CN115044551A - 一种脐血cik细胞分离、培养方法 - Google Patents

一种脐血cik细胞分离、培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脐血CIK细胞分离、培养方法，属于细胞技术领域。本发明针对传统方法制备CD3+CD56双阳CIK细胞纯度低，数量小的问题，提供一种新型的脐血CIK细胞分离、培养方法，以脐带血为原料，采用羟乙基淀粉溶液去除红细胞，所得血浆分离细胞，将分离的细胞用含IFN‑γ、胎牛血清的1640培养基经过短暂培养，使干细胞经过有效诱导活化，之后用IL‑2诱导活化，促进淋巴细胞生长、增殖和分化，获得的CD3+CD56双阳细胞纯度难以达到30％以上，较传统分离培养CIK细胞的方法具有明显优势，为临床大量制备高纯度的CD3+CD56双阳CIK细胞提供了新手段。

Description

一种脐血CIK细胞分离、培养方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种脐血CIK细胞分离、培养方法。
背景技术
CIK细胞是一种新型免疫活性细胞，它是自体外周血单个核细胞，经多种细胞因子共同诱导培养产生的一类CD3+和CD56+共同表达的高细胞毒细胞(杀伤细胞)。它是由美国斯坦福(Stanford)大学zui先研制的，兼有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞(NK)的非主要组织相关性复合物(MHC)限制性杀瘤的特点，杀伤活性可达84.7％。CIK细胞具有增殖快、杀瘤活性强、杀瘤谱广的优点，尤其是对化疗耐药的肿瘤细胞株亦有杀伤作用，而对正常造血集落的生长没有影响。通过取病人少量单个核细胞，在体外特定条件下制备出大量CIK细胞，回输体内后直接发挥有效清除肿瘤作用。因此，临床肿瘤治疗对CIK细胞的需求数量巨大。
然而目前，CIK细胞的来源主要基于体外扩增方法获得，例如，陈明水等报道了CIK细胞体外扩增方法，以外周血为原料分离单个核细胞后，加入不同的细胞因子诱导生产CIK细胞，但是该方法，获得CD3+CD56双阳纯度高的CIK细胞存在一定的困难。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脐血CIK细胞分离、培养方法，获得大量CD3+CD56双阳纯度大于30％的CIK细胞。
本发明提供了一种脐血CIK细胞分离、培养方法，包括以下步骤：
1)将脐带血和羟乙基淀粉溶液去除红细胞，所得血浆经离心，得到底层细胞；
2)将步骤1)中所述底层细胞置于含终浓度900`1100U/ml IFN-γ、体积百分含量9％～11％胎牛血清的1640培养基中培养1天后，向细胞中添加48～52ng/mL CD3和280`320U/ml的IL-2继续培养，记为继续培养第1天；
3)在步骤2)中所述继续培养进行第3天、5天和7天时分别向细胞中补加含300～500U/ml的IL-2的1640培养基，在继续培养的第10天收集细胞。
优选的，其特征在于，步骤1)中所述脐带血和羟乙基淀粉溶液的体积比为(4～5):1。
优选的，所述羟乙基淀粉溶液的质量百分含量为5％～7％。
优选的，步骤1)中静置的时间为20～30min。
优选的，步骤2)中所述培养或步骤3)中继续培养的条件为在37℃、CO2浓度为5％的环境中培养。
优选的，步骤2)中所述底层细胞的浓度为1～5×106/mL。
优选的，步骤3)中每次补加的含300～500U/ml的IL-2的1640培养基与含终浓度900～1100U/ml IFN-γ、体积百分含量9％`11％胎牛血清的1640培养基的体积比为1:1。
本发明提供的脐血CIK细胞分离、培养方法，以脐带血为原料，采用羟乙基淀粉溶液去除红细胞，所得血浆分离细胞，将分离的细胞用含IFN-γ、胎牛血清的1640培养基经过短暂培养，使干细胞经过有效诱导活化，之后用IL-2诱导活化，促进淋巴细胞生长、增殖和分化，获得的CD3+CD56双阳细胞纯度难以达到30％以上，较传统分离培养CIK细胞的方法具有明显优势，为临床大量制备高纯度的CD3+CD56双阳CIK细胞提供了新手段。
具体实施方式
本发明提供了一种脐血CIK细胞分离、培养方法，包括以下步骤：
1)将脐带血和羟乙基淀粉溶液去除红细胞，所得血浆经离心，得到底层细胞；
2)将步骤1)中所述底层细胞置于含终浓度900～1100U/ml IFN-γ、体积百分含量9％～11％胎牛血清的1640培养基中培养1天后，向细胞中添加48～52ng/mL CD3和280～320U/ml的IL-2继续培养，记为继续培养第1天；
3)在步骤2)中所述继续培养进行第3天、5天和7天时分别向细胞中补加含300～500U/ml的IL-2的1640培养基，在继续培养的第10天收集细胞。
本发明将脐带血和羟乙基淀粉溶液去除红细胞，所得血浆经离心，得到底层细胞。
在本发明中，所述脐带血来自医院。所述脐带血和羟乙基淀粉溶液的体积比为4～5:1，更优选为4:1。所述羟乙基淀粉溶液的质量百分含量优选为6％。所述羟乙基淀粉溶液作为红细胞聚集剂，用于从全血中快速沉淀红细胞从而分离有核细胞。由于凝集红细胞比分散细胞沉降速度快得多，所以控制沉淀时间或离心速度，大部分有核细胞停留在上清液中，小心的分离有何细胞，大约95％～99％红细胞将会被去除。所述静置的时间优选为20～30min，更优选为20min。所述离心的条件优选为500×g，升9降9，4℃，离心8min。得到底层细胞后，优选进行洗涤。所述洗涤的方法优选生理盐水重悬所述底层细胞，离心，收集底层细胞。所述离心的条件同上，在此不做赘述。
得到底层细胞后，本发明将所述底层细胞置于含终浓度1000U/ml IFN-γ、体积百分含量10％胎牛血清的1640培养基中培养1天后，向细胞中添加50ng/mL CD3和300U/ml的IL-2继续培养，记为继续培养第1天。
在本发明中，所述底层细胞优选先用1640完全培养基重悬底层细胞后，用10％胎牛血清的1640培养基定容至40mL，进行细胞计数，调整所述底层细胞的浓度为1～5×106/mL后添加IFN-γ。底层细胞的浓度优选为2×106/mL.所述IFN-γ的作用是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-I/II分子，活化单核、巨噬细胞并增强起溶菌活性及分泌IL-1,IL-6,IL-8，TNF-a等。所述培养或继续培养的条件为在37℃、CO2浓度为5％的环境中培养。所述CD3的作用是对T细胞的多种功能产生调节作用，CD3与IL-2具协同作用，诱导T细胞扩增，增强胞毒活性。
继续培养后，本发明在所述继续培养进行第3天、5天和7天时分别向细胞中补加含300～500U/ml的IL-2的1640培养基，在继续培养的第10天收集细胞。
在本发明中，所述继续培养的条件为在37℃、CO2浓度为5％的环境中培养。每次补加的含300～500U/ml的IL-2的1640培养基与含终浓度1000U/ml IFN-γ、体积百分含量10％胎牛血清的1640培养基的体积比优选为1:1。继续培养过程中添加IL-2的作用是促进淋巴细胞生长、增殖、分化。
在本发明中，利用本发明提供的方法培养得到的CD3+CD56双阳比例大于30％，较传统方法具有明显优势，而且本发明所得的细胞数量也明显高于传统方法获得的细胞数量。
下面结合实施例对本发明提供的一种脐血CIK细胞分离、培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种脐血CIK细胞分离、培养方法
1.制备器材
1.1原材料：脐带血来自医院。
1.2试剂及材料
1.2.1试剂：羟乙基淀粉(大分子)、1640培养基、胎牛血清、IFN-γ、重组人IL-2、重组人CD3。
1.2.2一次性易耗品：10mL移液管、T75瓶、50mL离心管、枪头、EP管、75％酒精棉球、医用无菌纱布、50mL注射器、75％酒精。
1.2.3器具：移液器、酒精灯、打火机、剪刀、止血钳。
2.仪器设备
2.1超净工作台、离心机、CO2培养箱。
3.操作环境：细胞制备部B级洁净区背景下的A级超净工作台中进行。
4.制备准备
4.1操作开始前进行制备前的准备工作，并对准备工作的完成情况进行检查。
4.2试剂准备：1640完全培养基：取60ml胎牛血清加入500ml1640培养基。
5.制备步骤
5.1用75％酒精纱布对脐带血血袋导管待开口处擦拭，将止血钳在酒精灯上过火，待冷却后夹住导管待开口处下方，将剪刀在酒精灯上过火，在导管待开口处剪开，取1.6mL的脐带血于2mL冻存管中留样，并加入0.4mL冻存液。
打开注射器外包装，按照脐带血重量：羟乙基淀粉溶液(6％)体积＝4:1的比例加入羟乙基淀粉溶液，轻轻摇晃5min使之混匀，然后将血袋中的溶液均匀分装至离心管中，静置20min。
5.2静置结束后，样品分两层，用吸管吸取离心管上层液体，置于另一洁净的离心管中。
5.3将收集上层液体的离心管放入离心机中，配平所有离心管，设置离心参数：500×g，升9降9，4℃，离心8min，离心结束后，吸取上层血浆至洁净的离心管中，上层血浆留样，在管上标明脐带血编号、体积、冻存时间，储存于-80℃冰箱。
加入适量的生理盐水重悬底层细胞(底层细胞在离心管底部)，定容至40mL，500×g，升9降9，4℃，离心8min，去上清。
加入适量1640完全培养基(采购于CORNING公司)重悬底层细胞，用含10％胎牛血清的1640培养基定容至40mL，取500μL细胞悬液，细胞计数。
5.4根据计数结果，调整细胞浓度至2.0×106/mL，取样2.5mL送检，将细胞浓度调整后的细胞悬液按照每瓶10mL分装至T75瓶，再向每瓶中加入分装好的IFN-γ，使其工作浓度1000U/ml。
6.检测指标包括无菌检测、病毒检测、支原体检测、数量检测、活率检测。检测结果由质控部门出具检测记录
6.1在培养瓶上标明细胞编号、日期、培养液体积、细胞类型后，将培养瓶放入温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，继续培养。
隔天(第1天)从培养箱中取出T75瓶，经75％的酒精消毒后放入超净工作台，向每个T75瓶中加入分装好的CD3(CD3加入时间应间隔分离培养时加入IFN-γ的时间24h以上)，使其工作浓度为50ng/mL，再向每个T75瓶中加入分装好的IL-2，使其终浓度为300U/ml。盖上瓶盖后轻轻摇匀。
6.2在培养瓶上标明细胞编号、日期、培养液体积、细胞类型后，将培养瓶放入温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，继续培养。
第3天，从培养箱中取出T75瓶，经75％的酒精消毒后放入超净工作台中，向每个T75瓶中加入10mL配制好的1640培养基，并按照终浓度300U/mL的浓度向每个T75瓶中加入IL-2，盖上瓶盖后轻轻摇匀，放入温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，继续培养。
第5天，从培养箱中取出T75瓶，经75％的酒精消毒后放入超净工作台中，向每个T75瓶中加入10mL配制好的1640培养基，并按照终浓度500U/mL的浓度向每个T75瓶中加入IL-2，盖上瓶盖后轻轻摇匀，放入温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，继续培养。
第7天，从培养箱中取出T75瓶，经75％的酒精消毒后放入超净工作台中，向每个T75瓶中加入10mL配制好的1640培养基，并按照终浓度500U/mL的浓度向每个T75瓶中加入IL-2，盖上瓶盖后轻轻摇匀，放入温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，继续培养。
第10天收集细胞。
对比例1
一种传统的分离CIK细胞的方法
采用淋巴细胞分离液分离获得PBMC，具体方法如下：
1.将血袋中的脐血倒入50ml离心管，取15mL淋巴细胞分离液至空白离心管中，再向装有淋巴细胞分离液的离心管中加入20～25mL脐血。
2.将所有离心管放入离心机中，配平所有离心管，室温下，设置离心参数为：800×g，升3降3，慢升慢降，离心20min。
3.离心结束后，血液被分为4层，由血浆层(第1层)、单个核细胞层(第2层)、分离液层(第3层)和红细胞层(第4层)构成。
4.用移液管将第2层的单个核细胞收集至洁净的离心管中，加入适量的0.9％的生理盐水重悬细胞，然后定容至40mL，将离心管放入离心机中，配平所有离心管，设置离心参数为：500×g，升5降5，离心10min，离心结束后，弃去上清液，共清洗2次。
5.第二次定容至20mL后，取500μL细胞悬液，进行细胞计数，获取需要数量的PBMC细胞。
使用CIK专用试剂盒(购自北京同立海源生物科技有限公司)培养PBMC细胞，培养至第10天，收集细胞。
实施例2
将3份脐血按照体积平分为实验组A和实验B组，其中实验组A:本发明实施例1分离培养方法培养，第10天收集细胞；实验组B:使用淋巴分离液分离获得PBMC，用商品CIK试剂盒培养，第10天收集细胞(传统方法)。
将两个实验组收集的细胞进行CD3+CD56双阳CIK细胞鉴定，方法为流式分析法，统计CD3+CD56双阳CIK细胞数量和总细胞数量。
结果见表1。由表1可知，采用不同分离培养方法对相同来源的脐带血进行培养，其中采用本发明方法分离得到的CD3+CD56双阳CIK细胞比例显著高于传统方法，同时细胞数量也呈相同的趋势。因此，本发明提供的方法在制备CD3+CD56双阳CIK细胞方面具有明显优势。
表1两种分离培养方法获得的CD3+CD56双阳CIK细胞的比例和细胞数量
Figure BDA0003758548950000071
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种脐血CIK细胞分离、培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将脐带血和羟乙基淀粉溶液去除红细胞，所得血浆经离心，得到底层细胞；
2)将步骤1)中所述底层细胞置于含终浓度900～1100U/ml IFN-γ、体积百分含量9％～11％胎牛血清的1640培养基中培养1天后，向细胞中添加48～52ng/mL CD3和280～320U/ml的IL-2继续培养，记为继续培养第1天；
3)在步骤2)中所述继续培养进行第3天、5天和7天时分别向细胞中补加含300～500U/ml的IL-2的1640培养基，继续培养的第10天收集细胞。
2.根据权利要求1所述脐血CIK细胞分离、培养方法，其特征在于，步骤1)中所述脐带血和羟乙基淀粉溶液的体积比为(4～5):1。
3.根据权利要求2所述脐血CIK细胞分离、培养方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉溶液的质量百分含量为5％～7％。
4.根据权利要求1所述脐血CIK细胞分离、培养方法，其特征在于，步骤1)中静置的时间为20～30min。
5.根据权利要求1所述脐血CIK细胞分离、培养方法，其特征在于，步骤2)中所述培养或步骤3)中继续培养的条件为在37℃、CO2浓度为5％的环境中培养。
6.根据权利要求1所述脐血CIK细胞分离、培养方法，其特征在于，步骤2)中所述底层细胞的浓度为(1～5)×106/mL。
7.根据权利要求1所述脐血CIK细胞分离、培养方法，其特征在于，步骤3)中每次补加的含300～500U/ml的IL-2的1640培养基与含终浓度900～1100U/ml IFN-γ、体积百分含量9％～11％胎牛血清的1640培养基的体积比为1:1。
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