포 배양 배지에서 포유동물 세포의 집단을 배양하는 단계; b) 단일 세포 클로닝에 의해 포유동물 세포의 집단으로부터 개별 세포를 얻는 단계; c) 생존율이 90% 이상으로 회복될 때까지 30시간 미만의 배가 시간으로 개별 세포를 확장시키고 계대배양시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지에는 IGF-1이 없다.
특정 실시형태에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 특정 실시형태에서, CHO 세포는 디히드로폴레이트 환원효소가 결핍(DHFR-)되거나 글루타민 합성효소가 넉아웃(GSKO)되어 있다.
도 1a 및 도 1b는 A) 110 집단 배가 수준(PDL; population doubling level)의 연장된 기간에 걸쳐 Long R3 IGF-1이 없는 독점 세포 배양 배지에 GSKO 숙주 세포주를 점진적으로 적응시키는 것; 및 B) 1.5개월의 기간에 걸쳐 Long R3 IGF-1이 없는 독점 세포 배양 배지에 GSKO 숙주 세포를 직접 적응시키는 것을 도시한다.
도 2a 내지 도 2b는 GSKO 대조군과 비교하여 GSKO IGF- 적응 단일 세포 클로닝된 숙주의 배가 시간을 도시한다. GSKO 단일 세포 클로닝된 숙주 세포주를 90% 초과로 회복될 때까지 약 24시간의 배가 시간으로 확장시키고 계대배양시켰다.
도 3은 단클론성 항체를 형질주입시킨 후 25 μM MSX 회복된 GSKO IGF- 적응 단일 세포 클로닝된 숙주에 대한 회복 그래프를 도시한다. 회색의 IGF- 적응 세포주는 검은색 선으로 지정된 대조군과 유사한 시간 기간에 회복된다.
도 4a 내지 도 4d: 단클론성 항체가 형질주입된 단일 세포 클로닝된 GSKO 숙주 세포주를 1e6 또는 3e6개 세포/㎖로 접종하고, 15D 유가식 생산에서 평가하였다. 회색 및 검정색의 상이한 음영은 단일 세포 클로닝된 숙주가 유래된 모 숙주 풀을 나타낸다. 형태는 개별 세포주마다 다르다. 형질주입된 세포주는 IGF-1을 갖는 다양한 GSKO 세포주 범위에서 다양한 수준의 성장 및 생산성을 나타내었다. A) 15D 유가식(FB) 생산에서 GSKO 단일 세포 클로닝된 형질주입된 세포주에 대한 생존 세포 밀도 그래프. B) 15D FB 생산에서 GSKO 단일 세포 클로닝된 형질주입된 세포주에 대한 생존율 그래프. C) 15D FB 생산에서 GSKO 단일 세포 클로닝된 형질주입된 세포주에 대한 역가 그래프. D) 15D FB 생산에서 GSKO 단일 세포 클로닝된 형질주입된 세포주에 대한 Qp(부피 특정 생산성) 그래프.
본 발명은 부분적으로 CHO 숙주 세포가 IGF- 배지(IGF-1이 결여된 배지)에서 성장하도록 직접 적응됨으로써 배지에서 높은 수준의 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)에 대한 필요성을 제거할 수 있다는 발견에 기초한다. GSKO CHO 숙주를 IGF-1이 없는 플랫폼 배지에 직접 적응시켰고 단일 세포를 클로닝시켜 IGF-1을 함유하는 세포 배양 배지에서 성장된 모 숙주 세포주의 성장 및 생산성 특성을 유지하거나 초과하는 견고한 숙주 세포주를 생성시켰다. 본 발명은 부분적으로 IGF-1R 경로의 신호전달을 통해 세포 성장을 지지하는 단백질 보충제인 IGF-1이 배지 비용의 최대 약 30%를 차지하므로, 약물 물질 1그램당 비용을 줄이려는 노력에서 비롯되었다. IGF-1 보충 없이 생존하고 성장할 수 있는 직접 적응된 CHO 세포는 대규모 재조합 단백질 생산에서 IGF-1의 높은 비용을 줄일 수 있다. IGF- 적응 숙주 세포 풀 및 후속적으로 단일 세포 클로닝된 IGF- 숙주는 추가 보충 필요 없이 플랫폼 CHO 숙주와 유사한 성능을 나타내었다.
본 명세서에 개시된 직접 적응된 세포는 본래 CHO 세포의 증식 속도와 동일하거나 그보다 높은 증식 속도를 나타낸다. 또한, 직접 적응된 세포는 본래 CHO 세포의 것과 동일하거나 그보다 높은 재조합 단백질 생산 효율을 나타낸다. 본 발명의 직접 적응된 세포주를 사용함으로써, 바이오의약품은 보다 저렴하고 보다 안정적인 방식으로 생산될 수 있다.
본 발명은 IGF-1이 결여된 세포 배양 배지에서 관심 단백질의 상업적 생산에서 특별한 유용성을 발견한다. 본 명세서에 기재된 방법은 유사한 생산을 유지하면서 저비용인 IGF-1 무함유 배지를 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 세포주("숙주 세포"라고도 지칭됨)는 IGF-1이 없거나 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 갖는 세포 배양 배지에서 성장하도록 직접 적응되고, 목적하는 특성을 갖는 단일 클론이 확장되고, 계대배양되고, 선택된다. 특정 실시형태에서, 세포주는 또한 상업적 또는 과학적 관심이 있는 단백질을 발현한다. 세포주는 전형적으로 무한한 시간 동안 배양에서 유지될 수 있는 1차 배양으로부터 발생한 계통에서 유래된다. 세포주의 유전자 조작은, 숙주 세포가 관심 단백질을 발현하게 하도록 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 이용하여 세포에 형질주입, 형질전환 또는 형질도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 관심 단백질을 발현하기 위해 세포 및/또는 세포주를 유전자 조작하는 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며; 예를 들어, 다양한 기술이 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, 및 분기별 업데이트본); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69]에 예시되어 있다.
정의
본 출원에서 사용되는 용어는 당분야에서의 표준 용어이지만, 소정 용어의 정의가 청구범위의 의미에 대한 명확성과 정의를 확실히 하기 위해 본 명세서에서 제공된다. 단위, 접두사 및 기호는 이의 SI(국제 단위계) 허용 형태로 표시될 수 있다. 본 명세서에서 인용되는 수치 범위는 범위를 한정하는 수치를 포함하며 정의된 범위 내의 각 정수를 뒷받침한다. 일반적으로, 본 명세서에서 기재된 방법 및 기법은 달리 명시되지 않는 한, 당분야에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 달리 명시적으로 나타내지 않는 한 하나 이상을 의미한다. 추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않은 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기법은 당해 분야에 널리 공지되고 흔히 사용되는 것이다.
특허, 특허 출원, 기사, 서적 및 조약이 포함되지만 이에 제한되지 않는, 본 출원에서 인용되는 모든 문헌 또는 문헌의 일부가 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함된다. 본 발명의 하나의 실시형태에 기재된 것은 본 발명의 다른 실시형태와 조합될 수 있다.
본 개시내용은 "관심 단백질"을 발현하는 방법을 제공한다. "관심 단백질"은 자연 발생 단백질, 재조합 단백질 및 조작된 단백질(예를 들어, 자연에서 발생하지 않고 인간에 의해 설계 및/또는 생성된 단백질)을 포함한다. 관심 단백질은 치료적으로 관련이 있는 것으로 알려져 있거나 의심되는 단백질일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"(예를 들어, 관심 단백질 또는 관심 폴리펩티드의 맥락에서 사용되는 바와 같음)은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 천연 유래 아미노산의 유사체 또는 모방체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 이들 용어는 또한, 예를 들어, 당단백질을 형성하기 위해 탄수화물 잔기의 첨가에 의해 변형되거나, 또는 인산화된 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질은 자연 발생 세포 및 비재조합 세포에 의해 생산될 수 있거나, 폴리펩티드 및 단백질은 유전자 조작 세포 또는 재조합 세포에 의해 생산될 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질은 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 자연 발생 아미노산만을 포함하는 분자뿐만 아니라 비-자연 발생 아미노산을 포함하는 분자도 포함한다. 비-자연 발생 아미노산(이것은 필요한 경우 본 명세서에 개시된 임의의 서열에서 발견되는 임의의 자연 발생 아미노산으로 대체될 수 있음)의 예는 다음을 포함한다: 4-히드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린). 본 명세서에서 사용되는 폴리펩티드 표기법에서, 표준 용법 및 관례에 따라 좌향(left-hand direction)은 아미노산 말단의 방향이며, 우향(right-hand direction)은 카복실-말단 방향이다.
단백질 또는 폴리펩티드 서열 내로 삽입될 수 있거나 단백질 또는 폴리펩티드 서열 내 야생형 잔기 대신 치환될 수 있는 비-자연 발생 아미노산 예의 비제한적 목록은 β-아미노산, 동종아미노산, 환식 아미노산 및 유도체화된 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 예는 (L-형태 또는 D-형태로; 삽입 어구에서와 같이 약칭): 시트룰린(Cit), 호모시트룰린(hCit), Nα-메틸시트룰린(NMeCit), Nα메틸호모시트룰린(Nα-MeHoCit), 오르니틴(Orn), Nα-메틸오르니틴(Nα-MeOrn 또는 NMeOrn), 사르코신(Sar), 호모리신(hLys 또는 hK), 호모알기닌(hArg 또는 hR), 호모글루타민(hQ), Nα메틸알기닌(NMeR), Nα-메틸류신(Nα-MeL 또는 NMeL), N-메틸호모리신(NMeHoK), Nα-메틸글루타민(NMeQ), 노르류신(Nle), 노르발린(Nva), 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린(Tic), 옥타히드로인돌-2-카복실산(Oic), 3-(1-나프틸)알라닌(1-Nal), 3-(2-나프틸)알라닌(2Nal), 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린(Tic), 2-인단일글리신(IgI), 파라-아이오도페닐알라닌(pI-Phe), 파라-아미노페닐알라닌(4AmP 또는 4-아미노-Phe), 4-구아니디노 페닐알라닌 (Guf), 글리실리신("K(Nε-글리실)" 또는 "K(글리실)" 또는 "K(gly)"로 약칭), 니트로페닐알라닌(니트로phe), 아미노페닐알라닌(아미노phe 또는 아미노-Phe), 벤질페닐알라닌(벤질phe), γ카복시글루탐산(γ-카복시glu), 히드록시프롤린(히드록시pro), p-카복실-페닐알라닌(Cpa), α-아미노아디프산(Aad), Nα-메틸 발린(NMeVal), Nα메틸 류신 (NMeLeu), Nα메틸노르류신(NMeNle), 사이클로펜틸글리신(Cpg), 사이클로헥실글리신(Chg), 아세틸알기닌(아세틸arg), α,β-다이아미노프로피온산(Dpr), α,γ-다이아미노뷰티르산(Dab), 다이아미노프로피온산(Dap), 사이클로헥실알라닌(Cha), 4-메틸-페닐알라닌(MePhe), α,β-다이페닐-알라닌(BiPhA), 아미노뷰티르산(Abu), 4-페닐-페닐알라닌(또는 바이페닐알라닌; 4Bip), α-아미노-이소뷰티르산(Aib), 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 피페리딘산, 아미노카프로산, 아미노헵탄산, 아미노피멜산, 데모신, 다이아미노피멜산, N-에틸글리신, N에틸아스파라긴, 히드록시리신, 알로-히드록시리신, 이소데모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸발린, 4-히드록시프롤린(Hyp), γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3메틸히스티딘, 5-히드록시리신, ω-메틸알기닌, 4-아미노-O-프탈산(4APA) 및 다른 유사한 아미노산 및 임의의 구체적으로 열거된 것의 유도체화된 형태를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산과 관련하여 사용된 용어 "이종"은 숙주 세포 내에서 자연 발생하지 않는 핵산을 갖는 것을 의미한다. 이는 돌연변이된 서열, 예를 들어, 자연 발생 서열과 상이한 서열을 포함할 수 있다. 이것은 다른 종으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 이는 또한 숙주 세포에서 자연 발생하는 것과 게놈 내의 상이한 위치에 서열을 갖는 것을 포함할 수 있다. 이것은 일반적으로 숙주 세포에서 발생할 수 있는 자연적인 돌연변이를 포함하지 않는다. 예를 들어, 발현 카세트의 안정적인 통합에 의해 관심 단백질을 암호화하는 이종 핵산을 이미 함유하는 세포는 이종 핵산 서열을 함유하는 것으로 간주될 것이다. 명확하게 하기 위해서, 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 갖는 CHO 세포 또는 이의 유도체(예를 들어, DHFR- 또는 GS 넉아웃)는 이종 핵산을 갖는 것으로 간주될 것이다.
본 개시내용은 다음 둘 다를 고려한다: (1) 예를 들어, 마스터 세포 뱅크 또는 작업 세포 뱅크를 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 IGF- 배지에 먼저 직접 적응되고, 그 다음 예를 들어, 항체를 암호화하는 핵산 서열을 혼입하도록 추가로 변형된 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포); 및 (2) 관심 이종 단백질, 예를 들어, 항체를 암호화하는 핵산을 이미 갖고 있고 그 다음 본 명세서에 기재된 바와 같은 IGF- 배지에 직접 적응된 세포, 예를 들어, 마스터 세포 뱅크 또는 작업 세포 뱅크.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물반응기"는 세포 배양물의 성장에 유용한 임의의 용기를 의미한다. 본 개시내용의 세포 배양물은 생물반응기에서 성장될 수 있으며, 이는 생물반응기에서 성장하는 세포에 의해 생산되는 관심 단백질의 적용에 기초하여 선택될 수 있다. 생물반응기는 세포의 배양에 유용하기만 하면 어떤 크기도 가능하다. 일반적으로, 생물반응기는 내부에서 성장하는 세포 배양물의 부피에 적합한 크기이다. 일반적으로, 생물반응기는 적어도 1리터일 것이며, 2, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 500, 1,000, 1500, 2000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000리터 또는 그 초과, 또는 그 사이의 임의의 부피일 수 있다. pH 및 온도를 포함하는(이로 한정되지 않음), 생물반응기의 내부 조건은 배양 기간 동안 제어될 수 있다. 당업자는 관련 고려사항에 기초하여 본 명세서에 개시된 방법을 실시하는데 사용하기에 적합한 생물반응기를 인식하고 선택할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "세포 배양" 또는 "배양"은 다세포 유기체 또는 조직 외부의 세포 성장 및 증식을 의미한다. 포유동물 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992) 참조). 포유동물 세포는 현탁 배양되거나 고체 기질에 부착된 상태에서 배양될 수 있다. 마이크로캐리어를 이용하거나 이용하지 않고 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러병, 진탕 플라스크, 또는 교반 탱크 생물반응기가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서 500 ℓ 내지 2000 ℓ의 생물반응기가 사용된다. 일 실시형태에서, 1000 ℓ 내지 2000 ℓ의 생물반응기가 사용된다.
용어 "세포 배양 배지"("배양 배지", "세포 배양 배지", "조직 배양 배지"라고도 함)는 세포, 예를 들어, 동물 또는 포유동물 세포를 성장시키는 데 사용되는 임의의 영양 용액을 지칭하며, 이것은 일반적으로 다음으로부터의 적어도 하나 이상의 성분을 제공한다: 에너지원(보통 탄수화물, 예컨대, 글루코스의 형태); 모든 필수 아미노산 중 하나 이상 및 일반적으로 20개의 기본 아미노산과 시스테인; 전형적으로 낮은 농도에서 필요한 비타민 및/또는 기타 유기 화합물; 지질 또는 유리 지방산; 및 일반적으로 마이크로몰 범위의 전형적으로 매우 낮은 농도에서 요구되는 미량 원소, 예를 들어, 무기 화합물 또는 자연 발생 원소.
영양 용액에는 선택적으로 세포의 성장을 최적화하기 위한 추가적인 선택적인 성분, 예컨대, 호르몬 및 기타 성장 인자, 예를 들어, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 혈청 등; 염, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트 및 완충제, 예를 들어, HEPES; 뉴클레오사이드 및 염기, 예를 들어, 아데노신, 티미딘, 히포잔틴; 및 단백질 및 조직 가수분해물, 예를 들어, 가수분해된 동물 또는 식물 단백질(동물 부산물, 정제된 젤라틴 또는 식물 물질로부터 얻을 수 있는 펩톤 또는 펩톤 혼합물); 항생제, 예를 들어, 젠타마이신; 세포 보호제 또는 계면활성제, 예컨대, Pluronic® F68(Lutrol® F68 및 Kolliphor® P188이라고도 함); 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥시드)의 2개의 친수성 쇄가 측접된 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥시드))의 중앙 소수성 쇄로 구성된 비이온성 삼블록; 배양될 세포의 요구 사항 및/또는 목적하는 세포 배양 매개변수에 따라 폴리아민, 예를 들어, 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제2008/154014호 참조) 및 피루베이트(예를 들어, 미국 특허 제8,053,238호)가 보충될 수 있다.
세포 배양 배지는 임의의 세포 배양 공정, 예컨대 세포의 회분식(batch), 연장된 회분식, 유가식 및/또는 관류 또는 연속 배양(이들로 제한되지는 않음)에서 전형적으로 사용되고/되거나 이것과 사용되도록 공지된 것을 포함한다.
"기본"(또는 회분식) 세포 배양 배지는 전형적으로 세포 배양을 개시하는 데 사용되며 세포 배양을 지지하기에 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다.
"유가식 배양"은 현탁 배양의 형태를 지칭하며, 배양 공정 개시 이후의 시간 또는 시간들에 추가 성분을 배양물에 제공하는 세포 배양 방법을 의미한다. 제공되는 성분은 전형적으로 배양 공정 중에 고갈된 세포를 위한 영양 보충제를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 추가 성분은 보충 성분(예를 들어, 세포 주기 저해 화합물)을 포함할 수 있다. 유가식 배양은 전형적으로 일부 지점에서 중단되고 배지 내 세포 및/또는 성분이 수거되고 선택적으로 정제된다.
"성장" 세포 배양 배지는 지수 성장의 기간, "성장 단계" 동안 세포 배양물에서 전형적으로 사용되고, 이 단계 동안 세포 배양을 지지하기에 충분히 완벽한 세포 배양 배지를 지칭한다. 성장 세포 배양 배지는 숙주 세포주로 혼입된 선택 가능한 마커에 내성 또는 생존을 부여하는 선택제를 또한 함유할 수 있다. 이러한 선택제는 게네티신(G418), 네오마이신, 하이그로마이신 B, 퓨로마이신, 제오신, 메티오닌 설폭시민, 메토트렉세이트, 글루타민 불포함 세포 배양 배지, 글리신, 하이포잔틴 및 티미딘, 또는 티미딘 단독이 결여된 세포 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"관류" 세포 배양 배지는 관류 또는 연속 배양 방법에 의해 유지되는 세포 배양물에서 전형적으로 사용되고, 이 공정 중에 세포 배양을 지지하기에 충분히 완벽한 세포 배양 배지를 지칭한다. 관류 세포 배양 배지 제형은 소비된 배지를 제거하는 데 사용된 방법을 수용하기 위해 기본 세포 배양 배지 제형보다 더 농후하거나 더 농축될 수 있다. 관류 세포 배양 배지는 성장 단계 및 생산 단계 둘 다 동안 사용될 수 있다.
"생산" 세포 배양 배지는 지수 성장이 끝나고 단백질 생산을 물려받는 전환 동안, 즉 "전환" 및/또는 "생성물" 단계 동안 세포 배양물에서 전형적으로 사용되고 이 단계 동안 목적하는 세포 밀도, 생존율 및/또는 생성물 역가를 유지하기에 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다
농축 세포 배양 배지는 세포 배양을 유지하는 데 필요한 영양소의 일부 또는 전부를 함유할 수 있으며; 특히, 농축 배지는 세포 배양의 생산 단계 과정 동안 소비되는 것으로 확인되거나 알려진 영양소를 함유할 수 있다. 농축 배지는 거의 모든 세포 배지 제형을 기반으로 할 수 있다. 이러한 농축 공급 배지는 세포 배양 배지의 성분 중 일부 또는 전부를 예를 들어, 정상적인 양의 약 2Х, 3Х, 4Х, 5Х, 6Х, 7Х, 8Х, 9Х, 10Х, 12Х, 14Х, 16Х, 20Х, 30Х, 50Х, 100Х, 200Х, 400Х, 600Х, 800Х 또는 심지어는 약 1000Х로 함유할 수 있다.
세포 배양 배지를 제조하는 데 사용되는 성분은 분말 배지 제형으로 완전히 밀링될 수 있으며; 필요에 따라 세포 배양 배지에 첨가된 액체 보충제와 함께 부분적으로 밀링되고; 또는 완전히 액체 형태로 세포 배양물에 첨가된다.
세포 배양물은 또한 제형화하기 어려울 수 있거나 세포 배양물에서 빠르게 고갈될 수 있는 특정 영양소의 독립적인 농축 공급물이 보충될 수 있다. 이러한 영양소는 아미노산, 예컨대, 티로신, 시스테인 및/또는 시스틴일 수 있다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO2012/145682호 참조). 예를 들어, 티로신의 농축 용액은 세포 배양물 중 티로신의 농도가 8 mM을 초과하지 않도록 하는 티로신을 함유하는 세포 배양 배지에서 성장된 세포 배양물에 독립적으로 공급될 수 있다. 또 다른 예에서, 티로신과 시스틴의 농축 용액은 티로신, 시스틴 또는 시스테인이 결여된 세포 배양 배지에서 성장될 세포 배양물에 독립적으로 공급된다. 독립적인 공급은 생산 단계 이전 또는 시작 시 시작할 수 있다. 독립적인 공급은 농축된 공급 배지와 동일한 날 또는 다른 날에 세포 배양 배지에 대한 유가식 공급에 의해 달성될 수 있다. 독립적인 공급은 또한 관류 배지와 동일한 날 또는 다른 날에 관류될 수 있다.
"무혈청"은 우태 혈청과 같은 동물 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. 한정 배양 배지를 포함한 다양한 조직 배양 배지가 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 다음 세포 배양 배지 중 임의의 하나 또는 조합이 사용될 수 있다: RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지 이글, F-12K 배지, 햄 F12 배지, Iscove의 변형된 Dulbecco 배지, McCoy 5A 배지, Leibovitz L-15 배지 및 무혈청 배지, 예컨대 특히 EX-CELLTM 300 Series(JRH Biosciences, 미국 캔자스주 레넥사 소재), MCDB 302(Sigma Aldrich Corp., 미국 미주리주 세인트 루이스 소재). 이러한 배양 배지의 무혈청 버전이 또한 이용 가능하다. 세포 배양 배지에는 배양될 세포의 요구 사항 및/또는 목적하는 세포 배양 파라미터에 따라, 추가적인 또는 증가된 농도의 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장 인자, 완충제, 항생제, 지질, 미량 원소 등과 같은 성분이 보충될 수 있다. 맞춤형 세포 배양 배지가 또한 사용될 수 있다.
"세포 밀도"는 주어진 부피의 배양 배지 내의 세포의 수를 지칭한다. "생존 세포 밀도"는 표준 생존율 검정(예컨대, 트리판 블루 염료 배제 방법)에 의해 결정된 바와 같이 주어진 부피의 배양 배지 내의 살아있는 세포의 수를 지칭한다.
"세포 생존율"은 주어진 배양 조건 또는 실험적 변화 세트 하에서 생존할 수 있는 배양물 내의 세포의 능력을 의미한다. 이 용어는 또한 해당 시점에 배양물에서 살아 있거나 죽은 세포의 총 수와 관련하여 특정 시점에 살아있는 세포 비율을 지칭한다.
"세포 성장 정지"로도 지칭될 수 있는 "성장 정지"는 세포가 수의 증가를 멈추거나 세포 주기가 더 이상 진행되지 않는 지점이다. 성장 정지는 세포 배양물의 생존 세포 밀도를 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 성장 정지 상태의 일부 세포는 크기는 증가하지만 수는 증가하지 않을 수 있으므로, 성장 정지 배양물의 패킹 세포 부피가 증가할 수 있다. 성장 정지는 세포의 건강이 저하되지 않은 경우 성장 정지로 이어지는 조건을 역전시킴으로써 어느 정도 역전될 수 있다.
"백분율 패킹 세포 부피(PCV%)"로도 지칭되는 "패킹 세포 부피"(PCV)는 세포 배양물의 총 부피에 대한 세포가 차지하는 부피의 비율이며, 백분율로 표시된다(문헌[Stettler et al., 2006, Biotechnol Bioeng. Dec20:95(6):1228-33] 참조). 패킹 세포 부피는 세포 밀도 및 세포 직경의 함수이고; 패킹 세포 부피의 증가는 세포 밀도 또는 세포 직경 또는 이들 둘 다의 증가로 인해 발생할 수 있다. 패킹 세포 부피는 세포 배양물 중의 고체 함량의 측정치이다. 수거 및 하류 정제 동안 고체가 제거된다. 광석 고체는 수거 및 하류 정제 단계 동안 목적하는 생성물로부터 고체를 분리시키기 위한 더 많은 노력을 의미한다. 또한 목적하는 생성물이 수거 공정 동안 고체에 갇혀서 손실되어 생성물 수율이 감소할 수 있다. 숙주 세포는 크기가 다양하고 세포 배양물은 또한 죽은 세포 및 죽어가는 세포 및 기타 세포 잔해물을 함유하기 때문에 패킹 세포 부피는 세포 밀도 또는 생존 세포 밀도보다 세포 배양 내의 고체 함량을 설명하는 더 정확한 방법이다. 예를 들어, 세포 밀도가 50Х106개 세포/㎖인 2000 ℓ 배양물은 세포 크기에 따라 패킹 세포 부피가 크게 달라질 것이다. 또한, 일부 세포는, 성장 정지 상태에 존재하는 경우 크기가 증가할 것이므로, 세포 크기 증가에 따른 바이오매스 증가로 인해서 성장 정지 전과 성장 정지 후 패킹 세포 부피가 상이할 가능성이 크다.
"역가"는 주어진 양의 배지 부피에서 세포 배양에 의해 생산된 관심 폴리펩티드 또는 단백질(관심 자연 발생 또는 재조합 단백질일 수 있음)의 총량을 의미한다. 역가는 배지 1밀리리터(또는 다른 부피 측정치)당 폴리펩티드 또는 단백질의 밀리그램 또는 마이크로그램 단위로 표현될 수 있다. "누적 역가"는 배양 과정 동안 세포에 의해 생성된 역가이며, 예를 들어, 일일 역가를 측정하고 해당 값을 사용하여 누적 역가를 계산함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 관심 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 것으로 이해된다. 세포의 유전자 조작은 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 암호화하는 핵산("관심 유전자)을 이용한 세포의 형질주입, 형질전환 또는 형질도입 및/또는 달리 숙주 세포가 목적 재조합 폴리펩티드를 발현하게 하는 (예를 들어, 상동 재조합 및 유전자 활성화 또는 재조합 세포와 비재조합 세포의 융합에 의한) 변경을 포함한다. 관심 폴리펩티드를 발현하기 위해 세포 및/또는 세포주를 유전자 조작하기 위한 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며; 예를 들어, 다양한 기술이 문헌[Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, 및 분기별 업데이트본); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69]에 예시되어 있다. 상기 용어는, 관심 대상의 유전자가 존재한다면, 자손이 본래 모 세포에 대한 형태 또는 유전적 구성에 있어 동일하든 아니든 모 세포의 자손을 포함한다. 세포 배양물은 하나 이상의 숙주 세포를 포함할 수 있다.
IGF-1은 분자 구조가 인슐린과 유사한 폴리펩티드 단백질 호르몬이다. 또한 IGF-1은 성체 포유동물의 성장 및 동화작용에 중요한 역할을 한다.
IGF-1R은 자가인산화를 위한 인산염을 제공하는 데 사용되는 ATP에 대한 결합 부위를 갖는다. 티로신 잔기 1165 및 1166의 자가인산화 복합체의 구조는 IGF1R 키나제 도메인의 결정 내에서 확인되었다. 문헌[Xu et al., 2015, Science 신호ing 8(405):rs13]을 참조한다. 리간드 결합에 반응하여 α 쇄는 β 쇄의 티로신 자가인산화를 유도한다. 이 사건은 세포-특이적이지만 종종 세포 생존 및 세포 증식을 촉진하는 세포내 신호 전달의 캐스케이드를 촉발한다. 문헌[Jones et al., 1995, Endocrine Reviews 16(1):3-34 및 LeRoith et al., 1995, Endocrine Reviews 16(2):143-63]을 참조한다. 재조합 단백질의 대규모 생산에서 세포 배양 배지에 IGF-1을 보충하는 것이 흔한 일이 되는 것은 세포 증식에 대한 이러한 효과이다.
IGF-1은 상업적으로 입수 가능하며 전형적으로 약 0.1 ㎎/ℓ의 농도로 세포 배양 배지의 보충제로 사용된다. 천연 IGF-1(70개 아미노산, 7.6 kDa, 예를 들어, R&D Systems에서 입수 가능), Long R3 IGF-1(83개 아미노산, 9.1 kDa, 예를 들어, MilliporeSigma 및 Repligen에서 입수 가능) 및 ShortTM AE-IGF-1(72개 아미노산, 7.9 kDa, 예를 들어, CellRx에서 입수 가능)을 비롯한, 세포 배양 배지에 포함될 수 있는 적어도 3개의 상업적으로 입수 가능한 IGF-1 형태가 존재한다.
포유동물 세포를 IGF- 배지에 직접 적응시키는 방법
포유동물 세포를 IGF- 배지(IGF-1이 결여된 배지)에 직접 적응시킴으로써, 유사한 성장 속도 및 생산성을 유지하면서 대규모 재조합 단백질 제조에서 IGF-1이 감소되거나 생략될 수 있다는 것을 발견하였다. 포유동물 세포를 IGF- 배지에 직접 적응시키는 것은 혈청에서 이용 가능한 IGF-1을 포함하여 IGF-1을 함유하는 세포 배양 배지에서 성장했거나 이전에 성장했던(그리고 후속적으로 동결된) 세포 배양물을 사용하고, 이들 세포를 IGF-1이 결여된 세포 배양 배지에서 직접 배양하는 것을 의미한다. 직접 적응에서, 세포는 IGF-1을 포함하지 않을 수 있는 IGF-1 농도를 갖는 단일 세포 배양 배지에만 적응된다. 이는 세포 배양 배지에 존재하는 IGF-1의 양을 연속적으로 감소시키고 IGF-1 농도를 감소시키는 각각의 단계에서 세포가 회복되도록 하는 것을 포함하는 점진적 적응과 대조적이다.
본 개시내용은 포유동물 세포를 IGF- 배지에 직접 적응시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 포함하는 세포 배양 배지에서 포유동물 세포의 집단을 배양하는 단계; b) 단일 세포 클로닝에 의해 포유동물 세포의 집단으로부터 개별 세포를 얻는 단계; 및 c) 90% 이상으로 회복될 때까지 30시간 미만의 배가 시간으로 개별 세포를 확장 및 계대배양시키는 단계를 포함한다. 최적의 클론은 생존율, 성장, 형질주입 능력과 같은 특징을 기준으로 선택된다.
IGF-1이 결여된 세포 배양 배지는 일반적으로 세포 배양 배지가 표준 세포 배양 조건에 비해 감소된 수준의 IGF-1을 함유한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 직접 적응을 위한 세포 배양 배지(때때로 본 명세서에서 제1 세포 배양 배지로 지칭됨)는 0.03 ㎎/ℓ 이하, 0.02 ㎎/ℓ 이하, 0.01 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 함유하거나 IGF-1을 함유하지 않을 수 있다. IGF-배지는 IGF-1이 결여된 세포 배양 배지를 지칭한다.
본 명세서에 개시된 방법에서, 임의의 포유동물 세포주가 사용될 수 있다. 배양에서의 성장에 적합한 매우 다양한 포유동물 세포주는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나서스 소재) 및 상업적 공급업체로부터 입수 가능하다. 산업에서 일반적으로 사용되는 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVl 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포(Graham et al, 1977, J. Gen Virol. 36:59); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251); 원숭이 신장 세포(CVl ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., 1982, Annals N.Y Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 포유동물 골수종 세포 및 다수의 다른 세포주 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상업적 용도를 위한 단백질의 대규모 생산은 전형적으로 현탁 배양으로 수행된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 재조합 포유동물 세포를 생성하는 데 사용되는 포유동물 숙주 세포는 현탁 배양에서의 성장에 적응될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 현탁 배양에서 성장에 적응된 다양한 숙주 세포가 공지되어 있으며, 이는 마우스 골수종 NS0 세포 및 CHO-S, DG44 및 DXB11 세포주로부터의 CHO 세포를 포함한다. 적합한 세포주는 마우스 골수종 SP2/0 세포, 베이비 햄스터 신장 BHK-21 세포, 인간 PER.C6® 세포, 인간 배아 신장 HEK-293 세포 및 본 명세서에 개시된 임의의 세포주로부터 유래되거나 조작된 세포주를 포함한다.
CHO 세포는 CHOK1 세포(ATCC CCL61)를 비롯한 복잡한 재조합 단백질을 생산하는 데 널리 사용된다. 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)-결핍 돌연변이 세포주(Urlaub et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 및 DG-44는 효율적인 DHFR 선택 및 증폭 가능한 유전자 발현 시스템을 통해 이들 세포에서 높은 수준의 재조합 단백질 발현이 가능하므로 바람직한 CHO 숙주 세포주이다(Kaufman R. J., 1990, Meth Enzymol 185:537-566). 글루타민 합성효소(GS)-기반 메티오닌 설폭시민(MSX) 선택을 사용하는 글루타민 합성효소(GS)-넉아웃 CHOK1SV 세포주가 또한 포함된다. 다른 적합한 CHO 숙주 세포는 다음을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다(괄호 안은 ECACC 수탁 번호): CHO(85050302), CHO(PROTEIN FREE)(00102307), CHO-K1(85051005), CHO-K1/SF(93061607), CHO/DHFR-(94060607), CHO/DHFR-AC-free(05011002), RR-CHOKI(92052129).
일반적이고 바람직한 성분을 함유하는 세포 배양 배지에서 포유동물 세포주의 세포 배양물이 직접 적응을 위해 사용된다. 전형적으로 이러한 세포 배양 배지는 IGF-1을 갖는 혈청을 포함한다. 세포는 바람직하게는 지수 성장 단계에 있는 동안 배양되고, 선택적으로 동결된다.
포유동물 세포는 IGF-1이 결여된 세포 배양 배지에서 계대배양된다. 특정 실시형태에서, IGF-1 농도는 0.03 ㎎/ℓ 이하이다. 특정 실시형태에서, IGF-1 농도는 0 ㎎/ℓ이다. 바람직하게는, 단일 세포는 예를 들어, Berkley Lights(BLI) Beacon Instrument에서 클로닝된다. 세포는 IGF- 배지에 적응될 때까지, 예를 들어, 생존율이 90% 이상이고 정상적인 성장 속도로 증식할 수 있을 때까지, 예를 들어, 30시간 이하의 배가 시간으로 확장되고 계대배양된다.
IGF- 직접 적응을 사용하는 본 명세서에 기재된 방법 및 세포주는 관심 단백질 제조에 사용되는 세포 배양 배지에서 IGF-1 양의 감소를 허용한다. 전형적으로, 세포 배양 배지 중의 IGF-1의 농도는 0.1㎎/ℓ이다. 본 명세서에 개시된 방법에서, 세포 배양 배지 중의 IGF-1의 농도는 0.05, 0.04, 0.03, 0.02 또는 0.01 ㎎/ℓ 이하까지 감소될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지에는 IGF-1이 필요하지 않으며, 즉 세포 배양 배지 중의 IGF-1의 농도는 0 ㎎/ℓ이다.
본 명세서에 기재된 방법에서, 세포는 IGF- 적응이 없는 동일한 계통의 세포와 유사한 성장 속도를 갖는다. 특정 실시형태에서, 성장 속도는 생산 첫 5일 동안 0.015~0.04 1/hr이다. 특정 실시형태에서, 성장 속도는 시드 트레인에서 0.022~0.025 1/hr이다. 특정 실시형태에서, 세포는 20~30시간 또는 23~35시간의 배가 시간을 갖는다.
본 명세서에 기재된 방법에서, 세포는 IGF-1이 없는 세포 배양 배지에 적응되지 않은 동일한 계통의 세포와 유사한 역가로 관심 재조합 단백질을 생산한다. 특정 실시형태에서, 관심 단백질의 역가는 배양 10일 후에 적어도 50 ㎎/ℓ, 100 ㎎/ℓ, 150 ㎎/ℓ, 200 ㎎/ℓ, 250 ㎎/ℓ, 300 ㎎/ℓ, 350 ㎎/ℓ, 400 ㎎/ℓ, 450 ㎎/ℓ, 500 ㎎/ℓ, 550 ㎎/ℓ 또는 600 ㎎/ℓ이다.
관심 단백질을 발현하는 포유동물 숙주 세포의 생성
세포에서 관심 단백질의 발현은 일시적으로 또는 안정적인 발현에 의해 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다(Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001).
안정적인 통합 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 간략하면, 안정적인 통합은 일반적으로 이종 폴리뉴클레오티드 또는 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 숙주 세포 내로 일시적으로 도입함으로써 달성되는데, 이는 상기 이종성 폴리뉴클레오티드의 세포 게놈 내로의 안정적인 통합을 촉진한다. 전형적으로, 이종 폴리뉴클레오티드에는 상동성 아암, 즉, 통합 부위의 상류 및 하류 영역에 상동성인 서열이 측접되어 있다. 포유동물 숙주 세포에 도입되기 전에 원형 벡터를 선형화하여 세포 게놈으로의 통합을 촉진할 수 있다. 벡터를 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 바이러스 전달과 같은 생물학적 방법, 양이온성 중합체, 인산칼슘, 양이온성 지질 또는 양이온성 아미노산을 사용하는 화학적 방법; 전기천공법 또는 미세주사법과 같은 물리적 방법; 또는 원형질체 융합과 같은 혼합 접근법을 사용한 형질주입을 포함한다.
포유동물 세포의 안정적인 형질주입을 위해, 사용되는 발현 벡터 및 형질주입 기법에 따라, 세포 작은 일부만 이의 게놈 내로 외래 DNA를 혼입할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 혼입물을 확인하고 선택하기 위해, (예를 들어, 항생제에 대한 내성에 대해) 일반적으로 선택 마커를 암호화하는 유전자가 관심 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선택 가능한 마커는 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것을 포함한다. 도입된 핵산이 안정적으로 형질주입된 세포는 다른 방법 중에서도 약물 선택(예를 들어, 선택 마커 유전자가 혼입된 세포는 살아있는 반면, 다른 세포는 사멸됨)에 의해 확인될 수 있다.
안정적인 통합의 구체적인 방법은 게놈의 부위 특이적 통합("표적 통합"이라고도 칭함)의 경우 재조합효소 매개 카세트 교환을 사용한다(RMCE; Bode and Baer, 2001, Curr Opin Biotechnol. 12:473-80, 및 Bode et al., 2000, Biol. Chem. 381:801-813). Flp 및 Cre와 같은 부위 특이적 재조합효소는 각각 FRT 및 loxP라고 불리는 표적 서열의 2개의 카피 사이의 재조합을 매개한다. 2개의 비상용성 표적 서열, 예를 들어, F3과 조합된 FRT(Schlake and Bode, 1994, Biochemistry, 33:12746-51) 및 역전된 인식 표적 부위(Feng et al., 1999, J. Mol. Biol. 292:779-85)의 사용은 유사한 구성의 표적 서열을 보유하는 미리 정의된 염색체 유전자좌에 DNA 분절을 삽입할 수 있다. EP 특허 제EP1781796B1호 및 EP 특허 출원 공개 제EP2789691A1호를 또한 참조한다.
게놈의 특정 부위에 RMCE를 삽입하는 것은 게놈에서 단일- 및 이중-가닥 절단(SSB/DSB)을 생성하도록 조작될 수 있는 뉴클레아제(예를 들어, 징크 핑거 단백질(ZFP), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문식 반복부(CRISPR)/CRISPR-연관 단백질 9(Cas9))에 의해 매개될 수 있다. DSB를 복구하는 두 가지 주요 및 구별되는 경로, 즉, 상동성 재조합 및 비상동성 말단 결합(non-homologous end-joining: NHEJ)이 존재한다. 상동성 재조합은 세포 복구 과정을 안내하기 위한 주형(예를 들어, RMCE를 포함하는 "공여자")과 같은 상동성 서열의 존재가 필요하며 복구 결과는 오류가 없고 예측 가능하다. 상동성 재조합을 위한 주형(또는 "공여자") 서열의 부재 하에서, 세포는 전형적으로 예측 불가능하고 오류가 발생하기 쉬운 비상동성 말단 결합(NHEJ) 과정을 통해 DSB를 복구하려고 시도한다.
"벡터"는 단백질 암호 정보를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 내의 특정 위치 및/또는 구획으로 전달 및/또는 수송하는 데 사용하기에 적합한 임의의 분자 또는 엔티티(entity)(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 바이러스 캡시드, 비리온, 네이키드(naked) DNA, 복합 DNA 등)일 수 있다. 벡터에는 바이러스 및 비 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유동물 벡터가 포함될 수 있다. 벡터는 종종 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 및 클로닝 벡터로 나타낸다. 벡터는 벡터 자체의 복제가 가능하도록 숙주 세포에 도입되어, 벡터 안에 포함된 폴리뉴클레오티드의 카피를 증폭시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 복제 원점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열 및 선택 가능한 마커를 제한 없이 일반적으로 포함하는 서열 성분을 포함할 수 있다. 이들 요소는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
벡터는 숙주세포의 형질전환에 유용하며, 벡터에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 암호화 영역의 발현을 (숙주세포와 함께) 지시 및/또는 제어하는 핵산 서열을 포함한다. 발현 작제물은 전사와 번역을 제어하거나 이에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있고, 인트론이 존재하는 경우에는 발현 작제물에 작동 가능하게 연결된 암호화 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. "작동 가능하게 연결된"이란 이 용어가 적용된 성분들이 이들의 고유 기능을 수행할 수 있도록 하는 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 단백질 암호화 서열에 "작동 가능하게 연결된" 벡터 내의 제어 서열, 예를 들어, 프로모터는 제어 서열의 정상적인 활성이 단백질 암호화 서열의 전사를 유도하여, 암호화된 단백질의 재조합 발현을 나타내도록 배열된다.
벡터는 사용되는 특정 숙주세포에서 기능하도록 선택될 수 있다(즉, 벡터는 숙주세포 기구에 적합하여 유전자의 증폭 및/또는 발현이 일어날 수 있도록 한다). 일부 실시형태에서, 디히드로폴레이트 환원효소와 같은 단백질 리포터를 이용한 단백질-단편 상보성 분석법을 채용한 벡터가 사용된다(예를 들어, 미국 특허 6,270,964호 참조). 적합한 발현 벡터는 당업계에 알려져 있고, 또한 상업적으로 입수 가능하다.
일반적으로, 숙주세포에 사용되는 벡터는 플라스미드 유지와 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 다음의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 원점, 전사 및 번역 제어 서열, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 스플라이스 부위를 포함하는 완전한 인트론 서열, 글리코실화 또는 수율을 개선하기 위한 다양한 프리- 또는 프로-서열, 폴리펩티드 분비를 위한 천연 또는 이종 신호 서열(리더 서열 또는 신호 펩티드), 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열, 발현 증강 서열 요소(EASE), 아데노바이러스 2의 3부분 리더(tripartite leader, TPA) 및 VA 유전자 RNA, 발현될 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 폴리링커 영역 및 선택 마커 요소. 벡터는 상업적으로 입수 가능한 벡터와 같은 개시 백터로부터 구성될 수 있으며, 추가 요소는 개별적으로 수득되어 벡터에 결찰될 수 있다. 각각의 성분을 얻기 위해 사용되는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
벡터 성분은 상동성(예를 들어, 숙주세포와 동일한 종 및/또는 균주에서 유래), 이종성(즉, 숙주세포 종 또는 균주 이외의 종에서 유래), 하이브리드(즉, 2개 이상의 공급원에서 유래된 측접 서열의 조합), 합성적 또는 천연적일 수 있다. 벡터에 유용한 성분의 서열은 매핑 및/또는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 이전에 확인된 것과 같이, 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한, 이들은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득될 수 있고/있거나 적합한 프로브로 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 수득될 수 있다.
리보솜-결합 부위는 일반적으로 mRNA의 번역 개시에 필요하며, Shine-Dalgarno 서열(원핵세포) 또는 Kozak 서열(진핵세포)을 특징으로 한다. 이 요소는 일반적으로 프로모터의 3' 및 발현될 폴리펩티드의 암호화 서열의 5'에 위치한다.
복제 원점은 숙주세포에서의 벡터의 증폭에 도움이 된다. 이들은 상업적으로 입수 가능한 원핵세포 벡터의 일부로서 포함될 수 있고, 기존에 알려진 서열을 기반으로 화학적으로 합성되어 벡터에 결찰될 수도 있다. 다양한 바이러스 기원(예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 또는 HPV 또는 BPV와 같은 유두종 바이러스)이 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는 데 유용하다.
포유동물 숙주세포 발현 벡터에 대한 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 게놈으로부터 절제될 수 있다. 일반적으로 사용되는 프로모터 및 인핸서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40(SV40) 및 인간 거대세포바이러스(CMV)로부터 유래된다. 예를 들어, 조기 발현 유전자(immediate early gene) 1의 인간 CMV 프로모터/인핸서가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Patterson et al., 1994, Applied Microbiol. Biotechnol. 40:691-98]을 참조한다. SV40 바이러스 게놈에서 유래된 DNA 서열, 예를 들어, SV40 기원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위가 포유동물 숙주세포에서 구조적 유전자 서열의 발현을 위한 다른 유전 요소를 제공하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 초기 및 후기 프로모터는 둘 다 바이러스 게놈에서 단편으로서 쉽게 얻어지고 바이러스 복제 원점을 포함할 수도 있기 때문에 특히 유용하다(Fiers et al. (1978), Nature 273:113; Kaufman (1990), Meth. in Enzymol. 185:487-511). Hind III 부위에서 복제 부위의 SV40 바이러스 기원에 위치한 BglI 부위로 연장되는 약 250 bp의 서열이 포함된다면, 더 작거나 더 큰 SV40 단편도 사용될 수 있다.
전사 종결 서열은 일반적으로 폴리펩티드 암호화 영역 말단의 3'에 위치하며 전사를 종결시키는 역할을 한다. 일반적으로, 원핵세포의 전사 종결 서열은 폴리-T 서열이 이어지는 G-C 풍부 단편이다. 서열은 라이브러리로부터 쉽게 클로닝되거나 벡터의 일부로서 상업적으로 구입되기도 하지만, 당업자에게 알려진 핵산 합성 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수도 있다.
선택 마커 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장한 숙주세포의 생존과 성장에 필요한 단백질을 암호화한다. 전형적인 선택 마커 유전자는 (a) 원핵 숙주세포에 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 테트라사이클린, 또는 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 단백질; (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하는 단백질; 또는 (c) 복합 또는 한정 배지에서 이용할 수 없는 중요 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다. 특정 선택 가능한 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유리하게는, 원핵 숙주세포 및 진핵 숙주세포 모두에서의 선택을 위해 네오마이신 내성 유전자가 또한 사용될 수 있다.
발현될 유전자를 증폭시키기 위해 다른 선택 가능한 유전자가 사용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존에 중요한 단백질의 생산에 필요한 유전자가 연속 세대의 재조합 세포의 염색체 내에서 일렬로 반복되는 과정이다. 포유동물 세포에 적합한 선택 가능한 마커의 예는 글루타민 합성효소(GS), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 무프로모터 티미딘 키나제 유전자를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환체는 벡터에 존재하는 선택 가능한 유전자에 의해 형질전환체만이 생존하도록 특유하게 적응되는 선택 압력 하에 놓인다. 형질전환된 세포를 배지 내 선택제의 농도가 연속적으로 증가하는 조건에서 배양함으로써 선택 압력을 가하여, 관심 단백질을 암호화하는 DNA와 선택 유전자 모두를 증폭시킨다. 그 결과, 증폭된 DNA로부터 증가된 양의 관심 폴리펩티드가 합성된다.
진핵 숙주세포 발현 시스템에서 글리코실화가 요구되는 경우와 같은 일부 경우에, 글리코실화 또는 수율을 개선하기 위해 다양한 프리- 또는 프로-서열을 조작할 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 펩티드의 펩티다제 절단 부위를 변경하거나, 프로서열을 추가할 수 있으며, 이 또한 글리코실화에 영향을 미칠 수 있다. 최종 단백질 산물은 (성숙 단백질의 제1 아미노산에 대한) -1 위치에, 완전히 제거되지 않았을 수 있는, 발현에 따른 하나 이상의 추가 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들어, 최종 단백질 산물은 아미노 말단에 부착된, 펩티다제 절단 부위에서 발견되는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 대안적으로, 일부 효소 절단 부위를 사용하면 효소가 성숙 폴리펩티드 내의 이러한 영역에서 절단하는 경우 목적하는 폴리펩티드의 약간 절단된 형태를 얻을 수 있다.
일반적으로 발현 및 클로닝은 숙주 유기체에 의해 인식되어 관심 단백질을 암호화하는 분자에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 구조적 유전자의 전사를 제어하는 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내의) 구조적 유전자의 개시 코돈의 상류(즉, 5')에 위치하는 전사되지 않은 서열이다. 프로모터는 전통적으로 두 부류, 즉, 유도성 프로모터 및 구성적 프로모터 중 하나로 분류된다. 유도성 프로모터는 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도 변화와 같은 배양 조건의 일부 변화에 반응하여 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 반면, 항시성 프로모터는 작동 가능하게 연결된 유전자를 균일하게 전사한다(즉 유전자 발현에 대한 제어가 거의 없거나 전혀 없음). 다양한 잠재적 숙주세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다.
포유동물 숙주세포와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 잘 알려져 있으며, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 포유동물 프로모터는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 열충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
관심을 가질 수 있는 추가의 프로모터는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: SV40 초기 프로모터(Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV 프로모터(Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); Rous 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복에 함유된 프로모터(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH); 메탈로티오닌 유전자로부터의 프로모터 및 조절 서열(Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 및 원핵생물 프로모터, 예컨대 베타-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75:3727-3731); 또는 tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). 다음의 동물 전사 제어 영역 또한 관심의 대상인데, 이들은 조직 특이성을 나타내며 유전자이식 동물에서 이용된다: 췌장 샘꽈리세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 림프세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역(PPinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); 간에서 활성인 알파-페토-단백질 유전자 제어 영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); 골수세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역(Sani, 1985, Nature 314:283-286); 및 시상하부에서 활성인 생식선자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
고등 진핵세포에 의한 전사를 증가시키기 위해 인핸서 서열이 벡터에 삽입될 수 있다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터 상에서 작용하는 길이가 보통 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용성 성분이다. 인핸서는 상대적으로 배향 및 위치 독립적이며, 전사 단위의 5' 및 3' 위치 모두에서 발견된다. 포유동물 유전자에서 얻을 수 있는 여러 인핸서 서열이 알려져 있다(예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린). 그러나, 일반적으로 바이러스의 인핸서가 사용된다. 당업계에 알려진 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 예시적 강화 요소이다. 인핸서는 벡터에서 암호화 서열의 5' 또는 3'에 위치할 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
관심 단백질의 세포외 분비를 촉진시키기 위해, 적절한 천연 또는 이종 신호 서열을 암호화하는 서열(리더 서열 또는 신호 펩티드)이 발현 벡터에 포함될 수 있다. 신호 펩티드 또는 리더의 선택은 관심 단백질이 생산되는 숙주세포의 유형에 따라 달라지며, 이종 신호 서열이 천연 신호 서열을 대체할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 기능적인 신호 펩티드의 예는 다음을 포함한다: 미국 특허 제4,965,195호에 기재된 인터류킨-7에 대한 신호 서열; 문헌[Cosman et al., 1984, Nature 312:768]에 기재된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; EP 특허 제0367 566호에 기재된 인터류킨-4 수용체 신호 펩티드; 미국 특허 제4,968,607호에 기재된 타입 I 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드; EP 특허 제0 460 846호에 기재된 타입 II 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드.
포유동물 발현 벡터로부터 이종 유전자의 발현을 개선하는 것으로 나타난 추가의 제어 서열은 CHO 세포에서 유래된 발현 증강 서열 요소(EASE)(Morris et al., Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); 미국 특허 6,312,951 B1호, 6,027,915호 및 6,309,841 B1호) 및 아데노바이러스 2의 3부분 리더(TPL) 및 VA 유전자 RNA(Gingeras et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:13475-13491)와 같은 요소를 포함한다. 바이러스 기원의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 디시스트론 mRNA가 효율적으로 번역될 수 있도록 한다(Oh and Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2697-2700).
작제 후, 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위한 적합한 세포에 하나 이상의 벡터가 삽입될 수 있다. 발현 벡터의 선택된 세포로의 형질전환은 형질주입, 감염, 인산칼슘 공침, 전기천공, 핵감염, 미량주입, DEAE-덱스트란 매개 형질주입, 양이온성 지질 매개 전달, 리포솜 매개 형질주입, 미립자 충격, 수용체 매개 유전자 전달, 폴리리신, 히스톤, 키토산 및 펩티드에 매개되는 전달을 비롯한 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로는, 사용될 숙주 세포의 유형에 따를 것이다. 이들 방법 및 다른 적합한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 매뉴얼 및 다른 기술 간행물, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)]에 제시되어 있다.
용어 "형질전환"은 세포의 유전적 특징의 변화를 지칭하며, 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 포함하도록 변형될 때 형질전환되었다. 예를 들어, 세포는 형질주입, 형질도입 또는 다른 기법을 통해 새로운 유전자 물질을 도입함으로써 천연 상태로부터 유전자 변형되는 경우에 형질전환된다. 형질주입 또는 형질도입 후, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 혼입되어 세포의 DNA와 재조합될 수 있거나, 복제되지 않고 일시적으로 에피솜 요소로서 유지될 수 있거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제할 수 있다. 형질전환 DNA가 세포 분열과 함께 복제될 때 세포는 "안정적으로 형질전환"된 것으로 간주된다.
용어 "형질주입"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 지칭한다. 다수의 형질주입 기법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197]을 참조한다.
용어 "형질도입"은 외래 DNA가 바이러스 벡터를 통해 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다. 문헌[Jones et al., (1998). Genetics: principles and analysis. Boston: Jones & Bartlett Publ]을 참조한다.
세포 배양 공정의 설명
본 명세서에 기재된 방법에서, 감소된 양의 IGF-1을 사용하거나 IGF-1을 사용하지 않는 것은 생산 실행의 임의의 또는 모든 단계에서 수행될 수 있다. 때때로 생산에 사용되는 세포 배양 배지는 본 명세서에서 제2 세포 배양 배지로 지칭된다. 이러한 제2 세포 배양 배지는 제1 세포 배양 배지와 동일한 농도의 IGF-1을 가질 필요는 없다. 제2 세포 배양 배지는 0.05 ㎎/ℓ 이하, 0.03 ㎎/ℓ 이하, 0.02 ㎎/ℓ 이하, 0.01 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1 농도를 갖거나 IGF-1을 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, IGF-1은 시드 규모, 생산 규모(N) 또는 그 사이(예를 들어, N-1, N-2 등)에서 0.03 ㎎/ℓ 이하까지 감소될 수 있다. 생산 규모에서, IGF-1은 적절한 경우 초기 세포 배양 배지 및/또는 관류 배지 또는 유가식 공급 배지에서 감소될 수 있다.
개시된 방법은 교반 탱크 반응기(스핀 필터를 포함할 수 있지만 반드시 포함할 필요는 없는 전통적인 회분식 및 유가식 세포 배양물 포함), 관류 시스템(교대 접선 유동("ATF") 배양물, 음향 관류 시스템, 심도 필터 관류 시스템 및 기타 시스템 포함), 중공 섬유 생물반응기(HFB, 이것은 일부 경우에 관류 공정에 사용될 수 있음)뿐만 아니라 기타 다양한 세포 배양 방법(예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Tao et al., 2003, Biotechnol. Bioeng. 82:751-65; Kuystermans & Al-Rubeai, (2011) "Bioreactor Systems for Producing Antibody from Mammalian Cells" in Antibody Expression and Production, Cell Engineering 7:25-52, Al-Rubeai (ed) Springer; Catapano et al., (2009) "Bioreactor Design and Scale-Up" in Cell and Tissue Reaction Engineering: Principles and Practice, Eibl et al. (eds) Springer-Verlag] 참조)에서 성장되는 부착 배양 또는 현탁 배양에 적용될 수 있다.
재조합 단백질 생산 동안 세포가 목적하는 밀도로 성장한 후 세포의 생리학적 상태가 세포가 에너지 및 기질을 사용하여 더 많은 세포를 만드는 것 대신에 관심 재조합 단백질을 생산하는 성장 정지 고 생산성 상태로 전환되는 제어된 시스템을 갖는 것이 바람직하다. 이 목표를 달성하기 위한 다양한 방법이 존재하며, 이러한 방법은 온도 변화 및 아미노산 결핍, 세포사멸을 유발하지 않고 세포 성장을 정지시킬 수 있는 세포 주기 저해제 또는 기타 분자의 사용을 포함한다.
재조합 단백질의 생산은 배양 플레이트, 플라스크, 튜브, 생물반응기 또는 기타 적합한 용기에서 단백질을 발현하는 세포의 포유동물 세포 생산 배양물을 확립하는 것으로 시작된다. 더 작은 생산 생물반응기가 전형적으로 사용되며, 일 실시형태에서 생물반응기는 500 ℓ 내지 2000 ℓ이다. 또 다른 실시형태에서, 1000ℓ~2000ℓ의 생물반응기가 사용된다. 생물반응기를 접종하는 데 사용되는 시드 세포 밀도는 생산되는 재조합 단백질의 수준에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 무혈청 배양 배지 중의 적어도 0.5 Х106 내지 최대 3.0 Х106개 및 그 초과의 생존 세포/㎖로 접종된다. 또 다른 실시형태에서, 접종은 1.0Х106개 생존 세포/㎖이다.
이후 포유동물 세포는 지수 성장 단계를 겪는다. 목적하는 세포 밀도에 도달할 때까지 보충 공급 없이 세포 배양물이 유지될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포 배양물은 보충 공급이 있거나 없이 최대 3일 동안 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 배양물은 간단한 성장 단계 없이 생산 단계를 시작하기 위해 목적하는 세포 밀도로 접종될 수 있다. 본 명세서의 임의의 실시형태에서, 성장 단계에서 생산 단계로의 전환은 또한 전술한 방법 중 임의의 것에 의해 개시될 수 있다.
성장 단계와 생산 단계 사이의 전환에서, 그리고 생산 단계 동안, 패킹 세포 부피의 백분율(PCV%)은 35% 이하일 수 있다. 예를 들어, 생산 단계 동안 유지되는 목적하는 패킹 세포 부피는 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하 또는 10% 이하이다.
성장 단계와 생산 단계 사이의 전환에서 그리고 생산 단계 동안 유지되는 목적하는 생존 세포 밀도는 프로젝트에 따라 다양할 수 있다. 이것은 과거 데이터로부터의 동등한 패킹 세포 부피에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생존 세포 밀도는 적어도 약 10Х106개 생존 세포/㎖ 내지 80Х106개 생존 세포/㎖, 적어도 약 10Х106개 생존 세포/㎖ 내지 70Х106개 생존 세포/㎖, 적어도 약 10Х106개 생존 세포/㎖ 내지 60Х106개 생존 세포/㎖, 적어도 약 10Х106개 생존 세포/㎖ 내지 50Х106개 생존 세포/㎖, 적어도 약 10Х106개 생존 세포/㎖ 내지 40Х106개 생존 세포/㎖, 적어도 약 10Х106개 생존 세포/㎖ 내지 30Х106개 생존 세포/㎖, 적어도 약 10Х106개 생존 세포/㎖ 내지 20Х106개 생존 세포/㎖, 적어도 약 20Х106개 생존 세포/㎖ 내지 30Х106개 생존 세포/㎖, 적어도 약 20Х106개 생존 세포/㎖ 내지 적어도 약 25Х106개 생존 세포/㎖, or 적어도 약 20Х106개 생존 세포/㎖일 수 있다.
생산 단계 동안 더 낮은 패킹 세포 부피는 더 높은 세포 밀도 관류 배양물을 방해할 수 있는 용존 산소 살포 문제를 완화하는 데 도움이 된다. 더 낮은 패킹 세포 부피는 또한 더 작은 배지 부피를 허용하는데 이것은 더 작은 배지 저장 용기를 사용할 수 있게 하고 더 느린 유량과 조합될 수 있다. 또한, 더 높은 세포 바이오매스 배양물에 비해 더 낮은 패킹 세포 부피는 수거 및 하류 가공에 미치는 영향이 적다. 이 모든 것은 재조합 단백질 치료제 제조와 관련된 비용을 감소시킨다.
포유동물 세포 배양에 의한 재조합 단백질의 생산을 위한 상업적인 공정에서는 전형적으로 회분식 배양, 유가식 배양 및 관류 배양의 세 가지 방법이 사용된다. 회분식 배양은 세포가 고정된 양의 배양 배지에서 짧은 시간 동안 성장된 후 전체가 수거되는 불연속적 방법이다. 회분식 방법을 사용하여 성장된 배양물은 최대 세포 밀도에 도달될 때까지 세포 밀도가 증가한 다음, 배지 성분이 소비되고 대사 부산물(예컨대, 락테이트 및 암모니아)이 축적됨에 따라서 생존 세포 밀도가 감소한다. 수거는 전형적으로 최대 세포 밀도가 달성되는 시점에 발생한다(예를 들어, 배지 제형, 세포주 등에 따라 5Х106개 세포/㎖ 이상). 회분식 공정은 가장 간단한 배양 방법이지만, 생존 세포 밀도는 영양소 가용성에 의해 제한되며 세포가 최대 밀도에 도달하면 배양이 감소하고 생산이 감소한다. 폐기물의 축적 및 영양소 고갈은 배양 감소(전형적으로 대략 3 내지 7일)로 급격하게 이어지기 때문에 생산 단계를 연장할 능력이 없다.
유가식 배양은 소비된 배지 성분을 보충하기 위해 볼러스 또는 연속 배지 공급을 제공함으로써 회분식 공정을 개선한다. 유가식 배양물은 실행 전반에 걸쳐 추가 영양소를 제공받기 때문에, 이것은 회분식 방법과 비교했을 때 더 높은 세포 밀도(배지 제형, 세포주 등에 따라 10 초과 내지 30Х106개 세포/㎖) 및 증가된 생성물 역가를 달성할 가능성이 있다. 회분식 공정과 달리, 목적하는 세포 밀도를 달성하기 위한 세포 증식 기간(성장 단계)과 중단되거나 느린 세포 성장 기간(생산 단계)을 구별하기 위해 공급 전략 및 배지 제형을 조작함으로써 2상 배양물이 생성되고 유지될 수 있다. 따라서, 유가식 배양물은 회분식 배양에 비해 더 높은 생성물 역가를 달성할 가능성이 있다. 전형적으로, 성장 단계 동안에는 회분식 방법이 사용되고, 생산 단계 동안에는 유가식 방법이 사용되지만, 전체 공정에 걸쳐 유가식 공급 전략이 사용될 수 있다. 그러나 회분식 공정과 달리 생물반응기 부피는 공급량을 제한하는 제한 요소이다. 또한 회분식 방법과 마찬가지로 대사 부산물 축적이 배양 감소로 이어질 것이고, 이것이 생산 단계 기간을 약 10 내지 21일로 제한한다. 유가식 배양물은 불연속적이며 수거는 전형적으로 대사 부산물 수준 또는 배양 생존율이 미리 결정된 수준에 도달할 때 발생한다. 공급이 일어나지 않는 회분식 배양과 비교할 때, 유가식 배양은 더 많은 양의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,672,502호를 참조한다.
관류 방법은 새로운 배지를 첨가하고 동시에 사용된 배지를 제거함으로써 회분식 및 유가식 방법에 비해 잠재적인 개선을 제공한다. 전형적인 대규모 상업용 세포 배양 전략은 반응기 부피의 거의 1/3 내지 1/2 초과가 바이오매스인 60 - 90(+)Х106개 세포/㎖의 높은 세포 밀도에 도달하기 위해 노력한다. 관류 배양으로, 1Х108개 세포/㎖ 초과의 극단적인 세포 밀도가 달성되었으며 훨씬 더 높은 밀도가 예측된다. 전형적인 관류 배양물은 하루 또는 이틀 동안 지속되는 회분식 배양물 시작으로 출발하고 그 다음 배양물에 새로운 공급 배지를 연속적으로, 단계적으로 그리고/또는 간헐적으로 첨가하고, 배양의 성장 단계 및 생산 단계 전체에서 세포 및 추가적인 고분자량 화합물, 예컨대, 단백질(필터 분자량 컷오프 기준)을 유지하면서 사용한 배지를 동시에 제거한다. 다양한 방법, 예컨대, 침전, 원심분리 또는 여과를 사용하여 세포 밀도를 유지하면서 사용한 배지를 제거할 수 있다. 하루당 작업 부피의 일부부터 하루당 작업 부피의 수 배까지의 관류 유량이 보고되었다.
관류 공정의 장점은 회분식 또는 유가식 배양 방법보다 생산 배양이 더 오랜 기간 동안 유지될 수 있다는 것이다. 그러나, 장기 관류 배양, 특히 또한 훨씬 더 많은 영양소가 필요한 높은 세포 밀도를 갖는 것을 지원하기 위해서는 증가된 배지 준비, 사용, 저장 및 폐기가 필요한데, 이들 모두는 회분식 및 유가식 방법에 비해서 생산 비용을 훨씬 더 높게 한다. 또한, 더 높은 세포 밀도는 생산 중의 문제, 예컨대, 용존 산소 수준 유지 및 더 많은 산소를 공급하고 더 많은 이산화탄소를 제거하는 것을 비롯한 증가된 가스 발생 문제를 유발할 수 있는데, 이는 더 많은 거품 발생 및 소포제 전략으로의 변경 필요성을 초래할 수 있고; 뿐만 아니라 과도한 세포 물질을 제거하는 데 필요한 노력이 생성물 손실을 초래하여 세포 질량 증가로 인한 역가 증가의 이점이 무효화될 수 있는 수거 및 하류 가공 중의 문제를 유발할 수 있다.
또한 성장 단계 동안 유가식 공급에 이어 생산 단계 동안 연속 관류를 조합하는 대규모 세포 배양 전략이 제공된다. 이 방법은 세포 배양이 35% 이하의 패킹 세포 부피로 유지되는 생산 단계를 목표로 한다.
일 실시형태에서, 볼러스 공급을 이용한 유가식 배양이 성장 단계 동안 세포 배양을 유지하는 데 사용된다. 그런 다음 생산 단계에서 관류 공급이 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 관류는 세포가 생산 단계에 도달했을 때 시작된다. 또 다른 실시형태에서, 관류는 세포 배양 대략 3일 내지 대략 9일차에 시작된다. 또 다른 실시형태에서, 관류는 세포 배양 대략 5일 내지 대략 7일차에 시작된다.
성장 단계 동안 볼러스 공급을 사용하면 세포가 생산 단계로 전환되어 생산 단계를 시작하고 제어하는 수단으로서 온도 변화에 덜 의존하게 되지만 성장 단계와 생산 단계 사이에 약 36℃에서 약 31℃로의 온도 변화가 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 변화는 36℃에서 32℃이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 생물반응기는 무혈청 배양 배지에서 적어도 0.5 Х106개 생존 세포/㎖ 내지 3.0Х106개 생존 세포/㎖, 예를 들어, 1.0Х106개 생존 세포/㎖로 접종될 수 있다.
관류 배양물은 세포 배양물이 신선한 관류 공급 배지를 받는 한편 동시에 소모된 배지를 제거하는 것이다. 관류는 지속적, 단계적, 간헐적 또는 이들 중 어느 것의 임의의 또는 모두의 조합일 수 있다. 관류 속도는 1일당 여러 번의 작업 용적에 대한 1회의 작업 용적 미만일 수 있다. 세포는 배양물에 보유되고, 제거되는 소모 배지는 세포가 실질적으로 없거나 배양물보다 유의하게 더 적은 세포를 가진다. 세포 배양에 의해 발현된 재조합 단백질도 배양에 유지될 수 있다. 관류는 원심분리, 침강, 또는 여과를 비롯한 다수의 수단에 의해 달성될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65]을 참조한다. 여과 방법의 예는 교번 접선 유동 여과이다. 교번 접선 유동은 중공-섬유 필터 모듈을 통해 배지를 펌핑함으로써 유지된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,544,424호; 문헌[Furey, 2002, Gen. Eng. News. 22 (7):62-63]을 참조한다.
"관류 유량"은 생물반응기로부터 통과(첨가 및 제거)되는 배지의 양이며, 전형적으로 주어진 시간에 작업 부피의 일부 또는 배수로 표현된다. "작업 부피"는 세포 배양에 사용되는 생물반응기 부피의 양을 지칭한다. 일 실시형태에서, 관류 유량은 1일당 1 작업량 부피 이하이다. 관류 공급 배지는 관류 영양소 농도를 최대화하여 관류 속도를 최소화하도록 제형화될 수 있다.
세포 배양물에는 세포 배양의 생산 단계 과정 동안 소비되는 영양분 및 아미노산과 같은 성분을 함유하는 농축 공급 배지가 보충될 수 있다.
농축 공급 배지는 거의 모든 세포 배지 제형을 기반으로 할 수 있다. 이러한 농축 공급 배지는 세포 배양 배지의 성분 대부분을, 예를 들어, 정상적인 양의 약 5Х, 6Х, 7Х, 8Х, 9Х, 10Х, 12Х, 14Х, 16Х, 20Х, 30X, 50Х, 100Х, 200Х, 400Х, 600Х, 800Х 또는 심지어는 약 1000Х로 함유할 수 있다. 농축 공급 배지는 유가 배양 공정에서 흔히 사용된다.
본 발명에 따른 방법은 다단계 배양 공정에서 재조합 단백질의 생산을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 다단계 공정에서, 세포는 두 개 이상의 별개의 단계에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 먼저 세포 증식 및 생존율을 최대화하는 환경 조건에서 하나 이상의 성장 단계로 배양된 후, 단백질 제조를 최대화하는 조건의 제조 단계로 전달될 수 있다. 포유동물 세포에 의한 단백질의 상업적 생산 공정에서, 최종 생산 배양에 앞서 상이한 배양 용기에서 수행되는 일반적으로 다수의, 예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 성장 단계가 존재한다.
성장 단계 및 생산 단계는 하나 이상의 전환 단계가 선행되거나 이에 의해 분리될 수 있다. 다중 단계 공정에서, 본 발명에 따른 방법은 적어도 상업용 세포 배양의 최종 생산 단계의 성장 단계 및 생산 단계 동안 사용될 수 있지만, 이것은 이전 성장 단계에서도 사용될 수 있다. 생산 단계는 대규모로 수행될 수 있다. 대규모 공정은 적어도 약 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10,000, 15,000, 20,000리터 부피로 수행될 수 있다. 일 실시형태에서 생산은 500 *?*, 1000 ℓl 및/또는 2000 *?*생물반응기에서 수행된다.
성장 단계는 생산 단계보다 높은 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 성장 단계는 약 35℃ 내지 약 38℃의 제1 온도에서 수행될 수 있고, 생산 단계는 약 29℃내지 약 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 약 36℃ 또는 약 30℃ 내지 약 34℃의 제2 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 온도 변화와 동시에, 그 이전 및/또는 이후에 카페인, 부티레이트 및 헥사메틸렌 비스아세트아미드(HMBA)와 같은 단백질 생산의 화학적 유도제가 첨가될 수 있다. 온도 변화 후에 유도제가 첨가되는 경우, 유도제는 온도 변화 1시간 내지 5일 후에, 선택적으로 온도 변화 1일 내지 2일 후에 첨가될 수 있다. 세포가 목적하는 단백질(들)을 생산하는 동안 세포 배양물은 며칠 또는 심지어는 몇 주 동안 유지될 수 있다.
세포 배양물로부터의 샘플은 당업계에 알려진 임의의 분석 기술을 사용하여 모니터링되고 평가될 수 있다. 배양 기간 동안 재조합 단백질 및 배지 품질 및 특징을 포함한 다양한 파라미터를 모니터링할 수 있다. 연속 모니터링, 실시간, 또는 거의 실시간을 포함하여 바람직한 빈도로 간헐적으로 샘플을 채취하고 모니터링할 수 있다.
전형적으로, 최종 생산 배양 이전의 세포 배양물(N-x 내지 N-1)은 생산 생물반응기, 즉 N-1 배양물을 접종하는 데 사용될 시드 세포를 생성하는데 사용된다. 시드 세포 밀도는 생산된 재조합 단백질의 수준에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 생성물 수준은 시드 밀도가 증가함에 따라 증가하는 경향이 있다. 역가의 개선은 더 높은 시드 밀도와 관련될 뿐만 아니라 생산에 투입되는 세포의 대사 및 세포 주기 상태에 의해 영향을 받을 가능성이 높다.
시드 세포는 임의의 배양 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 교대 접선 유동 여과를 사용하는 관류 배양이다. N-1 생물반응기는 생산 생물반응기에 접종하기 위해 고밀도의 세포를 제공하기 위해 교대 접선 유동 여과를 사용하여 작동될 수 있다. N-1 단계는 90Х106개 세포/㎖ 초과의 밀도로 세포를 성장시키는 데 사용될 수 있다. N-1 생물반응기는 볼러스 시드 배양물을 생성하는 데 사용될 수 있거나, 높은 시드 세포 밀도에서 다중 생산 생물반응기에 시딩하기 위해 유지될 수 있는 롤링 시드 스톡 배양물로 사용될 수 있다. 생산의 성장 단계의 기간은 7일 내지 14일의 범위일 수 있고, 생산 생물반응기의 접종 전에 세포를 기하급수적 성장 상태로 유지하도록 설계될 수 있다. 관류 속도, 배지 제형 및 시기는 세포를 성장시키고 세포를 생산 최적화에 가장 도움이 되는 상태로 생산 생물반응기에 전달하도록 최적화된다. 생산 생물반응기에서의 시딩을 위해서 15Х106개 세포/㎖ 초과의 시드 세포 밀도가 달성될 수 있다. 접종 시 시드 세포 밀도가 높을수록 목적하는 생산 밀도에 도달하는 데 필요한 시간이 줄어들거나 심지어 제거될 수도 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 포유동물 숙주 세포 및 방법을 사용하여 관심 단백질을 고수율로 생성할 수 있다. 관심 단백질을 높은 수준으로 생산하는 세포의 능력에 관한 높은 수율 또는 높은 부피 생산성. 구체적인 수율은 관심 단백질에 좌우될 것이고, 포유동물 숙주 세포에 적합한 공급 배지를 사용하고 감소된 양의 IGF-1을 함유하거나 또는 IGF-1이 결여되어 있으면서 아미노산, 비타민 또는 미량 원소를 함유하는 유가식 또는 관류 조건에서 성장되는 10일 배양에서 적어도 0.05 g/ℓ, 적어도 0.1 g/ℓ, 적어도 0.15 g/ℓ, 적어도 0.2 g/ℓ, 적어도 0.25 g/ℓ, 적어도 0.3 g/ℓ, 적어도 0.35 g/ℓ, 적어도 0.4 g/ℓ, 적어도 0.45 g/ℓ, 적어도 0.5 g/ℓ, 적어도 0.6 g/ℓ, 적어도 0.7 g/ℓ, 적어도 0.8 g/ℓ, 적어도 0.9 g/ℓ, 적어도 1 g/ℓ, 적어도 1.5 g/ℓ, 적어도 2 g/ℓ 또는 그 초과일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 숙주 세포 및 방법은 관심 단백질을 발현하고, 상기에 기재된 배양 조건 하에서 성장되는 경우 적어도 0.5 g/ℓ, 적어도 0.6 g/ℓ, 적어도 0.7 g/ℓ, 적어도 0.8 g/ℓ, 적어도 0.9 g/ℓ, 적어도 1 g/ℓ, 적어도 1.5 g/ℓ, 적어도 2 g/ℓ 또는 그 초과, 바람직하게는 최대 약 3 g/ℓ, 4 g/ℓl, 5 g/ℓl 또는 10 g/ℓ를 생산할 수 있다.
수율은 또한 하루당 세포당 생산되는 단백질의 양(pg/세포/일로 표현됨)을 기준으로 결정되는 세포주의 특정 생산성 측면에서 측정될 수 있다. 본 개시내용의 포유동물 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포에 적합한 공급 배지를 사용하고 감소된 양의 IGF-1을 함유하거나 또는 IGF-1이 결여되어 있으면서 아미노산, 비타민 또는 미량 원소를 함유하는 유가식 또는 관류 조건에서 성장되는 10일 배양에서 적어도 1 pg/세포/일, 적어도 2 pg/세포/일, 적어도 3 pg/세포/일, 적어도 4 pg/세포/ 일, 적어도 5 pg/세포/일, 적어도 6 pg/세포/일, 적어도 7 pg/세포/일, 적어도 8 pg/세포/일, 적어도 9 pg/세포/일, 적어도 10 pg/세포/일, 적어도 11 pg/세포/일, 적어도 12 pg/세포/일, 적어도 13 pg/세포/일, 적어도 14 pg/세포/일, 적어도 15 pg/세포/일, 적어도 20 pg/세포/일, 적어도 25 pg/세포/일 또는 그 초과, 바람직하게는 최대 50 pg/세포/일을 생산할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 개시내용의 포유동물 숙주 세포는 관심 단백질을 발현하고, 상기에 기재된 배양 조건 하에서 적어도 10 pg/세포/일, 적어도 11 pg/세포/일, 적어도 12 pg/세포/일, 적어도 13 pg/세포/일, 적어도 14 pg/세포/일, 적어도 15 pg/세포/일, 적어도 20 pg/세포/일, 적어도 25 pg/세포/일 또는 그 초과, 바람직하게는 최대 50 pg/세포/일의 특정 생산성을 갖는다.
본 명세서에 기재된 방법은 관심 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 데 사용될 수 있다. 발현된 단백질은 회수 및/또는 수집될 수 있는 배양 배지로 분비될 수 있다. 또한, 단백질은 알려진 공정 및 상업적 공급업체로부터 이용 가능한 제품을 사용하여 이러한 배양 또는 성분으로부터(예컨대, 배양 배지로부터) 정제되거나, 부분적으로 정제될 수 있다. 이어서 정제된 단백질은 "제형화"될 수 있다(즉, 완충제가 교환되고, 멸균화되고, 벌크-패키징되고/되거나 최종 사용자를 위해 패키징될 수 있다). 약제학적 조성물에 적합한 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18thed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa]에 기재된 것을 포함한다.
관심 단백질
관심 폴리펩티드 및 단백질은 단백질-기반 치료제를 포함하여 과학적 또는 상업적 관심 대상일 수 있다. 관심 단백질은 특히 분비 단백질, 비-분비 단백질, 세포 내 단백질, 또는 막 결합 단백질을 포함한다. 관심 폴리펩티드 및 단백질은 세포 배양 방법을 사용하여 재조합 동물 세포주에 의해 생산될 수 있으며, "재조합 단백질"로 지칭될 수 있다. 발현되는 단백질(들)은 이들이 회수되고/되거나 회수될 수 있는 배양 배지 내로 분비되거나 세포내 제조될 수 있다. 용어 "단리된 단백질" 또는 "단리된 재조합 단백질"은 치료, 진단, 예방, 연구, 또는 기타 사용을 방해하는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 기타 오염 물질로부터 분리 정제된 관심 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 관심 단백질은 표적, 특히 하기 열거된 것들(이들로부터 유래된 표적, 이들과 관련된 표적 및 이들의 변형을 포함함) 중의 표적에 결합하여 치료 효과를 발휘하는 단백질을 포함한다.
관심 단백질은 "항원 결합 단백질"을 포함한다. 항원 결합 단백질은 결합하는 다른 분자(항원)에 대해 친화성을 갖는 항원 결합 영역 또는 항원 결합 부분을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 항원 결합 단백질은 항체, 펩티바디, 항체 단편, 항체 유도체, 항체 유사체, 융합 단백질(단일 쇄 가변 단편(scFv), 이중 쇄(2가) scFv 및 IgGscFv 포함)(예를 들어, 문헌[Orcutt et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23:221-228] 포함), 헤테로-IgG(예를 들어, 문헌[ㄴLiu et al., 2015, J Biol Chem 290:7535-7562] 참조), 뮤테인 및 XmAb®(Xencor, Inc., 미국 캘리포니아주 몬로비아 소재)를 포함한다. 항원 결합 단백질의 예는 인간 항체, 인간화 항체; 키메라 항체; 재조합 항체; 단일 쇄 항체; 디아바디; 트리아바디, 테트라바디; Fab 단편; F(ab')2 단편; IgD 항체; IgE 항체; IgM 항체; IgG1 항체; IgG2 항체; IgG3 항체; 또는 IgG4 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 또한, 이중특이적 T세포 관여자(BiTE®), 반감기 연장과 같은 연장을 갖는 이중특이적 T세포 관여자, 예를 들어, HLE BiTE, 헤테로Ig BITE 등, 키메라 항원 수용체(CAR, CAR T) 및 T세포 수용체(TCR)가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단백질"은 가장 넓은 의미로 사용되며, 항원 ?척? 표적에 결합하는 부분을 포함하고, 선택적으로, 항원으로의 항원 결합 단백질의 결합을 촉진하는 입체배열(conformation)을 항원 결합 부분이 채택할 수 있게 하는 스캐폴드 또는 프레임워크 부분을 포함하는 단백질이다. 항원 결합 단백질은 예를 들어, 그래프팅된 CDR 또는 CDR 유도체를 갖는 대안적인 단백질 스캐폴드 또는 인공 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이러한 골격에는, 예를 들어, 항원 결합 단백질의 3차원 구조를 안정화하기 위해 도입된 돌연변이를 포함하는 항체 유래 골격뿐만 아니라, 예를 들어, 생체적합성 중합체를 포함하는 전체 합성 골격이 비제한적으로 포함된다. 예를 들어, 문헌[Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654]을 참조한다. 또한, 펩티드 항체 모방체("PAM")뿐만 아니라, 스캐폴드로서 피브로넥틴 성분을 사용하는 항체 모방체에 근거한 스캐폴드를 사용할 수 있다.
항원 결합 단백질은, 예를 들어, 자연 발생 면역글로불린의 구조를 가질 수 있다. "면역글로불린"은 사량체 분자이다. 자연 발생 면역글로불린에서, 각각의 사량체는 각각의 쌍이 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약50-70kDa)를 갖는 두 개의 동일한 폴리펩티드 쇄의 쌍으로 이루어진다. 각각의 쇄의 아미노-말단부는 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시 말단부는 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다.
천연 생성 면역글로불린 쇄는 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불리는 3개의 고가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. N-말단에서부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄는 모두 도메인들 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인으로의 아미노산들의 지정은 문헌[Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, (1991)]의 정의에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 경우, CDR은 Chothia의 것과 같은 대안적인 명명법 체계에 따라서 정의될 수도 있다(문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883 또는 Honegger and Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309:657-670] 참조).
본 개시내용의 맥락에서, 항원 결합 단백질은 해리 상수(KD)가 10-8 M 이하인 경우 표적 항원에 "특이적으로 결합하거나" 또는 "선택적으로 결합"한다고 한다. 항체는 KD가 5Х10-9 M 이하이면 "높은 친화성"으로 항체에 특이적으로 결합하고 KD가 5Х10-10 M 이하이면 "매우 높은 친화도"로 항체에 특이적으로 결합한다.
용어 "항체"는 달리 명시되지 않는 한 임의의 이소형 또는 하위부류의 글리코실화 및 비글리코실화 면역글로불린 모두에 대한 언급, 또는 특이적 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는 항원 결합 영역에 대한 언급을 포함한다. 추가로, 용어 "항체"는 달리 명시되지 않는 한, 특이적 결합에 대해서 온전한 항체와 경쟁하는 온전한 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있으며 관심 단백질의 요소를 형성할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 항체는 인간, 인간화, 키메라, 다중특이적, 단클론성, 다클론성, 헤테로IgG, 이중특이적 항체 및 이들의 올리고머 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 항체는 lgG1-, lgG2-, lgG3-, 또는 lgG4-타입을 포함한다. 또한, 표적 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디, Fd, dAb, 맥시바디, 단쇄 항체 분자, 단일 도메인 VHH, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 폴리펩티드와 같은 항원 결합 단편 또는 영역을 갖는 단백질이 포함된다.
항원 결합 단백질은 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 둘 이상의 결합 부위가 있는 경우, 결합 부위는 서로 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 예를 들어, 천연 생성 인간 면역글로불린은 통상 2개의 동일한 결합 부위를 갖는 반면, "이특이적" 또는 "이기능적" 항체는 2개의 상이한 결합 부위들을 갖는다.
Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 갖는 1가 단편이다; F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 디설피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편이다; Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인을 갖는다; Fv 단편은 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는다; 그리고 dAb 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 또는 VL 도메인의 항원 결합 단편을 갖는다(미국 특허 제6,846,634호, 제6,696,245호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0202512호, 제2004/0202995호, 제2004/0038291호, 제2004/0009507호, 제2003/0039958호, Ward et al., 1989, Nature 341:544-546).
단일 쇄 항체(scFv)는 VL 및 VH 영역이 링커(예를 들어, 아미노산 잔기의 합성 서열)를 통해 연결되어 연속 단백질 쇄를 형성하는 항체이며, 여기서 링커는 단백질 쇄가 스스로 되접혀서 1가 항원 결합 부위를 형성할 수 있을 정도로 길다(예를 들어, 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-26 및 Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83], 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호뿐만 아니라 문헌[Eshhar et al., 1997, Cancer Immunol Immunotherapy 45:131-136] 참조). scFv는 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 모 항체의 능력을 보유한다.
디아바디는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 2가 항체이며, 여기서 각각의 폴리펩티드 쇄는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함하며 링커는 짧아서 두 도메인들 간의 동일한 쇄 상에서의 쌍 형성을 허용하지 않고 따라서 각각의 도메인은 또 다른 폴리펩티드 쇄 상에서 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 된다(예를 들어, 문헌[Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48; 및 Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23] 참조). 디아바디의 두 폴리펩티드 쇄가 동일한 경우, 이들의 쌍 형성으로 생성되는 디아바디는 2개의 동일한 항원 결합 부위를 가질 것이다. 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드 쇄를 이용하여 2개의 상이한 항원 결합 부분을 갖는 디아바디를 제조할 수 있다. 유사하게, 트리아바디 및 테트라바디는 각각 3개 및 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함하며 각각 동일하거나 상이할 수 있는 3개 및 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 항체이다.
명확성을 위해, 그리고 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항원 결합 단백질은 인간 기원일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없으며, 일부 경우에 비인간 단백질을 포함할 것이라는 점에 유의한다. 예를 들어, 래트 또는 뮤린 단백질, 그리고 다른 경우 항원 결합 단백질은 인간과 비인간 단백질의 하이브리드(예를 들어, 인간화 항체)를 포함할 수 있다.
관심 단백질은 인간 항체를 포함할 수 있다. 용어 "인간 항체"란 인간 면역글로불린 서열에서 유래된 하나 이상의 가변 및 불변 영역을 갖는 모든 항체를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 모든 가변 및 불변 도메인은 인간 면역글로불린(완전인간 항체) 서열에서 유래된다. 이러한 항체는 인간 중쇄 및/또는 경쇄 암호화 유전자로부터 유래된 항체를 발현하도록 유전자 변형된 마우스, 예컨대, Xenomouse®, UltiMabTM 또는 Velocimmune® 시스템으로부터 유래된 마우스 또는 UniRat®로부터 유래된 래트를 관심 항원으로 면역화시키는 것을 포함하는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 파지 기반 접근법도 사용될 수 있다.
대안적으로, 관심 단백질은 인간화 항체를 포함할 수 있다. "인간화 항체"는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 비인간 종 유래의 항체 서열과 상이한 서열을 가져서 인간화 항체는 인간 대상체에 투여될 때 비인간 종의 항체에 비해 면역 반응을 유도할 가능성이 더 적고/적거나 덜 심한 면역 반응을 유도한다. 일 실시형태에서, 비인간 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 프레임워크 및 불변 영역의 특정 아미노산이 돌연변이되어 인간화 항체를 생성한다. 또 다른 실시형태에서, 인간 항체의 불변 도메인(들)이 비인간 종들의 가변 도메인(들)에 융합된다. 인간화 항체의 제조 예는 미국 특허 제6,054,297호, 제5,886,152호 및 제5,877,293호에서 찾아볼 수 있다.
또한, 비공유 결합, 공유 결합, 또는 공유 및 비공유 결합에 의해 화학적으로 변형된 단백질과 같은 변형된 단백질이 포함된다. 또한, 세포 변형 시스템에 의해 제조될 수 있는 하나 이상의 번역 후 변형 또는 효소적 및/또는 화학적 방법에 의해 생체외에 도입되거나 다른 방식으로 도입될 수 있는 변형을 추가로 포함하는 단백질이 포함된다.
관심 단백질은 또한, 예를 들어, 류신 지퍼, 코일드 코일(coiled coil), 면역글로불린의 Fc 부분 등과 같은 다량체화 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 분화 항원(CD 단백질이라고 함) 또는 이의 리간드 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 유사한 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질이 포함된다.
일부 실시형태에서, 관심 단백질은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자를 포함할 수 있다. 그러한 G-CSF 제제는, 비제한적으로 Neupogen®(필그라스팀) 및 Neulasta®(페그필그라스팀)을 포함한다. 또한, Epogen®(에포에틴 알파), Aranesp®(다르베포에틴 알파), Dynepo®(에포에틴 베타), Mircera®(메톡시 폴리에틸렌 글리콜-에포에틴 베타), Hematide®, MRK-2578, INS-22, Retacrit®(에포에틴 제타), Neorecormon®(에포에틴 베타), Silapo®(에포에틴 제타), Binocrit®(에포에틴 알파)，에포에틴 알파 헥살, Abseamed®(에포에틴 알파), Ratioepo®(에포에틴 세타), Eporatio®(에포에틴 세타), Biopoin®(에포에틴 세타), 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 에포에틴 제타, 에포에틴 세타 및 에포에틴 델타, 에포에틴 오메가, 에포에틴 이오타, 조직 플라스미노겐 활성화제, GLP-1 수용체 효능제 및 이의 분자 또는 변이체 또는 유사체 및 전술한 것들 중 임의의 것의 바이오시밀러의 적혈구 생성 자극제(ESA)가 포함된다.
일부 실시형태에서, 관심 단백질은 하나 이상의 CD 단백질, HER 수용체 패밀리 단백질, 세포 부착 분자, 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 전환 성장 인자(TGF), 인슐린-유사 성장 인자, 골유도 인자, 인슐린 및 인슐린 관련 단백질, 응고 및 응고 관련 단백질, 콜로니 자극 인자(CSF), 기타 혈액 및 혈청 단백질 혈액형 항원, 수용체, 수용체 관련 단백질, 성장 호르몬, 성장 호르몬 수용체, T-세포 수용체, 신경영양 인자, 뉴로트로핀, 릴렉신, 인터페론, 인터류킨, 바이러스 항원, 지단백질, 인테그린, 류마티스 인자, 면역독소, 표면 막단백질, 수송 단백질, 귀소 수용체, 어드레신, 조절 단백질 및 면역어드헤신에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 관심 단백질은 단독의 또는 임의의 조합의 다음 중 하나 이상에 결합한다: CD 단백질(CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD40, CD70, CD123, CD133, CD138, CD171 및 CD174가 포함되지만 이에 제한되지 않음), HER 수용체 패밀리 단백질(예를 들어, HER2, HER3, HER4 포함) 및 EGF 수용체, EGFRvIII, 세포 부착 분자, 예를 들어, LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 알파 v/베타 3 인테그린, 성장 인자(예를 들어, 혈관 내피 성장 인자("VEGF")가 포함되지만 이에 제한되지 않음); VEGFR2, 성장 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 뮬러관-억제 물질, 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파), 에리트로포이에틴(EPO), 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들어, aFGF 및 bFGF 포함), 표피 성장 인자(EGF), 크립토, 전환 성장 인자(TGF)(특히 TGF-α 및 TGF-β(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함) 포함), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I) 및 골유도 인자, 인슐린 및 인슐린 관련 단백질(인슐린, 인슐린 A-쇄, 인슐린 B-쇄, 프로인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질이 포함되지만 이에 제한되지 않음); (응고 및 응고 관련 단백질, 예를 들어, 특히, 인자 VIII, 조직 인자, 폰빌레브란트(von Willebrand) 인자, 단백질 C, 알파-1-항트립신, 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 유로키나아제 및 조직 플라스미노겐 활성화제("t-PA"), 봄바진, 트롬빈, 트롬보포이에틴 및 트롬보포이에틴 수용체, 콜로니 자극 인자(CSF)(특히 하기 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF 포함), 기타 혈액 및 혈청 단백질(알부민, IgE 및 혈액형 항원이 포함되지만 이에 제한되지 않음), 수용체 및 수용체 관련 단백질(예를 들어, flk2/flt3 수용체, 비만(OB) 수용체, 성장 호르몬 수용체 및 T-세포 수용체 포함); 신경영양 인자(골-유래 신경영양 인자(BDNF) 및 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6)이 포함되지만 이에 제한되지 않음); 릴렉신 A-쇄, 릴렉신 B-쇄 및 프로릴렉신, 인터페론(예를 들어, 인터페론-알파, -베타 및 -감마 포함), 인터류킨(IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-23, IL-12/IL-23, IL-2Ra, IL1-R1, IL-6 수용체, IL-4 수용체 및/또는 수용체에 대한 IL-13, IL-13RA2, 또는 IL-17 수용체, IL-1RAP,; 바이러스 항원(AIDS 외피 바이러스 항원이 포함되지만 이에 제한되지 않음), 지단백질, 칼시토닌, 글루카곤, 심방 나트륨이뇨 인자, 폐 계면활성제, 종양 괴사 인자-알파 및 -베타, 엔케팔리나아제, BCMA, Ig카파, ROR-1, ERBB2, 메소텔린, RANTES(정상적으로 발현 및 분비된 T-세포의 활성화 시에 조절됨), 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드, DNase, FR-알파, 인히빈 및 액티빈, 인테그린, 단백질 A 또는 D, 류마티스 인자, 면역독소, 골형성 단백질(BMP), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 표면 막 단백질, 분해 가속 인자(DAF), AIDS 외피, 수송 단백질, 귀소 수용체, MIC(MIC-a, MIC-B), ULBP 1-6, EPCAM, 어드레신, 조절 단백질, 면역어드헤신, 항원 결합 단백질, 소마트로핀, CTGF, CTLA4, 에오탁신-1, MUC1, CEA, c-MET, 클라우딘(Claudin)-18, GPC-3, EPHA2, FPA, LMP1, MG7, NY-ESO-1, PSCA, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GM2, BAFF, OPGL(RANKL), 미오스타틴, Dickkopf-1(DKK-1), Ang2, NGF, IGF-1 수용체, 간세포 성장 인자(HGF), TRAIL-R2, c-Kit, B7RP-1, PSMA, NKG2D-1, 세포예정사 단백질 1 및 리간드, PD1 및 PDL1, 만노스 수용체/hCGβ, C형 간염 바이러스, 메소텔린 dsFv[PE38 접합체, 레지오넬라-뉴모필라(lly), IFN 감마, 인터페론 감마 유도 단백질 10(IP10), IFNAR, TALL-1, 흉선 기질 림포포이에틴(TSLP), 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9(PCSK9), 줄기 세포 인자, Flt-3, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), OX40L, α4β7, 혈소판 특이적(혈소판 당단백질 IIb/IIIb(PAC-1), 전환 성장 인자 베타(TFGβ), 투명대 정자-결합 단백질 3(ZP-3), TWEAK, 혈소판-유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα), 스클레로스틴 및 상기 중 임의의 생물학적 활성 단편 또는 변이체.
다른 실시형태에서, 관심 단백질은 압식시맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 애플리버셉트, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아나킨라, 아타시셉트, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 비오소주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 칸투주맙 메르탄신, 카나키누맙, 세툭시맙, 세르톨리주맙 페골, 코나투무맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에타너셉트, 에볼로쿠맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 젬투주맙, 골리무맙, 이브리투모맙 튜세탄, 인플릭시맙, 이필리무맙, 레르델리무맙, 루밀릭시맙, 익세키주맙, 마파투무맙, 모테사닙 디포스페이트, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 네시리티드, 니모투주맙, 니볼루맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오프렐베킨, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 라니비주맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로미플로스팀, 로모소주맙, 사그라모스팀, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 비실리주맙, 볼로식시맙, 자놀리무맙, 잘루투무맙 및 이들 중 임의의 것의 바이오시밀러를 포함한다.
본 발명에 따른 관심 단백질은 전술한 모든 것을 포함하며, 전술한 항체 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체를 추가로 포함한다. 하나 이상의 CDR이 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 혼입되어, 항원 결합 단백질로 만들 수 있다. 항원 결합 단백질은 더 큰 폴리펩티드 쇄의 부분으로서 CDR(들)을 혼입시킬 수 있거나, 다른 폴리펩티드 쇄에 CDR(들)을 공유 결합시킬 수 있거나, 또는 CDR(들)을 비공유적으로 혼입시킬 수 있다. CDR들은 항원 결합 단백질이 관심 대상인 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있도록 한다. 또한, 아미노산 서열이 관심 단백질의 기준 아미노산 서열과 70% 이상, 특별히 80% 이상, 더 특별히 90% 이상, 훨씬 더 특별히 95% 이상, 구체적으로는 97% 이상, 더 구체적으로는 98% 이상, 훨씬 더 구체적으로는 99% 이상 동일한 영역을 포함하는 변이체가 포함된다. 이와 관련하여 동일성은 쉽게 입수 가능하고 잘 알고 있는 다양한 아미노산 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 선호되는 소프트웨어는 서열 검색 및 정렬 문제에 대한 만족스러운 해결책으로 간주되는 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm)을 구현하는 소프트웨어를 포함한다. 특히 속도가 중요한 고려 사항인 경우 다른 알고리즘도 사용될 수 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 DNA, RNA 및 폴리펩티드의 정렬 및 상동성 매칭을 위해 일반적으로 사용되는 프로그램은 FASTA, TFASTA, BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLASTN, PROSRCH, BLAZE 및 MPSRCH를 포함하며, 후자는 MasPar에서 만든 대규모 병렬 프로세서에서 실행하기 위한 스미스-워터맨 알고리즘의 구현이다.
관심 단백질은 또한 키메라 항원 수용체(CAR 또는 CAR-T)와 같은 유전자 조작된 수용체뿐만 아니라, 이러한 표적화된 항원과 상호작용하는 항원 결합 분자를 포함하는 다른 단백질을 포함할 수 있다. CAR은 이러한 표적화된 항원과 상호작용하는 항원 결합 분자를 혼입함으로써 항원(예컨대, 세포-표면 항원)에 결합하도록 조작될 수 있다. CAR은 일반적으로 하나 이상의 공동자극("신호전달") 도메인 및 하나 이상의 활성화 도메인과 일렬로 항원 결합 도메인(예컨대 scFv)을 포함한다.
바람직하게는, 항원 결합 분자는 이의 항체 단편이고, 보다 바람직하게는 하나 이상의 단일 쇄 항체 단편("scFv")이다. scFv는 다른 CAR 성분과 함께 단일 쇄의 일부로서 발현되도록 조작될 수 있기 때문에 키메라 항원 수용체에 사용하는 데 선호된다. 문헌[Krause et al., 1988, J. Exp. Med., 188(4): 619-626; Finney et al., 1998, J Immunol 161: 2791-2797]을 참조한다.
키메라 항원 수용체는 효능을 높이기 위해 하나 이상의 공자극(신호전달) 도메인을 포함한다. 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호뿐만 아니라 문헌[Krause et al. and Finney et al. (상기), Song et al., 2012, Blood 119:696-706; Kalos et al., 2011, Sci Transl. Med. 3:95; Porter et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365:725-33, 및 Gross et al., 2016, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83]을 참조한다. 적합한 공자극 도메인은 여러 공급원 중에서도 특히 CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3(알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타), CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD 33, CD37, CD40, CD 45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1(CDl la/CD18)), CD247, CD276(B7-H3), LIGHT(종양괴사인자 수퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 클래스 I 분자, TNF, TNFr, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자, BTLA, 톨(Toll) 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl-ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl-la, LFA-1, ITGAM, CDl-lb, ITGAX, CDl-lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, 41-BB, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 리간드, 또는 이들의 단편 또는 조합으로부터 유래될 수 있다. 공자극 도메인은 세포외 부분, 막관통 부분 및 세포내 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
CAR은 또한 하나 이상의 활성화 도메인을 포함한다. CD3 제타는 천연 T세포 상의 T세포 수용체의 요소이며, CAR에서 중요한 세포내 활성화 요소인 것으로 나타났다.
CAR은 막관통 단백질이며, 세포외 도메인을 포함하고, 관심 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질을 일반적으로 함유하고, 또한 "힌지" 영역을 포함한다. 또한 막관통 도메인 및 세포내(세포질) 도메인이 있다.
세포외 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 단백질 또는 이의 임의의 조합으로부터의 항원에 대한 림프구의 신호전달 및 효율적인 반응에 유익하다. 세포외 도메인은 합성 또는 천연 공급원, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 단백질로부터 유래될 수 있다. 세포외 도메인은 대개 힌지 부분을 포함한다. 이는 때로는 "스페이서" 영역으로 지칭되는, 세포외 도메인의 일부이다. 힌지는 본 명세서에 기재된 단백질, 특히 상기 공동자극 단백질뿐만 아니라 면역글로불린(Ig) 서열 또는 다른 적합한 분자에서 유래되어 표적 세포로부터 목적하는 특정 거리를 달성할 수 있다.
막관통 도메인은 CAR의 세포외 도메인에 융합될 수 있다. 유사하게 막관통 도메인은 CAR의 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 막관통 도메인은 합성 또는 천연 공급원, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 단백질, 특히 상기 공동자극 단백질로부터 유래될 수 있다.
세포내(세포질) 도메인은 막관통 도메인에 융합될 수 있으며, 면역세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 제공할 수 있다. T세포의 효과기 기능은 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 세포내 도메인은 본 명세서에 기재된 단백질, 특히 CD3으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디설피드 결합에 의해 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다. 항원 결합 단백질 및 Fc 융합 단백질을 포함하여 Fc 영역을 포함하는 관심 단백질은 본 개시내용의 또 다른 측면을 형성한다.
"헤미바디"는 완전한 중쇄, 완전한 경쇄 및 완전한 중쇄의 Fc 영역과 쌍을 이루는 제2 중쇄 Fc 영역을 포함하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 작제물이다. 링커는 중쇄 Fc 영역과 제2 중쇄 Fc 영역을 연결하기 위해 사용될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 특정 실시형태에서, 헤미바디는 본 명세서에 개시된 항원 결합 단백질의 1가 형태이다. 다른 실시형태에서, 하전된 잔기 쌍을 사용하여 하나의 Fc 영역을 제2 Fc 영역과 회합시킬 수 있다. 헤미바디는 본 개시내용의 맥락에서 관심 단백질일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 숙주세포, 면역세포, 조성물 등을 제조하는 데 다양한 공지 기술이 사용될 수 있다.
본 발명의 개별 양태의 단일 예시로서 의도된 본 명세서에서 기재된 특정 실시형태에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 성분은 본 발명의 범위 내에 속한다. 실제로, 본 명세서에서 나타내고 기재된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변형은 첨부되는 청구범위의 범위 내에 속하는 것이다.
실시예
실시예 1.
일상적인 배양을 위해, 세포를 선택 배지에서 현탁액으로 배양하였다. 배양물을 36℃, 5% CO2 및 85% 상대 습도에서 배기형 125 ㎖ 또는 250 ㎖ 삼각 진탕 플라스크(Corning Life Sciences, 미국 메사추세츠주 로웰 소재), 50 ㎖ 배기형 스핀 튜브(TPP, Trasadingen, 스위스 소재) 또는 Axygen® 24웰 딥 웰 플레이트(Axygen, 미국 캘리포니아주 유니온 시티 소재)에서 유지시켰다. 대용량 자동 CO2 인큐베이터(Thermo Fisher Scientific, 미국 메사추세츠주 왈탐 소재)에서 삼각 플라스크를 25 mm 궤도 직경으로 120 rpm으로 진탕하고, 스핀 튜브를 대용량 ISF4-X 인큐베이터(Kuhner AG, 스위스 바젤 소재)에서 225 rpm, 50 mm 궤도 직경으로 진탕하였다.
IGF-1이 없는 배지에 대한 CHO GSKO 숙주 세포의 적응
글루타민 합성효소 넉아웃(GSKO) 숙주 세포주를 IGF-1(Long R3 IGF-1)이 없는 배지에 적응시켰다. 이들 숙주 세포를 2가지의 상이한 방법을 사용하여 적응시켰다. 첫 번째 방법은 IGF-1이 없는 독점 배지(Long R3 IGF-1)에 대한 점진적 적응이었다. 이 배지는 GSKO 숙주 세포에 대한 표준 비선택적 숙주 세포 배지가 아니므로, 세포를 먼저 100% IGF-1(Long R3 IGF-1)을 함유하는 상이한 독점 배지에 적응시킨 후 IGF-1을 다음 증분으로 점진적으로 빼냈다: 75%, 50%, 25%, 10%의 IGF-1 및 마지막에는 IGF-1 없음. 적응 기간을 110개 초과의 집단 배가 수준(PDL)으로 확장시켰다. 도 1a를 참조한다. 이러한 적응된 세포주는 IGF-1을 갖는 모 숙주만큼 잘 기능하지는 않았는데(데이터는 표시되지 않음), 그 이유는 잠재적으로 독점 배지의 삼투압 농도(osmolarity)가 다르기 때문이다. 따라서, 이들 세포를 IGF-1이 없는 GSKO 숙주에 대한 플랫폼 비선택적 배지로 다시 전환시켰다. 이들 숙주를 모두 뱅킹하였고 BLI(Berkeley Lights) 비콘 기기를 사용하여 단일 세포 클로닝하였다. 총 158개의 클론을 얻었다.
두 번째 방법은 직접 적응이었다. GSKO 숙주 세포주를 IGF-1이 없는 독점 배지에 직접 적응시켰다. 이들 숙주를 모두 뱅킹하였고 BLI(Berkeley Lights) 비콘 기기를 사용하여 단일 세포 클로닝하였다. 전체 회수에는 약 1.5개월의 기간이 소요되었다. 도 1b를 참조한다. 총 44개의 클론을 얻었다.
Berkeley Lights 절차를 사용한 단일 세포 클로닝:
클론 유래 세포 뱅크를 보장하기 위해, 특정 조건 하에서 Beacon 기기(Berkeley Lights, 미국 캘리포니아주 에머빌 소재)를 사용하여 IGF- 적응 세포주를 단일 세포 클로닝하였다. Long R3 IGF-1이 없는 독점 배지를 두 숙주 모두에 대한 단일 세포 클로닝 및 규모 확대에 사용하였다. Beacon 기기는 단일 세포 조작, 세포 배양 및 생산성 분석을 허용하는 소형화된 세포 배양 플랫폼이다. 이 기기에서, 세포는 제어된 온도, 멸균 환경 및 성장 배지의 연속적인 관류 하에서 "나노펜"이라고 불리는 1000개 초과의 개별 용기로 구성된 나노유체 칩에서 단리되어 배양된다. 교차 오염이 발생하지 않도록 배양 기간 내내 층류가 유지된다. OEP(Opto-Electro Positioning) 기술은 광 활성화 표면 트랜지스터를 사용하여 국부적인 전하를 생성하여 세포를 밀어냄으로써 세포 조작을 가능하게 한다. OEP는 개별 세포를 나노펜 안팎으로 부드럽게 안내하는 데 사용된다. 통합 현미경 기능을 사용하면 생세포 영상화, 단일 세포 로딩, 영상화 및 배양물 내보내기가 가능하며 소프트웨어를 통해 자동화되고 제어되므로 추적성이 보장된다. 단일 세포 클론을 반복된 기기 내 현미경 영상화를 사용하여 단일 세포 기원에 대해 검증하였다. 문헌[Le et al., 2020, Biotech J 15:1900247 및 Le et al., 2018, Biotechnol Prog 34:1438-1446]을 참조한다.
GSKO 배경의 IGF- 세포주의 경우, 비클론성 세포 풀을 새로운 나노유체 칩으로 가져오고 단일 세포를 OEP를 사용하여 개별 나노펜으로 단리시켰다. 단일 세포 기원의 세포를 함유하는 나노펜을 식별하기 위해 통합 현미경 영상화를 사용하였다. 클론을 개별 나노펜에서 3일 동안 배양하였다. 그런 다음 나노펜의 성장을 분석하였다. 세포 집단을 클론 유래에 대해 검증하였고 다양한 성장 프로파일에 대해 선택하였다. 선택된 클론을 칩에서 96웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰로 독립적으로 내보냈다. 교차 오염이 검출되지 않도록 하기 위해 엄격한 품질 관리 단계가 이 접근 방식에 내장되어 있다. 클론 유래의 통계적 결정은 클론 유래 세포주의 단리에 대한 높은 확신을 나타낸다. 문헌[Le et al., 2020, Biotech J 15:1900247]을 참조한다.
내보낸 후, 단일 세포 유래 세포주를 Long R3 IGF-1이 없는 독점(+gln) 비선택적 성장 배지를 사용하여 규모 확대하였다. 세포주를 90% 초과의 생존율 및 안정화된 성장을 달성할 때까지 계대배양시켰다. 그런 다음 세포주를 Long R3 IGF-1 및 DMSO가 없는 비선택적 성장 배지에 뱅킹하고, 장기 보관을 위해 -80℃에서 동결시켰다.
GSKO-IGF 적응된 단일 세포 숙주는 24시간의 배가 시간을 가졌다(도 3a 내지 도 3b). 추가 평가를 위한 단일 세포 숙주는 처음에 엄격한 형질주입/유가식 평가에서의 성능을 기반으로 범위가 좁혀진 뒤 잘 기능하는 단클론성 항체를 사용한 형질주입으로 10 내지 15일 유가식 평가의 평가에서 추가로 평가되었다.
실시예 2
IGF-1 보충의 부재 하에서 치료제를 성장시키고 발현시키는 이들 IGF- 적응 숙주 세포의 능력을 형질주입 및 10D - 15D FB(10 내지 15일 유가식) 생산 실험에서 시험하였다.
CS9 GSKO 배경에서 단일 세포 클로닝된 IGF- 적응 세포주에서 시험 단클론성 항체 분자의 형질주입 및 회복
GSKO IGF- 적응 숙주를 단일 세포 클로닝 이전에 유리한 결과를 갖는 개념 증명 실험에서 형질주입 및 유가식 평가에 의해 시험하였다(데이터 제시되지 않음). GSKO 배경에서 IGF- 단일 세포 클로닝된 적응 세포주의 경우, 독점 ILT 트랜스포사제를 함유한 플라스미드 외에 잘 기능하는 단클론성 항체에 대한 원형 pGS1.1PB 플라스미드를 플랫폼 장기 전기천공 프로토콜을 사용하여 형질주입시켰다. 형질주입된 세포주를 Long R3 IGF-1이 없는 독점 비선택 배지에서 36℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 회복시켰다. 형질주입된 세포를 90% 초과까지 회복될 때까지 36℃ 및 5% CO2에서 Long R3 IGF-1이 없는 독점 배지 + 25 μM MSX 선택적 성장 배지(-글루타민)에서 3 내지 4일마다 계대배양시켰다(도 3). 그런 다음 이러한 GSKO IGF- 세포주를 15D 유가식 생산 실행에서 평가하였다.
유가식 생산 세포 배양
GSKO 배경에서 Long R3 IGF-1이 없는 배지에 적응된 형질주입된 세포주의 성장 및 생산성을 평가하기 위해 15일 유가식 생산을 수행하였다. 배양물을 Long R3 IGF-1이 없는 기본 생산 배지에 3Х106개 세포/㎖(GSKO 기반)로 접종하고 GSKO 배양물의 경우 3, 6, 8, 10 및 13일에 추가 영양소를 공급하였다. GSKO 배양물은 제15일 또는 생존율이 50 내지 60%로 떨어졌을 때 수거하였다(도 4a 내지 도 4d). 생산 상청액을 역가(단백질 A HPLC)에 대해 분석하였다.
형질주입된 세포주는 IGF-1을 갖는 다양한 GSKO 세포주 범위에서 다양한 수준의 성장 및 생산성을 나타내었다.
실시예 3
상이한 원형 piggyBAC 상용성 ITR-함유 벡터를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법을 사용하여, IGF-1 보충의 부재 하에서 상이한 양상의 치료제를 성장시키고 발현시키는 이들 IGF- 적응 숙주 세포의 능력을 형질주입 및 10D - 15D FB(10 내지 15일 유가식) 생산 실험에서 시험하였다. 평균값은 2회 실행된 실험에서 유래한다. NA는 배양물이 이미 수거되었으므로 데이터를 사용할 수 없음을 나타낸다.
BiTE - 이중특이적 T-세포 관여자
Fusion - 융합 단백질
Hetero-Ig - 헤테로 Ig 이중특이적 항체
mAb - 단클론성 항체
3-chain Ab - 3개 쇄 비대칭 항체-유사 분자
표 1 내지 표 4는 각각 IVCD, 생존율 %, 역가 및 Qp를 나타낸다.
IGF- 적응 세포주는 다양한 수준의 성장 및 생산성을 나타내었지만 IGF-1을 사용한 GSKO 세포주와 대등하였다.
실시예 4
IGF- 적응 형질주입된 숙주 세포주를 일반적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 15D FB(15일 유가식) 생산 실험에서 단클론성 항체를 발현하는 벡터를 사용하여 생산 규모 200 *?*생물반응기에서 시험하였다.
성장 및 역가는 IGF- 조건에 적응되지 않은 세포주를 사용한 유사한 생산 작업에서 관찰된 것과 대등하였다.

Claims (19)

  1. 포유동물 세포 배양으로부터 관심 단백질을 생산하는 방법으로서,
    (a) 0.05 ㎎/ℓ 이하의 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1)를 갖는 제2 세포 배양 배지에서 관심 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하여 상기 관심 단백질을 발현시키는 단계로서, 상기 포유동물 세포는 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 갖는 제1 세포 배양 배지에서 성장하도록 직접 적응되었고(directly adapted), 상기 관심 단백질을 암호화하는 이종 핵산을 포함하는, 단계; 및
    (b) 상기 포유동물 세포에 의해서 생산된 상기 관심 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포 배양 배지는 0.03 ㎎/ℓ미만의 IGF-1를 함유하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제2 세포 배양 배지는 IGF-1를 함유하지 않는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지는 IGF-1를 함유하지 않는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 IGF-1이 결여된 배지에 직접 적응되지 않은 동일한 계통의 포유동물 세포와 유사한 성장 속도를 갖는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포유동물 세포의 배가 시간은 30시간 미만인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발현된 관심 단백질의 역가는 배양 10일차에 적어도 50 ㎎/ℓ인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 항원 결합 단백질인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 관심 단백질은 단클론성 항체, 이중특이적 T 세포 관여자, 면역글로불린, Fc 융합 단백질 및 펩티바디로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양 공정은 유가식(fed-batch) 배양 공정, 관류(perfusion) 배양 공정 또는 이들의 조합을 이용하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양은 적어도 100 *?*의 생물반응기에 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 함유한 무혈청 배양 배지 중의 적어도 0.5Х106 내지 3.0Х106개 세포/㎖를 접종함으로써 확립되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO; Chinese Hamster Ovary) 세포인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CHO 세포는 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)가 결핍되거나(DHFR-) 글루타민 합성효소가 넉아웃(GSKO; glutamine synthetase knock out)된, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 회수된 관심 단백질은 정제되고 약제학적으로 허용 가능한 제형으로 제형화하는, 방법.
  15. 제14항의 정제되고 제형화된 관심 단백질.
  16. 포유동물 세포를 IGF- 배지에 직접 적응시키는 방법으로서,
    a) 0.03 ㎎/ℓ 이하의 IGF-1을 포함하는 세포 배양 배지에서 포유동물 세포의 집단을 배양하는 단계;
    b) 단일 세포 클로닝에 의해 상기 포유동물 세포의 집단으로부터 개별 세포를 얻는 단계;
    c) 90% 이상으로 회복될 때까지 30시간 미만의 배가 시간으로 상기 개별 세포를 확장시키고 계대배양시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 IGF-1을 포함하지 않는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 CHO 세포는 디히드로폴레이트 환원효소가 결핍되거나(DHFR-), 글루타민 합성효소가 넉아웃(GSKO)된, 방법.
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