KR20120036231A - 항암 면역 치료제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 림프구에 종양항원 특이 수용체와 생리활성물질 유전자를 동시에 발현되도록 하여 종양 부위에 항원 특이적 림프구가 특이적으로 침투하고 동시에, 예컨대 IL-2와 같은 면역물질을 국소적으로 전달함으로서 외부적으로 면역물질을 처리하지 않고 증식하여 생체 내 항암 효과를 보다 증진시킬 수 있으며, 이로써 우수한 림프구 생존능 및 면역 반응 유도 효과를 나타내며, 면역세포(NK 세포)의 종양부위내 침투를 유도시켜 효과적인 항암효과를 제공할 수 있다.

Description

항암 면역 치료제{Anticancer immunotherapeutic agent}
본 발명은 종양항원 특이 수용체 및 생리활성물질 유전자를 포함하는 림프구를 필요 부위에 주입함으로써, 종양항원 특이적 부위에 항원 특이적 림프구가 특이적으로 침투하고 동시에, 예컨대 IL-2와 같은 면역물질을 국소적으로 전달하여 NK 세포의 종양으로의 침투를 증가시키고, 외부적으로 면역물질을 처리하지 않고 증식하여 생체 내 항암 효과를 보다 증진시킬 수 있으며, 이로써 우수한 림프구 생존능 및 면역 반응 유도 효과를 갖는 항암 면역 치료제를 제공하고자 한다.
T 세포 입양면역치료법의 성공적인 임상결과는 앞으로 항종양 세포치료의 의학적 중요성을 뒷받침하고 있다. 일반적으로 입양면역치료법은 환자로부터 혈액을 채취하여 항원 특이적인 T 세포를 생산하여 다시 환자에게 주입해주는 방법으로, 최근에는 종양항원을 표적으로 하는 종양면역치료가 활발히 연구 개발되고 있지만, 의학적으로 상용화되기에는 많은 문제점이 있다.
임상 적용의 문제로는 종양에 대한 항원 특이 T 세포의 생산에 있어 개인차에 따른 재현성이 떨어지고, 항원 특이적인 T 세포가 시험관내에서 성공적으로 생성된다고 하여도 그 빈도수는 전체 세포의 1% 내외로 낮기 때문에 나머지 99%를 차지하는 T 세포의 생체 내 부작용에 대한 안전성이 고려 되어야 한다는 점이다.
T 세포를 이용한 면역치료법이 일반화가 되기 위한 새로운 접근법으로 T 세포 수용체 전이를 통한 입양면역 치료법이 개발되고 있다. 그러나 항원특이 TCR이 잘 규명되어 있지 않아 종양항원 특이 단일사슬항체(scFv)와 T 세포 수용체의 신호전달 부위인 CD28과 CD3z가 삽입된 융합면역수용체(CIR)를 사용한 방법이 연구되고 있다.
수용체 유전자 전이는 역전사 바이러스가 주로 사용되었으나 전이율이 낮고 바이러스 자체를 생산하기 위해 걸리는 시간과 비용, 삽입 할 수 있는 유전자의 수적 제한, 그리고 임상연구의 안전성 문제 등이 제기되고 있다. 최근 DNA를 대체하기 위해 TCR RNA 전이의 효용성을 규명한 시험관내 보고가 있었고 RNA의 일시적 발현이 생체 내에서도 동일한 항종양 효과 반응을 보이는 연구가 진행되었다.
한편, IL-2는 사이토카인 유전자 치료의 대표적인 물질이며 많은 연구를 통해 그 효과가 증명되었다. 그러나 전신 IL-2 치료에 따라 반응 부위로 인하여 혈관누출증후군을 비롯한 부작용이 문제가 되어왔다. 또한 치료에 사용되는 IL-2의 양을 비교하였을 때 국소적 IL-2 치료가 전신적 IL-2 치료보다 효율적이라는 보고도 있다.
본 발명은 종양 특이 수용체와 함께 IL-2 유전자, 수용성 TGF-베타 수용체 유전자와 같은 생리활성물질 유전자를 전이한 림프구를 이용한 입양면역 치료법을 제공함과 동시에, 종양의 국소 부위에 생리활성물질이 집중적으로 분비되도록 하여 전신 부작용을 최대한 줄이고, 림프구의 생존기간을 증가시켜 입양면역치료의 효과를 더욱 증대시키고자 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 종양 특이 수용체와 함께 IL-2 유전자, 수용성 TGF-베타 수용체와 같은 생리활성물질 유전자를 림프구에 전이하여 종양에 주입함으로써 상기 과제를 해결하였으며, 보다 상세하게는 DNA 또는 RNA 전이를 이용하여 제조된 항-Her-2/neu 특이융합면역수용체와 생리활성물질을 발현하는 림프구는, 국소적으로 분비되는 생리활성물질의 분비로 인하여 종양 부위에서 종양 특이 항원에 반응하는 융합면역수용체의 생체 내 항종양 효과를 보다 증진시킬 수 있으며, 이로써 우수한 림프구 생존능 및 면역 반응 유도 효과를 갖는 항암 면역 치료제를 제공하고자 한다.
본 발명의 항암 면역 치료제의 경우, 종양 부위 특이적 항종양 효과를 나타내 전신 부작용을 최소화할 수 있고, 림프구 생존이 지속되어 항암 효과를 지속시킬 수 있을 뿐만 아니라, NK 세포 등의 면역 반응을 유도하여 암의 예방 및 치료에 모두 사용될 수 있다는 장점을 갖는다.
도 1은 활성화된 인간말초혈액 림프구에서 RNA 전기천공에 의한 융합면역수용체(Chimeric Immune Receptor) 및 IL-2 발현을 나타낸 것으로, a)는 RNA의 전이 후 1일째에 mock-PBL, IL-2-PBL, CIR-PBL 및 CIR/IL-2-PBL에서 CIR 발현을 측정한 것이고, b)는 RNA의 전이 후 매일 CIR/IL-2-PBL 및 mock-PBL 에서 CIR 발현 발현을 측정한 것이고, c)는 RNA의 전이 후 1일째에 mock-PBL, IL-2-PBL, CIR-PBL 및 CIR/IL-2-PBL로부터 얻은 상층액에서 ELISA에 따른 IL-2 분비를 분석한 것이고, d)는 RNA의 전이 후 매일 CIR/IL-2-PBL로부터 얻은 상층액에서 IL-2 분비를 측정한 결과이고, e)는 mock-PBL, IL-2-PBL, CIR-PBL 및 CIR/IL-2-PBL과 SKOV3 세포와 공동 배양하여 IFN-γ 분비를 분석한 결과이다.
도 2는 in vitro에서 CIR 및/또는 IL-2 RNA가 전이된 림프구의 생존 기간을 나타낸 것으로, a)는 IL-2 없이 배양된 mock-PBL, IL-2-PBL, CIR-PBL 및 CIR/IL-2-PBL의 절대 세포수이고, b)는 아넥신 V 및 프로피디움 아이오다이드(PI)-양성 세포의 수이다.
도 3은 종양 특이 융합면역수용체(Chimeric Immune Receptor) 와 IL-2 RNA가 전이된 림프구를 주입한 동물 모델에서 주입된 림프구가 비장과 종양에 남아있는 비율을 CFSE 염색을 통해 도시한 것이다.
도 4는 종양 특이 융합면역수용체(Chimeric Immune Receptor) 와 IL-2 RNA를 동시에 또는 각각 동물 모델에 주입하여 각 그룹의 종양 생장 억제 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 종양 특이 융합면역수용체(Chimeric Immune Receptor) 및 IL-2 RNA가 전이된 림프구를 동물모델에 주입하여 종양(a) 및 비장(b) 부위에서의 자연살해세포를 측정한 것을 도시한 것이다.
도 6은 종양특이 융합면역수용체와 IL-2 RNA가 전이된 림프구를 주입하기 전, 동물모델의 자연살해세포를 없앤 뒤 림프구를 주입한 것과(b) 대조군(a)의 종양 부피의 증가 정도를 도시한 것이다.
본 발명은 항원 특이 수용체 및 생리활성물질 유전자를 포함하는 림프구를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 항원 특이 수용체가 종양항원 특이 수용체, 항원특이 T세포 수용체, 또는 항원 특이 T 림프구 등일 수 있으나, 이로 제한되지 않으며, 특히 항-Her-2/neu-특이 융합면역수용체를 사용할 수 있다.
본 발명에서, 생리활성물질 유전자로는 IL-2 유전자, 또는 TGF-베타 수용체 유전자 등을 사용할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에서, 생리활성물질 유전자는 IL-2 RNA일 수 있고, 상기 RNA는 전기천공법, 또는 리포좀을 사용하여 림프구로 전이될 수 있다.
본 발명은 종양 특이 융합면역수용체(Chimeric Immune Receptor) 및 생리활성물질 RNA가 전이된 림프구를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하며, 특히 림프구에 전이될 수 있는 종양 특이 융합면역수용체 RNA로는 항-Her-2/neu 융합면역수용체 등이 있으나 이로 한정되지 않는다.
또한, 도입되는 항원 특이 수용체의 종류에 따라 본 발명의 항암 치료제는 다양한 암의 치료 또는 면역접종, 바이러스 질환 치료 등에 사용될 수 있으며, 특히 Her-2/neu를 과발현하는 암, 예를 들어 난소암 등을 치료할 수 있다.
본 발명은 특히 항-Her-2/neu 특이 융합면역수용체 및 IL-2 RNA가 전이된 림프구를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 항원 특이 수용체 유전자 및 생리활성물질 유전자를 제공하는 단계; 및 상기 유전자를 림프구에 전이시키는 단계를 포함하는 림프구의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 종양 특이 융합면역수용체 및 생리활성물질 RNA가 도입된 림프구를 제조하는 공정을 포함하는, 항암 치료제의 제조방법을 제공한다.
보다 상세하게는, 종양 특이 융합면역수용체 RNA 및 생리활성물질 RNA를 제공하는 단계; 상기 RNA를 림프구에 전이시키는 단계를 포함하는 항암 치료제의 제조방법을 제공한다.
상기 종양 특이 융합면역수용체는 바람직하게는 항-Her-2/neu 융합면역수용체일 수 있다.
상기 생리활성물질 유전자는 IL-2 유전자, 또는 TGF-베타 수용체 유전자 등일 수 있다.
본 발명에서, 상기 RNA는 전기천공 (electroporation), 또는 리포좀 등의 방법으로 전이될 수 있다.
또한 본 발명은 종양 특이 융합면역수용체 및 생리활성물질 RNA가 도입된 림프구를 인간을 제외한 포유류에 투여하는 것을 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 치료적 유효량의 종양 특이 융합면역수용체 및 생리활성물질 RNA가 전이된 림프구를 종양을 가진 인간을 제외한 포유류에 투여함으로써 상기 종양의 성장을 억제하는 것을 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항원 특이적 수용체 유전자 및 생리활성물질 유전자가 전이된 림프구를 사용하여, 항원 특이적 림프구 특이적 부위에 생리활성물질이 국소적으로 발현되도록 하는 방법을 제공한다. 상기 생리활성물질 유전자로 IL-2 유전자, 또는 TGF-베타 수용체 유전자를 사용함으로써, 상기 림프구의 생존기간이 연장되고, 항원 특이적 림프구 특이적 부위에 국소 적용되도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 종양 특이 융합면역수용체 및 생리활성물질 RNA가 도입된 림프구를 포함하는 암 치료용 조성물은 종양 부위 특이적 항종양 효과를 나타내므로 전신 부작용을 최소화할 수 있고, 림프구 생존이 지속되어 항암 효과를 지속시킬 수 있을 뿐만 아니라, 면역 반응을 유도하여 암의 예방 및 치료에 모두 사용될 수 있다는 장점을 갖는다.
본 발명의 종양 특이 융합면역수용체 및 생리활성물질 RNA가 도입된 림프구를 포함하는 암 치료용 조성물은 비경구적으로, 예를 들어 혈관주사로 간편하게 투여될 수 있다. 투여 요법은 단일 투여 또는 다중 투여 스케줄일 수 있다. 암 치료용 조성물은 기타 면역조절제와 함께 투여될 수 있다. 이들 암 치료용 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제와 함께 본 발명의 림프구를 포함하는데, 이러한 담체는 그 자체로 조성물을 투여받는 개체에 유해한 반응을 일으키지 않는 임의의 담체인 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 통상적으로 희석제, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤, 에탄올 등을 포함할 수 있으며, 보조 물질, 예를 들어 습윤제, 유화제, pH 완충제 등이 조성물 중에 존재할 수 있다. 주사용으로 적합한 형태는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 수성용액 (수용성) 또는 분산액 및 멸균분말을 포함한다. 이들은 제조 조건하에서 안정해야 하고, 세균 또는 진균과 같은 미생물의 오염에 대항하여 보존되어야 한다. 미생물의 오염은 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 예방할 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사 조성물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 사용함으로써 가능할 수 있다. 전술한 용매 중에 필요량의 림프구와 앞에서 열거한 다양한 기타 성분을 결합시키고, 필요에 따라 림프구 등을 제외한 나머지 성분들, 예를 들면 PBS와 같은 완충용액을 여과 멸균함으로써 멸균 주사용액을 제조한다. 일반적으로, 기본적인 분산배지 및 전술한 것으로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균화 활성성분을 포함시킴으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사용액의 제조용 멸균분말의 경우, 바람직한 제조방법은 진공건조 및 동결건조 기법이다. 이러한 기법에 의해 활성성분, 및 전술한 이의 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 목적하는 성분의 분말을 얻는다.
본 발명의 작용을 어떤 식으로든 제한하지 않으면서, 본 발명에 따라 림프구를 전달하는 것은 면역반응을 유도하는데, 특히 NK 세포에 의한 면역 반응, 항원에 대한 세포독성 T-림프구의 반응을 유도하는데 유용하다. 상기 면역반응은 특이적 (T 세포 및/또는 B 세포) 및/또는 비특이적 면역반응일 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 인간, 특히 암환자에서 항원에 대한 면역반응을 일으키거나, 유도하거나, 또는 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 전술한 바와 같은 암 치료용 조성물 또는 림프구의 치료적 유효량을 암환자에 투여하는 것을 포함한다.
상기 면역반응은 NK 세포에 의한 면역 반응 및 세포독성 T-림프구 반응을 포함하는 것이 바람직하며, 본 발명의 세포독성 림프구 반응은 헬퍼 T 세포반응, 체액성 반응 또는 기타 특이적이거나 비특이적인 면역반응과 함께 또는 독립적으로 일어날 수 있다.
본 발명 조성물의 투여는, 질병 상태의 발병 또는 진행을 저해하거나, 중지시키거나, 지연시키거나, 예방하는 면역반응을 일으키거나, 유도하거나 또 다르게는 촉진한다.
조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사에 의해 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내로 이루어지거나, 또는 조직의 간극으로 전달된다. 조성물은 또한 병변으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 단일 용량 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다.
용어 '치료적 유효량'은 목적하는 면역반응을 적어도 부분적으로 달성하거나 또는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 이 양은 치료되어야 할 개체의 건강과 물리적 상태, 치료되어야 할 개체의 분류적 군, 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호의 정도, 면역 치료 제제, 의학적 상황의 평가 및 기타 관련 인자에 따라 달라진다. 이 양은 통상적인 시도를 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것으로 예상되며, 예를 들어 난소암 질환의 치료를 위해서 성인 60 ㎏을 기준으로 1회 투여당 2×106 내지 2×107 세포/주사의 양으로 투여될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
예비실험예 1. 세포 및 항체
인간 말초 혈액 림프구 (Human peripheral blood lymphocytes, PBLs)를 10% (v/v) FBS, 2 mM 글루타민, 페니실린(100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (10 ㎍/ml) (Invitrogen GIBCO)이 제공된 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다.
Her-2/Neu 항원을 발현하는 인간 난소암 세포라인 SKOV3을 10% (v/v) 우태아혈청(FBS), 2 mM 글루타민, 페니실린(100 U/ml), 및 스트렙토마이신(100 ug/ml) (Invitrogen GIBCO, Grand Island, NY)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 중에 두었다.
실험에 사용된 모노클로날 항체(mAbs)는 하기와 같다:
9E10 (mouse anti-cMyc FITC-conjugated) (Sigma, Saint Louis, MO); 마우스 항-마우스 Pan-NK (CD49b) PE-컨쥬게이티드 (eBioscience, San Diego, USA), 항-CD3 mAb (OKT3, ortho Biotech Inc., Raritan, NJ).
<실시예>
1. mRNA의 In vitro 트랜스크립션 (IVT)
CD28 및 CD3ζ의 세포내 부분과 연결된 항-Her-2/neu scFv (single chain variable fragment)를 함유하는 융합면역수용체(chimeric immune receptor, CIR)는 Dr. Philip K. Darcy (Peter MacCallum Cancer Centre, Australia)이 제공한 것을 사용하였다.
CIR 컨스트럭션을 백본의 시작 코돈에 가까운 T7 프로모터를 함유하는 pcDNA3.1 벡터 (Invitrogen)로 서브클로닝하였다. pcDNA3.1-IL-2는 인간 IL-2 cDNA와 결합된 발현 벡터이다. mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit (Ambion, Inc., Austin, TX, USA)를 사용하여 (제조업체 설명서에 의거하여 실험을 수행하였음), T7 RNA 폴리머라아제로 in vitro 트랜스크립션을 수행하였다. IVT 후, 페놀:클로로포름(시그마)를 사용하여 mRNA를 정제하고, 정제된 RNA를 RNase-free water로 4-5 mg/ml 분리하였다.
2. 프라이머리 인간 말초혈액림프구(primary human PBLs)의 RNA 전기천공
Baum C et al (Baum C, Kustikova O, Modlich U, Li Z, Fehse B. Mutagenesis and Oncogenesis by Chromosomal Insertion of Gene Transfer Vectors. Hum Gene Ther 2006; 17(3): 253-263)에 기재된 방법대로 인간 PBL에 형질도입(transduction)을 하였다.
Ficoll-Paque 밀도 원심분리기(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)를 사용하여 건강한 피검자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 분리하였다. 마이크로비드(Miltenyi, USA)를 사용하여 CD14+ 세포를 분리시키고(depleting) 인간 PBMC로부터 PBL을 분리하였다. CD14- PBL을 항-CD3 (ORTHOCLONE OKT3, 500 ng/ml; Ortho Biotech, Bridgewater, NJ) 및 재조합 인간 인터루킨-2 (IL-2, 600 IU/ml; eBioscience)로 3일간 활성화시켰다. 활성화된 PBL을 채취하고, mRNA를 함유하는 OPTI-MEM (Invitrogen, GIBCO)중에서 100㎕ 당 1×106 세포농도로 재분주하였다. 세포를 400V 에서 500μsec간 2-mm 큐벳으로 전기천공하였으며, 스퀘어 웨이브폼 생성기(square waveform generator, ECM 830 Electro Square Porator; BTX, a division of Genetronics, San Diego, CA)를 사용하였다. 전기천공된 PBL을 즉시 24-웰 조직 배양 플레이트 (2ml/well)에서 배양된 10% FBS를 함유하는 배지로 트랜스퍼하였다. 다음 날, 세포를 채취하여 유세포 분석(flow cytometry analysis) 또는 기능성 분석(functional assay)을 하는 데 사용하였다. PBL은 10% (v/v) FBS, 2mM 글루타민, 페니실린 (100U/ml) 및 스트렙토마이신 (100ug/ml; Invitrogen GIBCO)가 공급된 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다.
예비실험예 2. 사이토카인 측정
타겟 항원과 마주친 상태하에서의 형질도입된 PBL에 의한 사이토카인의 분비 정도를 ELISA(eBioscience)로 측정하였다.
각각의 RNA-형질도입된-PBL (1×106 cells/ml) (CIR/IL-2-PBL, CIR-PBL, IL-2-PBL, mock-PBL)을 Her-2/Neu 양성 세포, SKOV3와 함께 48-웰 배양 플레이트에서 6일간 37℃에서 배양하였다. 매일, 상등액을 채취하여 RNA 발현 PBL에 대하여 IFN-γ, IL-2를 측정하였다.
예비실험예 3. 아폽토시스 (세포사멸, apoptosis) 측정
FITC-컨쥬게이티드 아넥신-V 및 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI, BD PharMingen, San Diego, CA, USA)로 이중 염색하여 아폽토시스 정도를 측정하였다.
형질도입된 PBL을 24 웰 플레이트에 나누어 6일 동안 배양하였다. 매일, 24 웰 중 하나로부터 세포를 채취하여 아폽토시스 측정을 위해 염색하였다.
예비실험예 4. in vivo 트랙킹을 위한 CFSE 라벨링
RNA-형질도입된 PBL을 카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR)와 함께 37℃에서 10분간 배양하되, 최종 농도를 5 μM 로 하였다. 10% FBS가 공급된 냉 PBS로 세척하여 반응을 스톱시켰다. CFSE-표지된 RNA-도입-PBLs (2×106)를 마우스 (Balb/c nu/nu, Orient Bio, Korea)에 I.T. 주사하였다. 주사 후 하루째에(on a day after injection), 비장 및 암을 나일론 메쉬로 잘게 잘라 싱글-세포 서스펜젼으로 만들었다. 그 후, 세포 펠렛을 ACK 라이시스 버퍼로 재분주하여 적혈구를 용해시키고, 얼음에 10분간 재빨리 담갔다. 세포를 PBS로 워싱하고 즉시 파라포름알데히드로 고정시켰다 (최종농도 1%). 유세포 측정기로 세포를 측정하였다.
예비실험예 5. 누드 마우스 이종이식 모델 및 NK 세포의 제거
암컷 흉선이 결핍된 4-주령 누드 마우스(Balb/c nu/nu, Orient Bio, Korea)를 SPF 컨디션(specific pathogen-free conditions)에서 동물실험위원회(animal care committee)의 가이드라인에 따라 사육하였다. 모든 마우스의 귀에 태그를 부착하였고, 각 마우스의 종양 부피를 실험시간동안 모니터링하였다. 순응(acclimatization) 1주일 후, 마우스에 1×107 SKOV3 세포를 0.4-ml 싱글-세포 서스펜션 형태로 피하접종 하였다 (26-게이지 주사기 사용).
종양이 촉진할 수 있는 정도가 된 후, CIR 및 IL-2를 발현하는 2×106 PBL의 항암 효능을 평가하여, CIR, IL-2, mock-PBLs 및 PBS을 I.T. 주사한 경우와 비교하였다.
NK 세포 제거를 위해, 50㎕의 항아시알로-GM1 항체(antiasialo-GM1 antibody, Waco Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)를 종양 세포 주사 6일전에 i.v. 투여하고, 매주마다 총 4회 주사 하였다.
처치를 5일-간격으로 3회 수행하였으며, 매일 마우스의 종양 성장정도를 모니터링하였다. 처치 후, 종양 볼륨 (mm3)을 하기 공식에 의거하여 산출하였다:
(종양 폭 (mm) × 종양 길이 (mm) × 종양 높이 (mm)/2).
<통계학적 분석>
사이토카인 어세이의 경우 two-tailed Student's t-test로 통계분석하였고, 암 부피 측정 시에는 two-tailed Mann-Whitney nonparametric test로 통계분석하였다.
<실험예>
1. CIR 및 IL-2의 발현 및 기능
OKT3 및 IL-2로 활성화시킨 후 3일 후, 인간 PBL에 Her-2/neu 항원에 대항하는 CIR 및/또는 IL-2를 코딩하는 RNA를 전기천공하여 전이시켰다. 1일째에는 CIR RNA 또는 CIR 및 IL-2 RNA가 전기천공된 세포에서 CIR를 98% 이상 발현하는 것으로 나타났다 (도 1a 참조). mock-PBL 및 IL-2-PBL에서는 CIR를 발현하지 않았다.
또한, CIR/IL-2-PBL에서 CIR 발현 카이네틱스를 실험하였다 (도 1b). 10mg의 RNA로 전기천공한 결과, 1일째에 평균 형광 강도는 약 76.9이었다. 2일째에는 발현 강도가 약 1/3 감소하였다. 3일째에, 평균 형광 강도는 다시 전날 관찰된 것의 1/3이 감소하였다. 3일 후, 평균 형광 강도는 6일 동안 약 6-9로 유지되었다. 전기천공 후 1일째에, IL-2-PBL 및 CIR/IL-2-PBL는 높은 IL-2 발현을 나타냈다(25.7±1.7 및 24.8±2.8 ng/ml, **P=0.28)(도 1c). mock-PBL 및 CIR-PBL에서는 매우 낮은 IL-2 분비를 나타냈다.
도 1d는 CIR/IL-2-PBL에서의 IL-2 분비를 나타낸다. 1일째에 높은 정도의 IL-2 생성이 일어났다 (24.8±2.8 ng/ml). 플로우 사이토메트리에 의해 CIR 발현을 관찰한 결과, IL-2 분비능은 6일까지 계속 감소하였다(1.4±0.5 ng/ml).
Her-2/neu에 대한 CIR의 항원 특이 반응을 밝히기 위해, SKOV3 세포로 자극시킨 1일째에 IFN-γ 생성을 측정하였다 (도 1e).
CIR-PBL 및 CIR/IL-2-PBL은 mock-PBL (8.8±1.6 ng/ml) 보다 높은 IFN-γ 발현량을 나타냈다(52.8±2.4 및 73.8±5.4 ng/ml). IL-2-PBL는 또한 중간 정도의 IFN-γ 발현량을 나타냈다(34.8±0.9 ng/ml).
이러한 결과에 비추어, 활성화된 PBL에 RNA 전기천공을 함으로써 기능적으로 활성화된 CIR 및 IL-2가 성공적으로 발현됨을 알 수 있다.
2. IL-2 RNA 트랜스퍼에 의한 PBL의 지속적 생존
RNA 전기천공 후 각 그룹에서의 PBL의 수는 2일째까지 크게 변화되지 않았다. mock-PBL 및 CIR-PBL의 세포수의 경우 전기천공한 이후 유사한 수준으로 남아있었으나, IL-2-PBL 및 CIR/IL-2-PBL의 세포수는 2일째 이후부터 점차 증가하였다 (5일째에 각각 6.5-배 및 7-배) (도 2a).
아넥신-V 및 PI-염색을 사용한 아폽토시스 분석에서 (도 2b), mock-PBL 및 CIR-PBL 모두에서 아폽토시스 세포 비율은 점차적으로 증가하였다 (0일째에서 약 21%에서 5일 후 약 65%까지 증가함). 그러나, IL-2-PBL 및 CIR/IL-2-PBL에서는 전혀 증가하지 않았다.
IL-2 유전자가 RNA 형태로 전이된 경우 외생 IL-2를 배지에 첨가하였을 때와 유사한 효과가 나타나는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 보면, IL-2 유전자를 RNA 형태로 증식을 유도하고 아폽토시스를 저해하며, 활성화된 PBL의 생존을 지속시킴을 알 수 있다.
3. 주입된 PBL의 이동(Migration of infused PBLs)
종양 내 투입된 PBL의 분포를 측정하기 위하여, 비장 및 종양 중의 CFSE-라벨된 세포를 유세포 측정기로 분석하였다 (도 3 참조).
주입 후 1일째에, CIR/IL-2-PBL, CIR-PBL, IL-2-PBL 및 mock-PBL 각각에 대한 6.56 %, 4.84 %, 4 % 및 3.33 % CFSE 양성 세포를 종양 조직의 내부에서 검출하였다. 비장 CFSE+ 세포의 빈도가 종양 CFSE+ 세포의 빈도에 비하여 현저하게 낮았으며, CIR/IL-2-PBL의 경우 다른 그룹에 비하여 다소 증가하는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해, IL-2에 의해 종양 부위에 주입된 PBL의 CIR에 의한 트랩핑이 현저하게 증진됨을 알 수 있다.
4. 누드 마우스 모델에서의 항암 효과
총 1×107 개의 SKOV3 세포를 흉선이 결핍된 누드 마우스에 피하 주사하고, 종양 볼륨이 50-100 mm3이 될 때 처치를 4주 동안 매주 수행하였다. 주입 30일 후, CIR-PBL, IL-2-PBL 또는 CIR/IL-2-PBL를 투여한 종양-베어링 마우스 (tumor-bearing mice)의 경우 PBS 및 mock-PBL 처치한 마우스에 비하여 종양 성장이 현저하게 늦추어지는 것으로 나타났다 (도 4 참조). mock-PBL 처치한 경우의 종양 볼륨이 PBS 대조군에 비하여 작기는 하였으나, CIR/IL-2-PBL 처치한 그룹의 경우 mock-PBL 처치 그룹에 비하여 현저하게 종양을 저해하는 것으로 나타났다 (3.14배, P=0.0068). CIR/IL-2-PBL 또는 IL-2-PBL 처치한 마우스의 경우 CIR-PBL 처치한 마우스의 종양(527mm3)보다 종양 볼륨이 더 작았다 (2-배 또는 1.7-배).
IL-2-PBL 처치군의 경우 CIR/IL-2-PBL 처치군과 유사한 수준의 저해도를 보였다 (317 vs 263mm3; P=0.1230).
이러한 결과를 토대로, IL-2 유전자를 CIR-PBL로 전이시키는 경우 항암 효과를 증진시킬 수 있음을 알 수 있다.
5. 종양 및 비장 중 NK 세포 파퓰레이션
IL-2는 NK 세포의 활성화 및 T 세포 증식에 관여하는 것으로 알려져 있으므로, 종양 부위 및 비장에서 마우스 Pan-NK 마커, CD49b [DX5]를 발현하는 NK 세포의 수를 측정해 보았다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 종양 침윤성 NK 세포 수는 다른 그룹에 비해 IL-2-PBL 및 CIR/IL-2-PBL 그룹(20.18±1.71 % 및 20.31±2.7 %)에서 더 높았다.
비록 다른 그룹에 비하여 IL-2-PBL 및 CIR/IL-2-PBL 그룹에서 비장 중 NK 세포의 수가 다소 증가하였으나, 그 증가 수준은 미미하였다(도 5b).
이러한 결과로부터 주입된 PBL로부터 분비되는 IL-2가 전신 효과를 나타내기 보다는 종양 부위에 머무르면서 파라크라인 효과를 나타낸다는 점을 알 수 있다.
6. NK 세포 결핍 모델에서의 항암 효과 측정
NK 세포 결핍 모델 및 비결핍 모델에서의 항암 효과를 측정해 보았다 (도 6 참조).
NK 세포 비결핍 모델에서는, IL-2-PBL 및 CIR/IL-2-PBL의 경우 CIR-PBL에 비하여 항암 효과가 현저하게 높은 것으로 나타났으며 (1.42-배 및 1.63-배), IL-2-PBL의 경우 CIR/IL-2-PBL와 유사한 수준이었다 (287.5mm3 및 250.3mm3, P=0.14).
그러나 NK 결핍 모델에서는 IL-2-PBL의 경우 항암 효과가 CIR/IL-2-PBL에 비하여 현저하게 낮은 것으로 나타났으며 (1.54-배, P=0.045), CIR PBL과 유사한 수준이었다.
IL-2-PBL의 항암 효과는 NK 세포 결핍에 의하여 CIR-PBL과 유사한 수준으로 떨어진다는 점을 알 수 있으며, 상기 결과를 종합해 보면 IL-2를 RNA 형태로 CIR-PBL로 전이시킴으로써, NK 세포가 활성화되어 종양 부위로 침윤되며, 주입된 PBL의 in vivo 생존을 지속시킬 수 있다는 점을 알 수 있다.

Claims (15)

  1. 항원 특이 수용체 및 생리활성물질 유전자를 포함하는 림프구를 유효성분으로 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    항원 특이 수용체가 종양항원 특이 수용체, 항원특이 T 세포 수용체 및 항원 특이 T 림프구로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서
    항원 특이 수용체가 항-Her-2/neu-특이 융합면역수용체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    생리활성물질 유전자가 IL-2 유전자 및 수용성 TGF-베타 수용체 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    생리활성물질 유전자가 IL-2 유전자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    림프구는 말초혈액의 림프구에서 유래한 세포로서, 단기간 활성화시킨 T림프구, 또는 시험관내에서 대량 증폭된T 림프구인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성물질 유전자는 생리활성물질의 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 RNA는 전기천공법 또는 리포좀으로 림프구로 전이된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 종양 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 항원 특이 수용체 유전자 및 생리활성물질 유전자를 제공하는 단계; 및
    상기 유전자를 림프구에 전이시키는 단계를 포함하는 림프구의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    생리활성물질 유전자가 IL-2 유전자 및 수용성 TGF-베타 수용체 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 림프구의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 유전자는 RNA인 것을 특징으로 하는 림프구의 제조방법.
  13. 제10항에 있어서
    상기 RNA는 전기천공 (electroporation), 또는 리포좀 방법으로 전이되는 것을 특징으로 하는 림프구의 제조방법.
  14. 항원 특이적 수용체 유전자 및 생리활성물질 유전자가 전이된 림프구를 사용하여, 항원 특이적 림프구 특이적 부위에 생리활성물질이 국소적으로 발현되도록 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 생리활성물질 유전자로 IL-2 유전자를 사용함으로써, 상기 림프구의 생존기간이 연장되고, 항원 특이적 림프구 특이적 부위에 국소 적용되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
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