CN113710691A - 自然杀伤和嵌合抗原受体修饰的细胞的扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生成具有增强的细胞毒性和扩增能力的免疫治疗细胞(例如NK和T细胞)的方法和组合物。本文公开的方法和组合物可进一步用于具有增加的细胞毒性的CAR修饰的NK和T细胞的增强扩增。

Description

自然杀伤和嵌合抗原受体修饰的细胞的扩增
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月20日提交的美国临时专利申请62/808,031的权益，其以全文通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及产生经修饰的饲养细胞的方法、包含经修饰的饲养细胞的组合物及其使用方法。
对政府支持的感谢
本发明是在国家卫生研究院授予的1R01AI130197-01A1、HL125018、AI124769-01和AI129594项下政府支持下完成的。政府对这项发明有一定权利。
背景技术
NK细胞是淋巴细胞的一个重要亚群，提供身体的第一道防线。NK细胞最初被描述为能够自发地杀死肿瘤细胞(Rosenberg等人J Natl Cancer Inst 52:345-52(1974)；Kiessling等人Eur J Immunol 5:117-21(1975)；Kiessling等人Eur J Immuol 5:112-7(1975)；Herberman等人Int J Cancer 16:230-9(1975)；Herberman等人Int J Cancer 16:216-29(1975))并且与T细胞不同，T细胞需要事先敏化。NK细胞通过几种途径杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞(Liu等人Immunity 31:99-109(2012)；Liu等人Immunity 36:600-11(2012)；Long等人Annu Rev Immunol 31:227-58(2013))，包括直接细胞毒性(自然细胞毒性和ADCC)和间接作用(例如，细胞因子产生和与适应性免疫相互作用)。在这些功能之中，NK细胞的一个重要应用是使用原代离体(ex vivo)扩增的NK细胞或遗传修饰的NK细胞治疗各种癌症。大量临床试验表明，与T细胞输注相比，NK细胞输注具有较轻的移植物抗宿主疾病(GvHD)。
NK细胞主要有两种主要的临床应用。第一种是使用具有遗传修饰的原代离体扩增的NK治疗癌症。具体地，在临床上，使用NK细胞治疗ALL和AML(Miller等人Blood105:3051-7(2005)；Rubnitz等人J Clin Oncol 28:955-9(2010))。第二种是遗传修饰的NK细胞如嵌合抗原受体(CAR)修饰的NK细胞已成为癌症免疫治疗的新兴工具(Liu等人Leukemia 32:520-31(2018)；Liu等人Protein Cell 9:902(2018))。以CAR修饰的NK细胞为基础的免疫治疗的临床研究已被广泛用于几种类型的癌症(Rezvani K和Rouce RH，Front Immunol 6:578(2015))。类似于基于CAR-T细胞的免疫治疗，不同研究组研究了使用各种CAR分子重定向不同抗原特异性的遗传修饰的NK细胞(Rezvani K和Rouce RH，Front Immunol 6:578(2015)；Hermanson DL和Kaufman DS，Front Immunol 6:195(2015)；Glienke等人Front Pharmacol6:21(2015))。
CAR修饰的T细胞治疗已成为治疗血癌的有潜力的免疫治疗策略(Porter等人NEngl J Med 365:725-33(2011)；Kim等人Arch Pharm Res 39:437-52(2016)；Maude S andBarrett DM,Br J Haematol 172:11-22(2016))并且得到了学术和业界研究人员的高度关注(Glienke等人Front Pharmacol 6:21(2015))。将CAR修饰的免疫细胞(包括CAR-T、CAR-NK和CAR-NKT细胞)过继转移至患者体内在治疗多种血癌方面已显示出了显著的成功。使用CAR产物治疗多发性骨髓瘤(Garfall等人N Engl J Med 373:1040-7(2015)；Atanackovic等人Br J Haematol 172:685-98(2016))、白血病(Porter等人N Engl J Med 365:725-33(2011)；Maude等人N Engl J Med 371:1507-17(2014)；Lee等人Lancet 385:517-28(2015))、肉瘤(Ahmed等人J Clin Oncol 33:1688-96(2015))和神经母细胞瘤(Pule等人Nat Med 14:1264-70(2008)；Louis等人Blood 118:6050-6(2011))的临床试验已显示出有希望的结果。世界各地的科学家和医药公司已对CAR研发和优化投入了相当大的努力和资金(Casucci等人Cancer Immunol Immunother 64:123-30(2015)；Gottschalk等人ErnstSchering Found Symp Proc 69-82(2006)；Ramos等人Cancer J 20:112-8(2014)；SavoldoB and Dotti G,Cancer J 20:112-8(2014))。
过继CAR T细胞治疗将肿瘤抗原特异性与单个受体中的免疫细胞激活结合在一起，该治疗包括分离患者自身的T细胞，将其工程化以表达识别肿瘤蛋白的嵌合抗原受体(CAR)，并将其重新注入患者体内。过继CAR T细胞治疗的一个潜在问题是使用了从患者分离的自体T细胞。从患者分离的自体T细胞面临两个主要的问题。1)直接从免疫缺陷的癌症患者分离的T细胞一般具有较差的细胞毒性和功能性，所以不使用。2)由于潜在的GVHD，自体T细胞不能用于其他患者。
发明内容
仍需要改进的细胞毒性细胞介导的免疫治疗，例如，以减轻CAR修饰的细胞免疫治疗的缺点，如较差的细胞毒性。本文公开了扩增NK和T细胞等细胞以进行免疫治疗的方法和组合物，细胞毒性和细胞扩增能力得到提高。
本文公开了经修饰的721.221细胞。在一些示例中，所述经修饰的721.221细胞表达膜结合IL-21(mIL-21)、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、膜结合IL-15(mIL-15)、TLR配体、UL16结合蛋白(ULBP)-1、ULPB-2和/或主要组织相容性复合体(MHC)I类链相关蛋白A(MIC-A)中的至少一种。在具体的非限制性示例中，所述经修饰的721.221细胞例如使用病毒(如逆转录病毒)载体(例如慢病毒如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)载体，如SFG逆转录病毒载体)表达mIL-21，如包括与SEQ ID NO:2(和/或如由与SEQ ID NO:1具有90％或95％序列相同性的核酸序列编码)具有90％或95％序列相同性的氨基酸序列。所述经修饰的721.221细胞(例如IL-15受体α(IL-15Rα))可包括另外的异源细胞因子，包括激活受体配体、TRL配体或其受体。在一些示例中，所述经修饰的721.221细胞包括编码mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、mIL-15、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2和/或MIC-A中至少一种的异源核酸。在具体的示例中，所述经修饰的721.221细胞表达mIL-21或mIL-21和IL-15Rα。
本文还公开了产生经修饰的721.221细胞的方法，例如，包括用编码mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、膜结合IL-15(mIL-15)、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2和/或MIC-A的核酸转导或转染721.221细胞群；分离表达mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、膜结合IL-15(mIL-15)、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2和/或MIC-A的细胞；以及辐照所述分离的细胞，从而产生经修饰的721.221细胞。在一些示例中，通过转导(例如使用病毒载体如逆转录病毒或慢病毒)修饰所述细胞。在具体的非限制性示例中，所述经修饰的721.221细胞例如使用逆转录病毒载体(例如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)载体，如SFG逆转录病毒载体)表达mIL-21，如包括与SEQ ID NO:2(和/或如由与SEQID NO:1具有90％或95％序列相同性的核酸序列编码)具有90％或95％序列相同性的氨基酸序列。所述方法还可包括修饰所述721.221细胞以表达一或多于一个的另外的异源细胞因子、激活受体配体、TRL配体或其受体(例如IL-15Rα)。
本文还公开了扩增自然杀伤(NK)细胞群或T细胞群的方法，例如，通过在足以进行细胞扩增的条件下将淋巴细胞群与本文公开的经修饰的721.221细胞和至少一种细胞因子(例如白介素，如IL-5或IL-2)接触1-40天(例如14-21天)。淋巴细胞群可以来自任意样品类型，如外周血、脐带血、腹水、月经血或骨髓，并且可以例如包括外周血单个核细胞(PBMC)。与所述经修饰的721.221细胞接触的细胞群还可包括用于免疫疗法的经修饰的细胞，如嵌合抗原受体(CAR)-修饰的细胞(例如CAR-NK或CAR-T细胞，如CD19 CAR修饰的NK细胞)。在一些示例中，所述NK或T细胞群(例如在足以进行细胞扩增的条件下与所述经修饰的721.221细胞接触至少14-21天后)增加了至少5000-90000倍。
本文还公开了治疗癌症或感染性疾病或免疫疾病的方法，例如，通过向患有癌症或感染性疾病或免疫疾病的受试者施用使用本文所述的方法产生的NK细胞或T细胞(例如CAR修饰的NK细胞或T细胞，如CD19 CAR修饰的NK细胞)，从而治疗癌症或免疫疾病。在一些实例中，癌症或免疫疾病或感染性疾病包括自身免疫疾病、移植物排斥、实体瘤(例如淋巴瘤、乳腺癌、肝细胞癌(HCC)和胰腺癌)、肉瘤、神经母细胞瘤、血癌(例如多发性骨髓瘤；淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤；或白血病；如急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性髓系白血病(AML))、HIV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、结核病(TB)或疟疾。
根据以下参考附图进行的详细描述，本发明的前述和其他特征将变得更明显。
附图说明
图1A-1F.表达膜IL-21的K562和721.221细胞的表征。(图1A)，代表性直方图显示出了使用流式细胞术检测的K562(绿色)和用IL-21转导的K562(K562-mIL21，红色)的IL-21和4-1BBL表达。平均荧光强度(MFI)记录在各自直方图中。(图1B)，代表性直方图显示出了使用流式细胞术检测的721.221(绿色)和用IL-21转导的721.221(721.221-mIL21，红色)上IL-21和4-1BBL的表达。MFI记录在各自直方图中。(图1C)，在用IL-21转导的K562细胞(K562-mIL21)上IL-21表达的共焦图像。(图1D)，在用IL-21转导的221细胞(221-mIL21)上IL-21表达的共焦图像。(图1E)，代表性直方图显示出了使用流式细胞术检测的K562(绿色)和K562-mIL21(红色)细胞上ICAM-1、PD-L1、HLA-E和MICB的表达。MFI记录在各自直方图中。(图1F)，代表性直方图显示出了使用流式细胞术检测的721.221(绿色)和721.221-mIL21(红色)细胞上ICAM-1、PD-L1、HLA-E和MICB的表达。MFI记录在相应直方图中。
图2A-2E.用四种不同类型的饲养细胞进行的原代人NK细胞扩增。(图2A)，代表性点图显示出了使用流式细胞术检测的在扩增后指示的某天用不同类型的饲养细胞扩增的NK细胞的纯度。在第0天分别用辐照的K562、K562-mIL21、721.221和721.221-mIL21刺激PBMC。在第7天检测NK细胞的纯度，之后每隔3至5天检测。(图2B和2C)，定量数据表明了来自11个供体的分别用辐照的K562、K562-mIL21、721.221和721.221-mIL21扩增21天得到的NK细胞的倍数扩增(图2B)和纯度(图2C)。(图2D和2E)，定量数据表明了来自11个供体的用指示的饲养细胞扩增第21天得到的NK细胞的倍数扩增(图2D)和纯度(图2E)。(图2B)和(图2C)中示出了95％CI(灰色带)的平均值(实线)。*p<0.05.**p<0.01,***p<0.001。
图3A-3E.由不同饲养细胞扩增的NK细胞的表型。(图3A)，代表性直方图显示出了CD16、NKG2D、NKp46、2B4和DNAM-1在使用K562、K562-mIL21、721.221和721.221-mIL21扩增的NK细胞上的表达。(图3B)，代表性直方图显示出了CD69、CD94、CD8a和NKG2C在使用K562、K562-mIL21、721.221和721.221-mIL21扩增的NK细胞上的表达。(图3C)，代表性直方图显示出了NKG2A、CTLA-4、KLRG1和PD-1在使用K562、K562-mIL21、721.221和721.221-mIL21扩增的NK细胞上的表达。(图3D)，代表性直方图显示出了LIR1、TIM-3、TIGIT和LAG-3在使用K562、K562-mIL21、721.221和721.221-mIL21扩增的NK细胞上的表达。(图3E)，代表性直方图显示出了KIR、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR3DL1和KIR3DL2在使用K562、K562-mIL21、721.221和721.221-mIL21扩增的NK细胞上的表达。MFI显示在各自直方图中。
图4A-4H.NK细胞与易感靶细胞的功能比较。(图4A)，采用CFSE/7-AAD细胞毒性测定，定量数据表明了扩增NK细胞与K562细胞的细胞毒性活性。K562细胞用CFSE标记，然后与扩增的NK细胞以1:4至4:1的E:T比温育4小时。接下来，用7-ADD测定K562细胞的裂解。(图4B)，定量数据表明了在无刺激、用K562刺激以及用PMA/离子霉素刺激2小时后表达CD107a的扩增的NK细胞的百分比。(图4C)，采用CFSE/7-AAD细胞毒性测定，定量数据表明了扩增的NK细胞与721.221细胞的细胞毒性活性。721.221细胞用CFSE标记，然后与扩增的NK细胞以1:4至4:1的E:T比温育4小时。接下来，用7-ADD测定721.221细胞的裂解。(图4D)，在无刺激、用721.221刺激以及用PMA/离子霉素刺激2小时后表达CD107a的扩增NK细胞的百分比。(图4A)和(图4C)中显示了平均值±SD，并且(图4B)和(图4D)中显示了平均值±SD。(图4E)使用CFSE/7-AAD方法的NK细胞介导的细胞毒性的门控策略。在NK细胞与CFSE标记的靶细胞孵育4小时后，在7-AAD阳性亚群上对死亡细胞进行门控。(图4F)在以不同效应：靶(E:T)细胞比与扩增的NK细胞孵育后，CFSE标记的K562细胞中的7-AAD阳性细胞百分比的代表性流式细胞术点图。(图4G)用于细胞表面CD107a测定的门控策略。(图4H)在无刺激(仅NK细胞，阴性对照组)、用K562刺激以及用PMA/离子霉素(阳性对照组)刺激后表达CD107a的扩增的NK细胞的百分比的代表性点图。***p<0.001，ns p>0.05。
图5A-5F.图5A示意性地示出了用721.221-mIL21扩增CD19-CAR NK细胞的示例性方法。简要地，用100格雷(10000拉德)的剂量辐照221.mIL21细胞。然后PBMC在IL-2和IL-15存在下与辐照的饲养细胞共培养。平行地，通过转染293T细胞产生CD19-CAR逆转录病毒。在第7天用CD19-CAR逆转录病毒转导扩增的NK细胞。培养细胞21天。(图5B)，代表性点图显示出了扩增后在指示的某天CD19-CAR阳性细胞中扩增的NK细胞的百分比。在第0天用辐照的721.221-mIL21刺激PBMC并在第7天用CD19-CAR逆转录病毒转导。每隔3至4天检测CD19-CAR阳性细胞中NK细胞的纯度。(图5C)来自3个供体的CD19-CAR NK细胞的倍数扩增的动态延时扩增数据。用辐照的K562、K562-mIL21、221和221-mIL21饲养细胞扩增CD19-CAR修饰的NK细胞21天。(图5D)在扩增第21天时来自3个供体的CD19-CAR NK细胞的倍数扩增的定量数据。(图5E)在来自3个供体的CD19-CAR阳性细胞中NK细胞544的纯度的动态延时扩增数据。分别用辐照的545K562、K562-mIL21、221和221-mIL21饲养细胞扩增NK细胞。(图5F)在扩增后第21天来自3个供体的CD19-CAR阳性细胞中NK细胞的百分比的定量数据。(图5C)和(图5D)中示出95％CI(灰色带)的平均值(实线)。
图6A-6D.用721.221-mIL21扩增脐带血(CB)来源的NK和CAR-NK细胞。(图6A)在指示的天数NK细胞中CD19-CAR阳性细胞的百分比的流式细胞术点图。在第0天用辐照的饲养细胞刺激CBMC并在第7天用CD19-CAR逆转录病毒转导。(图6B)在由CBMC扩增的NK细胞中的CD19-CAR阳性细胞的百分比的定量数据(n＝3)。(图6C)采用CFSE/7-AAD细胞毒性测定，扩增的CD19-CAR CB-NK细胞对Raji细胞的细胞毒性活性的定量数据。靶细胞用CFSE标记，然后以5:1至0.3125:1的E:T比与扩增的CD19-CAR CB-NK细胞孵育4小时。接下来，用7-ADD检测靶细胞的裂解。(图6D)采用CFSE/7-AAD细胞毒性测定，扩增的CD19-CAR CB-NK细胞对Daudi细胞的细胞毒性活性的定量数据。
图7A-7I.淋巴瘤异种移植模型中221-mIL21扩增的CD19-CAR NK细胞的优异抗肿瘤活性。(图7A)Daudi淋巴瘤异种移植物模型的实验设计图。在第-4天通过尾静脉向雄性和磁性NSG小鼠(n＝5)静脉注射100μL PBS中的2×106个Daudi-FFLuc细胞。在第0天开始，在第0天、第3天、第7天和第10天，向小鼠(静脉)注射100μL PBS中的1×107个221-mIL21扩增的或者K562-mIL21扩增的CD19-CAR NK细胞并(腹腔内)注射150μL PBS中的IL-2(50000单位/鼠)和IL-15(10ng/鼠)。每周两次使用IVIS系统对动物进行成像以进行肿瘤细胞追踪。(图7B)在指示的时间点肿瘤负荷的代表图像。荧光强度范围为1×105至2×106单位光子/sec/cm2/sr。(图7C)在指示的时间点肿瘤负荷的定量数据。在指定的天数对小鼠进行成像以评估表示为定量的生物发光(平均光强度)的肿瘤负荷，表示肿瘤生长。(图7D)在指定的天数小鼠体重的定量数据。(图7E)Raji淋巴瘤异种移植物模型的实验设计图。在第0天通过尾静脉向雄性和雌性NSG小鼠(n＝10)静脉内注射100μL PBS中的2×106个Raji-FFLuc-GFP细胞。在第2天和第4天，向小鼠分别(静脉内)注射100μL PBS中的1×107个K562-mIL21扩增的CD19-CAR NK细胞、221-mIL21扩增的CD19-CAR NK细胞和221-mIL21扩增的CD19-CAR-IL15 NK细胞并(腹腔内)注射150μL PBS中的IL-2(50,000单位/鼠)和IL-15(10ng/鼠)。每周一次使用IVIS系统对动物进行成像以进行肿瘤细胞追踪。(图7F)在指示的时间点肿瘤负荷的代表图像。第7天的荧光强度范围为5×105至1×107单位光子/sec/cm2/sr，第14天和第21天的荧光强度范围为2×107至5×108单位光子/sec/cm2/sr。(图7G)携带肿瘤的小鼠在分别用PBS、K562-mIL21扩增的CD19-CAR NK细胞、221-mIL21扩增的CD19-CAR NK细胞和221-mIL21扩增的CD19-CAR-IL15 NK细胞治疗后的Kaplan–Meier存活曲线。通过对数秩(Mantel-Cox)检验对p值进行分析。(图7H)在指定时间点肿瘤负荷的定量数据。在指定的天数对小鼠进行成像以评估表示为定量的肿瘤负荷，表示肿瘤生长。(图7I)在指定的天数小鼠体重的定量数据。
图8A-8B.编码人IL-21的示例性重组逆转录病毒载体和用721.221.mIL-21饲养细胞扩增NK细胞的示例性方法的示意性表示。(图8A)，IL-21构建体含有人IgG1 Fab’结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域。(图8B)饲养细胞用100格雷(10000拉德)的剂量辐照，然后PBMC与具有IL-2和IL-15的经辐照的饲养细胞共培养以进行NK细胞扩增。
图9.人原代NK细胞表达细胞表面IL-21受体。代表性直方图显示出了IL-21R在来自PBMC的原代NK细胞上的表达。MFI记录在各自直方图中。
图10A-10C.用表达膜IL-15受体α(221-Mil-15Rα)的721.221细胞进行的原代人NK细胞扩增。(图10A)，代表性点图显示出了通过流式细胞术检测的在扩增后指示的某天用两种不同类型的饲养细胞扩增的NK细胞的纯度。在第0天分别用辐照的野生型721.221(上图)和721.221-mIL-15Rα刺激PBMC。在第7天、第14天和第21天检查NK细胞的纯度。(图10B和10C)，定量数据表明了分别用辐照的野生型721.221和721.221-mIL-15Rα扩增21天的来自7个供体的NK细胞的倍数扩增(图10B)和纯度(图10C)。
图11A-11C.用表达膜IL-21的721.221细胞进行的原代人T细胞扩增。(图11A)代表性点图显示出了通过流式细胞术检测的在扩增后指示的某天用两种不同类型的饲养细胞扩增的T细胞的纯度。在第0天分别用辐照的K562-mIL21(上图)和721.221-mIL21(下图)刺激PBMC。在第7天、第14天和第21天检查NK细胞的纯度。定量数据表明了分别用辐照的K562-mIL21和721.221-mIL21扩增21天的来自11个供体的T细胞的倍数扩增(左图)和纯度(右图)。(图11B)代表性点图显示出了通过流式细胞术检测的在扩增后指示的某天用两种不同类型的饲养细胞扩增的T细胞的纯度。在第0天分别用辐照的K562-mIL21(上图)和721.221-mIL21(下图)刺激脐带血单核细胞。在第7天、第14天和第21天检查NK细胞的纯度。定量数据表明了分别用辐照的K562-mIL21和721.221-mIL21扩增21天的来自11个供体的T细胞的倍数扩增(左图)和纯度(右图)。(图11C)代表性点图显示出了通过流式细胞术检测的在扩增后指示的某天用两种不同类型的饲养细胞扩增的T细胞的纯度。用辐照的721.221-mIL21饲养细胞刺激来自患有间变性大细胞淋巴瘤的患者的PBMC。分别在第7天、第20天和第28天检查T细胞的纯度。
图12.用四种不同类型的饲养细胞进行的原代人NK细胞扩增。用辐照的K562、K562-mIL21、721.221和721.221-mIL21刺激PBMC，定量数据表明了NK细胞的倍数扩增。
图13A-13N.221-mIL21扩增的NK细胞显示出了富集的代谢路径和不成熟表型。(图13A)用辐照的K562-mIL21和221-mIL21饲养细胞刺激PBMC。在第7天和第14天使用流式细胞术从扩增的细胞中纯化NK细胞以进行RNA测序(RNA-Seq)。在第7天和第14天用K562-mIL21或221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞的样品间距离的主成分分析(PCA)图。(图13B)与在第7天用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，在用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中差异表达的基因(DEG)的均值(MA)图；使用DESeq2计算p值。在MA图上标记前15个显著的DEG。上调，上调DEG，调整p<0.05和log2倍变化≥1；下调，下调DEG，调整后p<0.05和log2倍变化≤-1；NS，不显著。(图13C)与在第14天用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，在用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中DEG的MA图。在MA图上标记前15个显著的DEG。上调，上调DEG，调整p<0.05和log2倍变化≥1；下调，下调DEG，调整后p<0.05和log2倍变化≤-1；NS，不显著。(图13D)采用分子特征数据库(MSigDB)中的基因本体(GO)生物过程(BP)数据集，在第7天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中细胞氨基酸代谢过程的基因集富集分析(GSEA)。NES，标准化富集分数；p.调整，错误发现率(FDR)-调整的p值。(图13E)采用MSigDB中的Hallmark数据集，在第7天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中糖酵解的GSEA。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。(图13F)在使用K562-mIL21或221-mIL21作为饲养细胞进行NK细胞扩增期间，培养基中葡萄糖的动态水平。箭头表示培养基变化的时间点。(图13G)在第7天和第14天用K562-mIL21饲养细胞或221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞的定量葡萄糖摄取比较。(图13H)采用MSigDB中的GO_BP数据集，在第7天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中淋巴细胞激活的GSEA。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。(图13I)采用MSigDB中的GO_BP数据集，在第7天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中淋巴细胞分化的GSEA。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。(图13J)采用MSigDB中的GO_BP数据集，在第7天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中细胞-细胞粘附的GSEA。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。(图13K)NK细胞抑制性受体的热图。(图13L)NK细胞激活受体的热图。(图13M)与NK细胞的细胞毒性功能相关的基因的热图。(图13N)与NK细胞的发育和成熟相关的基因的热图。热图使用正则对数变换(regularized-logarithm transformation，rlog)从变换的RNA-seq计数得到的z分数生成。每一列代表一个生物学重复。
图14A-14F.不同类型的饲养细胞扩增系统中不同细胞群扩增的动力学。(图14A)来自用辐照的K562、K562-mIL21、221和221-mIL21饲养细胞扩增21天的PBMC(n＝11)的T细胞(CD3+CD56-)的百分比的动态延时扩增数据。(图14B)来自在第21天用指示的饲养细胞扩增的PBMC(n＝11)的T细胞(CD3+CD56-)的百分比的定量数据。(图14C)来自用辐照的K562、K562-mIL21、221和221-mIL21饲养细胞扩增21天的PBMC(n＝11)的CD3+CD56+的百分比的动态延时扩增数据。(图14D)来自用指示的饲养细胞扩增第21天的PBMC(n＝11)的CD3+CD56+的百分比的定量数据。(图14E)来自用辐照的K562、K562-mIL21、221和221-mIL21饲养细胞扩增21天的PBMC(n＝11)的CD3-CD56-的百分比的动态延时扩增数据。(图14F)来自用指示的饲养细胞扩增第21天的PBMC(n＝11)的CD3-CD56-的百分比的定量数据。(图14A、14C和14E)中示出了95％CI(灰色带)的均值(实线)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns p>0.05。
图15A-15K.图S7.使用221-mIL21细胞改善脐带血来源的NK细胞扩增。(图15A)在扩增后指示的某天用不同饲养细胞扩增的NK细胞的纯度的代表性流式细胞点图。在第0天用辐照的K562-mIL21或221-mIL21刺激脐带血单个核细胞(CBMC)，在第7天检查NK细胞的纯度，然后每隔3至4天检查。(图15B)用辐照的K562-mIL21或221-mIL21饲养细胞扩增21天的来自9个供体的CBMC的NK细胞的倍数扩增的动态延时扩增数据。(图15C)在第21天来自9个供体的CBMC的NK细胞的倍数扩增的定量数据。(图15D)用辐照的K562-mIL21或221-mIL21饲养细胞扩增21天的来自9个供体的CBMC的NK细胞的纯度的动态延时扩增数据。(图15E)在第21天来自9个供体的CBMC的NK细胞的纯度的定量数据。(图15F)用辐照的K562、K562-mIL21、221和221-mIL21饲养细胞扩增21天的CBMC(n＝9)的T细胞(CD3+CD56-)的百分比的动态延时扩增数据。(图15G)在第21天用指定的饲养细胞扩增的CBMC(n＝9)的T细胞(CD3+CD56-)的百分比的定量数据。(图15H)用辐照的K562、K562-mIL21、221或221-mIL21饲养细胞扩增21天的CBMC(n＝9)的CD3+CD56+的百分比的动态延时扩增数据。(图15I)在第21天用指定的饲养细胞扩增的CBMC(n＝9)的CD3+CD56+的百分比的定量数据。(图15J)用辐照的K562、K562-mIL21、221和221-mIL21饲养细胞扩增21天的CBMC(n＝9)的CD3-CD56-的百分比的动态延时扩增数据。(图15K)在第21天用指定的饲养细胞扩增的CBMC(n＝9)的CD3-CD56-的百分比的定量数据。(图15B、15D、15F、13H和15J)中示出了95％CI(灰色带)的均值(实线)。**p<0.01,ns p>0.05。
图16A-16D.使用不同的饲养细胞系统从脐带血单个核细胞扩增的NK细胞的表型和功能。(图16A)NKG2D、NKp46、2B4和CD226在使用221-mIL21(红色)和K562-mIL21(绿色)饲养细胞从脐带血单个核细胞扩增的NK细胞上的表达的代表性直方图。还示出了来自相同供体的新鲜分离的脐带血单个核细胞的NK细胞(蓝色)。(图16B)CD69、CD94、CD8a和CD16在使用221-mIL21(红色)和K562-mIL21(绿色)饲养细胞从脐带血单个核细胞扩增的NK细胞上的表达的代表性直方图。还示出了来自相同供体的新鲜分离的脐带血单个核细胞的NK(蓝色)。(图16C)NKG2A、NKG2C、KIR和KIR3DL1在使用221-mIL21(红色)和K562-mIL21(绿色)饲养细胞从脐带血单个核细胞扩增的NK细胞上的表达的代表性直方图。还示出了来自相同供体的新鲜分离的脐带血单个核细胞的NK(蓝色)。(图16D)使用CFSE/7-AAD细胞毒性测定的扩增的CB-NK细胞对K562细胞的细胞毒性活性的定量数据。K562细胞用CFSE标记，然后以5:1至0.3125:1的E:T比与扩增的CB-NK细胞孵育4小时。接下来，用7-ADD检测K562细胞的裂解。
图17A-17H.用不同饲养细胞系统扩增PBMC的CD19-CAR NK细胞。(图17A)在指定的时间点NK细胞中CD19-CAR阳性细胞的百分比的代表性流式细胞点图。PBMC在第0天用辐照的饲养细胞刺激并在第7天用CD19-CAR逆转录病毒转导。(图17B)在从PBMC(n＝3)扩增的NK细胞中CD19-CAR阳性细胞的百分比的定量数据。(图17C)在CD19-CAR阳性细胞(n＝3)中T细胞(CD3+CD56-)的百分比的动态延时扩增数据。(图17D)在第21天CD19-CAR阳性细胞(n＝3)中T细胞(CD3+CD56-)的百分比的定量数据。(图17E)在第21天CD19-CAR阳性细胞(n＝3)中CD3+CD56+的百分比的动态延时扩增数据。(图17F)在第21天CD19-CAR阳性细胞(n＝3)中CD3+CD56+的百分比的定量数据。(图17G)在CD19-CAR阳性细胞(n＝3)中CD3-CD56-的百分比的动态延时扩增数据。(图17H)在第21天CD19-CAR阳性细胞(n＝3)中CD3-CD56-的百分比的定量数据。(图17C、17E和17G)中示出了95％CI(灰色带)的均值(实线)。
图18A-18F.221扩增的NK细胞的富集代谢路径和免疫表型。(图18A)使用分子特征数据库(MSigDB)中的基因本体(GO)生物过程(BP)数据集，第7天(左)和第14天(右)用221-mIL21和K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞之间的基因的GSEA的点图。(图18B)在第14天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中细胞氨基酸代谢过程的基因集富集分析(GSEA)。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。(图18C)使用分子特征数据库(MSigDB)中Hallmark数据集，在第14天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中糖酵解的GSEA。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。(图18D)在第14天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中淋巴细胞激活的GSEA。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。(图18E)在第14天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中淋巴细胞分化的GSEA。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。(图18F)在第14天与用K562-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞相比，用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中细胞-细胞粘附的GSEA。NES，标准化富集分数；p.调整，FDR-调整的p值。
图19A-19I.扩增的NK细胞的富集代谢路径和免疫表型的热图。(图19A-19B)细胞氨基酸代谢过程的GSEA鉴定基因的热图。(图19C)糖酵解的GSEA鉴定基因的热图。(图19D-19E)淋巴细胞激活的GSEA鉴定基因的热图。(图19E-19F)淋巴细胞分化的GSEA鉴定基因的热图。(图19G-19I)细胞-细胞粘附的GSEA鉴定基因的热图。热图使用正则对数变换(rlog)从变换的RNA-seq计数得到的z分数生成。每一列代表一个生物重复。
序列
使用如37C.F.R.§1.822所定义的表示核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写显示本文提供的核酸和氨基酸序列。至少在某些情况下，只显示每个核酸序列的一条链，但是互补链被理解为包括在对所显示链的任何引用中。
SEQ ID NO:1为来自白介素(IL)-21的胞外结构域的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:2为来自IL-21的胞外结构域的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为用于用膜结合(m)IL-21转导细胞的构建体的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:4为IL-15Rα的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:5为IL-15Rα的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:6为IL-15的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:7为IL-15的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:8为IL-2的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:9为IL-2的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:10为IL-27的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:11为IL-27的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:12为IL-12B的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:13为IL-12B的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:14为IL-12p35的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:15为IL-12p35的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:16为IL-12p40的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:17为IL-12p40的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:18为IL-18的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:19为IL-18的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:20为IL-18的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:21为IL-18的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:22为IL-33的示例性核酸序劽。
SEQ ID NO:23为IL-33的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:24为IL-7的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:25为IL-7的示例性氨基酸序列。
SEQ ID NO:26为MICA的示例性核酸序列。
SEQ ID NO:27为MICA的示例性氨基酸序列。
具体实施方式
本文公开了表达一或多种细胞因子或细胞因子受体(例如IL-15受体α(IL-15Rα)和/或膜结合IL-21)的经修饰的721.221细胞以及使用经修饰的721.221细胞扩增免疫细胞的方法。如本文所示，经修饰的721.221细胞可以用于有效地扩增NK细胞或T细胞(包括CAR修饰的NK细胞或T细胞)。
与重组IL-15和IL-2以及经修饰的721.221细胞组合，原代NK细胞经三周扩增后扩增了大约39663倍。而且，用编码对CD19蛋白有特异性的CAR分子的逆转录病毒进行的转导可使来自外周血和脐带血的原代NK细胞扩增。因此，描述了用于扩增人原代NK细胞和遗传修饰的CAR-NK细胞的平台。
与先前的NK扩增系统(Denman等人PLoS One 7:e30264(2012)；Fujisaki等人Cancer Res 69:4010-7(2009))相比，本文所述的用于NK扩增的721.221-mIL-21细胞包括三个独特优点。使用本文所述的技术并与膜形式的IL-21和细胞培养物中的两种可溶性细胞因子组合，扩增的NK细胞的数量显著更高(在721.221-mIL-21细胞中大约增加39663倍，使用K562-mIL-21细胞增加3588倍)，其中NK细胞在体外高效繁殖。与K562-mIL-21扩增的NK细胞相比，721.221-mIL-21扩增的NK细胞还具有更高的纯度和增强的细胞毒性的特征。此外，本文中，利用721.221-mIL-21NK扩增从脐带血(CB)来源的CAR-NK细胞，CB易于从CB库获得，以及2)使用CB来源的CAR-NK细胞作为现成的CAR产品。
术语
除非另有指示，技术术语按照常规使用。分子生物学中常用术语的定义可参见Benjamin Lewin，Genes VII，牛津大学出版社出版，2000年(ISBN 019879276X)；Kendrew等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Publishers出版，1994年(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由Wiley，John&Sons，Inc.出版，1995年(ISBN 0471186341)；George P.Rédei，Encyclopedic Dictionary of Genetics,Genomics,and Proteomics，第二版，2003年(ISBN:0-471-26821-6)。
除非上下文另有明确说明，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”是指一个或一个以上。例如，术语“包括白介素”包括单数个或复数个白介素并且认为等同于短语“包括至少一种白介素”。除非上下文另有明确说明，术语“或”是指所陈述的可选择元素的单数元素或两个或更多个元素的组合。如本文所用，“包含”意指“包括”。因此，“包含A和B”意指“包括A，B或A和B”，不排除另外的元素。
进一步应理解的是，核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似值，仅供说明。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述相似或等价的方法和材料，但是下文仍描述了适宜的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入，
Figure BDA0003310365990000111
登录号也是如此(对于2019年2月20日出现的序列)。如有冲突，以本说明书为准，包括术语解释。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图限制。
为了便于评价本公开的各个实施方案，下面对特定术语进行了解释。
721.221细胞：也称为LCL 721.221或
Figure BDA0003310365990000112
CRL-1855TM细胞，721.221细胞是来源于人EB病毒转化的细胞系的B淋巴细胞。721.221细胞不表达I类组织相容性抗原(也称为主要组织相容性复合体(MHC)I类分子)。本领域已知产生721.221细胞的方法(参见例如Shimiz等，Proc Natl Acad Sci U S A.,85(1):227-31,1988，其全文通过引用并入本文)。
激活受体配体：结合自然杀伤(NK)或T细胞的受体从而激活NK或T细胞的配体。激活受体配体的示例包括UL16结合蛋白(ULBP)-1、ULPB-2和/或主要组织相容性复合体(MHC)I类链相关蛋白A(MIC-A)。
自身免疫紊乱：一种紊乱，其中免疫系统对外源性抗原产生免疫反应(例如B细胞或T细胞反应)，结果使组织受损。该损伤可局限于某些器官中，如甲状腺炎，或者可涉及位于不同位置的特定组织，如Goodpaster病，或者可能是全身性的，如红斑狼疮。
在一些示例中，自身免疫疾病包括全身性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿性关节炎、I型糖尿病、韦格纳肉芽肿、炎症性肠病、多肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特综合征、自身免疫性葡萄膜炎、艾迪生病、肾上腺炎、格雷夫斯病、甲状腺炎、桥本甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮性肝炎、动脉粥样硬化、老年前期痴呆、脱髓鞘疾病、多发性硬化、亚急性皮肤红斑狼疮、甲状旁腺功能减退症、德莱斯勒综合征、重症肌无力、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、秃发、类天疱疮、硬皮病、进行性全身性硬化、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺现象、食管运动障碍、硬性指关节炎和毛细血管扩张)、成人型糖尿病(II型糖尿病)、男性和女性自身免疫性不孕症、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、混合结缔组织病、多动脉炎、全身性坏死性血管炎、幼年型类风湿性关节炎、肾小球肾炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、Goodpaster综合征、查加斯病、结节病、风湿热、哮喘、反复流产、抗磷脂综合征、农民肺、多形红斑、心脏切开术后综合征、库欣综合征、自身免疫性慢性活动性肝炎、鸟类爱好者肺、过敏性疾病、过敏性脑脊髓炎、中毒性表皮坏死松解、脱发、阿尔波特综合征、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维性肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、锥虫病、Takayasu动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉菌病、Sampter综合征、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿、Behcet病、卡普兰综合征、川崎病、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心肌内膜纤维化、眼内炎、持久隆起性红斑、银屑病、胎儿成红细胞增多症、嗜酸性面炎、舒尔曼综合征、费尔蒂综合征、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异慢性睫状体炎(heterochronic cyclitis)、Fuch's睫状体炎、IgA肾病、过敏性紫癜、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、移植排斥反应、人类免疫缺陷病毒感染、埃可病毒感染、心肌病、阿尔茨海默病、细小病毒感染、风疹病毒感染、接种后综合征、先天性风疹感染、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、伊顿-兰伯特综合征、复发性多软骨炎、恶性黑色素瘤、冷球蛋白血症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、EB病毒感染、腮腺炎病毒属和埃文综合征。
癌症：也称为“恶性肿瘤”或“恶性新生物”，癌症是指以不受控的异常的细胞增殖为特征的多种疾病中的任意一种。癌细胞有可能会局部扩散或者通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部分(例如转移)，具有许多特征性结构和/或分子特征。“癌细胞”是一种具有特殊结构特性、缺乏分化并且能够侵入和转移的细胞。包括惰性和高级形式。在一些示例中，癌症是实体癌(如肉瘤(例如横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤和肺泡软部肉瘤)；癌(例如结直肠癌和肝细胞癌(HCC))；以及淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤)；神经母细胞瘤；妇科癌症(如卵巢癌)；乳腺癌；肝癌(例如肝细胞癌(HCC))；肺癌；前列腺癌；皮肤癌；骨癌；胰腺癌；脑癌(神经母细胞瘤)；头颈癌；肾癌(如肾母细胞瘤)；视网膜母细胞瘤；肾上腺皮质肿瘤；硬纤维瘤；结缔组织增生性小圆细胞瘤；内分泌肿瘤；和/或血癌(如骨髓瘤，如多发性骨髓瘤；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤；或白血病，如急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性髓系白血病(AML))。
嵌合抗原受体(CAR)：一种具有细胞外结构域的嵌合融合蛋白，所述细胞外结构域通过跨膜结构域与能够激活T细胞的细胞内信号转导结构域融合。CAR分子可包括细胞外结构域(胞外域)和在功能上彼此不同(多特异性CAR)并且结合靶上两个不同位点(多靶向)的两个(或更多个)靶向结构域。例如，多特异性CAR的一个靶向结构域可以是细胞表面受体，如CD19(例如多特异性的基于CD19的CAR)。在另一示例中，多特异性CAR的一个靶向结构域可以是细胞表面受体，如CD19，第二个靶向结构域可以是抗体或其片段，如scFv(即多特异性CD19-scFv CAR)。在一些实施方案中，CD19-scFv CAR结合两个不同的靶位点(即多靶向的CD19-scFv)。单功能CAR在靶向细胞外结构域中仅含有单个功能元件。在某些具体的实施方案中，CAR的细胞外结合结构域的一部分源自鼠或人源化单克隆抗体。
CAR分子的细胞内信号转导结构域包括两个不同的细胞质信号转导结构域。例如，一个信号转导结构域可以是细胞质效应功能信号转导结构域，第二个信号转导结构域可以是细胞质共刺激信号转导结构域。接头可将结构域彼此连接(例如两个靶向结构域)或者它们可以将一个结构域与另一个结构域连接在一起(例如将配体结合结构域与跨膜结构域连接)。CAR也称为嵌合免疫受体、zetakines和通用T细胞受体。
制备CAR的方法是可获得的(参见例如Park等Trends Biotechnol.,29:550-557,2011；Grupp等,N Engl J Med.,368:1509-1518,2013；Han等,J.Hematol Oncol.,6:47,2013；PCT公开WO 2012/079000,WO 2013/059593；和U.S.公开2012/0213783，每一篇均以全文通过引用并入本文)。
接触：处于直接物理关联中，包括固体和液体形式。在一个示例中，接触包括液体培养基中的物质或细胞(如细胞因子或饲养细胞)与一或多个其他细胞(如培养中的NK细胞或T细胞)之间的关联。与分离的细胞或组织的接触可以在体外发生，也可以通过向受试者施用而在体内发生。
培养或细胞培养物：在一组规定的条件下(如培养基、细胞外基质、温度和/或培养时间)细胞群的体外生长。在一些示例中，细胞培养物包括基本上纯的培养物(例如分离的721.221细胞或分离的NK细胞)。在另外的示例中，细胞培养物包括混合的培养物，如两种或更多种类型细胞的共培养物(例如NK细胞与饲养细胞的培养物)。在其他示例中，细胞培养物包括与细胞外基质接触生长的细胞。
培养基：一组合成的培养条件，含有支持特定细胞群如721.221细胞的存活、功能和/或生长所必需的营养。培养基一般包括碳源、氮源和维持pH的缓冲液等成分。培养基中的额外成分还可包括血清、细胞因子、激素、生长因子、蛋白酶抑制剂、蛋白水解产物、剪切力保护剂、蛋白质、维生素、谷氨酰胺、微量元素、无机盐、矿物质、脂质和/或附着因子中的一或多种。
细胞因子：由影响其他细胞的行为的细胞如淋巴细胞产生的蛋白质。在一个实施方案中，细胞因子为白介素，一种调节细胞生长、分化和能动性(例如以刺激免疫反应，如炎症)的分子。在其他实施方案中，细胞因子可以为激活受体配体、TRL配体或其受体。在一些示例中，细胞因子包括已知用刺激或共刺激细胞扩增(例如NK或T细胞扩增)的分子。术语“细胞因子”可用作在钠摩尔至皮摩尔浓度下充当体液调节剂并且在正常或病理条件下调节各个细胞和组织的功能活性的不同组的可溶性蛋白质和肽的通用名称。这些蛋白质也直接介导细胞之间的相互作用并调节发生在细胞外环境中的过程。细胞因子的示例包括但不限于肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL-2)、IL-7、IL-15、IL-21包括膜结合IL-21(mIL-21)、干扰素(IFN)γ、IFNα、IFNβ、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-1家族分子(例如IL-1α、IL-1β、IL-1Rα、IL-18、IL-36Rα、IL36α、IL36β、IL-36γ、IL-37、IL-38、IL-33、toll受体(TLR)配体、激活受体配体(例如UL16结合蛋白(ULBP)-1、ULPB-2、主要组织相容性复合体(MHC)I类链相关蛋白A(MIC-A))、IL-1家族分子、Fc受体、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、CD8α、2B4(也称为分化簇244(CD244))、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、CD8α、CD40、CD28、4-1BB配体(4-1BBL)、OX40L、TRX518、CD3抗体和CD28抗体。
有效量：足以例如在正在用药剂治疗的受试者中实现所需效果的所指定药剂的数量。在一些示例中，本文公开的扩增的NK细胞或T细胞(例如嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞或CAR-T细胞)的有效量为足以治疗或抑制受试者中的疾病或紊乱(如肿瘤、病毒感染、自身免疫疾病或移植排斥)的量。在其他示例中，有效量为足以减少或减轻受试者中的疾病或紊乱的一或多个症状的扩增的NK细胞或T细胞(例如嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞或CAR-T细胞)的量。有效量(例如减轻、抑制和/或治疗受试者中的紊乱的量)将取决于例如正在被治疗的具体紊乱、正在被治疗的受试者、施用组合物的方式和其他因素。
表达：将基因的编码信息转化为细胞的可操作的、不可操作的或结构部分的过程，如蛋白质合成。基因表达会受到外部信号影响。例如，将细胞暴露于激素可刺激激素诱导的基因的表达。不同类型的细胞可能会对相同信号产生不同应答。基因的表达还可在DNA到RNA到蛋白质的路径中的任意地方被调节。调节可包括对转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子如mRNA的降解的控制，或者通过特定蛋白质分子在其产生后的激活、失活、区室化或降解进行控制。
饲养细胞：在离体或体外培养物中向另一细胞类型提供支持的细胞。饲养细胞可提供用饲养细胞培养的细胞的存活、生长和/或分化(或抑制分化)所需的一或多种因子。通常，辐照或者另外处理饲养细胞以预防其在培养物中增殖。在本文所述的某些示例中，用饲养细胞如辐照的经修饰的721.221细胞(例如表达mIL-21的721.221细胞)培养NK细胞。
异源核酸：一种例如通过转导或转染引入细胞中的核酸。“异源”核酸或蛋白质是指起源于不同遗传来源的核酸或蛋白质。例如，对细胞是异源的核酸或蛋白质来源于表达其的细胞以外的生物体或个体，包括合成的核酸(例如mRNA)。在其他示例中，异源核酸或蛋白质来源于除了表达其的细胞以外的细胞类型(例如不正常存在于721.221细胞中的核酸或蛋白质对721.221细胞是异源的)。在进一步的示例中，异源核酸包括重组核酸，如与来自另一基因的启动子可操作连接的蛋白编码核酸和/或来自不同来源的两个或更多个可操作连接的核酸。
免疫系统紊乱：一种与受试者中病理性免疫反应有关的疾病或紊乱(参见国际专利公开WO 2013/192294和美国专利公开2011/00811323，二者皆通过引用并入本文)。示例包括免疫缺陷(例如原发性或遗传性免疫缺陷以及与其他状况相关的免疫缺陷，例如与HIV、老年和癌症相关的免疫抑制)、细胞因子风暴、过敏、哮喘、各种类型的炎症和自身免疫紊乱。
感染性疾病：也称为传染性疾病或传染病，感染性疾病是由感染引起的病态。感染由包括病毒、类病毒、朊病毒、细菌；线虫，如寄生蛔虫和蛲虫；节肢动物，如蜱、螨、跳蚤和虱子；真菌，如癣；以及其他大型寄生虫如绦虫和其他蠕虫在内的传染原引起。宿主通过免疫系统对抗感染，如先天性反应(例如哺乳动物)，其包括发炎，然后是适应性反应。用于治疗感染的药物包括抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂和抗蠕虫剂。感染性疾病的具体示例包括人免疫缺陷综合征(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、结核病(TB)和疟疾。
抑制或治疗病症：“抑制”病症是指抑制病症或疾病例如肿瘤的完全发展。病症的抑制可涵盖疾病(例如肿瘤、病毒感染、自身免疫疾病或移植排斥)的部分抑制到基本完全抑制(例如包括但不限于预防)的范围。在一些示例中，术语“抑制”是指减少或延迟病症的发生或发展。“治疗”是指在疾病或病症开始发展后减轻其征兆或症状的治疗性干预。将待施用有效量的公开的NK细胞或T细胞(例如CAR-NK细胞或CAR-T细胞)的受试者可通过此类紊乱的标准诊断技术(例如是否存在疾病或紊乱或者发展疾病或紊乱的风险因素)来鉴定。
分离的：一种“分离的”或“纯化的”生物组分(如细胞、核酸、肽、蛋白质、蛋白复合物或病毒样颗粒)已与其他组分(例如该组分天然存在其中的细胞或生物体中的其他生物组分)基本上分开、脱离产生或从中纯化。因此，已“分离”或“纯化”的细胞、核酸、肽和蛋白质包括由标准纯化方法纯化的细胞、核酸和蛋白质。
术语“分离的”或“纯化的”不要求绝对纯度；相反，它被认为是一个相对术语。因此，例如，分离的生物组分是指其中所述生物组分比在细胞、生物体、样品或生产容器(例如细胞培养系统)内的自然环境中的所述生物组分更富集的组分。优选地，纯化制剂以使得生物组分占制剂总生物组分含量的至少50％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高。
自然杀伤(NK)细胞：免疫系统的细胞，其在不存在特定抗原刺激物并且不受根据MHC类别限制的情况下杀伤靶细胞。靶细胞可以是肿瘤细胞或携带病毒的细胞。NK细胞的特征在于存在CD56以及不存在CD3表面标志物。NK细胞通常约占正常外周血中单个核细胞部分的10％至15％。历史上，NK细胞首先是通过其在没有先前免疫或激活时裂解某些肿瘤细胞的能力来鉴定的。NK细胞被认为针对病毒和肿瘤提供“后备”保护机制，这些病毒和肿瘤可能通过下调MHC I类呈递逃避细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。除了参与直接细胞毒性杀伤外，NK细胞还在细胞因子产生方面发挥作用，这对控制癌症和传染可能是重要的。包括驻留在组织中的记忆NK细胞。
在一些示例中，“CAR-NK细胞”是用编码或表达CAR的异源核酸转导的NK细胞。
药学上可接受的载体：可在本发明中使用的药学上可接受的载体(运载体)是常规的载体。Remington:The Science and Practice of Pharmacy,The University of theSciences in Philadelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA，第21版(2005年)描述了适用于药物递送一或多种治疗组合物如一或多种经修饰的NK细胞和/或另外的药物药剂的组合物和制剂。
一般地，载体的本质将取决于采用的具体施用方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，其包括作为运载体的药学上和生理学上可接受的液体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒固体载体可包括例如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，待施用的药物组合物可含有少量的无毒辅料物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。
受试者：一种活的多细胞脊椎动物生物体，包括人类和非人类哺乳动物(如兽医动物，包括狗和猫，以及小鼠、大鼠、兔、绵羊、马、牛和非人灵长类动物)的类别。
T细胞：一种对免疫反应至关重要的白细胞。T细胞包括但不限于CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T淋巴细胞是在其表面表达CD4的免疫细胞。这些细胞，也称为辅助T细胞，帮助协调免疫反应，包括抗体反应以及杀伤T细胞反应。Th1和Th2细胞是辅助T细胞的功能亚群。Th1细胞分泌一组细胞因子，包括干扰素-γ，其主要功能是刺激吞噬细胞介导的防御，针对感染尤其是与细胞内微生物相关的感染。Th2细胞分泌一组细胞因子，包括白介素(IL)-4和IL-5，其主要功能是刺激IgE和嗜酸性粒细胞/肥大细胞介导的免疫反应和下调Th1反应。在其他示例中，T细胞可包括调节性T细胞(Treg)、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、其他非常规T细胞(例如MAIT、γδT细胞和CD8αα+IEL)、先天淋巴细胞(ILC)、组织驻留记忆T细胞或任何疫苗引发的T细胞。与CD4+T细胞类似，Treg还表达CD4但可通过TGFβ的表达来区分。Treg可以帮助治疗免疫紊乱，如自身免疫疾病、慢性移植物抗宿主病(GVHD)、糖尿病、全身性红斑狼疮、肥胖和脑炎以及促进器官移植接受。NKT细胞共表达αβT细胞受体以及多种通常与NK细胞相关的分子标记物，如CD161。NKT细胞可以识别由CD1d分子呈递的脂质和糖脂，因此，NKT细胞可用以识别来自引起结核病的生物体如分歧杆菌的糖脂。
在一些示例中，遗传修饰T细胞，如“CAR-T细胞”，其为用编码或表达CAR的异源核酸转导的T细胞，或者可以为表达嵌合细胞因子受体(CCR)的T细胞，该T细胞是用编码CCR的异源核酸转导的T细胞(参见例如PCT专利公开WO 2017/029512，通过引用以全文并入本文)。
Toll样受体(TLR)配体：TLR配体在进化上是保守的，包括病原体相关分子，如细菌细胞表面脂多糖(LPS)、脂蛋白、脂肽和脂质阿拉伯甘露聚糖；蛋白质，如来自细菌鞭毛的鞭毛蛋白；病毒的双链RNA；细菌和病毒DNA的非甲基化的CpG岛；真核DNA启动子中的CpG岛；以及其他RNA和DNA分子。
转化的：转化的细胞是一种通过分子生物学技术已将核酸分子引入其中的细胞。如本文所用，术语转化包括所有技术，通过这些技术可将核酸分子引入至此细胞中，包括病毒载体转导、质粒载体转化以及通过电穿孔、脂染和颗粒枪加速(例如“转染”)引入裸DNA。
载体：一种允许将外源或异源核酸插入细胞(不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力)中的核酸分子。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可以包括一或多种可选择标记基因和其他遗传元件。表达载体是一种含有所需调节序列以允许转录和/或翻译所插入一或多个基因的载体。在一些非限制性示例中，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体。
II.若干实施方案的概述
本文描述了经修饰(例如遗传工程化)的721.221细胞和使用辐照的经修饰的721.221细胞系(如通过诱变获得的B细胞系，其不表达MHC I类分子或表达低水平MHC I类分子(Shimizu等，Proc Natl Acad Sci U S A 85:227-31(1988))扩增免疫细胞(如NK细胞、T细胞或遗传修饰的NK细胞或T细胞)的方法，所述辐照的经修饰的721.221细胞系表达膜结合IL-21(mIL-21)、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、mIL-15、IL-1家族细胞因子、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2、Fc受体、2B4(也称为CD244)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、CD8α和/或MIC-A中的至少一种。还公开了例如通过用编码表达膜结合IL-21(mIL-21)、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、mIL-15、IL-1家族细胞因子、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2、Fc受体、2B4(也称为CD244)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、CD8α和/或MIC-A的核酸转导或转染细胞来产生经修饰的721.221细胞的方法。在扩增原代NK细胞或T细胞或经修饰的NK细胞或T细胞(如CAR-NK或CAR-T细胞)的方法中使用经修饰的721.221细胞。最终，在治疗癌症、感染性疾病或免疫疾病等疾病或紊乱的方法中使用所述扩增的细胞。
最近研究表明，可以使用表达4-1BB(也称为CD137)配体(4-1BBL/CD137L)和IL-21的K562细胞作为饲养细胞快速体外扩增NK细胞(Denman等PLoS One 7:e30264(2012))。然而，这些用于治疗患者的细胞的表征和应用对确保细胞具有功能性并且是健康的是重要的。此外，还需要特定的NK细胞扩增来推进体内NK细胞免疫治疗。关于在细胞因子IL-2存在的条件下使用辐照的饲养细胞体外扩增NK细胞的一个潜在问题是幼稚
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免疫细胞在快速增殖和分化后被耗竭或衰老(Keir等Annu Rev Immunol26:677-704(2008))。的确，CAR修饰的免疫细胞表达耗竭标记物，如PD-1(John等Oncoimmunology 2:e26286(2013)；Cherkassky等,J Clin Invest 126:3130-44(2016)；Chong等,Blood(2016)；Gargett等,Mol Ther 24:1135-49(2016))。为解决免疫细胞耗竭的问题，一种方法是阻断CAR修饰的T细胞中的PD-1信号传导(Cherkassky等，J Clin Invest126:3130-44(2016))。鉴于T细胞中必需代谢信号传导(Buck等,J Exp Med 212:1345-60(2015))，另一个可能的策略是改变CAR修饰的T细胞中的代谢通路(Ping等，Protein Cell(2017))或者增强淋巴细胞新陈代谢(Lim WA and June CH,Cell 168:724-40(2017))。
在先前技术中，CAR修饰的T细胞和NK细胞的扩增需要使用抗体和细胞因子体外刺激遗传修饰的T细胞和NK细胞。这种抗体和细胞因子驱动的激活和扩增可负面改变CAR-T/NK细胞功能。例如，大量扩增程序结束时可能诱导CAR修饰的免疫细胞耗竭，这可以通过CART细胞中的PD-1、TIM-3和LAG-3的上调来证明(Long等Nat Med 21:581-90(2015))。因此，鉴于免疫细胞耗竭是慢性抗原刺激期间针对肿瘤和病毒的免疫反应受损的主要因素，可在体内开发新的修饰和扩增策略，但不诱导耗竭(Wherry EJ,Nat Immunol 12:492-9(2011)；Virgin等Cell 138:30-50(2009))。此外，扩增用于临床应用的CAR修饰的免疫细胞需要至少2-3周，这对某些患者是一个明显障碍。能够递送大的(9.1-14.3kb)可转座元件但T细胞效力没有显著降低的“睡美人转座子”或piggBac系统(Guerrero等,Chin J Cancer 33:421-33(2014)；Singh等,Immunol Rev 257:181-90(2014)；Maiti等,J Immunother 36:112-23(2013))组合表达膜结合IL-15和4-1BB配体的遗传工程人工细胞已用于CAR修饰的T细胞免疫疗法。
III.经修饰的721.221细胞和生产方法
本文公开了经修饰的(例如遗传工程化的)721.221细胞，其表达如下的一或多个：细胞因子(例如膜结合白介素-21(mIL-21)、IL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、mIL-15、toll样受体(TLR)配体或激活受体配体(例如UL16结合蛋白(ULBP)-1、ULBP-2、主要组织相容性复合体(MHC)I类链相关蛋白A(MIC-A))、IL-1家族分子、Fc受体、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和CD8α、2B4(也称为分化簇244(CD244))、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和CD8α)，包括CD40、CD28、4-1BB配体(4-1BBL)、OX40L、TRX518、CD3抗体和CD28抗体。本文中，这些细胞称为“经修饰的721.221细胞”。在一些实施方案中，经修饰的721.221细胞还表达IL-15受体α(IL-15Rα)。在一个示例中，经修饰的721.221细胞表达mIL-21。在其他示例中，经修饰的721.221细胞表达mIL-21和IL-15Rα。
721.221细胞是B淋巴细胞，特征在于用人EB病毒转化并且不表达I类组织相容性抗原(也称为主要组织相容性复合体(MHC)I类分子)或者表达低水平的MHC I分子。721.221细胞也称为LCL 721.221(此前也称为
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CRL-1855TM细胞)。可通过本领域使用的任意方法产生721.221细胞。在Shimiz等Proc Natl Acad Sci U S A.,85(1):227-31,1988(通过引用以全文并入)中描述了产生721.221细胞的示例性方法。
在一些实施方案中，经修饰的721.221细胞包括异源核酸，其编码mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、mIL-15、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2、MIC-A、IL-1家族分子、Fc受体、2B4(也称为CD244)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和/或CD8α中的一或多个。在一些实施方案中，所述核酸编码促进免疫细胞如自然杀伤(NK)细胞或T细胞的扩增的蛋白质。在一些示例中，所述核酸编码细胞因子或细胞因子受体(例如白介素或白介素受体)，如mIL-21、mIL-15、IL-7、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1家族分子或其受体(例如IL-15Rα；参见例如Wu等Front Immunol，8:930，2017，通过引用以全文并入本文)、toll样受体(TLR)配体、激活受体配体(如ULBP-1、ULPB-2、MIC-A、Fc受体、2B4(也称为CD244)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)和/或CD8α)、CD40、CD28、4-1BB配体(4-1BBL)、OX40L、TRX518、CD3抗体和CD28抗体。在其他示例中，细胞因子或细胞因子受体是膜结合的(例如膜结合IL-21或膜结合IL-15)。在具体的非限制性示例中，经修饰的721.221细胞包括编码mIL-21的核酸。在其它非限制性示例中，经修饰的721.221细胞包括编码mIL-21和IL-15Rα的异源核酸。在另外的非限制性示例中，经修饰的721.221细胞包括编码膜结合ICAM-1、Fc受体、CD8α、ULBP-1、ULPB-2或MIC-A的异源核酸。
在一些示例中，编码mIL-21的核酸包括与SEQ ID NO:1有至少90％相同性(如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性)的核酸或由其组成和/或编码蛋白质，所述蛋白质包括与SEQ ID NO:2有至少95％相同性(如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性)的氨基酸序列或由其组成。在一些示例中，编码IL-15α的核酸包括与SEQ ID NO:3有至少90％相同性(如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性)的核酸或由其组成和/或编码蛋白质，所述蛋白质包括与SEQ ID NO:5有至少95％相同性(如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性)的氨基酸序列或由其组成。
本文还公开了产生本文所述的经修饰的721.221细胞的方法。通过用至少一种异源核酸(如编码mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、mIL-15、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2、MIC-A、IL-1家族分子、Fc受体、2B4、ICAM-1、CD8α、CD40、CD28、4-1BB配体(4-1BBL)、OX40L、TRX518、CD3抗体或CD28抗体中的一或多种的核酸)并且在一些示例中还使用IL-15Rα转导或转染721.221细胞，产生经修饰的或重组的721.221细胞。在具体的非限制性示例中，经修饰的721.221细胞包括编码mIL-21的异源核酸。在其他非限制性示例中，经修饰的721.221细胞包括编码mIL-21和IL-15Rα的异源核酸。在另外的非限制性示例中，经修饰的721.221细胞包括编码膜结合ICAM-1、Fc受体、CD8α、ULBP-1、ULPB-2或MIC-A的异源核酸。
在一些示例中，用包括至少一种异源核酸的载体(如慢病毒或逆转录病毒载体)转导或转化721.221细胞。例如，用至少一种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种异源核酸或者大约1-2种、1-3种、1-5种、1-7种或1-10种异源核酸或者大约1种、2种或3种异源核酸转导或转染721.221细胞。
可以使用任意转导或转染方法，如病毒转导(例如使用逆转录病毒如MoMLV或慢病毒)或非病毒转导、mRNA转染或纳米级核酸递送(例如化学树枝状聚合物(dendrimer)、DNA树枝状聚合物、纳米球、纳米层、纳米棒和纳米管)。
在一些实施方案中，公开的方法利用病毒载体将至少一种异源核酸递送至721.221细胞中。适宜的病毒载体的示例包括逆转录病毒(例如MoMLV或慢病毒)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体和鸡痘载体。在具体的示例中，使用逆转录病毒系统将一或多种异源核酸引入721.221细胞中。在一些示例中，可以使用MoMLV载体，如SFG逆转录病毒载体。SFG载体来源于鼠白血病病毒(MLV)骨架。这种类型的基于鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体是常用的基因递送运载体并且已经广泛用于临床试验。当前的SFG载体针对淋巴细胞遗传修饰、蛋白质表达和病毒滴度的基因表达进行了全面优化。
在一些示例中，SFG载体是带有RD114包膜的假型γ逆转录病毒。通过将Peq-Pam质粒(Moloney GagPol；例如大约4.69μg)、RDF质粒(RD114包膜；例如大约3.125μg)和SFG-VRC01质粒(例如大约4.69μg)三重转染细胞(例如使用GeneJuice(Novagen)的293T细胞)中，可以生成RD114假型瞬时逆转录病毒supe。可以收集上清(例如大约48和72小时后)。通过多次转导猴和人淋巴细胞产生高滴度生产细胞系。
所引入的异源核酸可以是编码任意细胞因子、激活受体配体或其受体或片段如IL-21(例如以产生mIL-21)、IL-15Rα、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、TLR配体、ULBP-1、ULBP-2、MIC-A、IL-1家族分子、Fc受体、2B4、ICAM-1、CD8α、CD40、CD28、4-1BB配体(4-1BBL)、OX40L、TRX518、CD3抗体和/或CD28抗体的核酸。在具体的示例中，核酸编码mIL-21、IL-15Rα或其组合。在其他非限制性示例中，核酸编码膜结合ICAM-1、Fc受体、CD8α、ULBP-1、ULBP-2或MIC-A。
在其中至少一种异源核酸包括编码膜结合细胞因子的核酸的实施方案中，所述至少一种异源核酸可包含感兴趣的细胞因子和另外的异源核酸序列(例如在相同或不同载体中)，例如，以形成膜结合细胞因子。例如，所述至少一种异源核酸可包含至少一个细胞外序列、至少一个跨膜序列和/或至少一个细胞内序列(例如在相同载体中)。
在一些示例中，至少一种异源核酸包含至少两个细胞外序列、至少三个细胞外序列、至少四个细胞外序列或至少五个细胞外序列或者大约1-2个、1-3个或1-5个细胞外序列。所述至少一个细胞外序列可包括用于膜的感兴趣的细胞因子，如白介素。在具体的示例中，白介素为IL-21。在一些示例中，至少一个细胞外序列可包括来自IgG序列的细胞外片段。在一些示例中，至少一个细胞外序列可包括来自CD8α的细胞外片段。在一些示例中，至少一种异源核酸包含至少两个细胞外序列。在具体的示例中，所述至少两个细胞外序列包括感兴趣的细胞因子如IL-21和来自IgG序列的细胞外片段。
在一些示例中，至少一种异源核酸包含至少两个跨膜序列或至少三个跨膜序列或者大约1-2个或1-跨膜序列。在一些示例中，至少一个跨膜序列可包括来自CD28序列的跨膜片段。还可使用其他跨膜序列，如来自CD40L或2B4的跨膜序列。在一些示例中，至少一种异源核酸包含至少两个细胞内序列、至少三个细胞内序列、至少四个细胞内序列、至少五个细胞内序列或至少六个细胞内序列，或者大约1-2个、1-3个或1-6个细胞内序列。在一些示例中，至少一个细胞内序列可包括来自CD28序列的细胞内片段、来自4-1BB序列的细胞内片段和/或来自CD3ξ序列的细胞内片段。在一些示例中，核酸构建体包括与SEQ ID NO:3有至少90％相同性(如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性)的核酸或由其组成。
本文描述了体外分离和富集721.221细胞的技术。在一些示例中，大量721.221细胞或721.221细胞亚群可以通过富集过程分离，如通过使用免疫磁珠或流式分选。分离的721.221细胞可以在细胞培养基中生长。在一个示例中，培养基是含10％(v/v)胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素-链霉素
Figure BDA0003310365990000191
的RPMI-1640
Figure BDA0003310365990000192
可通过流式细胞术分析分离的721.221细胞的至少一个转基因如mIL-21和/或IL-15Rα的表达。在一些示例中，所述方法包括阻止721.221细胞的增殖，如通过与阻止试剂或条件接触。在一些示例中，通过辐照(例如γ辐照，如以至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少5,000、至少7,000、至少8,000、至少9,000、至少10,000、至少11,000、至少12,000或至少约15,000或者约1,000-15,000、2,000-12,000、1,000-5,000、5,000-10,000或8,000-12,000或约10,000拉德的剂量)或者通过与丝裂霉素-C(MC)接触来阻止721.221细胞增殖。
可以使用本领域技术人员已知的各种技术鉴定经修饰的721.221细胞。在一些示例中，使用流式细胞术或免疫磁法鉴定经修饰的721.221细胞。例如，可使用可检测的抗体结合经修饰的721.221，所述经修饰的721.221表达例如表面表达的感兴趣的细胞因子、TRL配体或激活受体配体。在一些示例中，之后还可以使用流式细胞术或磁珠鉴定经修饰的721.221细胞。
IV.利用经修饰的721.221细胞扩增免疫细胞的方法
本文公开了使用本文公开的经修饰的721.221细胞扩增NK或T细胞的方法。在具体的示例中，利用本文公开的方法扩增CAR修饰的NK或T细胞。
本文描述了体外或离体分离和富集NK或T细胞的技术。在通过引用以全文并入本文的美国专利申请公开2014/0086890、国际专利申请公开WO 2017/127729和美国专利公开2013/0315884中描述了示例性方法。本领域技术人员可鉴定扩增NK或T细胞的另外方法，例如如以下所述：通过引用以全文并入本文的Childs等Hematol.The EducationProgram2013:234-246，2013；美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和美国专利申请公开2006/0121005。
从受试者(如健康受试者、供体受试者或患有癌症、免疫紊乱或感染性疾病的受试者)或者从与待治疗受试者HLA匹配的供体收集单个核细胞。在一些示例中，通过单采血液成分术方法收集单个核细胞。例如，通过使用免疫磁珠策略进行的阴性耗竭来富集NK或T细胞的单个核细胞。在其他示例中，单个核细胞包括PBMC，所述PBMC是例如使用如基于
Figure BDA0003310365990000201
的分离方法(
Figure BDA0003310365990000202
Healthcare)等多糖技术分离的。
在一些示例中，任选地利用生物素化的单克隆抗体的混合物耗竭单个核细胞样品的T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞、血小板、巨噬细胞和红细胞而富集NK细胞。在一些示例中，用与链霉抗生物素蛋白偶联的磁珠去除样品中的非NK细胞，从而获得NK细胞的富集制备物。用于该方法的示例性商业可获得试剂盒是
Figure BDA0003310365990000203
UntouchedTM人NK细胞试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)。
在一些示例中，利用生物素化的单克隆抗体的混合物耗竭单个核细胞样品的NK细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞、血小板、巨噬细胞和红细胞而富集T细胞。在一些示例中，用与链霉抗生物素蛋白偶联的磁珠去除样品中的非NK细胞，从而获得NK细胞的富集制备物。用于该方法的示例性商业可获得试剂盒是EASYSEPTM人T细胞分离试剂盒(STEMCELLTMtechnologies,Cambridge,MA)。在一些示例中，用与链霉抗生物素蛋白偶联的磁珠去除样品中的非NK细胞，从而获得NK细胞的富集制备物。
在一些示例中，通过阳性选择富集NK或T细胞。在一些示例中，所述方法包括如通过利用与抗CD56抗体缀合的磁珠(如CD56 MicroBeads,Miltenyi Biotec,Inc.,Auburn,CA)对CD56+NK细胞进行阳性选择来富集NK细胞。在其他示例中，包括阴性耗竭(如T细胞耗竭)和随后的CD56+NK细胞的阳性选择的两步法用于富集NK细胞。在其他示例中，所述方法包括如通过利用与抗CD4或抗CD8抗体缀合的磁珠(如CD4或CD8MicroBeads,MiltenyiBiotec,Inc.,Auburn,CA)对CD4+T细胞或CD8+T细胞进行阳性选择来富集T细胞。在其他示例中，包括阴性耗竭(如NK细胞耗竭)和随后的CD4+T细胞或CD8+T细胞的阳性选择的两步法用于富集T细胞。本领域技术人员可鉴定可用以制备富集的NK或T细胞群的其他方法。
可通过流式细胞术分析分离的NK或T细胞的标记物的表达。在一些示例中，可以使用标记物测定分离的细胞的纯度。在一些示例中，可以使用CD56作为标记物以例如分析NK细胞。在一些示例中，可以使用CD8或CD4作为标记物以例如分析T细胞。
在一些实施方案中，体外扩增NK细胞或T细胞。在一些示例中，富集的NK细胞或T细胞可用于扩增。在其他示例中，使用异源细胞池(如源自如组织、体液或血液样品等样品的细胞群)扩增NK细胞或T细胞。在一些示例中，细胞群包括外周血单个核细胞(PMBC)。可以从任意组织、体液或血液样品中生成细胞群(例如PMBC)，例如，外周血、脐带血、腹水、月经血或骨髓。在具体的示例中，细胞群包括来自健康供体的PMBC、来自健康供体的脐带血单个核细胞或来自非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者的PBMC。
在一些示例中，为增强扩增，用本文公开的经修饰的721.221细胞(例如表达mIL-21的721.221细胞)扩增NK细胞或T细胞。利用本文公开的经修饰的721.221细胞作为NK或T细胞的饲养细胞。可以使用任意量的用于扩增的细胞和饲养细胞。在一些示例中，用于扩增的细胞(例如PMBC)的量可包括至少大约101、至少大约102、至少大约103、至少大约104、至少大约105、至少大约106、至少大约107、至少大约108、至少大约109或至少大约1010、大约101-1010、104-108或大约106如5x106个细胞。在一些示例中，用于扩增的细胞(例如包括NK细胞或T细胞的细胞群，如PMBC)可与至少大约101、至少大约102、至少大约103、至少大约104、至少大约105、至少大约106、至少大约107、至少大约108、至少大约109或至少大约1010、大约101-1010、105-109或大约106如1x107个饲养细胞(例如经修饰的721.221细胞，例如表达mIL-21的721.221细胞)接触。在一些示例中，用于扩增的细胞(例如PMBC)与饲养细胞的比率可以为至少大约1：1至大约1:50，例如至少大约1：1、至少大约1:2、至少大约1:5，至少大约1:6，至少大约1:7、至少大约1:8、至少大约1:9、至少大约1:10、至少大约1:15、至少大约1:20、至少大约1:25、至少大约1:30、至少大约1:35、至少大约1:40、至少大约1:45或至少大约1:50或大约1:2、大约1:7、大约3:20或大约1:20。在一些示例中，使用其他试剂来增强扩增，如额外的细胞因子，例如IL-2、IL-5、IL-7、IL-8和/或IL-12。
将用于扩增的细胞(例如包括NK细胞或T细胞的细胞群，如PMBC)与饲养细胞和/或其他扩增增强试剂(例如IL-2、IL-5、IL-7、IL-8和/或IL-12)接触至少大约1-40天，如至少大约1天、至少大约3天、至少大约5天、至少大约7天、至少大约10天、至少大约14天、至少大约21天、至少大约28天、至少大约35天、大约10-30天、10-20天、20-30天或15-25天，或大约14天(例如用于T细胞扩增)或大约21天(例如用于NK细胞扩增，如CAR-NK细胞)。
使用本文公开的技术(例如通过使NK细胞或T细胞与例如表达mIL-21的饲养细胞如经修饰的721.221细胞接触)产生的扩增的NK细胞或T细胞(例如富集的或者在异源细胞群如PMBC中)可能优于不使用饲养细胞如经修饰的721.221细胞(例如表达mIL-21)的对照扩增技术。在一些示例中，使用本文公开的技术进行的扩增可使扩增增强至少大约1倍、至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约4倍、至少大约5倍、至少大约6倍、至少大约7倍、至少大约8倍、至少大约9倍、至少大约10倍、至少大约15倍、至少大约20倍、1-20倍、5-15倍、1-5倍、5-10倍、10-15倍或大约10倍。
在一些示例中，可对扩增的NK细胞或T细胞的细胞毒性进行评估。可以在任意时间(如在对扩增的NK细胞或T细胞进行扩增后，或者任选地，在对扩增的NK细胞或T细胞进行转导(例如以表达嵌合抗原受体(CAR)后)评估细胞毒性。在一些示例中，为评估对肿瘤细胞的细胞毒性，可以使用动物模型，如表达可检测肿瘤标记物(例如生物荧光肿瘤标记物，如荧光素梅，例如ffluc.Daudi肿瘤细胞)的动物模型。在具体的示例中，与不使用本文公开的方法产生的对照NK或T细胞相比，所述NK或T细胞例如对肿瘤细胞表现出优越的细胞毒性。例如，使用所公开的方法产生的NK或T细胞例如对肿瘤细胞表现出更大的细胞毒性，为至少大约0.5倍、至少大约1倍、至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约4倍、至少大约5倍、至少大约6倍、至少大约7倍、至少大约8倍、至少大约9倍或至少大约10倍、大约0.5-10倍、1-5倍或5-10倍或大约3倍以上的毒性。在一些示例中，可以用铬释放测定来评估NK细胞对细胞靶的细胞毒性。本领域技术人员可鉴定其他的方法来评估分离的NK细胞群(例如纯度、存活和/或活性)。
在一些实施方案中，可以对NK或T细胞进一步转导以表达感兴趣的蛋白质。在具体的示例中，可对NK或T细胞进行转导以表达CAR。然后，使用经修饰的721.221细胞和本文公开的方法扩增经修饰的NK或T细胞。在本文所述的整个方法中可以在任意时间转导NK或T细胞，如在扩增之前或在扩增期间。在具体的示例中，在扩增期间(如至少大约1/4、1/3、1/2或3/4的扩增过程持续时间)用CAR转导NK或T细胞。在具体的非限制性示例中，在大约1/3扩增持续时间用CAR转导NK或T细胞，例如，扩增过程超过21天，可以在大约第7天用CAR转导NK或T细胞。在其他示例中，随后修饰使用本文公开的经修饰的721.221细胞修饰扩增的NK或T细胞以表达CAR。
在具体的示例中，用包含感兴趣的CAR的病毒载体(以在其中进行递送)转导NK或T细胞。合适的病毒载体的示例包括逆转录病毒(例如MoMLV或慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒和鸡痘载体。在具体的示例中，使用逆转录病毒系统将CAR引入NK或T细胞。在一些示例中，可以使用MoMLV载体如SFG逆转录病毒载体。在一些示例中，CAR可包含来自至少一种异源核酸的蛋白质或其片段，可包含至少一个细胞外序列、至少一个跨膜序列和/或至少一个细胞内序列(例如在相同或不同载体中)。
在一些示例中，至少一种异源核酸包含至少两个细胞外序列、至少三个细胞外序列、至少四个细胞外序列或至少五个细胞外序列或者大约1-2个、1-3个或1-5个细胞外序列。所述至少一个细胞外序列可包括任意感兴趣的CAR，如CD19或κ轻链序列。在一些示例中，至少一个细胞外序列可包括来自IgG序列的细胞外片段。可以使用其他细胞外序列，包括来自CD8α或CD28的细胞外序列。在一些示例中，至少一种异源核酸包含至少两个细胞外序列。在具体的示例中，所述至少两个细胞外序列包括感兴趣的CAR如CD19或κ和来自IgG序列的细胞外片段。
在一些示例中，至少一种异源核酸包含至少两个跨膜序列或至少三个跨膜序列或大约1-2个或1-跨膜序列。在一些序列中，至少一个跨膜序列可包括来自CD28序列的跨膜片段。可以使用其他跨膜序列，如4-1BB序列。在一些示例中，至少一种异源核酸包含至少两个细胞内序列、至少三个细胞外序列、至少四个细胞内细胞、至少五个细胞内序列或至少六个细胞内序列或者大约1-2个、1-3个或1-6个细胞内序列。在一些示例中，至少一个细胞内序列可包括来自CD28序列的细胞内片段、来自4-1BB序列的细胞内片段和/或来自CD3ζ序列的细胞内片段。
可以使用额外的CAR，例如LL1(抗CD74)、GD2抗原、CD5抗原、CD57抗原、LL2或RFB4(抗CD22)、维妥珠单抗(hA20、抗CD20)、利妥昔单抗(抗CD20)、阿托珠单抗(GA101、抗CD20)、lambrolizumab(抗PD1)、纳武单抗(抗PD1)、MK-3475(抗PD1)、AMP-224(抗PD1)、匹地利珠单抗(抗PD1)、MDX-1105(抗PD-LI)、MEDI4736(抗PD-Ll)、MPDL3280A(抗PD-LI)、BMS-936559(抗PD-L1)、伊匹木单抗(抗CTLA4)、trevilizumab(抗CTL4A)、RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1，也称为TROP-2))、PAM4或KC4(均为抗粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEA，也称为CD66e或CEACAM-5)、MN-15或MN-3(抗CEACAM-6)、Mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、Immu-31(抗甲胎蛋白)、Rl(抗IGF-lR)、A19(抗CD19)、TAG-72(例如CC49)、Tn、1591或HuJ591(抗PSMA(前列腺特异性膜抗原))、AB-PGl-XGl-026(抗PSMA二聚体)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IXMAb)、L243(抗HLA-DR)、阿仑珠单抗(抗CD52)、贝伐珠单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥珠单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)；帕木单抗(抗EGFR)；托西莫单抗(抗CD20)；PAM4(又名克利妥珠单抗，抗粘蛋白)、BWA-3(抗组蛋白H2A/H4)、LG2-1(抗组蛋白H3)、MRA12(抗组蛋白Hl)、PRI-1(抗组蛋白H2B)、LGll-2(抗组蛋白H2B)、LG2-2(抗组蛋白H2B)和曲妥珠单抗(抗ErbB2)、碳酸酐酶IX、B7、CCL19、CCL21、CSAp、HER-2/neu、BrE3、CDI、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CDS、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20(例如C2B8、hA20、1F5 MAb)、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD67、CD70、CD72、GPC-3、CD74、CD79a、CDS0、CD83、CD95、CD126、CD133、CD137、D138、CD147、CD154、CD127(也称为B7-H3)、CEACAM-5、CEACAM-6、CTLA4、甲胎蛋白(AFP)、VEGF(例如
Figure BDA0003310365990000231
纤连蛋白剪接变异体)、ED-B纤连蛋白(例如L19)、EGP-1(TROP-2)、EGP-2(例如17-lA)、EGF受体(ErbBl)(例如
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)、ErbB2、ErbB3、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、Ga 733、GRO家族蛋白、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HMl.24、HER-2/neu、胰岛素样生长因子(ILGF)、IFN家族蛋白、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、IGF-lR、Ia、HMl.24、神经节苷脂类、Fas-L、HCG、L243结合的HLA-DR抗原、CD66抗原(即CD66a-d或其组合)、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-18、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、胎盘生长因子(PlGF)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSMA、PAM4抗原、PD1受体、NCA-95、NCA-90、A3、A33、Ep-CAM、KS-1、Le(y)、间皮素、S100、生腱蛋白、TAC、Tn抗原、Thomas Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、肿瘤血管生成抗原、TNF-a、TRAIL受体(R1和R2)、TROP-2、VEGFR、RANTES和TI0l。也有可能使用其他CAR，如多特异性CAR(例如双特异性或三特异性CAR，如包括一或多个本文所公开的CAR)。
IV.治疗或抑制病症的方法和组合物
本文公开了通过将本文所述方法产生的NK或T细胞施用于受试者(例如CAR修饰的NK或T细胞)来治疗患有疾病或紊乱的受试者的方法。在具体的非限制性示例中，施用NK细胞。可以将未经修饰的NK或T细胞或者本文所述的经修饰的(例如CAR修饰的)NK或T细胞施用于动物或者人受试者。在具体的示例中，NK或T细胞(或CAR-NK或CAR T细胞)来自非HLA匹配的供体，包括不相关的个体。在其他示例中，NK或T细胞(或CAR-NK或CAR T细胞)来自正在接受治疗的受试者(例如自体的)。在一些实施方案中，所述疾病或紊乱是癌症(例如实体癌(如肉瘤(如横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤和肺泡软部肉瘤)；癌(如结直肠癌)；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤)；神经母细胞瘤；妇科癌症(如卵巢癌)；乳腺癌；肝癌；肺癌；前列腺癌；皮肤癌；骨癌；胰腺癌；脑癌(神经母细胞瘤)；头颈癌；肾癌(如肾母细胞瘤)；视网膜母细胞瘤；肾上腺皮质肿瘤；硬纤维瘤；结缔组织增生小圆细胞肿瘤；内分泌肿瘤；和/或血癌(如骨髓瘤，如多发性骨髓瘤；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤；或白血病，如急性淋巴细胞性白血病(ALL)或急性髓系白血病(AML))、免疫紊乱(例如自身免疫疾病或移植排斥)或感染性疾病(例如巨细胞病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒或HIV感染)。
可以将本文所述的扩增的NK或T细胞掺入药物组合物。这种组合物通常包括NK或T细胞(如经修饰的NK或T细胞)群和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”包括可与药物施用相容的任意并且所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,TheUniversity of the Sciences in Philadelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21st Edition,2005)。这种载体或稀释剂的示例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、平衡盐溶液和5％人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水性运载体，如不挥发性油。还可以将补充活性化合物掺入组合物中。用于制备可施用组合物的实际方法对本领域技术人员来说是已知的或者是明显的，并且在如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,The University of the Sciences inPhiladelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21st Edition(2005)的出版物中更详细描述。在一个非限制性示例中，将转导的NK细胞悬浮在PLASMA-LYTETM多重电解质溶液中。
在一些示例中，所述组合物包含大约104至1012个NK或T细胞(例如大约104至108个细胞、大约106至108个细胞或者大约106至1012个细胞)。例如，可制备组合物，以便将大约104至1010个NK或T细胞/kg(如大约104、105、106、107或108个细胞/kg)施用于受试者。在具体的示例中，所述组合物包含至少104、105、106或107个NK细胞。通常肠道外施用NK或T细胞群，例如静脉内；然而，还可以向肿瘤进行注射或输注或者接近肿瘤(局部施用)或者向腹膜腔施用。本领域技术人员可确定适宜的施用途径。
可以向受试者施用多个剂量的NK或T细胞群。例如，可以每天、每隔一天、每周两次、每周、每隔一周、每三周、每月或者更少频率地施用NK或T细胞群。熟练的临床医生可根据受试者、治疗的病症、先前治疗历史和其他因素选择施用计划。
在另外的示例中，还向受试者施用至少一种、至少一种、至少两种、至少三种或者至少四种细胞因子(如IL-2、IL-15、IL-21和/或IL-12)以支持NK或T细胞的存活和/或生长。在具体的非限制性示例中，至少一种细胞因子包括IL-2和IL-15(例如以支持NK细胞的存活和/或生长)。在NK或T细胞之前、之后或者与NK或T细胞基本上同时施用所述细胞因子。在具体的示例中，至少一种细胞因子(例如IL-2和/或IL-2)与例如NK细胞同时施用。
在一些示例中，所述方法包括治疗或抑制过度增生紊乱，如血液系统恶性肿瘤或实体瘤。血液系统恶性肿瘤的示例包括白血病，包括急性白血病(如11q23阳性急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病和成髓细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式；包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。可以施用未修饰的或经修饰的(例如CAR修饰的)NK或T细胞。在具体的示例中，可施用使用本文的方法扩增的未修饰的NK或T细胞以治疗或抑制淋巴瘤，如B细胞淋巴瘤；妇科癌症，如卵巢癌；乳腺癌；肝癌；肺癌；或血癌，如骨髓瘤或白血病，如多发性骨髓瘤、ALL或AML)。
肉瘤和癌等实体瘤的示例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴瘤(包括惰性和高分级型；霍奇金淋巴瘤；和非霍奇金淋巴瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤)、胰腺癌、乳腺癌(包括基底部乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓状癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
在具体的示例中，可通过本文公开的方法抑制或治疗的血液系统恶性肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓性白血病、前淋巴细胞/髓系白血病、浆细胞白血病、NK细胞白血病、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式；包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤)。在另外的具体示例中，可通过本文公开的方法治疗或抑制的实体瘤包括肺癌、前列腺癌、胰腺癌(如胰岛素瘤)、乳腺癌、结直肠腺癌或鳞状细胞癌、神经母细胞瘤、睾丸癌(如精原细胞瘤)和卵巢癌。在具体的、非限制性的示例中，受试者患有慢性髓性白血病、急性单核细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式；包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤)。本领域技术人员可选择表达适宜转基因的NK细胞或T细胞以治疗患有具体肿瘤或其他紊乱的受试者。
在一些示例中，还可向受试者(如患有肿瘤或增生过度紊乱的受试者)施用一或多种化疗剂和/或放射疗法。这些药剂包括烷基化剂，如氮芥(如氮芥、环磷酰胺、美法仑、尿嘧啶氮芥或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸盐(如白消安)、亚硝基脲(如卡莫司汀、洛莫司汀、塞莫司汀、链佐星或达卡巴嗪)；抗代谢物，如叶酸类似物(如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(如5-FU或阿糖胞苷)和嘌呤类似物，如巯基嘌呤或硫鸟嘌呤；或天然产物，例如长春花生物碱(如长春碱、长春新碱或长春地辛)、表鬼臼毒素(如依托泊苷或替尼泊苷)、抗生素(如更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素或丝裂霉素C)和酶(如L-天冬酰胺酶)。另外的药剂包括铂配位复合物(如顺式二胺二氯铂II，也称为顺铂)、取代的脲(如羟基脲)、甲基肼衍生物(如丙卡巴嗪)和肾上腺皮质抑制剂(如米托坦和氨鲁米特)；激素和拮抗剂，如肾上腺皮质类固醇(如泼尼松)、孕激素类(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)、雌激素类(如己烯雌酚和炔雌醇)、抗雌激素(如他莫昔芬)和雄激素类(如丙酸睾酮和氟甲睾酮)。最常用的化疗药物的示例包括亚德里亚霉素、美法仑
Figure BDA0003310365990000261
Ara-C(阿糖胞苷)、卡莫司汀、白消安、洛莫司汀、卡铂、顺铂、环磷酰胺
Figure BDA0003310365990000262
柔红霉素、达卡巴嗪、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇(或其他紫杉烷，如多西紫杉醇)、长春碱、长春新碱、VP-16，而较新的药物包括吉西他滨
Figure BDA0003310365990000263
曲妥珠单抗
Figure BDA0003310365990000264
伊立替康(CPT-11)、克利屈滨(leustatin)、诺维本、利妥昔单抗
Figure BDA0003310365990000265
伊马替尼(STI-571)、托泊替康
Figure BDA0003310365990000267
卡培他滨、伊布妥单抗(ibritumomab，
Figure BDA0003310365990000266
)和骨化三醇。
在一些示例中，所述方法包括治疗或抑制血癌(包括惰性和高级形式；包括骨髓瘤，如多发性骨髓瘤；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤；或白血病，如急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性髓系白血病(AML))。例如，所述方法可包括选择患有血癌的受试者。所述方法还可包括施用用本文公开的方法所公开的任意CAR修饰的淋巴细胞，从而治疗血癌。例如，使用721.221细胞产生的CD19-CAR修饰的NK细胞。在一些示例中，可以使用表达mIL-21和/或IL-15Rα的经修饰的721.221细胞产生所施用的CD19-CAR修饰的NK细胞。
在具体的非限制性示例中，所述方法包括治疗或抑制白血病(如急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性髓系白血病(AML))。例如，所述方法可包括选择患有白血病的受试者。所述方法还可包括施用使用本文公开的方法公开的任意CAR修饰的淋巴细胞，从而治疗白血病，例如，使用721.221细胞产生CD19-CAR修饰的NK细胞。在一些示例中，可以使用表达mIL-21和/或IL-15Rα的经修饰的721.221细胞产生所施用的CD19-CAR修饰的NK细胞。
在一些示例中，所述方法包括治疗或抑制实体瘤(惰性和高级别形式；包括肉瘤、癌和淋巴瘤(如霍奇金或非霍奇金病淋巴瘤))。例如，所述方法可包括选择患有实体瘤的受试者。所述方法还包括施用使用本文公开的方法公开的任意CAR修饰的淋巴细胞，从而治疗实体瘤。例如，使用721.221细胞产生CD19-CAR修饰的NK细胞。在一些示例中，可以使用表达mIL-21和/或IL-15Rα的经修饰的721.221细胞产生所施用的CD19-CAR修饰的NK细胞。
在具体的非限制性示例中，所述方法包括治疗或抑制淋巴瘤(包括惰性和高级别形式；包括霍奇金或非霍奇金淋巴瘤)。例如，所述方法可包括选择患有淋巴瘤的受试者。所述方法还包括施用使用本文公开的方法公开的任意CAR修饰的淋巴细胞，从而治疗淋巴瘤。例如，使用721.221细胞产生的CD19-CAR修饰的NK细胞。在一些示例中，可以使用表达mIL-21和/或IL-15Rα的经修饰的721.221细胞产生所施用的CD19-CAR修饰的NK细胞。
在具体的非限制性示例中，所述方法包括治疗或抑制非霍奇金病淋巴瘤(包括惰性和高级别形式；包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤或中枢神经系统淋巴瘤)。例如，所述方法可包括选择患有非霍奇金病淋巴瘤的受试者。所述方法还包括施用使用本文公开的方法公开的任意CAR修饰的淋巴细胞，从而治疗非霍奇金淋巴瘤。例如，使用721.221细胞产生的CD19-CAR修饰的NK细胞。在一些示例中，可以使用表达mIL-21和/或IL-15Rα的经修饰的721.221细胞产生所施用的CD19-CAR修饰的NK细胞。
在一些示例中，所述方法包括治疗或抑制免疫系统病症。免疫系统病症可以是任意类型的免疫系统病症，如细胞因子风暴，一种免疫系统紊乱(例如炎性或自身免疫病症)或者可以是与另外病症和/或疾病(例如人体免疫缺陷病毒感染或微重力暴露)有关的免疫系统病症。在一些非限制性示例中，免疫系统病症是炎性紊乱。在具体的实施方案中，炎性紊乱可以是类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、炎性肠病或全身性红斑狼疮。在其他示例中，免疫系统病症是自身免疫紊乱。在一些实施方案中，自身免疫紊乱是I型糖尿病、多发性硬化症、红斑狼疮、重症肌无力、强直性脊柱炎、乳糜泻、克罗恩病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、移植排斥或自身免疫性葡萄膜炎。可以使用通过本文公开的方法扩增的经修饰的或未修饰的NK或T细胞。在具体的示例中，可以使用经修饰(例如CAR修饰)的NK或T细胞来例如治疗或抑制类风湿性关节炎、克罗恩病或移植排斥。
在一些示例中，还可以向受试者(例如患有自身免疫性疾病、移植排斥或炎性疾病等免疫紊乱的受试者)施用一或多种免疫调节治疗(例如免疫调节生物制剂，如莫罗单抗、伊匹木单抗、阿巴西普、贝拉西普、曲美木单抗、BMS-936558、CT-011、MK-3475、AMP224、BMS-936559、MPDL323280A、MEDI4736、MGA271、IMP321、BMS-663513、PF-05082566、CDX-111127、抗OX40、huMAb、OX40L和TRXX518，如Yao等Nat Rev Drug Discov,12(2):130–146,2013,和Kamphorst等,Vaccine,33(0 2):B21–B28,2015，二者均通过引用以全文并入本文；调节性细胞因子，如IL-7；mTOR调节剂，如雷帕霉素；抗微生物治疗，如疫苗接种、抗真菌剂和/或抗生素)、抗炎剂(NSAIDS、抗白三烯类、免疫选择性抗炎衍生物、ImSAID、具有抗炎活性的生物活性化合物，如白花丹素和鸡蛋花素；和/或甾类)、疾病修饰抗风湿药物(DMARD，如甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、羟氯喹、托法替尼、英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab)、戈利木单抗、托珠单抗、阿那白滞素、阿巴西普和/或利妥昔单抗)、抗疟药物(如氯喹和羟氯喹)、医疗程序(包括手术和干细胞移植)；免疫抑制剂(例如，用于预防移植器官或组织的排斥、治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病；例如，糖皮质激素类，如泼尼松、地塞米松和氢化可的松；细胞抑制剂，如烷化剂和抗代谢物；抗体，如Atgam、胸腺球蛋白和针对T细胞受体-和IL-2受体的抗体；亲免蛋白靶向剂，如环孢素、他克莫司、西罗莫司和依维莫司；干扰素(IFN)，如IFNλ和IFNβ；阿片类；TNF结合蛋白，如英夫利昔单抗、依那西普和阿达木单抗；霉酚酸酯；以及小生物制剂，如芬戈莫德和多球壳菌素)、免疫耐受治疗(例如，用于治疗有组织或器官移植排斥风险的受试者、过敏受试者和/或自身免疫疾病受试者；例如，T或B细胞靶向或T或B细胞抑制药物，如CAMPATH-1H、钙神经素抑制剂、利妥昔单抗、依帕珠单抗、贝利木单抗和阿塞西普；抗分化簇(CD)3抗体；阿巴西普；造血嵌合体的诱导，如混合造血嵌合体，其中器官或组织接受者的骨髓被供体的骨髓或供体和接受者骨髓的混合物替代，以减少器官或组织移植排斥；抗原脱敏；见Nepom等Immuneno Rev；241(1)：49–62，2011，通过引用并入本文)、抗组胺药、蠕虫疗法(例如，故意用蠕虫或蠕虫卵感染受试者以治疗免疫紊乱)。
在一些示例中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物治疗或抑制感染性疾病。在一些方面，感染性疾病选自虫媒病毒感染、肉毒中毒、布鲁杆菌病、念珠菌病、弯曲菌病、水痘、衣原体、霍乱、冠状病毒感染、葡萄球菌感染、柯萨奇病毒感染、克雅氏病、隐孢子虫病、环孢子虫感染、巨细胞病毒感染、EB病毒感染、登革热、白喉、耳朵感染、脑炎、流感病毒感染、副流感病毒感染、贾第虫病、淋病、流感嗜血菌感染、汉坦病毒感染、病毒性肝炎、单纯疱疹病毒感染、HIV/AIDS、螺杆菌感染、人乳头瘤病毒(HPV)感染、传染性单核细胞增多症、军团杆菌病、麻风病、钩端螺旋体病、利斯特菌病、莱姆病、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、疟疾、麻疹、马尔堡出血热、脑膜炎、猴痘、腮腺炎、分枝杆菌感染、支原体感染、诺沃克病毒感染、百日咳、蛲虫感染、肺炎球菌病、肺炎链球菌感染、肺炎支原体感染、粘膜炎莫拉菌感染、铜绿假单胞菌感染、轮状病毒感染、鹦鹉热、狂犬病、呼吸道合胞病毒感染(RSV)、癣、洛矶山斑疹热、风疹、沙门菌病、SARS、疥疮、性传播疾病、志贺菌病、带状疱疹、孢子丝菌病、链球菌感染、梅毒、破伤风、旋毛虫病、结核、土拉菌病、伤寒、病毒性脑膜炎、细菌性脑膜炎、西尼罗河病毒感染、黄热病、腺病毒介导的感染和疾病、逆转录病毒介导的感染性疾病和耶尔森菌病动物传染病。例如，感染性疾病可以是流感、副流感、呼吸道合胞病毒。
可以使用本文公开的方法扩增的未修饰或经修饰(例如CAR修饰)的NK或T细胞治疗或抑制感染性疾病。在具体的示例中，可以使用公开的方法扩增的CAR修饰的NK或T细胞治疗或抑制HIV，如使用基于HIV抗体VRC01、2G12、2F5、4E10、3BNC117、10–1074、VRC01LS、VRC07-532LS、3BC176、PG16、NIH45-46G54W、PG9、PG16、PGT145、PGDM1400、PGT121、PGT124、PGT128、PGT135、8ANC195、10E8和/或PD-1的CAR。在具体的示例中，可以使用利用所公开的方法扩增的CAR修饰的NK或T细胞治疗或抑制HBV，如使用靶向HBsAg(例如
Figure BDA0003310365990000281
nos.KP972453.1或KP972454.1)和/或HB1的CAR。
在一些示例中，还向受试者(例如患有感染性疾病如HIV的受试者)施用一或多种抗感染剂(例如抗体、抗真菌剂、抗病毒剂和/或抗寄生虫剂)。在具体的示例中，感染性疾病是HIV，还向受试者施用抗逆转录病毒剂，如核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂(nRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂、进入抑制剂(或融合抑制剂)、成熟抑制剂或广谱抑制剂，如天然抗病毒剂。示例性药剂包括洛匹那韦、利托那韦、齐多夫定、拉米夫定、替诺福韦、恩曲他滨和依法韦仑。
实施例
提供如下实施例以说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应解释为是将本发明限制于所述的具体特征或实施方案。
嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞的临床成功需要对从患者获取的自体T细胞进行工程化，这限制了CAR细胞疗法的更广泛应用。同种异体通用细胞产品的研发将显著拓宽了其应用并降低成本。独特的NK细胞生物学特性使其成为临床上CAR修饰T细胞的安全有效的替代免疫治疗策略。
本文描述了一种扩增来自外周血和脐带血的NK和CAR修饰的NK细胞的方法。此处，开发具有膜结合白介素(IL)-21(mIL-21)的基于721.221的人工抗原呈递细胞(APC)以繁殖临床等级的NK和CAR修饰的NK细胞。与具有mIL-21的基于K562的APC相反，用表达mIL-21的721.221饲养细胞繁殖NK细胞的能力(扩增5335-94170倍；例如，图12)优于用具有mIL-21的K562饲养细胞(扩增662-7743倍)。721.221-mIL-21扩增的NK细胞与K562-mIL-21扩增的NK细胞在表型上相似。然而，观察到721.221-mIL-21扩增的NK细胞具有优异的细胞毒性。因此，开发源自脐带血或外周血的具有优异的功能性、持久性和增值性的现有NK细胞产品将支持用于过继免疫治疗的临床应用。该方法为免疫治疗领域提供了强有力的工具以扩展原代NK和CAR修饰的NK细胞用于临床应用。
实施例1：方法和材料
抗体和试剂.PE和APC抗人CD3抗体(克隆OKT3，
Figure BDA0003310365990000291
)、FITC、BV605、PE/Cy7和BV 510抗人CD56抗体(克隆HCD56，
Figure BDA0003310365990000292
)、PE抗人CD69抗体(克隆FN50，
Figure BDA0003310365990000293
)、PE/Cy7抗人CD8a抗体(克隆HIT8a，
Figure BDA0003310365990000294
)、AF647抗人IL-21抗体(克隆3A3-N2，
Figure BDA0003310365990000295
)，APC/Fire750抗人CD226抗体(DNAM-1)(克隆11A8，
Figure BDA0003310365990000296
)、APC/Fire 750抗人KLRG1(MAFA)抗体(克隆SA231A2，
Figure BDA0003310365990000297
)、BV421抗人CD335(NKp46)抗体(克隆9E2，
Figure BDA0003310365990000298
)、PE/Cy7抗人CD158b(KIR2DL2/L3，
Figure BDA0003310365990000299
)抗体(克隆DX27，
Figure BDA00033103659900002910
)、PE/Cy7抗人CD244(2B4)抗体(克隆C1.7，
Figure BDA00033103659900002911
)、PE抗人CD152(CTLA-4)抗体(克隆BNI3)、APC抗人CD366(Tim-3)抗体(克隆F38-2E2)、PerCP/Cy5.5抗人TIGIT(VSTM3)抗体(克隆A15153G)、FITC抗人CD223(LAG-3)抗体(克隆11C3C65，
Figure BDA00033103659900002912
)和PerCP/Cy5.5抗人CD94(克隆DX22，
Figure BDA00033103659900002913
)购自
Figure BDA00033103659900002914
(San Diego,CA,USA)。APC抗人CD16抗体(克隆B73.1，BDTM Biosciences)、FITC抗人CD3抗体(克隆UCHT1，BDTM Biosciences)、BV480抗人CD85j抗体(LIR-1)抗体(克隆GHI/75，BDTM Biosciences)、BV711抗人CD314(NKG2D)抗体(克隆1D11，BDTM Biosciences)和FITC抗人CD107a抗体(克隆H4A3，BDTM Biosciences)购自BDTM Biosciences(San Jose,CA,USA)。FITC抗人KIR/CD158抗体(克隆180704，R&D
Figure BDA0003310365990000301
)、PE抗人KIR2DL1/KIR2DS5抗体(克隆143211，R&D
Figure BDA0003310365990000302
)、APC抗人KIR3DL1抗体(克隆DX9，R&D
Figure BDA0003310365990000303
)、AF405抗人KIR3DL2/CD158k抗体(克隆539304，R&D
Figure BDA0003310365990000304
)、APC抗人NKG2A/CD159a抗体(克隆131411，R&D
Figure BDA0003310365990000305
)和PE抗人NKG2C/CD159c抗体(克隆134591，R&D
Figure BDA0003310365990000306
)购自R&D
Figure BDA0003310365990000307
AF647山羊抗人IgG F(ab')2片段抗体购自Jackson ImmunoResearch(West Grove,PA,USA)。
细胞系.721.221细胞系是赠予的。293T、K562和Daudi细胞系购自AMERICAN TYPECULTURE
Figure BDA0003310365990000308
为建立K562-mIL21和721.221-mIL21细胞，分别用IL-21逆转录病毒转导K562和721.221细胞，然后通过AF647小鼠IgG1抗人IL-21(克隆3A3-N2)使用FACS ARIATM II细胞分选器(BDTM Biosciences)分选膜IL-21阳性细胞。为建立Daudi-FFluc细胞，用编码FFIuc的慢病毒载体转导CD19阳性Daudi细胞，如先前所述(Xiong等MolTher 26:963-75(2018))。在5％(v/v)CO2于37℃在补加10％(v/v)胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素-链霉素
Figure BDA0003310365990000309
的RPMI-1640
Figure BDA00033103659900003010
中培养K562、721.221、K562-mIL21、721.221-mIL21、Daudi和Daudi-FFluc细胞。对于NK细胞扩增，以10,000拉德的剂量辐照K562、721.221、K562-mIL21和721.221-mIL21细胞，用PBS洗涤，然后用作饲养细胞。在5％(v/v)CO2于37℃在补加10％(v/v)胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素-链霉素
Figure BDA00033103659900003011
的DMEM
Figure BDA00033103659900003012
中培养293T。
原代NK细胞扩增.使用淋巴细胞分离培养基
Figure BDA00033103659900003013
从血沉棕黄层(GulfCoast Regional Blood Center)分离PBMC。对于NK细胞扩增，在
Figure BDA00033103659900003014
6多孔细胞培养板(Wilson Wolf)中，在35ml含有200U/ml IL-2
Figure BDA00033103659900003015
和5ng/ml IL-15
Figure BDA00033103659900003016
的完全RPMI-1640培养基中，用1×107 10000拉德辐照的饲养细胞培养5×106PBMC。每3-4天更换培养基，每个孔中留有2×107个细胞以继续培养。用台盼蓝计数总细胞数。为确定NK细胞的百分比，将细胞对CD3和CD56染色，然后进行流式细胞术分析。
用CD19-CAR转导扩增的NK细胞.为产生CD19-CAR逆转录病毒，用含有CD19特异性scFv的质粒、RDF和PegPam3的组合转染293T细胞，如前所述(Xiong等，Mol Ther 26:963-75(2018))。在扩增第7天收集NK细胞并在包被有
Figure BDA00033103659900003017
的板中用CD19-CAR逆转录病毒(使用SFG骨架)转导。两天后，将细胞转移至
Figure BDA00033103659900003018
6多孔细胞培养板中并且保持在35ml含有200U/ml IL-2(PeproTech)和5ng/ml IL-15(PeproTech)的完全RPMI-1640培养基中。每3-4天更换培养基，每个孔中留有2×107个细胞以继续培养。用台盼蓝计数总细胞数。为确定NK细胞的百分比和扩增CAR，将细胞对CD3、CD56和抗人IgG(H+L)F(ab’)2片段染色，然后进行流式细胞术分析。
流式细胞术分析.PBMC和扩增的NK细胞在FACS染色缓冲液(含有1％FBS的PBS)中用荧光缀合抗体在冰上染色30分钟，用PBS洗涤，在FACS LSRII或者
Figure BDA00033103659900003019
流式细胞仪(BDTM)上分析。调节PMT电压，在收集数据前计算补偿值。使用FACS DIVATM软件(BDTM)获取数据并使用
Figure BDA00033103659900003020
软件(Tree Star)分析。
基于流式细胞术的NK细胞毒性测定.分别使用K562和721.221细胞作为靶细胞确定NK细胞细胞毒性。收集靶细胞并在PBS中用5μM CELLTRACETM CFSE
Figure BDA0003310365990000311
染色20分钟。通过添加完全RPMI-1640培养基使染色终止，然后使用PBS洗涤两次。收集扩增的NK细胞并在完全RPMI-1640培养基中在V底96孔板上以5个不同的E:T比(效应物:靶；分别为4:1、2:1、1:1、0.5:1和0.25:1)与2×105CFSE标记的靶细胞共培养。在37℃和5％CO2的条件下孵育4小时后，细胞用7-AAD(EBIOSCIENCETM)染色，然后通过流式细胞术分析。门控靶细胞(CFSE+)，然后使用7-ADD+的百分比以通过(实验-自发性死亡)/(100-自发性死亡)×100％来计算NK细胞细胞毒性。
NK脱粒测定(CD107a).于37℃在完全RPMI-1640培养基中在V底96孔板上用1.5×105个K562细胞孵育扩增的NK细胞(5×105)2小时。之后，收集细胞；洗涤；用GOLGISTOPTM对CD3、CD56和CD107a染色30分钟；以及通过流式细胞术进行分析。(见例如Zheng等J AllergyClin Immunol 135,1293-1302,(2015)，通过引用并入本文)。
动物研究.所有动物实验均为Houston Methodist Research InstituteInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准。来自Jackson Laboratory的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠用于所有体内实验。为建立人淋巴瘤异种移植模型，雄性和雌性NSG小鼠(8周龄)均经尾静脉静脉注射于100μL PBS中的2×106个FFLuc-Daudi细胞。从第0天开始，对小鼠注射(静脉)于100μL PBS中的1×107 721.221-mIL21扩增的或者K562-mIL21扩增的CD19-CAR NK细胞，然后在第0天、第3天、第7天和第10天注射(腹腔内)于150μL PBS中的IL-2(50,000单位/小鼠)和IL-15(10ng/小鼠)。在每只小鼠腹腔(i.p.)施用150mg/kg D-萤光素(GOLD
Figure BDA0003310365990000312
St.Louis,MO,USA)后10分钟，使用
Figure BDA0003310365990000313
系统(
Figure BDA0003310365990000314
-200,
Figure BDA0003310365990000315
Waltham,MA,USA)对异氟醚麻醉的动物成像。使用LIVING
Figure BDA0003310365990000316
软件64(
Figure BDA0003310365990000317
Life Sciences,Hopkinton,MA,USA)定量从表达萤光素酶的肿瘤细胞中发射的光子。生成表示光强度的(蓝色最不强烈，红色最强烈)假彩色图像并叠加在灰度级参考图像上。在除了尾部的整个动物上画出恒定的感兴趣区(ROI)，信号的强度以每秒光子总数测量。在效应CD19-CAR NK细胞注射后，在HoustonMethodist Research Institute的临床前成像中心每周对动物成像两次以进行肿瘤细胞跟踪。
RNA-seq样品制备、测序和数据分析.用如前所述的辐照的221-mIL21和K562-mIL21细胞在PBMC中扩增NK细胞。在扩增的第7天和第14天，收集细胞并用PE-抗CD3和PE/Cy7-抗CD56抗体在冰上染色30分钟。在用FACS染色缓冲液(含有2％FBS的PBS)洗涤两次后，将细胞重旋在FACS染色缓冲液中，然后使用FACS Aria II细胞分选仪(BD Biosciences)将CD3-CD56+细胞分选至每个重复的纯度>98％。在Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific)直接裂解纯化的NK细胞以使用制造商方案进行RNA提取。通过BGI Group(Shenzhen,Guangdong,China)在BGISEQ-500平台上进行RNA侧序(RNA-seq)。在过滤低质量读段(reads)(超过50％的碱基质量低于15的读段)、具有衔接子的读段和具有超过10％未知碱基(N)的读段后，获得FASTQ格式的清洁读段。使用STAR2.6.1d将FASTQ文件与hg38人类参考基因组进行比对。使用GenomicAlignments包(v.1.20.0)处理比对的文件以获得计数矩阵。作为初始步骤，在所有比较中预过滤具有少于10个读段中值的基因。使用DESeq2包(v.1.24.0)鉴定差异表达的基因并定义为具有调整的p值<0.05和log2倍数变化≥1或≤-1。使用lfcShrinkfunction缩小log2倍数变化，然后使用ggpubr包(v.0.2.1)将其用于制作MA-图。使用MSigDB(Broad Institute)和clusterProfiler包(v.3.12.0)进行GSEA。热图使用从对数转换计数得出的z分数生成。所有数据分析均使用R(v.3.6.0)进行。
统计分析.将数据表示为平均值±SEM。使用双尾未配对学生t检验、双尾配对学生t检验或双向ANOVA确定统计显著性，如指明。P<0.05被认为是统计学显著的。
实施例2人工抗原呈递细胞系上膜形式IL-21的生成
之前研究表明，IL-21在NK细胞增殖发面起关键作用(例如Denman等PLoS One,7(1):e30264,2012)。使用表达膜形式的IL-21的721.221细胞开发人工抗原呈递细胞系，无明显表型变化(图8A)。还检查了IL-21受体在人原代细胞上的表达(图9)。
为扩增人原代NK细胞，从外周血或脐带血分离PMBC。在存在200U/mL IL-2和5ng/mL IL-15条件下将新鲜分离的PBMC与表达膜IL-21的721.221细胞(221-mIL-21)共培养(图8B)。如图8A-8B所示，将IL-21克隆至含有人IgG1、CD28跨膜(TM)结构域、CD28胞内结构域、4-1BB配体和CD3ζ的SFG载体中(图8A-8B)。作为对照，测定包括野生型(WT)K562、K562-mIL-21和WT 721.221。K562和721.221细胞用IL-21逆转录病毒转导并且通过用抗人IL-21抗体染色使用FACS分选。培养2周后，使用FACS检查IL-21在K562-mIL21和721.221-mIL21上的表达。在K562-mIL21(图1A)和721.221-mIL21细胞(图1B)上表达高水平的IL-21。K562-mIL21和721.221-mIL21细胞均用抗IL-21抗体染色，mIL-21细胞也用抗IL-21抗体染色并通过共焦显微镜评估IL-21蛋白的适当质膜定位(图1C-1D)。在K562-mIL21和721.221-mIL21细胞表面上表达膜形式的IL-21分子(图1D)。验证IL-21受体(IL-21R)的人原代NK细胞表达(图9)。为确定IL-21分子转导K562和721.221细胞是否改变激活和抑制NK细胞配体的表达，使用流式细胞术检查ICAM-1(LFA-1的配体)、PD-L1(PD-1的配体)、HLA-E(CD94/NKG2A/C的配体)和MICB(NKG2D的配体)。转导前后的表达水平相当(图1E和1F)。因此，建立了IL-21在具有类似表面配体的K562和721.221细胞中的膜表达。
实施例3在不同类型饲养细胞之中721.221-mIL21细胞对NK细胞的优异增殖
在建立K562-、K562-mIL21、721.221-和721.221-mIL21细胞系作为饲养细胞后，考察用于扩增人NK细胞的最佳饲养细胞系。为扩增原代人NK细胞，从健康供体的血沉棕黄层中分离出PBMC并与饲养细胞加200U/ml IL-2和5ng/ml IL-15培养，如上所述。为比较扩增NK细胞的能力，对K562-mIL21和721.221-mIL21进行直接比较。使用WT-K562和WT-221细胞系作为对照组。NK细胞的初始数量和NK细胞的比例分别为5百万和10-20％。示出了在不同时间点(第0天、第7天、第12天、第17天和第21天)使用流式细胞术数据用CD3和CD56门控的代表性NK扩增谱(图2A)。通过将PBMC与不同饲养细胞共培养扩增3周后，NK细胞的动态数量(图2B)和比例(图2C)显著增加。然而，用721.221-mIL21饲养细胞的扩增的NK细胞的倍数(图2D)和扩增的NK细胞的纯度(图2E)显著高于K562-mIL21饲养细胞的。此外，在表达mIL-21的饲养细胞存在下，非NK细胞(包括CD3+CD56-、CD3+CD56+和CD3-CD56-细胞)减少(图14A-F)。因此，721.221-mIL-21细胞作为饲养细胞扩增人原代NK细胞优于K562-mIL21细胞。
实施例4源自外周血的扩增的NK细胞的特征
为确定扩增的NK细胞的免疫表型分型，用针对激活和抑制受体的抗体使用流式细胞术检查562-、K562-mIL21-、721.221-和721.221-mIL21-扩增的NK细胞。激活受体包括CD16、NKG2D、NKP46、2B4、DNAM-1、CD69、CD94、CD8a和NKG2C(图3A和3B)。抑制受体包括NKG2A、CTLA-4、KIRG1、PD-1、LIR1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、总KIR、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR3DL1和KIR3DL2(图3C、3D和3E)。这些激活和抑制受体在扩增的NK细胞上的表达是相当的。CD69，一种NK细胞的激活标记物，在221-mIL21扩增的NK细胞中减少。
为检查离体扩增的NK细胞的功能相似性，通过与NK易感靶细胞721.221(图4A和4B)和K562(图4C和4D)共培养来考察扩增的NK细胞细胞毒性。有趣地，用721.221-mIL-21细胞扩增的NK细胞比用K562-mIL-21细胞扩增的NK细胞显示出更好的细胞毒性(图4A)。为进一步确认该观察，在NK脱粒后使用CD107a测定检查CD107a分子的表面水平。观察到K562-mIL-21-和721.221-mIL-21-扩增的NK细胞之间可比的脱粒(图4B)。将这些扩增的NK细胞与WT K562细胞共培养时，未观察到细胞毒性和脱粒的显著差异(图4C和4D)。
为进一步检查是否可以通过该系统扩增从脐带血(CB)分离的NK细胞，比较K562-mIL21和221-mIL21的NK扩增数量和纯度。获得相似的结果(图15A-15K)。也用流式细胞术检测由K562-mIL21和221-mIL21扩增的NK细胞的免疫表型。在细胞毒性相当的221-mIL21扩增的NK细胞中，CD69表达显著降低(图16A-16D)。总之，扩增的NK细胞显示出与新鲜分离的人原代NK细胞相似的表型，并且具有优越的细胞毒性。
实施例5使用721.221-mIL-21细胞改善源自外周血的CAR-NK扩增
还检查了721.221-mIL-21饲养细胞是否能以如非遗传修饰的原代NK细胞相似的方式扩增CAR-NK细胞。为离体扩增CAR-NK细胞，在可溶性IL-2和IL-15的存在下用721.221-mIL-21饲养细胞刺激未分级的PBMC 7天，诱导NK细胞的快速增殖，并且在某些情况下，T细胞的非特异性扩增(图5A)。在第7天，用CD19-CAR逆转录病毒转导扩增的NK细胞。在第0天、第7天、第11天、第14天、第18天和第21天检查NK细胞数量的动力学和纯度。来自一个供体的离体扩增的NK细胞的典型特征显示出优越的NK数量和纯度(图5B)。来自5个供体的NK细胞数量(图5C)和纯度(图5D)的定量分析显示出721.221-mIL-21饲养细胞提供了优异的CD19-CAR-NK细胞扩增。来自3个供体的NK细胞数量(图5C-5D)和纯度(图5E-5F)的定量分析显示出221-mIL21饲养细胞提供了优异的CD19-CAR-NK细胞扩增。
然而，由K562-mIL21刺激的CD19-CAR阳性NK细胞的百分比与由221-mIL21刺激的NK细胞的百分比相当(图17A-17H)。相反地，在表达mIL-21的饲养细胞的存在下非NK细胞(包括CD3+CD56-、CD3+CD56+和CD3-CD56-群)减少(图17A-17H)。总之，721.221-mIL-21饲养细胞显示出了比用K562-mIL-21饲养细胞扩增的CAR-NK细胞更优异的CAR-NK细胞扩增能力。
实施例6 721.221-mIL-21饲养细胞体现出优异的扩增脐带血来源的原代NK和CAR-NK扩增的能力
鉴于脐带血来源的NK和CAR-NK细胞的多重优势(Liu等Leukemia 32:520-31(2018)；Nahm等J Immunother 41:64-72(2018)；Balassa K and Rocha V,Expert OpinBio Ther 18:121-34(2018))，研究了721.221-mIL-21饲养细胞是否可以扩增脐带血来源的NK细胞和CAR-NK细胞。为离体扩增CB-NK细胞，在可溶性IL-2和IL-15的存在下用721.221-mIL-21饲养细胞刺激未分级的CB-淋巴细胞7天，诱导NK细胞的快速增殖(图6A-6D)。作为对照，在单独组中，在可溶性IL-2和IL-15的存在下用K562-mIL21饲养细胞刺激未分级的CB-淋巴细胞。在第7天，用CD19-CAR逆转录病毒转导扩增的NK细胞。在第0天、第7天、第11天、第14天、第18天和第21天检查NK细胞数量的动力学和纯度。来自一个供体的离体扩增的NK细胞的典型特征显示出优越的NK数量和纯度(图6A)。来自3个供体的NK细胞数量纯度(图6B)的定量分析显示出721.221-mIL-21饲养细胞提供了优异的CD19-NK细胞扩增。
为检查这些离体扩增的CD19-CAR.CB-NK细胞是否具有相似的功能，通过将扩增的NK细胞与NK易感Raji和Daudi细胞共培养来检查其细胞毒性。用221-mIL21细胞扩增的CD19-CAR.CB-NK细胞比用K562-mIL21细胞扩增的CD19-CAR.CB-NK细胞显示出优异的细胞毒性(图6C-6D)。因此，使用721.221-mIL-21细胞改进脐带血来源的NK和CAR-NK扩增的NK扩增方法是成功的。
实施例7体内扩增的CAR-NK细胞的有效性和副作用
为进一步评估扩增的CD19-CAR-NK细胞是否可以体内杀死肿瘤细胞，使用NSG小鼠淋巴瘤异种移植模型比较721.221-mIL-21扩增的CD19-CAR-NK细胞和K562-mIL-21扩增的CD19-CAR-NK细胞的抗肿瘤活性(图7A-7D)。使用静脉内(i.v.)尾静脉注射植入荧光素酶标记的Daudi(FFluc-Daudi)。通过测量肿瘤衍生的生物发光，然后输注CD19-CAR-NK，在指定点评估肿瘤负荷(图7A)。治疗后，用721.221-mIL-21扩增的CD19-CAR-NK细胞治疗的小鼠表现出比K562-mIL-21扩增的CD19-CAR-NK细胞更优异的抗肿瘤活性(图7B和7C)。获得相似的肿瘤生长抑制(TGI)结果。为进一步评估体内扩增的CD19-CAR-NK细胞的毒性，对小鼠的体重定量。观察到体重无显著差异(图7D)，表明离体扩增的CD19-CAR-NK细胞的副作用最小。总之，721.221-mIL-21扩增的CD19-CAR-NK细胞表现出优异的体内抗肿瘤活性，副作用最小。
比较野生型221与表达IL-15的跨膜呈递的221细胞的NK细胞扩增能力。然而，观察到NK扩增倍数和NK扩增纯度无显著差异(图10A-10C)。
实施例8 221-mIL21细胞扩增的T细胞的效力
进一步测试使用721.221-mIL21扩增不同来源的T细胞。检查了来自PBMC和脐带血的CD3阳性T细胞亚群。K562-mIL21细胞和721.221-mIL21细胞都可扩增T细胞。然而，与K562-mIL21细胞相比，使用721.221-mIL21细胞扩增来自PBMC和脐带血样品的T细胞可获得优异的倍数增加(图11A-11C)。通过721.221-mIL21细胞扩增的来自PBMC的T细胞的百分比低于使用K562-mIL21细胞扩增的百分比(图11A)。在K562-mIL21细胞和721.221-mIL21细胞之间观察到来自脐带血的T细胞纯度无差异(图11B)。进一步，721.221-mIL21饲养细胞优选扩增来自患有间变性大细胞淋巴瘤(ALCL，罕见类型的非霍奇金淋巴瘤)的患者的PBMC的CD4+T细胞。通过721.221-mIL21饲养细胞扩增两周后，超过90％的细胞是CD4+、CD3+和CD56-亚群(图11C)。
实施例9 221-mIL21饲养细胞扩增系统促进分化程度较低的记忆样NK细胞发育
为进一步研究221-mIL21饲养细胞扩增系统诱导优越NK细胞扩增能力和功能，在不同时间点使用不同饲养细胞系统扩增的NK细胞进行RNA测序(RNA-Seq)实验。简单地说，用辐照的K562-mIL21或221-mIL21饲养细胞刺激PBMC。在第7天和第14天，使用流式细胞术对来自这两种不同扩增系统的扩增的NK细胞分选以用于RNA-Seq。使用K562-mIL21或221-mIL21细胞扩增的NK细胞的样品间距离的主成分分析(PCA)图显示，与第14天扩增的NK细胞相比，在第7天存在显著差异(图13A)。
因此，以下RNA-Seq数据分析集中于第7天的数据。与第14天用K562-mIL21扩增的NK细胞相比，通过平均(MA)图，在第7天用221-mIL21饲养细胞扩增的NK细胞中差异表达基因(DEG)的数量显著增加(图13B和13C)。使用分子特征数据库(MSigDB)中的基因本体(GO)生物过程(BP)数据集和标志数据集进行基因集富集分析(GSEA)表明，与使用K562-mIL21饲养细胞扩增系统扩增的NK细胞相比，使用221-mIL21饲养细胞扩增系统扩增的NK细胞在第7天上调了与细胞氨基酸代谢过程和糖酵解相关的基因特征，葡萄糖摄取分析进一步验证了这一点(图13D-13H；图18A-18C；图19A-19C)。
出乎意料的是，与使用K562-mIL21饲养细胞扩增系统扩增的NK细胞相比，在第7天使用221-mIL21饲养细胞扩增系统扩增的NK细胞中，淋巴细胞活化、淋巴细胞分化和细胞-细胞粘附的基因特征显著下调(图13H-13J；图18A和18D-18F)，这可以通过NK细胞发育和成熟、抑制性受体、激活受体和细胞毒性功能的热图进一步说明(图13K-13N；图19D-19I)。总之，221-mIL21饲养细胞扩增系统促进分化程度较低、记忆样NK细胞发育。
鉴于本发明的原理可以应用于许多可能的实施方案，应当认识到，所示的实施方案只是示例，不应被视为在范围上的限制。相反，范围由以下权利要求书限定。因此，我们要求保护在这些权利要求的范围和精神内的所有内容。
序列表
<110> 罗格斯新泽西州立大学
<120> 自然杀伤和嵌合抗原受体修饰的细胞的扩增
<130> 7213-101957-02
<150> US 62/808,031
<151> 2019-02-20
<160> 27
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自白细胞介素（IL）-21的胞外结构域的示例性核酸序列
<400> 1
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgcgtc 60
gaccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat tgttgatcag 120
ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga agatgtagag 180
acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa gtcagcaaat 240
acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag gaaaccacct 300
tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg tgattcttat 360
gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca aaagatgatt 420
catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cc 462
<210> 2
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自IL-21的胞外结构域的示例性氨基酸序列
<400> 2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Val Asp Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg
20 25 30
Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu
35 40 45
Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu
50 55 60
Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn
65 70 75 80
Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys
85 90 95
Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu
100 105 110
Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe
115 120 125
Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu
130 135 140
Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
145 150
<210> 3
<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于用膜结合（m）的IL-21转导细胞的构建体的示例性核酸序列
<400> 3
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgcgtc 60
gaccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat tgttgatcag 120
ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga agatgtagag 180
acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa gtcagcaaat 240
acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag gaaaccacct 300
tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg tgattcttat 360
gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca aaagatgatt 420
catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt ccctgcggcc gccgtacgtc 480
accgtctctt cacaggatcc cgccgagccc aaatctcctg acaaaactca cacatgccca 540
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 600
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 660
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 720
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 780
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 840
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 900
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 960
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcaaccg 1020
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1080
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1140
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1200
aaagatccca aattttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 1260
ctagtaacag tggcctttat tattttttgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac 1320
agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 1380
tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1440
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1500
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1560
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1620
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1680
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1740
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1800
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1860
caggccctgc cccctcgcta a 1881
<210> 4
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-15Ralpha的示例性核酸序列
<400> 4
ctgggcagcg ctcgcccggg gagtccagcg gtgtcctgtg gagctgccgc catggccccg 60
cggcgggcgc gcggctgccg gaccctcggt ctcccggcgc tgctactgct gctgctgctc 120
cggccgccgg cgacgcgggg catcacgtgc cctcccccca tgtccgtgga acacgcagac 180
atctgggtca agagctacag cttgtactcc agggagcggt acatttgtaa ctctggtttc 240
aagcgtaaag ccggcacgtc cagcctgacg gagtgcgtgt tgaacaaggc cacgaatgtc 300
gcccactgga caacccccag tctcaaatgc attagagacc ctgccctggt tcaccaaagg 360
ccagcgccac cctccacagt aacgacggca ggggtgaccc cacagccaga gagcctctcc 420
ccttctggaa aagagcccgc agcttcatct cccagctcaa acaacacagc ggccacaaca 480
gcagctattg tcccgggctc ccagctgatg ccttcaaaat caccttccac aggaaccaca 540
gagataagca gtcatgagtc ctcccacggc accccctctc agacaacagc caagaactgg 600
gaactcacag catccgcctc ccaccagccg ccaggtgtgt atccacaggg ccacagcgac 660
accactgtgg ctatctccac gtccactgtc ctgctgtgtg ggctgagcgc tgtgtctctc 720
ctggcatgct acctcaagtc aaggcaaact cccccgctgg ccagcgttga aatggaagcc 780
atggaggctc tgccggtgac ttgggggacc agcagcagag atgaagactt ggaaaactgc 840
tctcaccacc tatgaaactc ggggaaacca gcccagctaa gtccggagtg aaggagcctc 900
tctgctttag ctaaagacga ctgagaagag gtgcaaggaa gcgggctcca ggagcaagct 960
caccaggcct ctcagaagtc ccagcaggat ctcacggact gccgggtcgg cgcctcctgc 1020
gcgagggagc aggttctccg cattcccatg ggcaccacct gcctgcctgt cgtgccttgg 1080
acccagggcc cagcttccca ggagagacca aaggcttctg agcaggattt ttatttcatt 1140
acagtgtgag ctgcctggaa tacatgtggt aatgaaataa aaaccctgcc ccgaatcttc 1200
cgtccctcat cctaactttc agttcacaga gaaaagtgac atacccaaag ctctctgtca 1260
attacaaggc ttctcctggc gtgggagacg tctacaggga agacaccagc gtttgggctt 1320
ctaaccaccc tgtctccagc tgctctgcac acatggacag ggacctggga aaggtgggag 1380
agatgctgag cccagcgaat cctctccatt gaaggattca ggaagaagaa aactcaactc 1440
agtgccattt tacgaatata tgcgtttata tttatacttc cttgtctatt atatctatac 1500
attatatatt atttgtattt tgacattgta ccttgtataa acaaaataaa acatctattt 1560
tcaata 1566
<210> 5
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-15Ralpha的示例性氨基酸序列
<400> 5
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
35 40 45
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
100 105 110
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
115 120 125
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
130 135 140
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
145 150 155 160
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
165 170 175
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
180 185 190
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
195 200 205
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
210 215 220
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
225 230 235 240
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
245 250 255
Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
260 265
<210> 6
<211> 2333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-15的示例性核酸序列
<400> 6
gttgggactc cgggtggcag gcgcccgggg gaatcccagc tgactcgctc actgccttcg 60
aagtccggcg ccccccggga gggaactggg tggccgcacc ctcccggctg cggtggctgt 120
cgccccccac cctgcagcca ggactcgatg gagaatccat tccaatatat ggccatgtgg 180
ctctttggag caatgttcca tcatgttcca tgctgctgac gtcacatgga gcacagaaat 240
caatgttagc agatagccag cccatacaag atcgttttca actagtggcc ccactgtgtc 300
cggaattgat gggttcttgg tctcactgac ttcaagaatg aagccgcgga ccctcgcggt 360
gagtgttaca gctcttaagg tggcgcatct ggagtttgtt ccttctgatg ttcggatgtg 420
ttcggagttt cttccttctg gtgggttcgt ggtctcgctg gctcaggagt gaagctacag 480
accttcgcgg aggcattgtg gatggatggc tgctggaaac cccttgccat agccagctct 540
tcttcaatac ttaaggattt accgtggctt tgagtaatga gaatttcgaa accacatttg 600
agaagtattt ccatccagtg ctacttgtgt ttacttctaa acagtcattt tctaactgaa 660
gctggcattc atgtcttcat tttgggatgc agctaatata cccagttggc ccaaagcacc 720
taacctatag ttatataatc tgactctcag ttcagtttta ctctactaat gccttcatgg 780
tattgggaac catagatttg tgcagctgtt tcagtgcagg gcttcctaaa acagaagcca 840
actgggtgaa tgtaataagt gatttgaaaa aaattgaaga tcttattcaa tctatgcata 900
ttgatgctac tttatatacg gaaagtgatg ttcaccccag ttgcaaagta acagcaatga 960
agtgctttct cttggagtta caagttattt cacttgagtc cggagatgca agtattcatg 1020
atacagtaga aaatctgatc atcctagcaa acaacagttt gtcttctaat gggaatgtaa 1080
cagaatctgg atgcaaagaa tgtgaggaac tggaggaaaa aaatattaaa gaatttttgc 1140
agagttttgt acatattgtc caaatgttca tcaacacttc ttgattgcaa ttgattcttt 1200
ttaaagtgtt tctgttatta acaaacatca ctctgctgct tagacataac aaaacactcg 1260
gcatttcaaa tgtgctgtca aaacaagttt ttctgtcaag aagatgatca gaccttggat 1320
cagatgaact cttagaaatg aaggcagaaa aatgtcattg agtaatatag tgactatgaa 1380
cttctctcag acttacttta ctcatttttt taatttatta ttgaaattgt acatatttgt 1440
ggaataatgt aaaatgttga ataaaaatat gtacaagtgt tgttttttaa gttgcactga 1500
tattttacct cttattgcaa aatagcattt gtttaagggt gatagtcaaa ttatgtattg 1560
gtggggctgg gtaccaatgc tgcaggtcaa cagctatgct ggtaggctcc tgccagtgtg 1620
gaaccactga ctactggctc tcattgactt ccttactaag catagcaaac agaggaagaa 1680
tttgttatca gtaagaaaaa gaagaactat atgtgaatcc tcttctttat actgtaattt 1740
agttattgat gtataaagca actgttatga aataaagaaa ttgcaataac tggcatataa 1800
tgtccatcag taaatcttgg tggtggtggc aataataaac ttctactgat aggtagaatg 1860
gtgtgcaagc ttgtccaatc acggattgca ggccacatgc ggcccaggac aactttgaat 1920
gtggcccaac acaaattcat aaactttcat acatctcgtt tttagctcat cagctatcat 1980
tagcggtagt gtatttaaag tgtggcccaa gacaattctt cttattccaa tgtggcccag 2040
ggaaatcaaa agattggatg cccctggtat agaaaactaa tagtgacagt gttcatattt 2100
catgctttcc caaatacagg tattttattt tcacattctt tttgccatgt ttatataata 2160
ataaagaaaa accctgttga tttgttggag ccattgttat ctgacagaaa ataattgttt 2220
atattttttg cactacactg tctaaaatta gcaagctctc ttctaatgga actgtaagaa 2280
agatgaaata tttttgtttt attataaatt tatttcacct taaaaaaaaa aaa 2333
<210> 7
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-15的示例性氨基酸序列
<400> 7
Met Val Leu Gly Thr Ile Asp Leu Cys Ser Cys Phe Ser Ala Gly Leu
1 5 10 15
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
20 25 30
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
35 40 45
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
50 55 60
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
65 70 75 80
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
85 90 95
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
100 105 110
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
115 120 125
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
130 135
<210> 8
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-2的示例性核酸序列
<400> 8
agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta 60
caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc 120
tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca 180
gatgattttg aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacatt 240
taagttttac atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga 300
actcaaacct ctggaggaag tgctaaattt agctcaaagc aaaaactttc acttaagacc 360
cagggactta atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac 420
attcatgtgt gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat 480
taccttttgt caaagcatca tctcaacact gacttgataa ttaagtgctt cccacttaaa 540
acatatcagg ccttctattt atttaaatat ttaaatttta tatttattgt tgaatgtatg 600
gtttgctacc tattgtaact attattctta atcttaaaac tataaatatg gatcttttat 660
gattcttttt gtaagcccta ggggctctaa aatggtttca cttatttatc ccaaaatatt 720
tattattatg ttgaatgtta aatatagtat ctatgtagat tggttagtaa aactatttaa 780
taaatttgat aaatataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 822
<210> 9
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-2的氨基酸序列
<400> 9
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 10
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-27的示例性核酸序列
<400> 10
gaccaaagag gctgggcccc gccatgggcc agacggcagg cgaccttggc tggcggctca 60
gcctgttgct gcttcccttg ctcctggttc aagctggtgt ctggggattc ccaaggcccc 120
cagggaggcc ccagctgagc ctgcaggagc tgcggaggga gttcacagtc agcctgcatc 180
tcgccaggaa gctgctctcc gaggttcggg gccaggccca ccgctttgcg gaatctcacc 240
tgccaggagt gaacctgtac ctcctgcccc tgggagagca gctccctgat gtttccctga 300
ccttccaggc ctggcgccgc ctctctgacc cggagcgtct ctgcttcatc tccaccacgc 360
ttcagccctt ccatgccctg ctgggagggc tggggaccca gggccgctgg accaacatgg 420
agaggatgca gctgtgggcc atgaggctgg acctccgcga tctgcagcgg cacctccgct 480
tccaggtgct ggctgcagga ttcaacctcc cggaggagga ggaggaggaa gaggaggagg 540
aggaggagga gaggaagggg ctgctcccag gggcactggg cagcgcctta cagggcccgg 600
cccaggtgtc ctggccccag ctcctctcca cctaccgcct gctgcactcc ttggagctcg 660
tcttatctcg ggccgtgcgg gagttgctgc tgctgtccaa ggctgggcac tcagtctggc 720
ccttggggtt cccaacattg agcccccagc cctgatcggt ggcttcttag ccccctgccc 780
cccacccttt agaactttag gactggagtc ttggcatcag ggcagccttc gcatcatcag 840
ccttggacaa gggagggctc ttccagcccc ctgccccagg ctctacccag taactgaaag 900
cccctctggt cctcgccagc tatttatttc ttggatattt atttattgtt tagggagatg 960
atggtttatt tattgtcttg gggcccgatg gtcctcctcg ggccaagccc ccatgctggg 1020
tgcccaataa agcactctca tcca 1044
<210> 11
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-27的示例性氨基酸序列
<400> 11
Met Gly Gln Thr Ala Gly Asp Leu Gly Trp Arg Leu Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Leu Leu Val Gln Ala Gly Val Trp Gly Phe Pro Arg Pro
20 25 30
Pro Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Phe Thr
35 40 45
Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu Val Arg Gly Gln
50 55 60
Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val Asn Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp Val Ser Leu Thr Phe Gln Ala
85 90 95
Trp Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe Ile Ser Thr Thr
100 105 110
Leu Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Gly Leu Gly Thr Gln Gly Arg
115 120 125
Trp Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu Trp Ala Met Arg Leu Asp Leu
130 135 140
Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu Ala Ala Gly Phe
145 150 155 160
Asn Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
165 170 175
Arg Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Leu Gln Gly Pro
180 185 190
Ala Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Ser Thr Tyr Arg Leu Leu His
195 200 205
Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Glu Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Ser Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe Pro Thr Leu Ser
225 230 235 240
Pro Gln Pro
<210> 12
<211> 2347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-12B的示例性核酸序列
<400> 12
ctgtttcagg gccattggac tctccgtcct gcccagagca agatgtgtca ccagcagttg 60
gtcatctctt ggttttccct ggtttttctg gcatctcccc tcgtggccat atgggaactg 120
aagaaagatg tttatgtcgt agaattggat tggtatccgg atgcccctgg agaaatggtg 180
gtcctcacct gtgacacccc tgaagaagat ggtatcacct ggaccttgga ccagagcagt 240
gaggtcttag gctctggcaa aaccctgacc atccaagtca aagagtttgg agatgctggc 300
cagtacacct gtcacaaagg aggcgaggtt ctaagccatt cgctcctgct gcttcacaaa 360
aaggaagatg gaatttggtc cactgatatt ttaaaggacc agaaagaacc caaaaataag 420
acctttctaa gatgcgaggc caagaattat tctggacgtt tcacctgctg gtggctgacg 480
acaatcagta ctgatttgac attcagtgtc aaaagcagca gaggctcttc tgacccccaa 540
ggggtgacgt gcggagctgc tacactctct gcagagagag tcagagggga caacaaggag 600
tatgagtact cagtggagtg ccaggaggac agtgcctgcc cagctgctga ggagagtctg 660
cccattgagg tcatggtgga tgccgttcac aagctcaagt atgaaaacta caccagcagc 720
ttcttcatca gggacatcat caaacctgac ccacccaaga acttgcagct gaagccatta 780
aagaattctc ggcaggtgga ggtcagctgg gagtaccctg acacctggag tactccacat 840
tcctacttct ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca agagcaagag agaaaagaaa 900
gatagagtct tcacggacaa gacctcagcc acggtcatct gccgcaaaaa tgccagcatt 960
agcgtgcggg cccaggaccg ctactatagc tcatcttgga gcgaatgggc atctgtgccc 1020
tgcagttagg ttctgatcca ggatgaaaat ttggaggaaa agtggaagat attaagcaaa 1080
atgtttaaag acacaacgga atagacccaa aaagataatt tctatctgat ttgctttaaa 1140
acgttttttt aggatcacaa tgatatcttt gctgtatttg tatagttaga tgctaaatgc 1200
tcattgaaac aatcagctaa tttatgtata gattttccag ctctcaagtt gccatgggcc 1260
ttcatgctat ttaaatattt aagtaattta tgtatttatt agtatattac tgttatttaa 1320
cgtttgtctg ccaggatgta tggaatgttt catactctta tgacctgatc catcaggatc 1380
agtccctatt atgcaaaatg tgaatttaat tttatttgta ctgacaactt ttcaagcaag 1440
gctgcaagta catcagtttt atgacaatca ggaagaatgc agtgttctga taccagtgcc 1500
atcatacact tgtgatggat gggaacgcaa gagatactta catggaaacc tgacaatgca 1560
aacctgttga gaagatccag gagaacaaga tgctagttcc catgtctgtg aagacttcct 1620
ggagatggtg ttgataaagc aatttagggc cacttacact tctaagcaag tttaatcttt 1680
ggatgcctga attttaaaag ggctagaaaa aaatgattga ccagcctggg aaacataaca 1740
agaccccgtc tctacaaaaa aaatttaaaa ttagccaggc gtggtggctc atgcttgtgg 1800
tcccagctgt tcaggaggat gaggcaggag gatctcttga gcccaggagg tcaaggctat 1860
ggtgagccgt gattgtgcca ctgcatacca gcctaggtga cagaatgaga ccctgtctca 1920
aaaaaaaaaa tgattgaaat taaaattcag ctttagcttc catggcagtc ctcaccccca 1980
cctctctaaa agacacagga ggatgacaca gaaacaccgt aagtgtctgg aaggcaaaaa 2040
gatcttaaga ttcaagagag aggacaagta gttatggcta aggacatgaa attgtcagaa 2100
tggcaggtgg cttcttaaca gccctgtgag aagcagacag atgcaaagaa aatctggaat 2160
ccctttctca ttagcatgaa tgaacctgat acacaattat gaccagaaaa tatggctcca 2220
tgaaggtgct acttttaagt aatgtatgtg cgctctgtaa agtgattaca tttgtttcct 2280
gtttgtttat ttatttattt atttttgcat tctgaggctg aactaataaa aactcttctt 2340
tgtaatc 2347
<210> 13
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-12B的示例性氨基酸序列
<400> 13
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 14
<211> 823
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-12 p35的示例性核酸序列
<400> 14
agaaagcaag agaccagagt cccgggaaag tcctgccgcg cctcgggaca attataaaaa 60
tgtggccccc tgggtcagcc tcccagccac cgccctcacc tgccgcggcc acaggtctgc 120
atccagcggc tcgccctgtg tccctgcagt gccggctcag catgtgtcca gcgcgcagcc 180
tcctccttgt ggctaccctg gtcctcctgg accacctcag tttggccaga aacctccccg 240
tggccactcc agacccagga atgttcccat gccttcacca ctcccaaaac ctgctgaggg 300
ccgtcagcaa catgctccag aaggccagac aaactctaga attttaccct tgcacttctg 360
aagagattga tcatgaagat atcacaaaag ataaaaccag cacagtggag gcctgtttac 420
cattggaatt aaccaagaat gagagttgcc taaattccag agagacctct ttcataacta 480
atgggagttg cctggcctcc agaaagacct cttttatgat ggccctgtgc cttagtagta 540
tttatgaaga cttgaagatg taccaggtgg agttcaagac catgaatgca aagcttctga 600
tggatcctaa gaggcagatc tttctagatc aaaacatgct ggcagttatt gatgagctga 660
tgcaggccct gaatttcaac agtgagactg tgccacaaaa atcctccctt gaagaaccgg 720
atttttataa aactaaaatc aagctctgca tacttcttca tgctttcaga attcgggcag 780
tgactattga tagagtgatg agctatctga atgcttccta aaa 823
<210> 15
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-12 p35的示例性氨基酸序列
<400> 15
Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg
20 25 30
Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val
35 40 45
Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro
50 55 60
Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg
65 70 75 80
Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr
85 90 95
Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys
100 105 110
Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu
115 120 125
Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys
130 135 140
Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser
145 150 155 160
Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn
165 170 175
Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn
180 185 190
Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser
195 200 205
Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys
210 215 220
Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala
225 230 235 240
Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
245 250
<210> 16
<211> 1007
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-12 p40的示例性核酸序列
<400> 16
agcaagatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt tctggcatct 60
cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt ggattggtat 120
ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga agatggtatc 180
acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct gaccatccaa 240
gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga ggttctaagc 300
cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga tattttaaag 360
gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa ttattctgga 420
cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag tgtcaaaagc 480
agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact ctctgcagag 540
agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga ggacagtgcc 600
tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt tcacaagctc 660
aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc tgacccaccc 720
aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag ctgggagtac 780
cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt tcaggtccag 840
ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc agccacggtc 900
atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta tagctcatct 960
tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt taggttctga tccagga 1007
<210> 17
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-12 p40的示例性氨基酸序列
<400> 17
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 18
<211> 1151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-18的示例性核酸序列
<400> 18
attctctccc cagcttgctg agccctttgc tcccctggcg actgcctgga cagtcagcaa 60
ggaattgtct cccagtgcat tttgccctcc tggctgccaa ctctggctgc taaagcggct 120
gccacctgct gcagtctaca cagcttcggg aagaggaaag gaacctcaga ccttccagat 180
cgcttcctct cgcaacaaac tatttgtcgc aggaataaag atggctgctg aaccagtaga 240
agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac aatacgcttt actttataga 300
aaacctggaa tcagattact ttggcaagct tgaatctaaa ttatcagtca taagaaattt 360
gaatgaccaa gttctcttca ttgaccaagg aaatcggcct ctatttgaag atatgactga 420
ttctgactgt agagataatg caccccggac catatttatt ataagtatgt ataaagatag 480
ccagcctaga ggtatggctg taactatctc tgtgaagtgt gagaaaattt caactctctc 540
ctgtgagaac aaaattattt cctttaagga aatgaatcct cctgataaca tcaaggatac 600
aaaaagtgac atcatattct ttcagagaag tgtcccagga catgataata agatgcaatt 660
tgaatcttca tcatacgaag gatactttct agcttgtgaa aaagagagag acctttttaa 720
actcattttg aaaaaagagg atgaattggg ggatagatct ataatgttca ctgttcaaaa 780
cgaagactag ctattaaaat ttcatgccgg gcgcagtggc tcacgcctgt aatcccagcc 840
ctttgggagg ctgaggcggg cagatcacca gaggtcaggt gttcaagacc agcctgacca 900
acatggtgaa acctcatctc tactaaaaat acaaaaaatt agctgagtgt agtgacgcat 960
gccctcaatc ccagctactc aagaggctga ggcaggagaa tcacttgcac tccggaggta 1020
gaggttgtgg tgagccgaga ttgcaccatt gcgctctagc ctgggcaaca acagcaaaac 1080
tccatctcaa aaaataaaat aaataaataa acaaataaaa aattcataat gtgaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa a 1151
<210> 19
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-18的示例性氨基酸序列
<400> 19
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met
1 5 10 15
Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Glu Asn Leu Glu Ser Asp
20 25 30
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
35 40 45
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
50 55 60
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
65 70 75 80
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
85 90 95
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
100 105 110
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
115 120 125
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
130 135 140
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
145 150 155 160
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
165 170 175
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
180 185
<210> 20
<211> 1115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-18的示例性核酸序列
<400> 20
cctttgctcc cctggcgact gcctggacag tcagcaagga attgtctccc agtgcatttt 60
gccctcctgg ctgccaactc tggctgctaa agcggctgcc acctgctgca gtctacacag 120
cttcgggaag aggaaaggaa cctcagacct tccagatcgc ttcctctcgc aacaaactat 180
ttgtcgcagg aataaagatg gctgctgaac cagtagaaga caattgcatc aactttgtgg 240
caatgaaatt tattgacaat acgctttact ttatagctga agatgatgaa aacctggaat 300
cagattactt tggcaagctt gaatctaaat tatcagtcat aagaaatttg aatgaccaag 360
ttctcttcat tgaccaagga aatcggcctc tatttgaaga tatgactgat tctgactgta 420
gagataatgc accccggacc atatttatta taagtatgta taaagatagc cagcctagag 480
gtatggctgt aactatctct gtgaagtgtg agaaaatttc aactctctcc tgtgagaaca 540
aaattatttc ctttaaggaa atgaatcctc ctgataacat caaggataca aaaagtgaca 600
tcatattctt tcagagaagt gtcccaggac atgataataa gatgcaattt gaatcttcat 660
catacgaagg atactttcta gcttgtgaaa aagagagaga cctttttaaa ctcattttga 720
aaaaagagga tgaattgggg gatagatcta taatgttcac tgttcaaaac gaagactagc 780
tattaaaatt tcatgccggg cgcagtggct cacgcctgta atcccagccc tttgggaggc 840
tgaggcgggc agatcaccag aggtcaggtg ttcaagacca gcctgaccaa catggtgaaa 900
cctcatctct actaaaaata caaaaaatta gctgagtgta gtgacgcatg ccctcaatcc 960
cagctactca agaggctgag gcaggagaat cacttgcact ccggaggtag aggttgtggt 1020
gagccgagat tgcaccattg cgctctagcc tgggcaacaa cagcaaaact ccatctcaaa 1080
aaataaaata aataaataaa caaataaaaa attca 1115
<210> 21
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exemplary amino acid sequence of IL-18的示例性氨基酸序列
<400> 21
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met
1 5 10 15
Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn
20 25 30
Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile
35 40 45
Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro
50 55 60
Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg
65 70 75 80
Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met
85 90 95
Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile
115 120 125
Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly
130 135 140
His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe
145 150 155 160
Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys
165 170 175
Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu
180 185 190
Asp
<210> 22
<211> 2612
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-33的示例性核酸序列
<400> 22
ctgctgcctt ccaccatcag atgatcctca ccagatgcca gcataatatt cttggatttg 60
cctgcctcta gaagtaatcc caacagaagg ccaaagaagt ttgccccatg tactttatga 120
agctccgctc tggccttatg ataaaaaagg aggcctgtta ctttaggaga gaaaccacca 180
aaaggccttc actgaaaaca ggtagaaagc acaaaagaca tctggtactc gctgcctgtc 240
aacagcagtc tactgtggag tgctttgcct ttggtatatc aggggtccag aaatatacta 300
gagcacttca tgattcaagt atcacaggaa tttcacctat tacagagtat cttgcttctc 360
taagcacata caatgatcaa tccattactt ttgctttgga ggatgaaagt tatgagatat 420
atgttgaaga cttgaaaaaa gatgaaaaga aagataaggt gttactgagt tactatgagt 480
ctcaacaccc ctcaaatgaa tcaggtgacg gtgttgatgg taagatgtta atggtaaccc 540
tgagtcctac aaaagacttc tggttgcatg ccaacaacaa ggaacactct gtggagctcc 600
ataagtgtga aaaaccactg ccagaccagg ccttctttgt ccttcataat atgcactcca 660
actgtgtttc atttgaatgc aagactgatc ctggagtgtt tataggtgta aaggataatc 720
atcttgctct gattaaagta gactcttctg agaatttgtg tactgaaaat atcttgttta 780
agctctctga aacttagttg atggaaacct gtgagtcttg ggttgagtac ccaaatgcta 840
ccactggaga aggaatgaga gataaagaaa gagacaggtg acatctaagg gaaatgaaga 900
gtgcttagca tgtgtggaat gttttccata ttatgtataa aaatattttt tctaatcctc 960
cagttattct tttatttccc tctgtataac tgcatcttca atacaagtat cagtatatta 1020
aatagggtat tggtaaagaa acggtcaaca ttctaaagag atacagtctg acctttactt 1080
ttctctagtt tcagtccaga aagaacttca tatttagagc taaggccact gaggaaagag 1140
ccatagctta agtctctatg tagacaggga tccattttaa agagctactt agagaaataa 1200
ttttccacag ttccaaacga taggctcaaa cactagagct gctagtaaaa agaagaccag 1260
atgcttcaca gaattatcat tttttcaact ggaataaaac accaggtttg tttgtagatg 1320
tcttaggcaa cactcagagc agatctccct tactgtcagg ggatatggaa cttcaaaggc 1380
ccacatggca agccaggtaa cataaatgtg tgaaaaagta aagataacta aaaaatttag 1440
aaaaataaat ccagtatttg taaagtgaat aacttcattt ctaattgttt aatttttaaa 1500
attctgattt ttatatattg agtttaagca aggcattctt acacgaggaa gtgaagtaaa 1560
ttttagttca gacataaaat ttcacttatt aggaatatgt aacatgctaa aacttttttt 1620
tttttaaaga gtactgagtc acaacatgtt ttagagcatc caagtaccat ataatccaac 1680
tatcatggta aggccagaaa tcttctaacc taccagagcc tagatgagac accgaattaa 1740
cattaaaatt tcagtaactg actgtccctc atgtccatgg cctaccatcc cttctgaccc 1800
tggcttccag ggacctatgt cttttaatac tcactgtcac attgggcaaa gttgcttcta 1860
atccttattt cccatgtgca caagtctttt tgtattccag cttcctgata acactgctta 1920
ctgtggaata ttcatttgac atctgtctct tttcatttct tttaactacc atgcccttga 1980
tatatctttt gcacctgctg aacttcattt ctgtatcacc tgacctctgg atgccaaaac 2040
gtttattctg ctttgtctgt tgtagaattt tagataaagc tattaatggc aatatttttt 2100
tgctaaacgt ttttgttttt tactgtcact agggcaataa aatttatact caaccatata 2160
ataacatttt ttaactacta aaggagtagt ttttatttta aagtcttagc aatttctatt 2220
acaacttttc ttagacttaa cacttatgat aaatgactaa catagtaaca gaatctttat 2280
gaaatatgac cttttctgaa aatacatact tttacatttc tactttattg agacctatta 2340
gatgtaagtg ctagtagaat ataagataaa agaggctgag aattaccata caagggtatt 2400
acaactgtaa aacaatttat ctttgtttca ttgttctgtc aataattgtt accaaagaga 2460
taaaaataaa agcagaatgt atatcatccc atctgaaaaa cactaattat tgacatgtgc 2520
atctgtacaa taaacttaaa atgattatta aataatcaaa tatatctact acattgttta 2580
tattattgaa taaagtatat tttccaaatg ta 2612
<210> 23
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-33的示例性氨基酸序列
<400> 23
Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala
1 5 10 15
Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly
20 25 30
Arg Lys His Lys Arg His Leu Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Ser
35 40 45
Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr
50 55 60
Arg Ala Leu His Asp Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu
65 70 75 80
Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala
85 90 95
Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp
100 105 110
Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro
115 120 125
Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr
130 135 140
Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His
145 150 155 160
Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe
165 170 175
Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys
180 185 190
Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu
195 200 205
Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe
210 215 220
Lys Leu Ser Glu Thr
225
<210> 24
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-7的示例性核酸序列
<400> 24
acacttgtgg cttccgtgca cacattaaca actcatggtt ctagctccca gtcgccaagc 60
gttgccaagg cgttgagaga tcatctggga agtcttttac ccagaattgc tttgattcag 120
gccagctggt ttttcctgcg gtgattcgga aattcgcgaa ttcctctggt cctcatccag 180
gtgcgcggga agcaggtgcc caggagagag gggataatga agattccatg ctgatgatcc 240
caaagattga acctgcagac caagcgcaaa gtagaaactg aaagtacact gctggcggat 300
cctacggaag ttatggaaaa ggcaaagcgc agagccacgc cgtagtgtgt gccgcccccc 360
ttgggatgga tgaaactgca gtcgcggcgt gggtaagagg aaccagctgc agagatcacc 420
ctgcccaaca cagactcggc aactccgcgg aagaccaggg tcctgggagt gactatgggc 480
ggtgagagct tgctcctgct ccagttgcgg tcatcatgac tacgcccgcc tcccgcagac 540
catgttccat gtttctttta ggtatatctt tggacttcct cccctgatcc ttgttctgtt 600
gccagtagca tcatctgatt gtgatattga aggtaaagat ggcaaacaat atgagagtgt 660
tctaatggtc agcatcgatc aattattgga cagcatgaaa gaaattggta gcaattgcct 720
gaataatgaa tttaactttt ttaaaagaca tatctgtgat gctaataagg aaggtatgtt 780
tttattccgt gctgctcgca agttgaggca atttcttaaa atgaatagca ctggtgattt 840
tgatctccac ttattaaaag tttcagaagg cacaacaata ctgttgaact gcactggcca 900
ggttaaagga agaaaaccag ctgccctggg tgaagcccaa ccaacaaaga gtttggaaga 960
aaataaatct ttaaaggaac agaaaaaact gaatgacttg tgtttcctaa agagactatt 1020
acaagagata aaaacttgtt ggaataaaat tttgatgggc actaaagaac actgaaaaat 1080
atggagtggc aatatagaaa cacgaacttt agctgcatcc tccaagaatc tatctgctta 1140
tgcagttttt cagagtggaa tgcttcctag aagttactga atgcaccatg gtcaaaacgg 1200
attagggcat ttgagaaatg catattgtat tactagaaga tgaatacaaa caatggaaac 1260
tgaatgctcc agtcaacaaa ctatttctta tatatgtgaa catttatcaa tcagtataat 1320
tctgtactga tttttgtaag acaatccatg taaggtatca gttgcaataa tacttctcaa 1380
acctgtttaa atatttcaag acattaaatc tatgaagtat ataatggttt caaagattca 1440
aaattgacat tgctttactg tcaaaataat tttatggctc actatgaatc tattatactg 1500
tattaagagt gaaaattgtc ttcttctgtg ctggagatgt tttagagtta acaatgatat 1560
atggataatg ccggtgagaa taagagagtc ataaacctta agtaagcaac agcataacaa 1620
ggtccaagat acctaaaaga gatttcaaga gatttaatta atcatgaatg tgtaacacag 1680
tgccttcaat aaatggtata gcaaatgttt tgacatgaaa aaaggacaat ttcaaaaaaa 1740
taaaataaaa taaaaataaa ttcacctagt ctaaggatgc taaaccttag tactgagtta 1800
cattgtcatt tatatagatt ataacttgtc taaataagtt tgcaatttgg gagatatatt 1860
tttaagataa taatatatgt ttacctttta attaatgaaa tatctgtatt taattttgac 1920
actatatctg tatataaaat attttcatac agcattacaa attgcttact ttggaataca 1980
tttctccttt gataaaataa atgagctatg tattaa 2016
<210> 25
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-7的示例性氨基酸序列
<400> 25
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 26
<211> 12846
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MICA的示例性核酸序列
<400> 26
tggtctgagc ggttctactg cggcaggtgc ttctgagagg cagaggtggc tgagatctgg 60
aaacaggtct gcaaatctgg tcactggtct cattgccagt aacgctgtgc gcggttgagg 120
gagtgtgttg ggagaatagc cacgcgttgt ctgtcctgga aggaacaagc cagtgagagc 180
cggtttaatg gggcggccgg cgaaaggggc ttggtgaggc ccgcgctcct cggggtgggg 240
gcgcggggat gggtggtcgc gatgccggga gggcaggcag ggccctgccc gtgcttatga 300
agttggagct gtactctcag ctactcgaag ctggtccctg ctttaggctg cgctcccgcg 360
tgctccccat tttctgggcc ccaggtcccg ccttctaaat ctccccaggt ctccagccca 420
ctggaatttt ctcttccaag cgtggccccg ccctctccgc tcgtgattgg ccctaagttc 480
cgggccccag tttcattgga tgagcggtcg ggggaccggg ccaggtgact aagtttccgc 540
ggcgccttct ccccggccac tgcttgagcc gctgagaggg tggcgacgtc ggggccatgg 600
ggctgggccc ggtcttcctg cttctggctg gcatcttccc ttttgcacct ccgggagctg 660
ctgctggtga gtggcgttcc tggcggtcct cggcggagcg ggagcagtgg gacgtttccg 720
ggggtcgggt gggtagcggc gagcgctgtg cggtcagggc gggcctcctg tgcgctgtcg 780
gtggcgcagg gagctggacg cggcccgtta ccgccacact tcagccctgc ttccccgtca 840
cttttcagtc ctcctcggga tcgcgcatca cctgcacttt ctggtctcct cctgctcttt 900
ctctcctcgc gtctcctccg cttcctctca cttttcggac aaaccagtcc ttctgaggcc 960
catgggttcc cgggctgcct ccggggctgc tcctgtgaat ggcattcgag tgcccttcca 1020
gcgcggccac tgaagcagcc acaacccccg gtgctcgggg cggctctcag gtccctgaag 1080
tcctgtcctc tcccggagcc gacgtgttct cagctcctgg gccgcagctc ctggagtagg 1140
ggccctcctt tctcgggacc cggagctggt gcttcctgct gctgtgggga ctgtgggggg 1200
tcctgactct caagctgagg ggttggagtc tgcaggctcc gggcagagga ttcttcctgc 1260
gacttctctc atccccagct cattctcccc tcgcctctgg ctccgagggt cctctcctct 1320
ctctcatccc acccctacta atgaccagtg atctaaggac accagattcc ctctcacctc 1380
ctccctgccc atctcagggc ccgctgagtc cttttgccct cccagctccc tgctacccct 1440
tcctgtgtgc tgttctctga tccatttcta gggtgtcctc tgccctcatc ccctgtcccc 1500
gccaccgaag gtccctcctg caccccttat gggcctttcc tacaagcagc cttcacccag 1560
tgctgcccct atgcctcccc gttcccaaat gtccctgact ctaactttct ggtgctgcct 1620
tttatccggg ggggtcttcc ctccatccca ctcccctcca cacccccaag gggaaccctg 1680
atgctaatgg cagttgggcc ttaggcaggg cgcagggcag cgcagatgcc ccctcccctc 1740
cagtgcagat gcctgctctg gaccctgcct cattgtggcc ccttccccac tccttcatcc 1800
tcagcctcac cctcttgagg accccaccct ccagcccaca ggtgctggac catccctccc 1860
tggtccctcc gcccctctcc accttgggac cttgtgctgc tcctatctct tgcccagctg 1920
ccttgggccc tcagcacgtt ctcatctttc agtgggaaag tgggagtgct ggagcatatg 1980
acagtgctga gcatctttcc caagccccac cctcccccag agcaccctcc cctcctgtcc 2040
tcaccctacc ccaagttctc ccacagtcac tcctgcccca tgctcatgcc gccctccagt 2100
tcttgctctg cccatctccc ctccccaacc cagacctaaa acaggctgtt gggccagctg 2160
ttccttgacc ttccttcttt tcttttggtt ccttgacccc agtgggctct cactccccac 2220
accgcatatc taaaatctgt tttgcctgct cttggggtgc cactgctccc cctccagcat 2280
tactcctttt ggcaggtcct tcctcaggct gagaatctcc ccctctacct tggttttctc 2340
tctctggcca gcacccccac cccttgcttt gtttttaatt tttaactttt gtttgggtac 2400
gtagtagata tatatgtata tatttatggg gtacatggga tattttcaca caggcctaca 2460
atatgtaata atcacatcag ggtaaatggg ttatatcaca acaagcattt atcctttctt 2520
tgtgctacaa acaatcccat tatgctcttt cagttatttt taaatgtaca ataaattatt 2580
gttgactgta ctcaccctgc tgtgctatct actagatctt attcattcta attatatttt 2640
tgtacccatt attaaccatc cctgctcccc cactccccac tacccttctc agcctctggt 2700
aatcatcatt ctattgtctc tccccatgag gtccattgtt ttaaattttg gctgccacaa 2760
ataagtgaga acatgcaaag tttgtctgtc tgggcctggg gcttatttca cttcacagga 2820
tgacctccag ttctttgcaa atgacacgat ggctgaatag ttctccacat acacatgtac 2880
accacatttt ctttatccat gcgtctgttg atggacactt agattgcttg cagatcttgg 2940
ctactttgaa tagtgctgca ataaacatgg aaaagtagat agctctttaa tataccgatt 3000
tcctttcttt ggagtatatg cctaacagtg ggagtgctgg agcatatgac agctctattg 3060
tatttttagt ttttggaaga acctccacat tgtttcccat agtggttgta ctagtttacg 3120
ttcccaccaa cagtgtacat cctcaccagc attccttatt tctacatcct cgccagcatt 3180
ccttattgcc tgtcttctgg ataaaagcca gtttatctgg ggtgggatgt tatctcgtag 3240
gagttttgat ttgccttcat ctgttgacga atgatgttga gcaccttttc atatacctgt 3300
ttgccattta tatgtcttct tttgagaaat gactattcag atcttttctc atttttaaat 3360
tggattatta tatttttttt tcctatagtt gttcgagctc cttatatgtt tcagttactg 3420
atcctttgtc agatgaatag tttgaaaata ttttctccca ttcttggatg gtctcttcat 3480
tttgtttatt gtttcctttg ctgtgcagaa gcctttttac ttgatatgat cccatttatg 3540
caattttact ttggttacct gtgcttgtgg ggtattactt taaaaatctt tgcccagtcc 3600
aatatcctag agagtttccc caatgttttc ttgtatagtt tcatagtttg aggtcataga 3660
tttacatctt taatccactt tgatttgatt tttgtatatg gtgaaagaca gggtctagtt 3720
tcattcttct gcataaggat atctagtttc cccagcacca tttttgaaga gactctcctt 3780
tgccaatgtg tgttcttggt acctttgttg gaaatgagtt tactgtagat gtatggaatt 3840
gtttctgggt tctctattct gtttcattgg tctgtgtgtc tgtttttatg ccagtatcat 3900
gctgttttgg ttactgtagc tctgtagtat aatttgaagt cagataatgt gattcctcta 3960
gttttgttca ttttgctcag gatagcttta tctattctgg tttttttgtg gttccatatg 4020
cattttagga ttatttttat tatttctgtg aagaatgtca ttagtgtttt gatagggatt 4080
gcattgaatc tgtagattac tttgggtagt atggatattt caacaaaact gattcttcca 4140
atccatgaac gtggactatc ttttccattt tttgtgtcct tcaatttttt gcatcagtgt 4200
tttttgtttt tggtttttga gatggagttt cactcttgtt gcccaggcta gaatgcaagg 4260
gtgtgatctt ggctcaccgc aacctccgcc tcccaggttc aagcgattct tctgcctcag 4320
cctcccaagt agctgggatt acaggcatgt gccactgtgc ctggctaatt ttctattttt 4380
attagagatg gggtttctct atgttggcca ggctagtctt gaactcctga cctcaggtga 4440
tccacctgcc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggc atgagccacc acgcccagcc 4500
acatcactgt tttatagttt ttattggaga ggtctttcac ttcttcagtt aggtttattc 4560
ctcagtattt tattttattt gtagctattg taaatgggat tcgtttcttg atttcttttt 4620
cagattattt gctgttagca ctgatttttg catgttgatt ttgtatcctg caactttact 4680
gaatttgttc ttcagttcta atggtttttt ggtggagtct ttaggttttt ccaaatatca 4740
gaccacatga tctgcaaaca aggataattt gacttcttct tttccagttt taatgccctt 4800
tctttctttc tcctgtctga ttgctctagt taggatctgc agtactgtgt tgcataactg 4860
tggtaaaatt agtcatcctt gtcttattcc agatcttaga gaaaaggctt tcagttttcc 4920
cccattcagt atgttactag ctgtgagttt gtcatatatg gcttttatta tattgaggtc 4980
tgttccttgt atacttagtt ttttgagagt ttttatcatg aagggatgtt gaatttatca 5040
aatgcttttt cagtatcaat tgaatgatac tggcttttgt cctttattct gttgatatga 5100
cgtattacat tgattgattt gtgtatgtta aatcatcctt gcatacctgg aatacattcc 5160
acttgctcat aaagaatgat cttttttaat gtattgttga atgtggtttg ctagtatttc 5220
cttgacgatt tttgcatcgg tgttcatcag ggatataggc ctgtagtttt cttttttatg 5280
atgtgtcttt gcctggtttt tgtatcagga tattcctggc tttgtaaaat gagtttggaa 5340
gtattccctc ctcctctatt tttcagaaca gtttgaatag gactgacata tgttgttctt 5400
taaaagttta attgtggtaa attatacatt acataaattt tactgtttta accactttta 5460
agtgtatact cggtggcatt agatacattc acatttttgt gcaacccaaa actctgtgcc 5520
cattaatcgg taactcccca ttcctcccta cctctggccc ctggtaacca ccattctact 5580
ttttgtttct atgaatttga ccactctagg tacctcattt aagcagaatc atgtaatgtt 5640
tgtctttttg tttctggctt atttcactta taatattttt gaggttcggt gggcacagtg 5700
gctcacgcct ggatttccag cactttggga ggctgaagca ggtggatcac ctgagtttcg 5760
gagttcgaaa ccagcctggc caacatggtg aaaccccatc tctactaaaa ataataaaag 5820
ttagccgggc gtgatggcgg gtgcctgtaa tcccaactac ttgggaggct gaggcaggag 5880
aatcgcttga atccgggaag tggaggttgc agtgagctga gatcaggcca ctgcactcca 5940
gcctgggcaa caagagtgaa attccatctc caaaaaaaaa aataaaacaa taataataat 6000
aatatttttg aggttcatcc aagttgtagt atgggtcaga atttcattcc ttttaaggat 6060
ggataatact cattatatgt atgtaccaca tcttggttat ccatccctca gacaacggac 6120
acttgggtta cttctacctt ttggatattg gcaaatattt catttccttt gggtatatat 6180
ttatttcctt tgggtatttc ttttgggtat atatccagaa atagaagcag tacatagggg 6240
cttcattttc tctgtctctt tgccaacctt gctctgtgtg tgtgtgtgta tgtgtgtgtg 6300
taggtgtgtg ataacagcca tcctgattgg tttcaggtgg catctcattg tggtttggat 6360
ttgcattttc ctaatgagtg ctgatattga gcatcttttc atgtgtttgt tgatcatttg 6420
taattttctt tgaagaattg gccatttaag tcttttgccc attttttccc ccacatagct 6480
tctcttatca gatatatgac ttgcaatatt tatttcattt cggggttgat tgctttttca 6540
ctctgattgt gccctttgat gcatagatgt tttgaatttt catcagtcta ctttgtcagt 6600
tctttctatt ctatctgtgc tttggtgtca tatccatgaa agcactgtca aatcctatgt 6660
catgaacatt atccccaatg tttgcttcta agaaattttt aggttttagt tcttgagtgt 6720
agagtttagg tctttgattc attttgagtt aatttttgta tatagtgcaa attaagggtc 6780
caattttatt ttaacacccc ctgcccccag aactatttgc tgaaaagatc aactgactct 6840
ttgtcacctg ctcaccccag tggacactag ctgttccatc caattgctgt cctggggcct 6900
tgtcatgcca ctcttccact ttgaacccaa gcccacaccg ttgctcccct ctgggatact 6960
gaccccacta taaacttcac tggggctaca accttcctac cctttgtgcc tcatgaccac 7020
cccctccctt gtccccacca tgcccatgat gagtctcttc tcgaggcagc tccccttgcc 7080
tccatctcac cctcacctat gcaccacagc cacactggac atgggtccct ctgagcctga 7140
gtcccttccc attcccacca tcccctctgg caagaccttc cttccaccac cttcatgctc 7200
ctcccttgcc cctgcagggc agcctctccc cttggcccct attcccttag ggggcttgtg 7260
gccacccagt ccttgcacct ggcctacaag tttgccatct tcattccccc ttcttctgtt 7320
catcagcccc ctcctctatc ctcccaccct cacagttttc tttgtatatg aaatcctcgt 7380
tcttgtccct ttgcccgtgt gcatttcctg cctcctcagg aaggttggga cagcagacct 7440
gtgtgttaaa catcaatgtg aagttacttc caggaagaag tttcacctgt gatttcctct 7500
tccccagagc cccacagtct tcgttataac ctcacggtgc tgtccgggga tggatctgtg 7560
cagtcagggt ttctcgctga ggtacatctg gatggtcagc ccttcctgcg ctgtgacagg 7620
cagaaatgca gggcaaagcc ccagggacag tgggcagaag atgtcctggg aaataagaca 7680
tgggacagag agaccaggga cttgacaggg aacggaaagg acctcaggat gaccctggct 7740
catatcaagg accagaaaga aggtgagagt cggcaggggc aagagtgact ggagaggcct 7800
tttccagaaa agttaggggc agagagcagg gacctgtatc tacccactgg atctggctca 7860
ggctgggggt gaggaatggg ggtcagtgga actcagcagg gaggtgagcc ggcactcagc 7920
ccacacaggg aggcatggag gagggccagg gaggcgtacc ccctgggctg agttcctcac 7980
ttgggtggaa aggtgatggg ttcgggaatg gagaagtcac tgctgggtgg gggcaggctt 8040
gcattccctc caggagatta gggtctgtga gatccatgaa gacaacagca ccaggagctc 8100
ccagcatttc tactacgatg gggagctctt cctctcccaa aacctggaga ctgaggaatg 8160
gacaatgccc cagtcctcca gagctcagac cttggccatg aacgtcagga atttcttgaa 8220
ggaagatgcc atgaagacca agacacacta tcacgctatg catgcagact gcctgcagga 8280
actacggcga tatctaaaat ccggcgtagt cctgaggaga acaggtaccg acgctggcca 8340
ggggctctcc tctccttcca attctgctag agttgcctca cctcccagat gtgtccaggg 8400
aaaccctccc tgtgctatgg atgaaggcat ttcctgttgg cacatcgtgt cctgattttc 8460
ctctattgtt agagccactg gataaagaca gtgggtcagg gactggacca tccagtgttg 8520
taatcagggc aagtagagga ccctccgaca gaatcctgag cctggggtgg gtgtcaggca 8580
ggagaggaag gcttcagggc cagggctgcc ccctctgcct cccagcctgc ccatcctgga 8640
gagttccctc ctggccccac aacccaggag tccacccctg acatccccct cctcagcatc 8700
aatgtgggga tcccagagcc tgaggccaca gtcccatggc ccatcctcct gccagcctgg 8760
aagaactggg ccccagagtg aggacagact tgcaggtcag gggtcccaga gggcttcagc 8820
cagagtgaga acagtgaaga gaaacagccc tgttcctctc ccctccttag aggggagcag 8880
ggcttcactg gctctgccct ttcttctcca gtgcccccca tggtgaatgt cacccgcagc 8940
gaggcctcag agggcaacat taccgtgaca tgcagggctt ctggcttcta tccctggaat 9000
atcacactga gctggcgtca ggatggggta tctttgagcc acgacaccca gcagtggggg 9060
gatgtcctgc ctgatgggaa tggaacctac cagacctggg tggccaccag gatttgccaa 9120
ggagaggagc agaggttcac ctgctacatg gaacacagcg ggaatcacag cactcaccct 9180
gtgccctctg gtgagcctag ggtgaccctg gagagggtca ggccagggta gggacagcag 9240
ggatggctgt ggctctctgc ccagtgtata acaagtccct tttttttcag ggaaagtgct 9300
ggtgcttcag agtcattggc agacattcca tgtttctgct gttgctgctg ctgctgctgc 9360
tgctgctgct atttttgtta ttattatttt ctacgtctgt tgttgtaaga agaaaacatc 9420
agctgcagag ggtccaggtg agaaaagcgg gcagtttctg gagatggtaa ggcccctgtc 9480
tgggcagtag ggtcccctca ttgctcctgc aaagataggc atgttggtga caaggcttct 9540
gtaacagggg atgaaagttg gggaatttgg gaagggaatg ggggcaacat ctccatctac 9600
acccataagt gctgcccaag cgagggtcaa acgcccagct gtggcatctt cctgctgcag 9660
gtgaggagtg ggcagcaggg agggctgcgg cgcctgctct gtccccatcc cggtctctgt 9720
gtctcttgga ctcactaggg cgcatccagg tggggtgagc tgggaatcac gtgctgaatg 9780
ctgaggacct ggatgatcac ggcctcagag ggagcaaata gtaaaggcag ctgtgatctg 9840
gggagggcca gaaactggag aggaatctga ggagaggcgg tgcccctatt cccttcctct 9900
ctgcatccct ctcccctatt tctccagcca ttggggcgga caccaagaaa aagacctatg 9960
aggcccagcc tgggggccct gcctgtgtag ccctttggag accccttgta acagggaggg 10020
tcctgagcac acatggccat ctctgtccac ttttcagctc cccatgcacc tcctccagga 10080
gctttcttgg ggttgtcgtg tcctctgcac cattcgaggc cctactcttt ccaggttccc 10140
acagcctggt ctccctgagt ttcttgcaga tgagatggat gagtagataa gcagatgtcc 10200
ctgggccatt tgaggagtgg ggcccagccc ctcatcaggg cagctgtggt ccctgttttc 10260
atcctacctc cgagtgtttt cttctccagt ccctgaggga cacagtcctc agggcccatg 10320
tttttggggc tttaatctgt gctctgtggc ctcaccttgc cctccctgag ccaatttccc 10380
tttctaaagg tggtcactgc ctggtaagtt tggagtaagg gacggtcaga atcatttccc 10440
ctacagtcag gttgtttgat gggggatgaa aagagacagc aggaagtttt gtgtttctgc 10500
aaagacagaa gcagttcagg ggacagtaag aggctggggt gtccaggagg gtgtgtctgg 10560
cagtagggtc gctggtttct catccttgaa cctaattgca ctgtcagtcg gcccctcagg 10620
cctgagcaga tgggaaggtt tgtcccctgc cctgcagtaa gagggccctg tccaggaggc 10680
acccataaca ggggcagtgc aggtctgtgg tcgctcctgc tctcacctgt ggcgtctccc 10740
gtagagggat tatcagttct ggttccctgt gggcaggaat ggtttcctca taggtcactg 10800
gagttttggc caggaaaaga gtatgaagtt catgtgccag tttctcaaaa ttcctgcttt 10860
caatgttgat gtcaagcaaa gatattcgta atttcagctc tataatctta ataggatttc 10920
ccctaatatt gtaaagcatc ttatatgaaa caggaacaca aatttctcaa aattcctgcg 10980
atgtccaata aagattttca taatttcggc tctccaatct taataggatt tcctaatact 11040
gtaaagcata ttaaatgaaa caggaaccca aatttggagc cccctctcca ggaggttctg 11100
tgtggagatg gtggctgtgg cagtggcagt tcccaggtgc agagggtggg cagaggcagc 11160
ctcaggctaa ggggtctccc ctactccaca tggagaaaat cccttgtagg ttgcaagggc 11220
agtggccggg tggaatccct gctagggaca gagcaggaag gcctcgcagc ctcaccaagc 11280
agcagccctg gggtggagct gcgtttccag ggttaagcgg accaggcagg agcagtggtt 11340
actcaacagc aggtcacagg cttgggttgt gagggtcagg agaggccagg cctcctcgag 11400
caaggtgggg gtcccagggt caggtcaggt gcagatcctg tggcagccac gtctttccat 11460
gctgggcctg ctgggccccc caggctttct gatggggtcc ccagttagga gctgcctgct 11520
cagggctggg aggggaggag cgctgagctg cagatagagg gcagagccca cagtgggcag 11580
ggcctgccct ggtgtgtagg tgcctctgca ggagaggagg gcctggggac tgagagcaag 11640
ggtcagggcc tctctttgag gaggcctctc actgtaacag gactggtcag gcctgagagg 11700
aggtcactgg gttccctctt gggtcttgtc ctttagtctt ggggcccttt ccctccctgc 11760
acgatgagtg gtgggcacag ggcaggggct gatgttgatg gagtgatggg agggaactgg 11820
taggggctgg gaaaagcaag gagggaggaa gaaaaaagtg ggggcctcat cttctctcag 11880
agaaagggcg aatctggttt tggagcaact gaagagagaa aagtccccag ggaataaaca 11940
caacactgca cccagtggag catttacccg tttccctctt ttctccagag ctcgtgagcc 12000
tgcaggtcct ggatcaacac ccagttggga cgagtgacca cagggatgcc acacagctcg 12060
gatttcagcc tctgatgtca gatcttgggt ccactggctc cactgagggc gcctagactc 12120
tacagccagg cagctgggat tcaattccct gcctggatct cacgagcact ttccctcttg 12180
gtgcctcagt ttcatgacct atgaaacaga gaaaataaaa gcacttattt attgttgttg 12240
gaggctgcaa aatgttagta gatatgaggc gtttgcagct gtaccatatt aattggtgtc 12300
attgtttctg ttgttttcgt attattattt ttttttttta agacagagtc tcaggccagg 12360
cacggtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc cgaggcgggc ggatcacaag 12420
gtcaagagat cgagaccacc ctgatcaaca tggtgaaacc ctgtctctac taaaaataca 12480
aaaaattagc tgggcctggt ggcatgtgcc tgtagtccca gctactcagg agctgaggca 12540
ggaaaatcac ttgaacctgg gaggtggaga ttgcagtgag ctgagatcgc gccactgcac 12600
tccagcctgg cgacagagcg agactctgtc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagac 12660
agagtctcac tctgtcaccc aggctgcagt tcagtgacat gatctcagct cgttgcagcc 12720
tccgcctccc gggttcaagc acttcttgtg cctcagcctc ccgagtagct ggggttacag 12780
acatgcacca ccatacccgg ctaatttttg catttttcat agagacagga ttttgccatg 12840
ttggcc 12846
<210> 27
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MICA的示例性氨基酸序列
<400> 27
Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
20 25 30
Thr Val Leu Ser Gly Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu
35 40 45
Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu
85 90 95
Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg
115 120 125
Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln
290 295 300
Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ile Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr Val Cys Cys Cys
325 330 335
Lys Lys Lys Thr Ser Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu Val Ser Leu Gln
340 345 350
Val Leu Asp Gln His Pro Val Gly Thr Ser Asp His Arg Asp Ala Thr
355 360 365
Gln Leu Gly Phe Gln Pro Leu Met Ser Asp Leu Gly Ser Thr Gly Ser
370 375 380
Thr Glu Gly Ala
385

Claims (50)

1.一种经修饰的721.221细胞，其表达膜结合IL-21(mIL-21)。
2.根据权利要求1所述的经修饰的721.221细胞，其中所述mIL-21包含：
与SEQ ID NO:2具有至少90％或至少95％序列相同性的氨基酸序列；和/或
编码所述mIL-21的核酸包含与SEQ ID NO:1具有至少90％或至少95％序列相同性的核酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的经修饰的721.221细胞，其中采用病毒载体在所述721.221细胞中表达所述mIL-21。
4.根据权利要求3所述的经修饰的721.221细胞，其中所述病毒载体为逆转录病毒载体。
5.根据权利要求4所述的经修饰的721.221细胞，其中所述逆转录病毒载体为莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)载体。
6.根据权利要求5所述的经修饰的721.221细胞，其中所述MoMLV载体为SFG逆转录病毒载体。
7.根据权利要求3-6任一项所述的经修饰的721.221细胞，其中所述载体与SEQ ID NO:3具有至少90％或95％的序列相同性。
8.根据权利要求1-7任一项所述的经修饰的721.221细胞，其中所述细胞进一步表达至少一个另外的异源白介素和/或白介素受体。
9.一种经修饰的721.221细胞，其表达膜结合IL-21(mIL-21)、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、膜结合IL-15(mIL-15)、toll样受体(TRL)配体、UL16膜结合蛋白(ULBP)-1、ULPB-2和/或主要组织相容性复合体(MHC)I类链相关蛋白A(MIC-A)中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的经修饰的721.221细胞，其中所述细胞包含编码mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、mIL-15、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2和/或MIC-A中的一或多个的异源核酸。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的经修饰的721.221细胞，其中所述细胞还表达至少一种另外的异源细胞因子、激活受体配体、TRL配体或其受体。
12.根据权利要求8或权利要求11所述的经修饰的721.221细胞，其中所述至少一种另外的异源细胞因子、激活受体配体、TRL配体或其受体包括IL-15受体α(IL-15Rα)。
13.根据权利要求12所述的经修饰的721.221细胞，其中所述细胞包含编码IL-15Rα的异源核酸。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的经修饰的721.221细胞，其中所述经修饰的721.221细胞表达mIL-21和IL-15Rα。
15.根据权利要求9或权利要求10所述的经修饰的721.221细胞，其中所述经修饰的721.221细胞表达mIL-21。
16.根据权利要求15所述的经修饰的721.221细胞，其中所述经修饰的721.221细胞包含编码mIL-21的异源核酸。
17.一种产生经修饰的721.221细胞的方法，包括：
用编码mIL-21的核酸转导或转染721.221细胞群；
分离表达mIL-21的细胞；以及
辐照所分离的细胞，
从而产生经修饰的721.221细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中用包含编码所述mIL-21的核酸的病毒转导所述721.221细胞群。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中:
所述mIL-21包含与SEQ ID NO:2具有至少90％或至少95％序列相同性的氨基酸序列；和/或
所述编码mIL-21的核酸包含与SEQ ID NO：1具有至少90％或至少95％序列相同性的核酸序列。
20.根据权利要求18所述的经修饰的721.221细胞，其中用逆转录病毒载体转导所述721.221细胞群。
21.根据权利要求20所述的经修饰的721.221细胞，其中所述逆转录病毒载体为莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)载体。
22.根据权利要求21所述的经修饰的721.221细胞，其中所述MoMLV载体为SFG逆转录病毒载体。
23.根据权利要求20-22任一项所述的经修饰的721.221细胞，其中所述逆转录病毒载体与SEQ ID NO:3具有至少90％或95％的序列相同性。
24.一种产生根据权利要求9-17任一项所述的经修饰的721.221细胞的方法，包括：
用编码mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、膜结合IL-15(mIL-15)、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2和/或MIC-A的核酸转导或转染721.221细胞群；
分离表达mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、膜结合IL-15(mIL-15)、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2和/或MIC-A的细胞；以及
辐照所分离的细胞，
从而产生经修饰的721.221细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中用包含编码mIL-21、IL-2、IL-12、IL-33、IL-27、IL-18、IL-7、mIL-7、IL-15、膜结合IL-15(mIL-15)、TLR配体、ULBP-1、ULPB-2和/或MIC-A的核酸的病毒转导所述721.221细胞群。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述病毒为逆转录病毒或慢病毒。
27.根据权利要求17-26任一项所述的方法，其中用编码另外的异源细胞因子、激活受体配体、TRL配体或其受体的核酸进一步转导或转染所述721.221细胞群。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述另外的外源异源细胞因子、激活受体配体、TRL配体或其受体是膜结合的。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述另外的异源细胞因子、激活受体配体、TRL配体或其受体包括IL-15α。
30.一种扩增自然杀伤(NK)细胞群或T细胞群的方法，包括在足以细胞扩增的条件下，使细胞群与根据权利要求1-10任一项所述的经修饰的721.221细胞和至少一种细胞因子接触1-40天。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞群来自外周血、脐带血、腹水、月经血或骨髓。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述细胞群包含外周血单个核细胞(PBMC)。
33.根据权利要求30-32任一项所述的方法，其中所述细胞群包含嵌合抗原受体(CAR)修饰的细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述CAR修饰的细胞包括CAR修饰的T细胞或CAR修饰的自然杀伤(NK)细胞。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述CAR修饰的细胞包括CD19 CAR修饰的NK细胞。
36.根据权利要求30-35任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞因子包括至少一种白介素。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述白介素为白介素-15(IL-15)和/或白介素-2(IL-2)。
38.根据权利要求30-37任一项所述的方法，其中所述细胞群与所述经修饰的721.221细胞接触至少14-21天。
39.根据权利要求34所述的方法，其中在所述细胞群接触至少14-21天后，所述自然杀伤(NK)细胞群或T细胞群增加至少5000至90000倍。
40.一种治疗癌症或者感染性疾病或免疫疾病的方法，包括向患有癌症或者感染性疾病或免疫疾病的受试者施用由根据权利要求30-39任一项所述的方法产生的自然杀伤(NK)细胞或T细胞，从而治疗癌症或者免疫疾病。
41.一种治疗癌症或者感染性疾病或免疫疾病的方法，包括：
使细胞群与根据权利要求1-10任一项所述的经修饰的721.221细胞群和至少一种细胞因子接触至少14-21天，从而产生自然杀伤(NK)细胞或T细胞；以及
向患有癌症或者感染性疾病或免疫疾病的受试者施用所述NK细胞或T细胞，从而治疗癌症或者免疫疾病。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述癌症或者免疫疾病包括自身免疫疾病、移植排斥、肉瘤、神经母细胞瘤、实体瘤或血癌。
43.根据权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述细胞群来自患有癌症或者免疫疾病的受试者。
44.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述感染性疾病包括人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、结核病(TB)或疟疾。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述血癌包括多发性骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述实体瘤包括淋巴瘤、乳腺癌、肝细胞癌(HCC)和胰腺癌。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述白血病为急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性髓系白血病(AML)。
48.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中所述淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。
49.根据权利要求41-48任一项所述的方法，其中所述细胞群包含CAR修饰的淋巴细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述CAR修饰的淋巴细胞包括CD19 CAR修饰的自然杀伤细胞。
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