CN117551608A - 活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用 - Google Patents
活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117551608A CN117551608A CN202311494884.6A CN202311494884A CN117551608A CN 117551608 A CN117551608 A CN 117551608A CN 202311494884 A CN202311494884 A CN 202311494884A CN 117551608 A CN117551608 A CN 117551608A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- cells
- concentration
- tlr
- agonist
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 83
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title abstract description 11
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 30
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 27
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 229940124614 TLR 8 agonist Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229940124615 TLR 7 agonist Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 10
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 7
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 102000013135 CD52 Antigen Human genes 0.000 claims 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 8
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 1
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种活化培养基、高分泌IFN‑γ的NK细胞的培养方法及应用，本发明的活化培养基包括IL‑2、IL‑15、IL‑18、IL‑21、L‑抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5‑氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR‑7激动剂、TLR‑8激动剂、TLR‑9激动剂以及灭活自体血浆。基于本发明的活化培养基培养出来的NK细胞在体外培养16‑18天，能使NK细胞扩增500‑1000倍，NK细胞含量＞90％，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性NK细胞比例均＞90％，且较市售NK细胞培养基培养得到的NK细胞分泌更高水平的IFN‑γ，此外，加入的5‑氨基乙酰丙酸及中药单体白藜芦醇使NK细胞对A549肺癌细胞的体外杀伤率达95％以上。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用。
背景技术
IFN-γ主要有T细胞和NK细胞产生。IFN-γ可以增强巨噬细胞和树突状细胞的抗微生物活性，增加MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子的表达，促进抗原提呈和T细胞的激活分化。IFN-γ还能抑制病毒复制，促进感染细胞中抗病毒蛋白的表达，有利于对病毒的清除，此外，IFN-γ还促进B细胞的分化和类别转换。因此，增加NK细胞的IFN-γ分泌是增强其功能的一个重要保证。
现有通过体外添加细胞因子(IL-21、IL-15等)的方法进行NK细胞培养的方法，NK细胞扩增能力大多在200～500倍，并且分泌IFN-γ的能力相对较弱，另外，现有技术针对靶向肺部的NK细胞的培养方案并不多，并且现有技术培养的NK细胞的靶向肺部能力也普遍较弱，难以适用于肺部相关疾病的治疗。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明提供了一种活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用，本发明的主要目的旨在解决现有技术NK细胞体外扩增中存在的NK细胞组织靶向性弱、杀伤活性较差的问题。
本发明的内容如下：
本发明第一方面提供了一种活化培养基，包括：IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆。
在本发明第一方面一种可选的实施方式中，在所述活化培养基中，IL-2的浓度为10～1000U/mL、IL-15的浓度为5～50ng/mL、IL-18的浓度为5～50ng/mL、IL-21的浓度为5～50ng/mL、L-抗坏血酸的浓度为5～50μg/mL、氢化可的松的浓度为0.1～10μM、SCF的浓度为5～50U/mL、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为5～50ng/mL、5-氨基乙酰丙酸的浓度为50～500μM、白藜芦醇的浓度为0.1～10μM、TLR-7激动剂的浓度为0.5～50μM、TLR-8激动剂的浓度为0.5～50μM、TLR-9激动剂的浓度为0.5～50μM，灭活自体血浆的浓度为5～10％。
本发明第二方面提供了一种高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，包括：
使用刺激因子包被初始培养瓶，所述刺激因子包括纤连蛋白、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体中至少一种；
从人外周血中分离得到外周血单个核细胞；
将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，所述活化培养基包括IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆；
基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间；
收集得到培养好的NK细胞，进行所述NK细胞的相关测试，所述相关测试包括纯度、扩增倍数、杀伤活性和分泌的IFN-γ检测。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述初始培养瓶为T25培养瓶，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间包括：
在所述T25培养瓶中培养3天之后，将所述外周血单个核细胞转移到T175培养瓶中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；
在所述T175培养瓶中继续培养4天之后，将所述外周血单个核细胞转移到1L的培养袋中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；
在所述培养袋中继续培养9天之后，获得培养好的NK细胞。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述从人外周血中分离得到外周血单个核细胞采用密度梯度离心法。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中的接种密度为3×106～5×106个/mL。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，以及所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间均在30～40℃的培养温度以及3～5％的二氧化碳浓度下进行。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养的准则为使所述培养容器中的NK细胞浓度维持在2×106～4×106个/mL。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述收集得到培养好的NK细胞中NK细胞的含量＞90％，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性细胞比例均＞90％。
本发明第三方面提供了一种上述任一项所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法培养得到的NK细胞在治疗肺癌药物中的应用。
有益效果：本发明提供了一种活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用，本发明的活化培养基包括：IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆。基于本发明的活化培养基培养出来的NK细胞在体外培养16-18天，能使NK细胞扩增500-1000倍，NK细胞含量＞90％，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性NK细胞比例均＞90％，且较市售NK细胞培养基培养得到的NK细胞分泌更高水平的IFN-γ，此外，加入的5-氨基乙酰丙酸及中药单体白藜芦醇使NK细胞对A549肺癌细胞的体外杀伤率达95％以上。
附图说明
图1为各实施例和对比例外周血单个核细胞各培养时间点的存活曲线图；
图2为各实施例和对比例外周血单个核细胞的扩增曲线图；
图3为各实施例和对比例获得的NK细胞对A549肺癌细胞杀伤活性结果图；
图4：a为ELISA检测个实施例和对比例细胞上清液中细胞因子INF-γ浓度结果；b为流式检测实施例1细胞上清液中细胞因子INF-γ浓度结果图。
图5为实施例1外周血单个核细胞(PBMC)培养第0天、3天、5天、7天、9天、11天和16天的细胞形态图；
图6为实施例1培养第16天时NK细胞的流式检测纯度结果图；
图7为实施例1流式检测NK细胞表达肺部靶向标志性受体CCR5(a)和CXCR3(b)结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明第一方面提供了一种活化培养基，包括：IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆。
在本发明第一方面一种可选的实施方式中，在所述活化培养基中，IL-2的浓度为10～1000U/mL(例如10U/mL、20U/mL、35U/mL、50U/mL、75U/mL、500U/mL、1000U/mL)、IL-15的浓度为5～50ng/mL(例如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、40ng/mL、50ng/mL)、IL-18的浓度为5～50ng/mL(例如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、40ng/mL、50ng/mL)、IL-21的浓度为5～50ng/mL(例如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、40ng/mL、50ng/mL)、L-抗坏血酸的浓度为5～50μg/mL(例如5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)、氢化可的松的浓度为0.1～10μM(例如0.1μM、0.5μM、1μM、3μM、7μM、10μM)、SCF的浓度为5～50U/mL(例如5U/mL、7U/mL、10U/mL、30U/mL、45U/mL、50U/mL)、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为5～50ng/mL(例如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、50ng/mL)、5-氨基乙酰丙酸的浓度为50～500μM(例如50μM、55μM、100μM、150μM、300μM、400μM、500μM)、白藜芦醇的浓度为0.1～10μM(例如0.1μM、0.5μM、3μM、5μM、8μM、10μM)、TLR-7激动剂的浓度为0.5～50μM(例如0.5μM、1.5μM、3μM、10μM、35μM、45μM、50μM)、TLR-8激动剂的浓度为0.5～50μM(例如0.5μM、1.5μM、3μM、10μM、35μM、45μM、50μM)、TLR-9激动剂的浓度为0.5～50μM(例如0.5μM、1.5μM、3μM、10μM、35μM、45μM、50μM)，灭活自体血浆的浓度为5～10％(例如5％、6％、7.5％、10％)，需要说明的是灭活自体血浆的浓度为5～10％的意思是灭活自体血浆占活化培养基总体积的5～10％。
本发明第二方面提供了一种高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，包括：
使用刺激因子包被初始培养瓶，所述刺激因子包括纤连蛋白(FN)、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体中至少一种；
从人外周血中分离得到外周血单个核细胞；
将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，所述活化培养基包括IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆；
基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间；
收集得到培养好的NK细胞，进行所述NK细胞的相关测试，所述相关测试包括纯度、扩增倍数、杀伤活性和分泌的IFN-γ检测。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述初始培养瓶为T25培养瓶，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间包括：
在所述T25培养瓶中培养3天之后，将所述外周血单个核细胞转移到T175培养瓶中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；
在所述T175培养瓶中继续培养4天之后，将所述外周血单个核细胞转移到1L的培养袋中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；
在所述培养袋中继续培养9天之后，获得培养好的NK细胞。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述从人外周血中分离得到外周血单个核细胞采用密度梯度离心法。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中的接种密度为3×106～5×106个/mL。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，以及所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间均在30～40℃的培养温度以及3～5％的二氧化碳浓度下进行。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养的准则为使所述培养容器中的NK细胞浓度维持在2×106～4×106个/mL。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述收集得到培养好的NK细胞中NK细胞的含量＞90％，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性细胞比例均＞90％。
本发明第三方面提供了一种上述任一项所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法培养得到的NK细胞在治疗肺癌药物中的应用。
为了更好的说明本发明技术方案的技术效果，本发明构造了如下实施例和对比例进行测试。
实施例1：活化培养基包括TLR-7、8、9激动剂，相关细胞因子IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸(LAA)、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、白藜芦醇和灭活自体血浆的培养基，其中，IL-2的浓度为700U/mL、IL-15的浓度为20ng/mL、IL-18的浓度为20ng/mL、IL-21的浓度为20ng/mL、LAA的浓度为20μg/mL、氢化可的松的浓度为5μM、SCF的浓度为10U/mL、Flt3L的浓度为20ng/mL、5-ALA的浓度为100μM、白藜芦醇的浓度为10μM、TLR-7激动剂的浓度为10μM、TLR-8激动剂的浓度为10μM、TLR-9激动剂的浓度为10μM、灭活自体血浆的浓度为5％。
NK细胞的培养采用如下方法：使用刺激因子包被T25培养瓶，刺激因子包括FN、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体；分离人外周血单个核细胞(PBMC)；将外周血单个核细胞(PBMC)接种于包被好的T25培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，其中PBMC接种浓度为4.0×106个/mL；待培养3天后，将单个核细胞转移到T175培养瓶中，补充适量活化培养基继续培养，其中PBMC浓度为2.5×106个/mL；待培养7天后，将单个核细胞转移到1L培养袋中，补充适量活化培养基继续培养，其中PBMC浓度为2.5×106个/mL；待培养16天后，收集细胞，进行纯度、扩增倍数、杀伤活力、细胞因子释放等检测。
对比例1：活化培养基包括TLR-7、8、9激动剂，相关细胞因子IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸(LAA)、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)和灭活自体血浆的培养基，其中，IL-2的浓度为700U/mL、IL-15的浓度为20ng/mL、IL-18的浓度为20ng/mL、IL-21的浓度为20ng/mL、LAA的浓度为20μg/mL、氢化可的松的浓度为5μM、SCF的浓度为10U/mL、Flt3L的浓度为20ng/mL、5-ALA的浓度为100μM、白藜芦醇的浓度为10μM、TLR-7激动剂的浓度为10μM、TLR-8激动剂的浓度为10μM、TLR-9激动剂的浓度为10μM、灭活自体血浆的浓度为5％，即活化培养基不包括5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)和白藜芦醇。
NK细胞的培养采用如下方法：使用刺激因子包被T25培养瓶，刺激因子包括FN、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体；分离人外周血单个核细胞(PBMC)；将外周血单个核细胞(PBMC)接种于包被好的T25培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，其中PBMC接种浓度为4.0×106个/mL；待培养3天后，将单个核细胞转移到T175培养瓶中，补充适量活化培养基继续培养，其中PBMC浓度为2.5×106个/mL；待培养7天后，将单个核细胞转移到1L培养袋中，补充适量活化培养基继续培养，其中PBMC浓度为2.5×106个/mL；待培养16天后，收集细胞，进行纯度、扩增倍数、杀伤活力、细胞因子释放等检测。
对比例2：活化培养基只包括IL-2、IL-15、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)和灭活自体血浆。其中，IL-2的浓度为700U/mL、IL-15的浓度为20ng/mL、SCF的浓度为10U/mL、Flt3L的浓度为20ng/mL、灭活自体血浆的浓度为5％，
NK细胞的培养采用如下方法：使用刺激因子包被T25培养瓶，刺激因子包括FN、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体；分离人外周血单个核细胞(PBMC)；将外周血单个核细胞(PBMC)接种于包被好的T25培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，其中PBMC接种浓度为4.0×106个/mL；待培养3天后，将单个核细胞转移到T175培养瓶中，补充适量活化培养基继续培养，其中PBMC浓度为2.5×106个/mL；待培养7天后，将单个核细胞转移到1L培养袋中，补充适量活化培养基继续培养，其中PBMC浓度为2.5×106个/mL；待培养16天后，收集细胞，进行纯度、扩增倍数、杀伤活力、细胞因子释放等检测。
对比例3：市售的一种NK细胞专用培养基试剂盒，包括NK-A液(包被用)、NK-B液(诱导用)、NK-C液(活化用)、NK-D液(扩增用)及基础培养基，具体试剂配方不详。NK细胞的培养方法依据试剂盒的提供的指导方法进行培养。
测试结果：采用全自动计数仪分别在培养第0天、3天、5天、7天、9天、11天和16天检测细胞数量，并绘制各实施例和对比例的NK细胞存活曲线(如图1和下表1)及细胞扩增曲线(如图2和下表2)，其中，实施例1扩增了约830倍。
表1各实施例和对比例的NK细胞存活率表
表2各实施例和对比例的NK细胞扩增倍数表
采用LDH释放实验检测收集的NK免疫细胞对A549肺癌细胞的杀伤活力，方法具体如下：以A549肺癌细胞(购自中国科学院细胞库)为靶细胞，以NK细胞为效应细胞，将处于对数期生长的A549肺癌细胞用0.25％的胰酶消化，制备成单个细胞悬液，台盼蓝染色计数，后调整细胞的密度为1×105个/mL；将A549细胞悬液加入96孔板中，每孔50uL，按照不同效/靶比(1:1、5:1、10:1)加入效应细胞(NK)，每孔同样为50μL：同时设立效应细胞及靶细胞自然释放孔、靶细胞最大释放孔及培养基自然释放孔，体积校正对照孔，每孔体积100μL，且均设立3个复孔；置于37℃、5％CO2培养箱孵育12h，待反应结束前45min靶细胞最大释放孔每孔中加入10uL裂解液；待反应结束，每孔吸取50uL LDH酶反应液和50μL上清液加入到另一新的96孔板，在室温条件下避光反应30min，后加入反应终止液50μL，使用酶标仪检测其OD值；按照如下公式计算杀伤活性：杀伤活性(％)＝(测定管OD值-靶细胞自然释放管OD值-效应细胞自然释放管OD值)/(靶细胞最大释放管OD值-靶细胞自然释放管OD值)×100％。计算结果如图3和表3所示，其中，实施例1杀伤率达96％。
表3不同效靶比下各实施例和对比例的NK细胞扩增倍数表
采用ELISA试剂盒和流式细胞检测方法对收集的NK细胞上清液进行INF-γ浓度检测，检测结果如图4和表4所示。
表4各实施例和对比例的NK细胞分泌IFN-γ含量数据表
采用倒置显微镜分别在培养第0天、3天、5天、7天、9天、11天和16天拍照保存细胞形态，如图5所示。采用流式细胞检测方法对收集的细胞中NK细胞(CD3-CD56+)的含量进行检测，检测结果为91.9％，如图6所示。采用流式细胞检测方法对步收集的NK细胞(CD3-CD56+)CCR5和CXCR3的阳性比例进行检测，检测结果分别为97.1％和91.6％，如图7所示。其中阴性对照为样品中只加入了使用抗体(CCR5、CXCR3)的同型对照抗体。
基于本发明活化培养基和培养方法将人外周血单个核细胞在体外共培养2周后，能使NK细胞扩增500-1000倍，且NK细胞比例＞90％，并能够增强NK细胞的杀伤活性，对A549肺癌细胞的杀伤率＞95％(效靶比为10:1)，通过该培养方法获得的NK细胞具有靶向肺部的特性，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性细胞比例均＞90％。此外，通过该培养方法获得的NK细胞可分泌较高水平的IFN-γ(与市售NK细胞培养基相比)。实施例1获得的NK细胞上清液中IFN-γ浓度为17.12ng/mL，而对比例1(市售NK细胞培养基)获得的NK细胞上清液中IFN-γ浓度为8.28ng/mL，此外，在效靶比为10:1的条件下，加入的5-ALA及中药单体白藜芦醇使NK细胞对A549肺癌细胞的体外杀伤率达95％以上。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种活化培养基，其特征在于，包括：IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆。
2.根据权利要求1所述的活化培养基，其特征在于，在所述活化培养基中，IL-2的浓度为10～1000U/mL、IL-15的浓度为5～50ng/mL、IL-18的浓度为5～50ng/mL、IL-21的浓度为5～50ng/mL、L-抗坏血酸的浓度为5～50μg/mL、氢化可的松的浓度为0.1～10μM、SCF的浓度为5～50U/mL、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为5～50ng/mL、5-氨基乙酰丙酸的浓度为50～500μM、白藜芦醇的浓度为0.1～10μM、TLR-7激动剂的浓度为0.5～50μM、TLR-8激动剂的浓度为0.5～50μM、TLR-9激动剂的浓度为0.5～50μM、灭活自体血浆的浓度为5～10％。
3.一种高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，其特征在于，包括：
使用刺激因子包被初始培养瓶，所述刺激因子包括纤连蛋白、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体中至少一种；
从人外周血中分离得到外周血单个核细胞；
将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，所述活化培养基包括IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆；
基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间；
收集得到培养好的NK细胞，进行所述NK细胞的相关测试，所述相关测试包括纯度、扩增倍数、杀伤活性和分泌的IFN-γ检测。
4.根据权利要求3所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述初始培养瓶为T25培养瓶，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间包括：
在所述T25培养瓶中培养3天之后，将所述外周血单个核细胞转移到T175培养瓶中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；
在所述T175培养瓶中继续培养4天之后，将所述外周血单个核细胞转移到1L的培养袋中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；
在所述培养袋中继续培养9天之后，获得培养好的NK细胞。
5.根据权利要求4所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述从人外周血中分离得到外周血单个核细胞采用密度梯度离心法。
6.根据权利要求4所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中的接种密度为3×106～5×106个/mL。
7.根据权利要求4所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，以及所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间均在30～40℃的培养温度以及3～5％的二氧化碳浓度下进行。
8.根据权利要求4所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养的准则为使所述培养容器中的NK细胞浓度维持在2×106～4×106个/mL。
9.根据权利要求7所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述收集得到培养好的NK细胞中NK细胞的含量＞90％，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性细胞比例均＞90％。
10.一种基于权利要求3至9任一项所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法培养得到的NK细胞在治疗肺癌药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311494884.6A CN117551608B (zh) | 2023-11-10 | 2023-11-10 | 活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311494884.6A CN117551608B (zh) | 2023-11-10 | 2023-11-10 | 活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117551608A true CN117551608A (zh) | 2024-02-13 |
| CN117551608B CN117551608B (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=89821337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311494884.6A Active CN117551608B (zh) | 2023-11-10 | 2023-11-10 | 活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117551608B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016209021A1 (ko) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | 주식회사 차바이오텍 | 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물 |
| CN110205293A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-09-06 | 中冠赛尔生物科技(北京)有限公司 | 一种加强型高效治疗肺癌的nk免疫细胞的制备方法及应用 |
| CN113881629A (zh) * | 2020-07-03 | 2022-01-04 | 山东荆卫生物科技有限公司 | 一种体外高效扩增nk细胞的培养基及培养方法 |
| EP4245847A1 (en) * | 2020-11-11 | 2023-09-20 | Hanbio Co., Ltd. | Mass proliferation culture method of nk cells |
-
2023
- 2023-11-10 CN CN202311494884.6A patent/CN117551608B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016209021A1 (ko) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | 주식회사 차바이오텍 | 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물 |
| CN110205293A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-09-06 | 中冠赛尔生物科技(北京)有限公司 | 一种加强型高效治疗肺癌的nk免疫细胞的制备方法及应用 |
| CN113881629A (zh) * | 2020-07-03 | 2022-01-04 | 山东荆卫生物科技有限公司 | 一种体外高效扩增nk细胞的培养基及培养方法 |
| EP4245847A1 (en) * | 2020-11-11 | 2023-09-20 | Hanbio Co., Ltd. | Mass proliferation culture method of nk cells |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 陶家龙;邱玉华;庄志祥;沈丽琴;: "CD137单抗联合IL-15体外扩增NK细胞及其对肺癌细胞的杀伤活性", 中国肿瘤生物治疗杂志, no. 06, 10 December 2012 (2012-12-10) * |
| 黄庆生;李琦;黄勇;商澎;张明杰;: "人NK细胞体外高效扩增的实验研究", 细胞与分子免疫学杂志, no. 12, 18 December 2008 (2008-12-18) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117551608B (zh) | 2024-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114774365B (zh) | 一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用 | |
| CN111961648B (zh) | 一种肿瘤特异性t细胞的分离培养方法及由其获得的产品 | |
| CN105754941A (zh) | 一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法 | |
| CN104711225B (zh) | Nk细胞的体外制备方法 | |
| CN111690610A (zh) | 一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法 | |
| CN112725274A (zh) | 一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法 | |
| CN109536444B (zh) | 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法 | |
| CN111172110B (zh) | 一种脐带血cik细胞的培养方法 | |
| CN117551608B (zh) | 活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用 | |
| CN107663515B (zh) | 一种定向制备人红细胞的方法及制剂 | |
| CN111424015A (zh) | 用于前列腺肿瘤细胞的培养基和三维培养方法 | |
| CN114438028B (zh) | 一种体外扩增外周血nk的方法 | |
| US20230123462A1 (en) | In vitro proliferation medium, in vitro culture kit and in vitro proliferation culture method of umbilical cord blood (ucb)-derived natural killer (nk) cells | |
| CN111154721B (zh) | Nk细胞扩增方法 | |
| CN110592007B (zh) | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN117264886B (zh) | CD56dimCD16+NK细胞培养试剂盒、培养方法及应用 | |
| CN110129267B (zh) | 冻存人外周血单个核细胞的复苏液及方法 | |
| CN108690830B (zh) | 一种高效扩增nkt细胞的方法 | |
| CN113293130A (zh) | 一种肿瘤特异性t细胞的培养方法 | |
| CN115247149B (zh) | 适用于nk细胞的培养基组合物及培养方法 | |
| CN110195039B (zh) | 一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法 | |
| CN117736988B (zh) | 用于诱导Tscm细胞的培养基、培养方法及其应用 | |
| CN112961827B (zh) | 佛司可林在t细胞培养中的应用 | |
| WO2023019637A1 (zh) | 人原代急性淋巴白血病细胞的培养基及培养方法 | |
| CN117106718B (zh) | 一种靶向肺部的nk细胞培养基、培养方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |