WO2021071127A1 - 엑소좀 pd-l1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물 - Google Patents

엑소좀 pd-l1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물 Download PDF

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정인성
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    • G01N2333/55—IL-2

Definitions

  • the present invention is a composition for enhancing anticancer effect comprising an inhibitor for the expression of exosomes PD-L1 as an active ingredient, specifically, anticancer effect using a new mechanism in which IL-2 inhibits the expression of exosomes PD-L1 in cancer cells It's about an enhancer.
  • Melanoma is an aggressive skin cancer with an ever-increasing incidence worldwide. The disease primarily affects the white population of both sexes, with high levels of metastasis, mortality and recurrence. In the past few years, several therapies have been approved by the Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA). Depending on the characteristics of the tumor, the therapeutic agent may be surgical resection, chemotherapy, radiation therapy, photodynamic therapy (PDT), immunotherapy or targeted therapy.
  • FDA Food and Drug Administration
  • EMA European Medicines Agency
  • Targeted therapy consisting of BRAF protein inhibitors such as vemurafenib and dabrafenib, or MEK inhibitors typified by trametinib, and approval of immune checkpoint inhibitors such as nivolumab, ipilimumab, pembrolizumab were introduced.
  • BRAF protein inhibitors such as vemurafenib and dabrafenib
  • MEK inhibitors typified by trametinib
  • immune checkpoint inhibitors such as nivolumab, ipilimumab, pembrolizumab
  • the cytokine IL-2 has been widely used as a single agent for host immune regulation in cancer therapy.
  • IL-2 has been most successfully treated as a biological response modifier in melanoma. It promotes T cell activation, proliferation and cytotoxic activity of CD8+ T cells and NK cells, and is an important factor regulating the T cell differentiation program in response to antigens.
  • IL-2 the most studied cytokine since its discovery about 38 years ago, has a well-known mechanism of immune cells, but the mechanisms of melanoma and IL-2 are unclear.
  • Small extracellular vesicles which are membrane-bound vesicles with a diameter of 40 to 150 nm, include exosomes and microvesicles, and are present in almost all biological fluids. It contains functional biomolecules (i.e., proteins, lipids, RNA and DNA) that can move horizontally to the recipient cell. After fusion with the plasma membrane, they are released into the extracellular space in most cell types.
  • Tumor cells can evade the immune system by many strategies. Among them, they induce immune escape by inducing the surface expression of programmed death-ligand 1 (PD-L1), which communicates with programmed death 1 (PD-1). Exosomal PD-L1 can interact with PD-1 and help cancer survival by inhibiting the activation of T cells. It is clinically important because it affects the progression of cancer.
  • Tumor-derived extracellular vesicles play an important role in making more aggressive and metastatic in intracellular signaling and epithelial-mesenchymal metastasis (EMT). Many factors that regulate the secretion of extracellular endoplasmic reticulum are already known. Among these, IL-2 and IL-12 may play an important role through the regulation of extracellular vesicle formation and secretion in T cells. However, studies on the secretion regulator of tumor-derived exosomes PD-L1 are not clear.
  • Immunotherapy is used to treat metastatic melanoma based on the fact that the immune response is related to the onset of melanoma, but the treatment approved by the US Food and Drug Administration (FDA) is interferon-alpha (for stage 3 treatment). And interleukin-2 (for stage IV treatment).
  • FDA US Food and Drug Administration
  • dacarbazine (DTIC) and cisplatin are used alone or as a combination therapy.
  • DTIC dacarbazine
  • cisplatin a combination therapy.
  • new treatments known as'targeted therapy' or'cell therapy' are being developed, giving hope. Although it is used, it is currently in the stage just before clinical trials or introduction in Korea.
  • the present invention suggests that IL-2, which is used as a stage 4 treatment for melanoma, inhibits extracellular vesicle secretion and PD-L1 expression in a MAPK signaling-dependent manner in melanoma cells, thereby enabling more effective anticancer treatment.
  • the present invention is a composition for enhancing anticancer effect comprising an inhibitor for the expression of exosomes PD-L1 as an active ingredient, specifically, anticancer effect using a new mechanism in which IL-2 inhibits the expression of exosomes PD-L1 in cancer cells
  • IL-2 inhibits the expression of exosomes PD-L1 in cancer cells
  • the enhancer by confirming that the anticancer effect of inhibiting the secretion of exosomes derived from cancer cells and inhibiting the expression of PD-L1, which induces immune evasion of T cells, is enhanced when IL-2 is treated on cancer cells, IL -2, the expression promoter or activator thereof is provided as an inhibitor for the expression of exosomes PD-L1 as an anticancer effect enhancing agent capable of promoting the prevention or treatment of cancer diseases.
  • the present invention provides a composition for enhancing anticancer effect comprising an inhibitor for the expression of exosomes PD-L1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the composition for enhancing the anticancer effect as an active ingredient.
  • the present invention is a first step of treating a candidate drug in a sample isolated from a subject suspected of cancer disease; A second step of measuring the expression or activity level of IL-2 in the sample treated with the candidate drug; And a third step of selecting a candidate drug that increases the expression or activity level of IL-2 compared to a control sample; and an inhibitor screening method for secretion of exosomes derived from cancer cells and expression of PD-L1 is provided.
  • the present invention provides a method for inhibiting the secretion of exosomes derived from cancer cells and the expression of PD-L1 comprising administering IL-2, an agent for promoting its expression or an activator thereof to a subject.
  • the present invention confirms that when IL-2 is treated with cancer cells, the secretion of exosomes derived from cancer cells is suppressed, and the anticancer effect of suppressing the expression of PD-L1, which induces immune evasion of T cells, is enhanced.
  • the expression promoter or activator thereof may be provided as a novel anticancer effect enhancing agent capable of promoting the prevention or treatment of cancer diseases.
  • 5 is a result of confirming the decrease in the amount of exosomes and the expression of Rab27a secreted from melanoma cells by IL-2.
  • Figure 8 confirmed the apoptosis of melanoma in co-culture of melanoma cells treated with IL-2 in cytotoxic T cells.
  • FIG. 9 confirms the apoptosis of melanoma in co-culture when the subsignal of melanoma cells treated with IL-2 was blocked in cytotoxic T cells.
  • 11 is a result of confirming the decrease in PD-L1 expression by IL-2 in a melanoma transplanted mouse model.
  • the numerical range includes the numerical values defined in the above range. All maximum numerical limits given throughout this specification include all lower numerical limits as if the lower numerical limits were expressly written. All minimum numerical limits given throughout this specification include all higher numerical limits as if the higher numerical limits were expressly written. All numerical limits given throughout this specification will include all better numerical ranges within the wider numerical range, as if the narrower numerical limits were expressly written.
  • the inventors of the present invention confirmed that when IL-2 was treated on melanoma cells, the secretion of exosomes derived from cancer cells was suppressed, and the expression of PD-L1, which induces immune evasion of T cells, was suppressed.
  • the present invention was completed by discovering a new mechanism for enhancing the anticancer effect by acting directly.
  • the present invention provides a composition for enhancing anticancer effect comprising an inhibitor for the expression of exosomes PD-L1 as an active ingredient.
  • the inhibitor is IL-2, an expression promoter or activator thereof, and the IL-2 expression promoter or activator may be selected from the group consisting of compounds, peptides, aptamers, and antibodies that specifically bind to IL-2 protein. However, it should be stated that it is not limited thereto.
  • the IL-2 an expression promoter or activator thereof, may reduce the secretion of exosomes derived from cancer cells and the expression of PD-L1, thereby suppressing immune evasion and increasing anticancer effects.
  • the cancer is melanoma, skin cancer, lung cancer, liver cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, bone cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hawkins' disease, Esophageal cancer, small intestine cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, anal muscle cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney Or it may be selected from the group consisting of ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, and pituitary adenoma, but is not limited thereto.
  • composition for enhancing anticancer effect may be administered in combination with one or more anticancer agents.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the composition for enhancing the anticancer effect as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • compositions of the present invention can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to a conventional method. .
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • external preparations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • external preparations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • external preparations such as fillers, weight agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are commonly used.
  • Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders
  • Such a solid preparation may be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc. in addition to the active ingredient.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. It can be prepared by adding various excipients, such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives, and the like, in addition to oral liquids and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and tasks.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like may be used.
  • a base for suppositories witepsol, macrosol, Tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like can be used.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the form of the drug, and the time, but may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the daily dosage of the composition is preferably It is 0.001 mg/kg to 50 mg/kg, and it can be administered once to several times a day, if necessary.
  • the present invention is a first step of treating a candidate drug in a sample isolated from a subject suspected of cancer disease; A second step of measuring the expression or activity level of IL-2 in the sample treated with the candidate drug; And a third step of selecting a candidate drug that increases the expression or activity level of the IL-2 compared to a control sample. It provides a method for screening inhibitors for secretion of exosomes and PD-L1 expression derived from cancer cells comprising a.
  • the expression or activity level of IL-2 in the second step is reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and radioimmunoassay. ), immunohistochemistry, microarray, western blotting, and flow cytometry (FACS).
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • radioimmunoassay radioimmunoassay.
  • immunohistochemistry microarray
  • western blotting and flow cytometry
  • the present invention provides a method for secreting cancer cells-derived exosomes and inhibiting PD-L1 expression comprising administering IL-2, an agent for promoting its expression or an activator thereof to a subject.
  • Example 1 Analysis of PD-L1 expression in melanoma cells using real-time polymerase chain reaction
  • mRNA extraction kit # 9767; TaKaRa
  • concentration of mRNA was measured using a nanodrop (DS-11 Series Spectrophotometer; DeNovix). Then, after synthesizing cDNA (SuperScript III First-Strand Synthesis System, Ref.
  • mouse PD-L1 primary set: Forward: AGT TCC CAA AAC ATG AGG AT (SEQ ID NO: 1), Reverse: CAC GTA CAA GTC CTT TGG AG (SEQ ID NO: 2)
  • human PD-L1 primary set: Forward: GGT CAT CCC AGA ACT ACC TC (SEQ ID NO: 3)
  • Reverse The gene expression level of ACG GAA GAT GAA TGT CAG TG (SEQ ID NO: 4) was analyzed.
  • Control melanoma cells were inoculated at a density of about 2 ⁇ 10 6 cells/well, and cultured in DMEM medium to which fetal calf serum was not added for 24 hours. Subsequently, in order to separate exosomes, each supernatant obtained from each cell was continuously centrifuged at 300 xg, 2500 xg, and 10,000 xg. Then, the supernatant was filtered through a 0.2 ⁇ m syringe filter and centrifuged at 120,000 xg. The exosome pellet was resuspended in PBS and centrifuged again at 120,000 xg. The purified exosome pellet was resuspended in PBS or 1X cell lysis buffer for the next experiment.
  • Example 4 Analysis of exosomes derived from melanoma cells using nanoparticle tracking
  • Melanoma cells (B16F10: 5 X 10 4 cells) were treated with IL-2 at a concentration of 10 ⁇ g/ml and incubated for 48 hours, and then the size and concentration of exosomes derived from the culture supernatant were determined by fast video capture and particles. Measurements were made using a Nanosight LM10 (Malvern Instruments) equipped with tracking software.
  • Example 5 Analysis of exosomes derived from melanoma cells using Western blot
  • PD-L1 programmed death ligand 1
  • FIG. 4(A) it was confirmed by Western blot that the expression of exosomal PD-L1 was significantly reduced in melanoma treated with IL-2 compared to the control group, and flow cytometry was performed as shown in FIG. 4(B). It was confirmed by re-validation using.
  • Melanoma cells were inoculated into a 96-well plate at a density of about 5 ⁇ 10 3 cells/well, and melanoma cells pretreated with IL-2 were used as a control. After 48 hours of incubation, the cells were cultured with different ratios of CTLL-2 cells (1:1 to 1:10). At the end of the culture, MTS reagent was added to each well and incubated at 37°C for 2 hours. After removing the MTS containing the supernatant of each well, the absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader.
  • Example 7 Analysis of the decrease in PD-L1 expression of IL-2 in a melanoma transplanted mouse model
  • B16F10 mouse melanoma cells 1 X 10 6 were injected subcutaneously into the right flank of balb/c mice. After 10 days from the start of the experiment, PBS, rhIL-2 (50,000 IU/mouse) was injected directly into the cancer tissues daily for 6 days. Thereafter, cancer tissues (long axis * short axis 2 * 0.52) of mice were measured and compared once every 2 days using an engineering digital caliper.
  • Example 8 Analysis of the regulation of PD-L1 expression in cancer of IL-2 in a melanoma transplanted mouse model

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Abstract

본 발명은 IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 암세포에 IL-2를 처리 시, 암세포 유래 엑소좀 분비가 억제되고, T 세포의 면역 회피를 유도하는 PD-L1의 발현이 억제되어 항암 효과가 증진되는 것을 확인하였으며, IL-2가 세포독성 T 세포를 활성화시켜 면역 항암 효과를 나타내는 종래 기술과는 달리, IL-2가 암세포에 직접적으로 항암 효과를 나타내는 것을 확인한 바, IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

엑소좀 PD-L1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물
본 발명은 엑소좀 PD-L1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물로, 구체적으로 IL-2가 암세포의 엑소좀 PD-L1의 발현을 억제하는 새로운 기전을 이용한 항암 효과 증진제에 관한 것이다.
흑색종은 전 세계적으로 발병률이 지속적으로 증가하는 공격적인 피부암이다. 이 질환은 전 이율, 치사 및 재발 수준이 높은 두 성별의 백인 인구에 주로 영향을 미친다. 지난 몇 년간 FDA (미국 식품 의약품 안전청)와 EMA (유럽 의약품 청)에서 여러 요법을 승인했다. 종양의 특징에 따라, 치료제는 외과적 절제술, 화학 요법, 방사선 요법, 광 역학 요법 (PDT), 면역 요법 또는 표적 요법 일 수 있다. 베무라페닙 및 다브라페닙과 같은 BRAF 단백질 억제제, 또는 트라메티닙으로 대표되는 MEK 억제제로 구성되는 표적 요법, 및 니볼루맙, 이필리무맙, 펨브롤리주맙과 같은 면역 체크 포인트 억제제의 승인이 도입되었다. 또한 사이토 카인 IL-2는 암 요법에서 숙주의 면역 조절을 위한 단일 작용제로서 광범위하게 사용되어왔다.
IL-2는 흑색종에서 생물학적 반응 조절제로 가장 성공적으로 치료되었다. 그것은 T 세포 활성화, 증식 및 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 세포 독성 활성을 촉진하고 항원에 반응하여 T 세포 분화 프로그램을 조절하는 중요한 인자이다. 약 38년 전에 발견된 이후 가장 많이 연구된 사이토카인인 IL-2는 면역 세포의 기전이 잘 알려져 있지만 흑색종과 IL-2의 기전은 불분명하다.
직경이 40~150 nm 인 막-결합 소포 인 세포외 소포체(Small extracellular vesicles; sEV)는 엑소좀(exosome), 미세소포(microvesicle) 등을 포함하며, 거의 모든 생물학적 유체에 존재한다. 여기에는 수용 세포로 수평으로 이동할 수 있는 기능적 생체 분자 (즉, 단백질, 지질, RNA 및 DNA)가 포함되어 있다. 이들은 원형질막과 융합된 후 대부분의 세포 유형에서 세포 외 공간으로 방출된다.
종양 세포는 많은 전략에 의해 면역계를 피할 수 있다. 그 중에서, 이들은 프로그램 된 사멸 1(PD-1)과 통신하는 프로그램 된 사멸-리간드 1(PD-L1)의 표면 발현을 유도함으로써 면역 탈출을 유도한다. 엑소좀 PD-L1(Exosomal PD-L1)은 PD-1과 상호 작용할 수 있고 T 세포의 활성화를 억제하여 암 생존을 도울 수 있다. 암의 진행에 영향을 미치기 때문에 임상 적으로 중요하다. 종양-유래 세포외 소포체는 세포 내 신호 전달 및 상피-중간엽 전이 (EMT)에서 더 공격적이고 전이성을 만드는 데 중요한 역할을 한다. 세포외 소포체 분비를 조절하는 많은 요인들이 이미 알려져 있다. 이들 중 IL-2 및 IL-12는 T 세포에서 세포외 소포체 형성 및 분비의 조절을 통해 중요한 역할을 할 수 있다. 그러나 종양 유래 엑소좀 PD-L1(Exosomal PD-L1)의 분비 조절 인자에 관한 연구는 명확하지 않다.
한편, 흑색종의 치료로는 수술 외에도 면역치료(인터페론), 항암치료, 방사선 치료와 최근 도입 단계에 있는 표적치료가 있으며, 최근 각광받고 있는 면역요법이 있다. 면역요법은 면역반응이 흑색종의 발병에 관련이 있다는 사실을 근거로 전이성 흑색종 치료에 이용되는데 현재까지 미국식품의약군(FDA)에서 승인을 받은 치료로는 인터페론-알파(3기 치료용)와 인터루킨-2(4기 치료용)가 있다.
항암요법제로는 다카바진(DTIC)과 시스플라틴 등이 단독 또는 복합요법으로 사용되고 있으며, 최근들어 ‘표적치료’ 또는 ‘세포치료’로 알려진 새로운 치료제들이 개발되고 있어 희망을 주고 있으며 속속 FDA 승인을 얻어 점차 사용되는 추세이지만 국내에서는 현재 임상시험 또는 도입 직전 단계이다.
본 발명은 흑색종의 4기 치료제로 사용되고 있는 IL-2가 흑색종 세포에 있어 MAPK signaling 의존적으로 세포외 소포체 분비 및 PD-L1 발현을 억제시켜 보다 효과적인 항암치료가 가능함을 제시한다.
본 발명은 엑소좀 PD-L1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물로, 구체적으로 IL-2가 암세포의 엑소좀 PD-L1의 발현을 억제하는 새로운 기전을 이용한 항암 효과 증진제에 관한 것으로, IL-2를 암세포에 처리하였을 때에 암세포 유래의 엑소좀 분비가 억제되고, T 세포의 면역 회피를 유도하는 PD-L1의 발현이 억제되는 항암효과가 증진되는 것을 확인함으로써, IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제를 엑소좀 PD-L1의 발현에 대한 억제제로써 암 질환의 예방 또는 치료를 증진할 수 있는 항암 효과 증진용 제제로 제공하는 것이다.
본 발명은 엑소좀 PD-L1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항암 효과 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 암 질환이 의심되는 대상체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 제1단계; 상기 후보 약물이 처리된 시료에서 IL-2의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제2단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 IL-2의 발현 또는 활성 수준을 증가시키는 후보 약물을 선별하는 제3단계;를 포함하는 암세포 유래의 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현에 대한 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암세포 유래의 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 IL-2를 암세포에 처리하였을 때에 암세포 유래의 엑소좀 분비가 억제되고, T 세포의 면역 회피를 유도하는 PD-L1의 발현이 억제되는 항암효과가 증진되는 것을 확인함으로써, IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제를 엑소좀 PD-L1의 발현에 대한 억제제로써 암 질환의 예방 또는 치료를 증진할 수 있는 새로운 항암 효과 증진용 제제로 제공할 수 있다.
도 1은 IL-2를 흑색종 세포에 직접 처리하였을 때, 발현하는 PD-L1을 확인한 결과이다.
도 2는 IL-2를 다양한 흑색종 세포에 직접 처리하였을 때, 발현하는 PD-L1을 확인한 결과이다.
도 3은 엑소좀을 투과 전자현미경으로 획득한 이미지를 나타낸 것이다
도 4는 IL-2에 의해 흑색종 세포에서 엑소좀 PD-L1의 발현 감소를 확인한 결과이다.
도 5는 IL-2에 의해 흑색종 세포에서 분비된 엑소좀의 양 및 Rab27a의 발현 감소를 확인한 결과이다.
도 6은 IL-2에 의해 감소하는 PD-L1발현의 기전을 확인한 결과이다.
도 7은 IL-2 수용기에 따른 다양한 암 세포에서 PD-L1과 Rab27a의 발현 변화를 확인하였다.
도 8는 세포독성 T 세포에서 IL-2로 처리된 흑색종 세포의 공동배양에서 흑색종의 세포사멸을 확인하였다.
도 9는 세포독성 T 세포에서 IL-2로 처리된 흑색종 세포의 하위신호를 저지하였을 때, 공동배양에서 흑색종의 세포사멸을 확인하였다.
도 10은 흑색종 이식 마우스 모델에서 암 성장을 확인한 결과이다.
도 11은 흑색종 이식 마우스 모델에서 IL-2에 의한 PD-L1발현 감소를 확인한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 흑색종 세포에 IL-2 처리 시, 암세포 유래 엑소좀 분비가 억제되고, T 세포의 면역 회피를 유도하는 PD-L1의 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, IL-2가 암세포에 직접적으로 작용하여 항암 효과를 증진시키는 새로운 기전을 발견하며 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 엑소좀 PD-L1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물을 제공한다.
상기 억제제는 IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제이고, 상기 IL-2 발현 촉진제 또는 활성화제는 IL-2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제는 암세포 유래 엑소좀 분비 및 PD-L1의 발현을 감소시켜 면역 회피를 억제하고 항암 효과를 증대시킬 수 있다.
상기 암은 흑색종, 피부암, 폐암, 간암, 위암, 췌장암, 골암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병, 식도암, 소장암, 대장암, 결장암, 직장암, 항문부근암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 항암 효과 증진용 조성물은 하나 이상의 항암제와 병용 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항암 효과 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 암 질환이 의심되는 대상체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 제1단계; 상기 후보 약물이 처리된 시료에서 IL-2의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제2단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 IL-2의 발현 또는 활성 수준을 증가시키는 후보 약물을 선별하는 제3단계; 를 포함하는 암세포 유래의 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현에 대한 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 제2단계의 IL-2의 발현 또는 활성 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석(radioimmunoassay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 마이크로어레이(microarray), 웨스턴 블랏(western blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암세포 유래 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현 억제 방법을 제공한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 흑색종 세포의 PD-L1 발현 분석
흑색종 세포와 IL-2 전처리 된 흑색종 세포로부터 mRNA (mRNA extraction kit, # 9767; TaKaRa)를 추출한 뒤, nanodrop (DS-11 Series Spectrophotometer; DeNovix)을 이용하여 mRNA의 농도를 측정하였다. 이후 100 ng의 mRNA로 cDNA (SuperScript III First-Strand Synthesis System, Ref. 18080-051; invitrogen)를 합성한 후, 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하여 mouse PD-L1(프라이머 세트: Forward: AGT TCC CAA AAC ATG AGG AT(서열번호 1), Reverse: CAC GTA CAA GTC CTT TGG AG(서열번호 2))와 human PD-L1(프라이머 세트: Forward: GGT CAT CCC AGA ACT ACC TC(서열번호 3), Reverse: ACG GAA GAT GAA TGT CAG TG(서열번호 4))의 유전자 발현 수준을 분석하였다.
그 결과, 도 1(A), 도 2(A)와 같이, 대조군 대비 IL-2 전처리된 흑색종 세포에서 PD-L1의 유전자 발현이 약 50% 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 2: 엑소좀 정제
대조군 흑색종세포를 약 2 X 106 세포/웰 밀도로 접종하고, 우태아혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지에서 24 시간 배양하였다. 이후 엑소좀을 분리하기 위해, 각 세포에서 얻은 각 상등액을 300 x g, 2500 x g, 10,000 x g로 연속 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 0.2 μm 주사기 필터로 여과하고, 120,000 x g에서 원심 분리하였다. 엑소좀 펠릿을 PBS에 재현탁하고 다시 120,000 x g에서 원심 분리하였다. 정제된 엑소좀 펠릿은 다음 실험을 위해 PBS 또는 1X 세포 용해 완충액에 재현탁하였다.
실시예 3: 정제된 엑소좀의 특성 분석
전자현미경을 사용하여 정제된 엑소좀의 특성을 확인하기 위해, PBS에 현탁한 정제된 엑소좀을 포름바 탄소 코팅 니켈 그리드 (formvar carbon-coated nickel grids) 위에 떨어뜨렸다. 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)로 염색한 후, 그리드를 공기 건조시키고 HF-3300 (Hitachi) 투과 전자현미경을 사용하여 직경 구조를 가시화하였다.
그 결과, 도 3(A)과 같이, 50~150nm 크기의 엑소좀을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 나노입자 추적을 이용한 흑색종 세포 유래 엑소좀 분석
흑색종 세포(B16F10: 5 X 104 세포)에 IL-2를 10 μg/ml 농도로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, 배양 상층액으로부터 유래되는 엑소좀의 크기 및 농도를 fast video capture 및 입자 추적 소프트웨어가 장착된 Nanosight LM10(Malvern Instruments)을 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3(B)와 같이, 대조군 대비 IL-2를 직접 처리한 흑색종 세포에서 엑소좀의 수가 감소하는 것을 나노입자 추적 분석으로 확인하였다.
실시예 5: 웨스턴 블랏을 이용한 흑색종 세포 유래 엑소좀 분석
상기 흑색 종 세포 유래 엑소좀 수의 감소를 재검증하기 위해, 엑소좀 분비 및 발현에 관여하는 Rab 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 세포질 또는 엑소좀 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 이후, 각각의 일차 항체(ab18211; abcam/Rab5, ab50533; abcam/Rab7, ab55667; abcam/Rab 27a, # 4970; Cell signaling/β-actin, ab10931; abcam/PD-L1)와 배양하고, HRP가 접합된 이차 항체로 배양하였다. Enhanced chemiluminescence(ECL) 검출 시약(# 34095; Thermo Scientific, # RPN2209; GE Healthcare)을 사용하여 이미지를 시각화하고 ECL 하이퍼 필름(AGFA, Morstel)을 사용하여 정량화하였다.
그 결과, 도 5(C)와 같이, 대조군 대비 IL-2를 처리한 흑색 종 세포에서 Rab 27a의 단백질 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
더불어, 흑색종에서 IL-2의 효능을 평가하기 위해, 암세포의 면역회피에 가장 중요하다고 알려져 있는 PD-L1(programmed death ligand 1) 단백질의 발현을 측정하였다.
그 결과, 도 1(B), 도 2(B)와 같이, 대조군 대비 IL-2를 처리한 흑색종 세포에서 PD-L1의 단백질 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 이는 도 2(D)와 같이 면역염색법을 통해 재검증하였다.
다음으로 IL-2에 의한 흑색종 유래 exosomal PD-L1 발현 조절 여부를 평가하기 위하여 웨스턴 블랏과 유세포 분석법을 수행하였다.
그 결과, 도 4(A)와 같이, 대조군 대비 IL-2를 처리한 흑색종에서 exosomal PD-L1의 발현이 현저하게 감소하는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였으며, 도 4(B)와 같이 유세포 분석법을 이용하여 재검증하여 확인하였다.
실시예 6: 공동 배양 분석
IL-2에 의한 흑색종 세포의 PD-L1 감소와 더불어 세포독성 T 세포의 활성 증가에 의한 항암 효과를 증명하기 위해, 도 8(A) 및 9(A)와 같이, IL-2를 처리한 흑색종 세포(B16F10)와 세포독성 T 세포를 함께 공동 배양한 뒤 흑색종 세포의 생존율을 확인하였다. 세포 발광 유전자를 가진 흑색종 세포(B16F10-luc-g5)를 사용하였으며, IVIS spectrum(PerkinElmer)을 이용하여 분석하였다.
96 웰 플레이트에 흑색종 세포를 약 5 X 103 세포/웰 밀도로 접종하고 대조군으로 IL-2를 전처리한 흑색종 세포를 사용하였다. 배양 48시간 후, 세포를 상이한 비율의 CTLL-2 세포(1:1 내지 1:10)와 함께 배양하였다. 배양 종료 시, MTS 시약을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 각 웰의 상층액을 포함하는 MTS를 제거한 후, 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 8(B)및 9(B)와 같이, 세포독성 T 세포와 IL-2를 전처리한 흑색종 세포의 공동 배양군에서 흑색종 세포의 생존율이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 7: 흑색종 이식 마우스 모델에서 IL-2의 PD-L1발현 감소분석
B16F10 마우스 흑색종 세포 1 X 106을 balb/c 마우스 우측 옆구리에 피하주사하였다. 실험 시작일로부터 10일 후 6일간 매일 PBS, rhIL-2(50,000 IU/마리)를 암 조직에 직접 주사하였다. 이후 공학용 디지털 캘리퍼를 이용하여 2일에 한 번씩 마우스의 암 조직(장축*단축2*0.52)을 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 10과 같이, IL-2를 주입한 마우스의 암 성장은 PBS 대조군과 비슷한 크기로 성장하였다. 이후 마우스에서 적출되어진 암 조직의 무게 분석과 같은 결과를 보였다(도 10).
실시예 8: 흑색종 이식 마우스 모델에서 IL-2의 암 중 PD-L1발현 조절에 대한 분석
상기 실험의 마우스에서 암 조직을 적출한 뒤, 액체질소를 이용하여 급속냉각 후, RBC lysis buffer를 통해 조직 내 적혈구를 제거한 후, 550 x g에서 원심분리하여 세포을 얻었다. 이후 상등액을 300 x g, 2,500 x g, 10,000 x g로 연속 원심분리하였다. 이어서, 분리된 세포를 이용해 웨스턴 블랏 및 면역화학염색법을 이용해 PD-L1발현을 확인하였다.
그 결과 도 11와 같이, IL-2를 주입한 마우스의 PD-L1 발현양이 대조군에 비해 유의있게 감소됨을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 엑소좀 PD-L1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 억제제는 IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제인 것을 특징으로 하는 항암 효과 증진용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 IL-2 발현 촉진제 또는 활성화제는 IL-2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암 효과 증진용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제는 암세포 유래 엑소좀 분비 및 PD-L1의 발현을 감소시켜 면역 회피를 억제하고 항암 효과를 증대시키는 것을 특징으로 하는 항암 효과 증진용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 피부암, 폐암, 간암, 위암, 췌장암, 골암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병, 식도암, 소장암, 대장암, 결장암, 직장암, 항문부근암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 항암 효과 증진용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항암 효과 증진용 조성물은 하나 이상의 항암제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 항암 효과 증진용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항암 효과 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
  8. 암 질환이 의심되는 대상체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 제1단계;
    상기 후보 약물이 처리된 시료에서 IL-2의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제2단계; 및
    대조구 시료와 비교하여 상기 IL-2의 발현 또는 활성 수준을 증가시키는 후보 약물을 선별하는 제3단계;
    를 포함하는 암세포 유래의 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현에 대한 억제제 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2단계의 IL-2의 발현 또는 활성 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석(radioimmunoassay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 마이크로어레이(microarray), 웨스턴 블랏(western blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 측정하는 것을 특징으로 하는 암세포 유래 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현 억제제 스크리닝 방법.
  10. IL-2, 이의 발현 촉진제 또는 활성화제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암세포 유래의 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현을 억제하는 방법.
PCT/KR2020/012631 2019-10-11 2020-09-18 엑소좀 pd-l1의 발현에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 조성물 WO2021071127A1 (ko)

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