TWI785426B - 包含含有il-2蛋白及cd80蛋白之融合蛋白與自然殺手細胞的用於治療癌症的藥學組成物 - Google Patents

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Abstract

本文提供有一種抗癌劑，其包含作為活性成份之含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白與自然殺手細胞。在一實施例中，含有CD80片段、免疫球蛋白Fc結構域及IL-2變異體之融合蛋白能活化免疫細胞如自然殺手細胞。此外，當與自然殺手細胞結合投與時，該融合蛋白能有效地抑制癌症，且含有該融合蛋白之藥學組成物能活化體內的免疫活性。因此，該藥學組成物能有效地用於治療癌症且具有高產業應用性。

Description

包含含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白與自然殺手細胞的用於治療癌症的藥學組成物
發明領域
本發明係有關於一種用於治療癌症的藥學組成物，其包含作為活性成份之含有CD80蛋白及IL-2變異體之融合蛋白與NK細胞。
發明背景
IL-2，亦稱作T細胞生長因子(TCGF)，是一種球狀醣蛋白，其在淋巴細胞之產生、存活及恆定中發揮核心的作用。IL-2蛋白具有15.5kDa至16kDa之大小且由133個胺基酸構成。IL-2藉由與具有三個不同次單元之IL-2受體結合，介導各種免疫作用。此外，IL-2主要是由活化的T細胞合成，特別是由CD4+輔助型T細胞。IL-2會刺激T細胞的增殖與分化，及誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)的產生及周邊血液淋巴細胞分化成細胞毒性細胞與淋巴激素活化殺手細胞(LAK細胞)。
同時，CD80，亦稱作B7-1，是膜連型蛋白B7家族的成員，其藉由與其配體結合，透過遞送共刺激反應及共抑制反應之方式進行免疫調節。CD80是一種表現在T細胞、B細胞、樹狀細胞及單核球表面上之穿膜蛋白。CD80已知會與CD28、CTLA4 (CD152)及PD-L1結合。CD80、CD86、CTLA4及CD28涉及共刺激-共抑制系統。例如，其等會調節T細胞之活性且涉及其之增殖、分化及存活。
此外，已知自然殺手細胞(之後稱NK細胞)會通過移除癌細胞而表現出抗癌活性(Loris Zamaiet.al., J. Immunol. , 178:4011-4016, 2007)。NK細胞活性之調節是通過各種活化性及抑制性受體傳訊的平衡。已知NK細胞還能透過表現在表面上的各種免疫受體來辨別癌細胞以達到抗癌活性。由於正常細胞中存在主要組織相容性複合體(MHC)第I類，所以正常細胞不會被NK細胞之抑制性受體辨識，從而不會遭受攻擊，但癌細胞或一些受感染的細胞因MHC第I類減少或具有NK細胞活化受體的配體而會被NK細胞清除。除了癌細胞外，NK細胞還可消除癌幹細胞，因此成為不僅可抑制癌的發展、增殖及轉移，且可降低完全康復後癌症的復發之備受關注的治療劑來源。
本發明之詳細說明 技術問題
據此，研究開發安定且有效的IL-2之結果，本發明人發現共投與在一分子中含有IL-2蛋白及CD80蛋白之新穎的融合蛋白二聚體與自然殺手細胞的組合，表現出優異的抗癌作用，並完成本發明。解決問題之方法
為達成上述目的，根據本發明之一個態樣，提供一種抗癌劑，其包含作為活性成份之含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白二聚體與自然殺手細胞。本發明之效果
已確認含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白二聚體不僅可活化免疫細胞，且當與自然殺手細胞結合投與時，可表現出協同作用。因此，此組合療法可用於治療癌症。
實施本發明之最佳模式
本發明之一個態樣提供一種藥學組成物，其包含作為活性成份之含有CD80蛋白及IL-2蛋白之融合蛋白與NK細胞。
本發明之另一個態樣提供一種用於治療癌症之藥學組成物，其包含作為活性成份之含有CD80蛋白及IL-2蛋白之融合蛋白與NK細胞。自然殺手細胞
本文中使用的術語"NK細胞"意指自然殺手細胞(之後稱NK細胞)，是先天性免疫細胞的一種，其會直接與各種巨噬細胞及T細胞交互反應或產生細胞激素，調節免疫反應，從而在自體免疫疾病中起重要作用。在本發明中，NK細胞可從脾或骨髓中分離出來，但不限於此。具體地，NK細胞可從自體或異源細胞獲得。
此外，NK細胞可源自哺乳動物或人。較佳地，其可從預期接受NK細胞治療之個體獲得。在此情況下，可從個體之血液中直接分離出NK細胞，然後使用，或使從個體獲得的不成熟NK細胞或幹細胞進行分化，然後使用。
此外，該自然殺手細胞可從下列步驟獲得，其包括：i)從周邊血液單核細胞(PBMC)中分離出不會表現CD3的細胞；ii)從以上步驟獲得之不會表現CD3的細胞中分離出會表現CD56的細胞；及iii)在含有IL-2或其變異體及CD80或其片段之融合蛋白二聚體之存在下培養分離的細胞。
此外，該自然殺手細胞可通過下列步驟獲得：i)從PBMCs中分離出不會表現CD3的細胞；及ii)在含有IL-2或其變異體及CD80或其片段之融合蛋白二聚體之存在下培養該分離的細胞。
再者，該自然殺手細胞可通過下列步驟獲得：i)從PBMCs中分離出不會表現CD56的細胞；及ii)在含有IL-2或其變異體及CD80或其片段之融合蛋白二聚體之存在下培養該分離的細胞。包含IL-2 蛋白及CD80 蛋白之融合蛋白二聚體
本文中使用的術語"IL-2"或"白介素-2"，除非有另外說明，否則意指從任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，例如靈長類動物(如人)及囓齒動物(如小鼠及大鼠)獲得之任何野生型IL-2。IL-2可從動物細胞獲得，還包括從能夠產生IL-2之重組細胞獲得的IL-2。此外，IL-2可為野生型IL-2或其變異體。
在本說明書中，IL-2或其變異體可集體以術語"IL-2蛋白"或"IL-2多肽"表示。IL-2、IL-2蛋白、IL-2多肽及IL-2變異體會專一性地結合至例如IL-2受體。此專一性結合可用熟悉此技藝之人士已知的方法鑑定。
IL-2之一個實施例可具有序列辨識編號：35或序列辨識編號：36之胺基酸序列。在此，IL-2亦可為成熟形式。具體地，成熟IL-2可不含訊息序列，且可具有序列辨識編號：10之胺基酸序列。在此，IL-2可在包含野生型IL-2之片段的概念下使用，其中野生型IL-2之N端或C端部分被截短。
此外IL-2之片段可為從具有序列辨識編號：35或序列辨識編號：36之胺基酸序列之蛋白的N端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續的胺基酸之形式。此外，該IL-2之片段可為從具有序列辨識編號：35或序列辨識編號：36之胺基酸序列之蛋白的C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續的胺基酸之形式。
本文中使用的術語“IL-2變異體”意指全長IL-2或上述IL-2之片段中一部分的胺基酸被取代之形式。即，IL-2變異體可具有與野生型IL-2或其片段不同的胺基酸序列。然而，IL-2變異體可具有與野生型IL-2相當或相似的活性。在此，"IL-2活性"可意指例如與IL-2受體專一性結合，該專一性結合可用熟悉此技藝之人士已知的方法測量。
具體地，IL-2變異體可藉由取代野生型IL-2中一部分的胺基酸而獲得。藉由胺基酸取代而獲得的IL-2變異體之實施例，可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中的第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之至少一個而獲得。
具體地，該IL-2變異體可藉由以另一胺基酸取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中的第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之至少一個而獲得。此外，當IL-2為序列辨識編號：35之胺基酸序列中N端的一部分被截短之形式時，可以另一胺基酸取代與序列辨識編號：10之胺基酸序列中互補對應位置處之胺基酸。例如，當IL-2具有序列辨識編號：35之胺基酸序列時，其IL-2變異體可藉由以另一胺基酸取代序列辨識編號：35胺基酸序列中第58個、第62個、第65個、第81個或第92個胺基酸中之至少一個而獲得。此等胺基酸殘基分別對應於序列辨識編號：10之胺基酸序列中的第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸殘基。根據一個實施例，可取代一、二、三、四、五、六、七、八、九或十個胺基酸，只要此IL-2變異體能保持IL-2活性。根據另一個實施例，可取代一至五個胺基酸。
在一個實施例中，IL-2變異體可為二個胺基酸被取代之形式。具體地，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第42個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第45個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個及第45個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第45個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第45個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第61個及第72個胺基酸而獲得。
再者，IL-2變異體可為三個胺基酸被取代之形式。具體地，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個及第45個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第45個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第45個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第61個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個、第45個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個、第45個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第45個、第61個及第72個胺基酸而獲得。
此外，IL-2變異體可為四個胺基酸被取代之形式。具體地，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個、第45個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個、第45個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第45個、第61個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個、第61個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可藉由取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸而獲得。
再者，IL-2變異體可為五個胺基酸被取代之形式。具體地，該IL-2變異體可藉由以另一胺基酸取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之每一個而獲得。
在此，藉由取代而導入的"另一胺基酸"可為任一個選自於由下列所構成之群組：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。然而，在該IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第38個胺基酸不能以精胺酸取代、第42個胺基酸不能以苯丙胺酸取代、第45個胺基酸不能以酪胺酸取代、第61個胺基酸不能以麩胺酸取代及第72個胺基酸不能以白胺酸取代。
在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第38個胺基酸，精胺酸，可以非精胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第38個胺基酸，精胺酸，可以丙胺酸取代 (R38A)。
在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第42個胺基酸，苯丙胺酸，可以非苯丙胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第42個胺基酸，苯丙胺酸，可以丙胺酸取代(F42A)。
在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第45個胺基酸，酪胺酸，可以非酪胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第45個胺基酸，酪胺酸，可以丙胺酸取代(Y45A)。
在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第61個胺基酸，麩胺酸，可以非麩胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第61個胺基酸，麩胺酸，可以精胺酸取代(E61R)。
在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第72個胺基酸，白胺酸，可以非白胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第72個胺基酸，白胺酸，可以甘胺酸取代(L72G)。
具體地，IL-2變異體可藉由至少一個選自於由下列所構成之群組之取代而獲得：序列辨識編號：10之胺基酸序列中之R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
具體地，該IL-2變異體可藉由在選自於由R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G所構成之群組之位置中的二個、三個、四個或五個位置處之胺基酸取代而獲得。
此外，IL-2變異體可為二個胺基酸被取代之形式。具體地，IL-2變異體可藉由R38A及F42A之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A及Y45A之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由F42A及Y45A之取代而獲得 。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由F42A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由F42A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由E61R及L72G之取代而獲得。
此外， IL-2變異體可為三個胺基酸被取代之形式。具體地，IL-2變異體可藉由R38A、F42A及Y45A之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A、F42A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A、F42A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A、Y45A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A、Y45A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由F42A、Y45A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由F42A、Y45A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由F42A、E61R及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由Y45A、E61R及L72G之取代而獲得。
此外，IL-2變異體可為四個胺基酸被取代之形式。具體地，IL-2變異體可藉由R38A、F42A、Y45A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A、F42A、Y45A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A、F42A、E61R及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由R38A、Y45A、E61R及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可藉由F42A、Y45A、E61R及L72G之取代而獲得。
此外， IL-2變異體可藉由R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G之取代而獲得。
較佳地，該IL-2變異體之實施例可包含任一個選自於下列序列辨識編號：10之胺基酸序列中的取代組合(a)至(d)： (a) R38A/F42A； (b) R38A/F42A/Y45A； (c) R38A/F42A/E61R；或 (d) R38A/F42A/L72G。
在此，當IL-2具有序列辨識編號：35之胺基酸序列時，胺基酸取代可出現在與序列辨識編號：10之胺基酸序列中互補對應位置處。此外，即使IL-2是序列辨識編號：35之胺基酸序列的片段，胺基酸取代亦可出現在與序列辨識編號：10之胺基酸序列中互補對應位置處。
具體地，該IL-2變異體可具有序列辨識編號：6、22、23或24之胺基酸序列。
此外，該IL-2變異體可具有低活體內毒性之特徵。在此，該低活體內毒性可能是IL-2與IL-2受體α鏈(IL-2Rα)結合引起的副作用。已開發出各種可減少因IL-2與IL-2受體α結合所引起的副作用之IL-2變異體，且此IL-2變異體可為美國專利案第5,229,109號及韓國專利案第1667096號中所揭示的。特別是，本申請案中所述的IL-2變異體對IL-2受體α鏈(IL-2Rα)具有低結合能力，因此具有比野生型IL-2低的活體內毒性。
本文中使用的術語"CD80"，亦稱作"B7-1"，是一種存在樹狀細胞、活化B細胞及單核球中之膜蛋白。 CD80提供T細胞之活化及存活必需的共刺激訊息。CD80已知為存在T細胞表面上二種不同的蛋白，CD28及CTLA-4，之配體。CD80由288個胺基酸構成，具體地具有序列辨識編號：11之胺基酸序列。此外，本文中所使用的術語"CD80蛋白"意指CD80全長或CD80片段。
本文中使用的術語"CD80片段"意指CD80之截短形式。此外，該CD80片段可為CD80之胞外結構域。CD80片段之實施例可藉由刪除CD80之N端第1個至第34個胺基酸(其是訊息序列)而獲得。具體地，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第35個至第288個胺基酸構成之蛋白。此外，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第35個至第242個胺基酸構成之蛋白。此外，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第35個至第232個胺基酸構成之蛋白。此外，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第35個至第139個胺基酸構成之蛋白。此外，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第142個至第242個胺基酸構成之蛋白。在一實施例中，CD80片段可具有序列辨識編號：2之胺基酸序列。
此外，該IL-2蛋白及該CD80蛋白可透過一連接子或一攜帶體(carrier)彼此附接。具體地，該IL-2或其變異體及該CD80 (B7-1)或其片段可透過一連接子或一攜帶體彼此附接。在本說明中，該連接子及該攜帶體可交換使用。
該連接子會連接二個蛋白。該連接子之實施例可包括1至50個胺基酸、白蛋白或其片段、免疫球蛋白之Fc結構域等等。在此，免疫球蛋白之Fc結構域意指含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)及重鏈恆定區3 (CH3)，而不含免疫球蛋白之重及輕鏈可變區及輕鏈恆定區1 (CH1)之蛋白。該免疫球蛋白可為IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，較佳地可為IgG4。在此，野生型免疫球蛋白G4之Fc結構域可具有序列辨識編號：4之胺基酸序列。
此外，免疫球蛋白之Fc結構域可為Fc結構域變異體及野生型Fc結構域。此外，在本文中使用的術語"Fc結構域變異體"可意指在醣基化模式方面與野生型Fc結構域不同的形式，與野生型Fc結構域相比具高醣基化，或與野生型Fc結構域相比具低醣基化，或去醣基化的形式。此外，無醣基化Fc結構域包含於其中。通過宿主的培養條件或基因工程，可使該Fc結構域或其變異體適應而具有調整數量的唾液酸、岩藻醣基化或醣基化。
此外，免疫球蛋白之Fc結構域的醣基化可藉由習用的方法修飾，如化學方法、酵素方法及使用微生物之遺傳工程方法。此外，該Fc結構域變異體可為免疫球蛋白、IgG、IgA、IgE、IgD及IgM各別的Fc區之混合形式。此外，該Fc結構域變異體可為Fc結構域的一些胺基酸經其它胺基酸取代之形式。Fc結構域變異體之實施例可具有序列辨識編號：12之胺基酸序列。
該融合蛋白可具有使用Fc結構域作為連接子(或攜帶體)之結構，其中CD80蛋白及IL-2蛋白，或IL-2蛋白及CD80蛋白，連接至該融合蛋白的N端及C端(圖1)。該Fc結構域之N端或C端與CD-80或IL-2間之連接，可任擇地藉由一連接肽達成。
具體地，融合蛋白可由下列結構式(I)或(II)構成： N'-X-[連接子(1)]n -Fc結構域-[連接子(2)]m -Y-C'  (I) N'-Y-[連接子(1)]n -Fc結構域-[連接子(2)]m -X-C'  (II) 在此，於結構式(I)及(II)中， N '是該融合蛋白的N端， C '是該融合蛋白的C端， X是CD80蛋白， Y是IL-2蛋白， 該連接子(1)及(2)是胜肽連接子，及 n及m各獨立地為0或1。
較佳地，該融合蛋白可由結構式(I)構成。該IL-2蛋白如上所述。此外，該CD80蛋白如上所述。根據一個實施例，該IL-2蛋白可為與野生型IL-2相比具有一至五個胺基酸取代的IL-2變異體。該CD80蛋白可為從野生型CD80之N端或C端截短高達約34個連續的胺基酸殘基所獲得的片段。或者，該CD80蛋白可為具有與T細胞表面受體CTLA-4及CD28結合之活性的胞外免疫球蛋白樣結構域。
具體地，該融合蛋白可具有序列辨識編號：9、26、28或30之胺基酸序列。根據另一個實施例，該融合蛋白包括與序列辨識編號：9、26、28或30之胺基酸序列具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽。在此，該一 致性是例如同源百分比，且可透過同源性比對軟體如National Center of Biotechnology Information (NCBI)的BlastN軟體測定。
該胜肽連接子(1)可包含在該CD80蛋白與該Fc結構域之間。該胜肽連接子(1)可由5至80個連續的胺基酸、20至60個連續的胺基酸、25至50個連續的胺基酸或30至40個連續的胺基酸構成。在一實施例中，該胜肽連接子(1)可由30個胺基酸構成。此外，該胜肽連接子(1)可包含至少一個半胱胺酸。具體地，該胜肽連接子(1)可含有一個、二個或三個半胱胺酸。此外，該胜肽連接子(1)可源自免疫球蛋白的鉸鏈。在一實施例中，該胜肽連接子(1)可為由序列辨識編號：3之胺基酸序列構成的胜肽連接子。
該胜肽連接子(2)可由1至50個連續的胺基酸、3至30個連續的胺基酸或5至15個連續的胺基酸構成。在一實施例中，該胜肽連接子(2)可為(G4S)n (其中n是1至10之整數)。在此，於(G4S)n 中，n可為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一實施例中，該胜肽連接子(2)可為由序列辨識編號：5之胺基酸序列構成的胜肽連接子。
在本發明之另一態樣中，提供有一種藥學組成物，其包含作為活性成份之藉由結合二個融合蛋白而獲得的二聚體，其各含有IL-2蛋白及CD80蛋白，與NK細胞。含有IL-2或其變異體及CD80或其片段之融合蛋白如上所述。
在此，構成該二聚體之融合蛋白間的結合，可藉由，但不限於，存在該連接子中之半胱胺酸形成的雙硫鍵達成。構成該二聚體之融合蛋白可為彼此相同或不同的融合蛋白。較佳地，該二聚體可為同型二聚體。構成該二聚體之融合蛋白的實施例可為具有序列辨識編號：9之胺基酸序列的蛋白。
在本發明中，該癌症可為任一個選自於由下列所構成之群組：胃癌、肝癌、肺癌、結直腸癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、急性淋巴母細胞白血病、腦瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、頭頸癌、唾腺癌及淋巴瘤。
該藥學組成物之較佳劑量隨著患者的病況及體重、疾病嚴重度、藥物形式、投與途徑與期間而變，且可由熟悉此技藝之人士適當地選擇。在用於治療或預防癌症之本發明的藥學組成物中，可依據應用、用途、劑型、摻合目的等等而包含任何數量(有效量)的活性成份，只要該活性成份表現出抗癌活性。其常規有效量以該組成物之總重量為基礎，判定在0.001重量%至20.0重量%之範圍內。在此，術語“有效量”意指活性成份能夠引起抗癌作用之數量。此一有效量可在熟悉此技藝之人士之常識範圍內通過實驗判定。
本文中使用的術語“治療”可用於意指治療性與預防性治療。在此，預防性可用於指減輕或緩和個體的病理狀態或疾病。在一實施例中，術語“治療”包括用於治療哺乳動物，包括人，之疾病的施用或任何形式的投藥。此外，該術語包括抑制或減慢疾病或疾病的進展；及包括復原或修復損傷或喪失的功能，以便部分或完全減輕疾病的意思；刺激低效的治療；或減輕嚴重疾病。
本文中所使用的術語“療效”意指可利用一或多個參數確定的能力，例如在一定時間如一年、五年或十年內的存活率或無病存活率。此外，該參數可包括縮小個體中至少一個腫瘤的大小。
藥動學參數如生物可用率及基礎參數如廓清率亦會影響療效。因此，“增強療效”(例如，改善療效)可以是由於增強藥動學參數而改善療效，其可藉由比較實驗室動物或人受試者中之廓清率及腫瘤生長，或藉由比較參數如存活率、復發或無疾病存活率來測量。
本文中所使用的術語"治療有效量"或"藥學有效量"意指有效預防或治療提到的疾病之化合物或組成物的數量，其足夠以適用於醫療之合理的效益/風險比治療疾病而不會引起副作用。該有效量之位準可依據包括下列之因素決定：患者的健康狀況、疾病的種類或嚴重度、藥物活性、患者對藥物的敏感性、投藥模式、投藥時間、投藥途徑與排泄率、治療期間、配方或同時使用的藥物及醫學領域中熟知之其它因素。在一實施例中，該治療有效量意指有效治療癌症的數量。
在此，該藥學組成物可進一步包括一藥學上可接受的載劑。該藥學上可接受的載劑可為任一載劑，只要該載劑為適合遞送至患者之無毒性物質。可包含蒸餾水、酒精、脂肪、蠟及惰性固體作為該載劑。該藥學組成物中亦可包含藥學上可接受的佐劑(緩衝液、分散劑)。
具體地，藉由包含除活性成份外之藥學上可接受的載劑，可依據投藥途徑，使用業界慣用的方法，將該藥學組成物製備成腸胃外配方。在此，術語"藥學上可接受的"意指該載劑之毒性不超過所施用的(處方的)受試者所能適應的毒性，同時不抑制活性成份的活性。
在將該藥學組成物配製成胃腸外配方時，可根據業界熟知之方法用適合的載劑將其製成注射劑、穿皮貼片、鼻吸劑或栓劑之形式。在製成注射劑之情況下，可使用無菌水、乙醇、諸如甘油或丙二醇之多元醇或其等之混合物作為適合的載劑；及較佳地可使用等張溶液，諸如林格氏溶液、含三乙醇胺或注射用無菌水之磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)及5%右旋糖等等。藥學組成物之配方是業界已知的，且可具體參考Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)等等。此文件視為本說明書之一部分。
該藥學組成物中二聚體之較佳劑量範圍可從每日0.01μg/kg至10g/kg或0.01mg/kg至1g/kg，取決於患者的病況、體重、性別、年齡、患者的嚴重程度、投藥途徑。該劑量之投與，可一天一次，或可分成一天數次。此一劑量在任何方面不應被解釋為本發明之範疇的限制。此外，藥學組成物中的NK細胞可以1×102 至1×1013 細胞、1×107 至1.5×1011 細胞的數量投與，並在顯示藥學作用之範圍內適當地調整。
該藥學組成物可施用(處方)之受試者為哺乳動物及人，特別適合的是人。除了活性成份外，本申請案之藥學組成物可進一步含有任何已經過安全認證且已知具抗癌活性之化合物或天然萃取物，以便增強或加強抗癌活性。
在本發明之又另一態樣中，提供一種含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白二聚體與NK細胞用於治療癌症或感染性疾病的用途。
在本發明之又另一態樣中，提供一種含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白二聚體與NK細胞用於提高對癌症之療效的用途。
在本發明之又另一態樣中，提供一種含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白二聚體與NK細胞用於製造用於治療癌症之藥劑的用途。
在本發明之又另一態樣中，提供一種用於治療癌症的方法和/或用於提高對癌症之療效的方法，其包含對一受試者投與含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白，或二個該融合蛋白附接之融合蛋白二聚體，與NK細胞。
在此，該融合蛋白二聚體與該NK細胞可同時或依序投與。在此情況下，投與順序可決定為在投與該融合蛋白二聚體後接著投與該NK細胞，或在投與該NK細胞後接著投與該融合蛋白二聚體。
該受試者可為罹患癌症或感染性疾病之個體。此外，該受試者可為哺乳動物，較佳地人。該含有IL-2蛋白及CD80蛋白之融合蛋白，或其中二個融合蛋白附接之融合蛋白二聚體如上所述。
投與該融合蛋白或融合蛋白二聚體與NK細胞之投藥途徑、劑量及頻率可依患者的病況，有或無副作用而變化，因此可以各種方法及數量投與該融合蛋白或該融合蛋白二聚體至受試者。最適當的投藥方法、劑量及投藥頻率可由熟悉此技藝之人士在適當的範圍內選擇。此外，該融合蛋白或融合蛋白二聚體可與治療效果已知和待治療之疾病有關的其它藥物或生理活性物質結合投與，或可與其它藥物配製成組合製劑之形式。
由於IL-2活性，本發明實施例中之融合蛋白可活化免疫細胞，如自然殺手細胞。因此，該融合蛋白可有效地用於癌症與感染性疾病。特別是，經鑑定，與野生型相比，具二至五個胺基酸取代之IL-2變異體，特別是在選自於由R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G所構成之群組之位置中的二個、三個、四個或五個位置處含有胺基酸取代之IL-2變異體，對IL-2受體α鏈具低結合能力，因此在習知IL-2之藥理副作用方面，展現出改善的特徵。因此，此一IL-2變異體當單獨使用或以融合蛋白之形式使用時，可降低血管(或微血管)滲漏症候群(VLS；一種習知與IL-2相關的問題)之發生率。本發明之模式
於下文中，將藉由下列範例更詳細的說明本發明。然而，下列範例僅供例示說明本發明，而本發明之範疇不受其限制。I. 含有IL-2 及CD80 之融合蛋白二聚體的製備 製備範例1 ，hCD80-Fc-IL-2 變異體(2M) ：GI101 之製備
為了產生含有人CD80片段、Fc結構域及IL-2變異體之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific Inc.之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成包含核苷酸序列(序列辨識編號：8)之多核苷酸序列，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、CD80片段(序列辨識編號：2)、連接子結合的Ig鉸鏈(序列辨識編號：3)、Fc結構域(序列辨識編號：4)、連接子(序列辨識編號：5)及具有二個胺基酸(R38A，F42A)取代之IL-2變異體(2M) (序列辨識編號：6)之融合蛋白，並選殖進入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(EXPI-CHOTM )中，用以表現具序列辨識編號：9之融合蛋白。在導入該載體後，將CHO細胞置於37℃、125 RPM及8% CO2 之環境下培養7天，然後收集以純化融合蛋白。將純化的融合蛋白二聚體命名為"GI-101"。
使用含MabSelect SuRe蛋白A樹脂之層析法進行純化。該融合蛋白在25 mM Tris，25 mM NaCl及pH 7.4之條件下會被結合。之後，用100 mM NaCl及100 mM醋酸於pH 3下進行洗提。在將20%的1M Tris-HCl，pH 9放入收集管中後，收集該融合蛋白。將收集的融合蛋白於PBS緩衝液中透析16個小時進行交換。
之後，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)之粒徑篩析層析法，測量在波長280nm下隨時間推移之吸收度，以獲得高濃度的融合蛋白。此時，對該分離純化的融合蛋白進行還原(R)或非還原(NR)條件下的SDS-PAGE處理且用考馬斯藍(Coomassie blue)染色，確定其純度(圖2)。 使用NanoDrop檢測時，確認包括2.78 mg/mL濃度的融合蛋白。且，使用粒徑篩析層析法分析的結果示於圖3中。製備範例 2 ， Fc-IL-2 變異體 (2M) 二聚體 ： Fc-IL-2v2 之製備
為了產生含有Fc結構域與IL-2變異體之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific Inc.之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成包含核苷酸序列(序列辨識編號：45)之多核苷酸序列，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、Ig鉸鏈(序列辨識編號：38)、Fc結構域(序列辨識編號：4)、連接子(序列辨識編號：5)及具有二個胺基酸(R38A，F42A)取代之IL-2 變異體(2M) (序列辨識編號：6)之融合蛋白，並選殖進入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(EXPI-CHOTM )中，用以表現具序列辨識編號：44之融合蛋白。在導入該載體後，將CHO細胞置於37℃、125 RPM及8% CO2 之環境下培養7天，然後收集以純化融合蛋白二聚體。將純化的融合蛋白二聚體命名為" Fc-IL2v2"。
以在製備範例1中相同的方式進行該融合蛋白的純化及收集。對分離純化的融合蛋白進行在還原(R)或非還原(NR)條件下之SDS-PAGE處理，且用考馬斯藍染色，確認其純度(圖4)。結果，確認該融合蛋白形成二聚體。且，使用粒徑篩析層析法分析的結果示於圖5中。製備範例 3 ， hCD80-Fc 二聚體 ： hCD80-Fc 之製備
為了產生含有CD80片段與Fc結構域之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific Inc.之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成包含核苷酸序列(序列辨識編號：39)之多核苷酸序列，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、CD80片段(序列辨識編號：2)、連接子結合的Ig鉸鏈(序列辨識編號：3)及Fc結構域(序列辨識編號：4)之融合蛋白，並選殖進入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(EXPI-CHOTM )中，用以表現具序列辨識編號：40之融合蛋白。導入載體後，在37°C、125RPM及8% CO2 之環境中進行培養7天，然後收集以純化融合蛋白二聚體。將純化的融合蛋白二聚體命名為“hCD80-Fc”。
使用含MabSelect SuRe蛋白A樹脂之層析法進行純化。該融合蛋白在25 mM Tris，25 mM NaCl及pH 7.4之條件下會被結合。之後，用100 mM NaCl及100 mM醋酸於pH 3下進行洗提。在將20%的1M Tris-HCl，pH 9放入收集管中後，收集該融合蛋白。將收集的融合蛋白於PBS緩衝液中透析16個小時進行交換。
之後，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)之粒徑篩析層析法測量在波長280nm下隨時間推移之吸收度，以獲得高濃度的融合蛋白。此時，對該分離純化的融合蛋白進行還原(R)或非還原(NR)條件下的SDS-PAGE處理且用考馬斯藍染色，確定其純度(圖6)。結果，確認該融合蛋白形成二聚體。且，使用粒徑篩析層析法分析的結果示於圖7中。製備範例4 ，mCD80-Fc-IL-2 變異體(2M): mGI101 之製備
根據製備範例1中相同的方法，製造含有小鼠來源CD80及IL-2之小鼠型GI-101。具體地，為了產生含有小鼠CD80、Fc結構域及IL-2變異體之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific Inc.之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成多核苷酸。該多核苷酸含有核苷酸序列(序列辨識編號：14)，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、mCD80(序列辨識編號：13)、連接子結合的Ig鉸鏈(序列辨識編號：3)、Fc結構域(序列辨識編號：4)、連接子(序列辨識編號：5)及具有二個胺基酸(R38A，F42A)取代之IL-2 變異體(2M) (序列辨識編號：6)之融合蛋白。將該多核苷酸插入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(EXPI-CHOTM )中，用以表現具序列辨識編號：47之融合蛋白。在導入該載體後，將CHO細胞置於37℃、125 RPM及8% CO2 之環境下培養7天。然後收集該培養物並從其中純化出融合蛋白。將純化的融合蛋白命名為"mGI101"。II. NK 細胞之製備與培養 製備範例1 ，周邊血液單核細胞(PBMC) 來源CD3(-) CD56(+) 自然殺手細胞之分離
為了獲得CD3(-)細胞，使用ADAM-MC2自動細胞計數器(NanoEnTek，購自Cosmo Genetech Co., Ltd.)測量PBMCs (周邊血液單核細胞，Zen-Bio. Inc, NC 27709, USA, Cat#: SER-PBMC-200-F)之數量。將PBMCs移到新的試管中，然後在300×g，溫度4℃下離心5分鐘。在PBS中加入0.5% (v/v)的牛血清白蛋白(BSA)及2 mM的EDTA製備MACS緩衝液(pH7.2)。離心完成後，以每1×107 細胞80μl之MACs緩衝液及20μl之CD3磁珠(Miltenyi biotech, 130-050-101)處理細胞沈澱物使其懸浮，然後在4℃溫度下反應15分鐘。加入10mL的MACs緩衝液進行清洗並在300×g，溫度4℃下離心10分鐘，然後將細胞沈澱物重新懸浮於0.5mL之MACs緩衝液中。
先讓2mL的MACs緩衝液流進LD管柱(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-042-901)，之後接著細胞懸浮液。然後獲得通過LD管柱之CD3(-)細胞。此時，使2mL的MACs緩衝液流過三次，獲得CD3(-)細胞，如此可充分地分開殘留在LD管柱中之細胞。使用細胞計數器計數所獲得的CD3(-)細胞，然後將其置於新管中，在300×g，溫度4℃下離心5分鐘。之後，移除上清液，之後每1×107 細胞添加80μl之MACs緩衝液及20μl之CD56磁珠(Miltenyi biotech, Cat#: 130-050-401)，接著在溫度4℃下反應15分鐘。加入10mL的MACs緩衝液進行清洗，在300×g，溫度4℃下離心10分鐘，之後將細胞沈澱物重新懸浮於0.5mL的MACs緩衝液中。
使3mL的MACs緩衝液先流進LS管柱(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-042-901)中，接著細胞懸浮液。此時，使2mL的MACs流進三次，如此可充分地分開殘留在LS管柱中之細胞。將LS管柱與磁力架分開後，加入5mL的MACs緩衝液，用活塞加壓以獲得CD3(-)CD56(+)自然殺手細胞。然後將獲得的CD3(-)CD56(+)自然殺手細胞置於新管中，在300×g，溫度4℃下離心5分鐘。移除上清液後，將細胞懸浮於培養基中，及使用細胞計數器測量懸浮細胞的數量。製備範例2 ，CD3-CD56+ 自然殺手細胞之培養與獲得
將包含在NK細胞活化/擴張套組(Cat#: 130-112-968)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)中之100μl的CD335 (NKp46)-生物素及100μl的CD2-生物素置於1.5mL微管中並混合。加入500μl的抗生物素MACSiBead粒子並混合。之後，加入300μl的MACs緩衝液，及使用微管旋轉器在2℃至8℃下混合2小時。
之後，將每1x106 細胞5μl的NK活化珠轉移至新管中。加入1mL的PBS並在300×g下離心5分鐘。移除上清液後，根據5μl/106 NK細胞，加入添加有5%人AB血清(Cat#:H4522)(Sigma, St. Louis, Missouri, US)之RPMI1640培養基並使珠懸浮，接著接種至在製備範例1中分離的CD3-CD56+自然殺手細胞中。
接著，將CD3-CD56+自然殺手細胞種在24孔盤中，然後於其中加入具有5%人AB血清(Cat#:H4522) (Sigma, St. Louis, Missouri, US)及rhIL-2 (500 IU/mL)之RPMI1640培養基，接著在37°C、5% CO2 之條件下培養。之後，每2天測定細胞數量，當占培養容器的80%以上(匯合)時，依照12孔盤、6孔盤及25T培養瓶之順序繼代培養，最後在第21天收成所有的細胞。製備範例3 ，小鼠來源自然殺手細胞之培養及收集 製備範例3.1 ，小鼠脾細胞及骨髓的製備
為獲得小鼠來源自然殺手細胞，首先製備小鼠脾細胞及骨髓。具體地，從6周大雌性Balb/c (ORIENT BIO Inc.)中取出脾與股骨，盡可能的清除脂肪與肌肉，小心不要弄斷股骨。將取出的股骨置於70%乙醇中，接著裝有5mL PBS之50mL管中，立即將脾轉移至裝有5mL PBS之50mL試管中，然後儲存在冰中。用70μm細胞濾網蓋住分別為脾及骨髓製備之裝有5mL FACS緩衝液的50mL管。FACS緩衝液A之組成述於以下表1中。 [表1]
組成 體積 最後濃度
產品 製造商
FACS 緩衝液 A FBS Hyclone 15 mL 3%
EDTA Welgene 10 mL 10 mM
HEPES Welgene 10 mL 20 mM
多黏菌素B Merk 300 mL 10 g/mL
盤尼西林/鏈黴素 Biolegend 5 mL 10,000 U/mL盤尼西林/ 10,000 g/mL鏈黴素
100 mM丙酮酸鈉 Gibco 5 mL 1 mM
PBS Sigma 至500 mL  
在用針尖搗碎後，加入5mL FACS緩衝液A以收集細胞。之後，在1,300rpm、4℃下離心5分鐘，除去上清液。用3mL ACK溶胞緩衝液將脾溶解，以去除紅血球細胞，然後置於冰上培育3分鐘。3分鐘後，加入FACS緩衝液A，使總積體至20mL。渦旋產物，然後在1,300rpm、4℃下離心5分鐘及去除上清液。通過重複以上過程去除紅血球，直到沈澱物之顏色轉成粉紅色，然後用10mL FACS緩衝液A溶解，以計數細胞。
在用於骨髓的70μm細胞濾器上將股骨二側切開，使用1ml充填10mL FACS緩衝液A之針筒，讓FACS緩衝液A流進骨頭的洞中。來回移動一會兒，然後在FACS緩衝液A流至切開的組織時，收集細胞。收集細胞，然後於1,300rpm、4℃下離心5分鐘。然後，去除上清液，並用10mL FACS緩衝液A溶解，接著計數細胞。製備範例3.2 ，小鼠NK 細胞之分離與培養
使用NK細胞分離套組(#130-115-818)，從以上製備範例3.1之6周大雌性Balb/c (ORIENT BIO Inc.)小鼠中分離出來的脾及骨髓中，分離出NK細胞。分離後，在1,300×g、4℃下進行離心，並去除上清液。
每107 細胞添加40μl MACS緩衝液(脾600μl，骨髓200μl)使細胞沈澱物懸浮，及每107 細胞添加40μl NK雞尾酒細胞(脾150μl，骨髓50μl)。然而，在此情況下，超過5×107 細胞顯示出凝集現象，所以將其等分開並混合。之後，在300×g、4℃下離心，去除上清液。
每107 細胞加入2mL清洗緩衝液(脾30mL，骨髓10mL)，清洗，在300×g，4℃下離心並去除上清液。之後，每107 細胞加入80μl MACS緩衝液(脾1.2mL，骨髓400μl)，然後每107 細胞加入20μl抗生物素微珠(脾300μl，骨髓100μl)，混合，並在冰箱中培養10分鐘。
使500μl混合與抗生物素微珠的細胞流進MS管柱，獲得通過該管柱的上清液。重複相同的過程，以獲得通過該管柱之上清液，然後在300×g，4℃下離心。之後去除上清液。通過重新懸浮於GC-RPMI培養基(1×)中計數細胞(脾：6.95×105 /mL生存力59%，骨髓：1.58×106 /mL生存力64%)。GC-RPMI培養基之組成述於以下表2中。 [表2]
組成 最後濃度
產品 製造商 Cat.#
GC-RPMI RPMI 1640 Welgene LM 011-01  
Pen-Strep Welgene LS 202-02 1×
正大黴素 Gibco 15750-060 50 µg/mL
丙酮酸鈉 Welgene LS 013-01 1 mM
2-巰乙醇 Gibco 21985-023 55 μM
NEAA Gibco 11140050 2 mM
L-麩醯胺酸 Gibco 25030149 2 mM
FBS Hyclone SH30084.03 10%
在將3.5×105 個從脾及骨髓中分離出來之NK細胞種於60mm培養容器後，用50ng/mL的rmIL-2處理並培養14天。Ⅲ. 癌細胞之製備及小鼠模型之建構 製備範例4 ，人源癌細胞株及其培養基之製備
參考以下表3，使用適合各種癌細胞株之培養溶液。 [表3]
癌細胞株 來源生物 疾病 製造商 培 養基之組份
K562 智人，人 慢性骨髓性 白血病 ATCC RPMI1640 + 10% FBS
MDA-MB-231 智人，人 乳癌 Korean Cell Line Bank 高葡萄糖RPMI1640 + 10% FBS
HCT-116 智人，人 結腸癌 ATCC McCoy's 5A + 10% FBS
A549 智人，人 肺癌 ATCC RPMI1640 + 10% FBS
具體地，使2×106 細胞之癌細胞株重新懸浮於8mL各培養溶液中並於25T培養瓶中培養。回收細胞時，對貼壁型細胞用1mL的胰蛋白酶-EDTA (0.25%)處理，並於5% CO2 中反應2分鐘。之後，加入5mL培養溶液，以便回收脫離培養瓶的細胞，然後於300×g下離心5分鐘。 以下表4顯示用於各癌細胞株之具體培養溶液的組成。 [表4]
組成 體積 最後濃度
產品 製造商 Cat.#
RPMI1640 (10% FBS) 主要組份 RPMI 1640 培養 基 (1×)，液體 Welgene LM011- 01 500 mL  
FBS HYCLONE™ SV30207.02 50 mL 10%
盤尼西林-鏈黴素溶液(×100) Welgene LS 202-02 0.5 mL 1×
高葡萄糖 RPMI1640 (10% FBS) 主要組份 高葡萄糖RPMI 1640培養基 ATCC 30-2001 500 mL  
FBS HYCLONE™ SV30207.02 50 mL 10%
盤尼西林-鏈黴素溶液(×100) Welgene LS 202-02 0.5 mL 1×
McCoy's (10% FBS) 主要組份 McCoy`s 5A(ATCC) ATCC 30-2007 500 mL  
FBS HYCLONE™ SV30207.02 50 mL 10%
盤尼西林-鏈黴素溶液(×100) Welgene LS 202-02 0.5 mL 1×
製備範例5 ，小鼠來源癌細胞株及其培養基的製備
CT26.WT，一種小鼠結腸癌細胞，購自ATCC (American Type Culture Collection, USA) (表5)。將待用於實驗的癌細胞解凍，置於細胞培養瓶中，在37℃，5% CO2 培育箱中(MCO-170M，Panasonic, Japan)培養。將細胞株移植那一天培養的細胞置於離心管中並收集，然後在125×g下離心5分鐘，去除上清液。之後，加入PBS製備細胞懸浮液(5x107 細胞/mL)，等份分配給9隻小鼠，並儲存在冰上直至投與。 [表5]
  來源生物 疾病 製造商 最後濃度
CT26 家鼷鼠，小鼠 結腸癌 ATCC 5×105
將胎牛血清(FBS；16000-044，Thermofisher scientific, USA)、盤尼西林-鏈黴素(10,000單位/mL盤尼西林及10,000㎍/mL鏈黴素；15140122, Thermofisher scientific, USA)及RPMI1640 (A1049101，Thermofisher scientific, USA)混合以獲得每100mL具有以下表6中所述的組成，用作癌細胞之培養基。 [表6]
組成 體積 最後濃度
產品 製造商 Cat.#
用於癌細胞的培 養基 FBS Thermofisher scientific 16000-044 10 mL 10%
盤尼西林& 鏈黴素 Thermofisher scientific 15140122 1 mL 10,000 U/mL 盤尼西林 & 10,000 ㎍/mL 鏈黴素
RPMI 1640 Thermofisher scientific A1049101 至100 mL  
製備範例6 ，癌小鼠模型之製備 製備範例6.1 ，實驗小鼠的隔離和馴化過程
從ORIENT BIO Inc.購入36隻雌性12周大BALB/c小鼠。在用於實驗室之前，先將小鼠帶至動物實驗室馴化5天。接到小鼠時，他們會評估外觀及稱體重。在5天的馴化期間，每天觀察一般症狀一次，且在馴化期結束時，測量體重，然後核對一般症狀及體重的變化，以評估小鼠的健康狀況。異常的小鼠在CO2 麻醉下安樂死。
有關實驗室小鼠之資訊總結並示於以下表7中。 [表7]
  來源品種 購自 年 齡 性別
小鼠 Balb/c OrientBio 12周大 雌性
製備範例6.2 ，癌細胞株的移植
在腫瘤抑制模型方面，在隔離及馴化期結束後隔天測量體重，然後將為健康動物準備的CT26細胞懸浮液(5×105 細胞/0.1mL)，裝在拋棄式針筒中，皮下投與至小鼠的右背(0.1mL/隻)進行移植。在細胞株移植後之植入及生長期間，每天觀察一般症狀一次。製備範例6.3 ，腫瘤生長抑制小鼠模型之分組
在CT26細胞移植一段時間後，測量沒有異常健康狀態之小鼠的腫瘤體積及體重，並分成4組(9隻/組)，以便各組的平均值達到50mm3 。Ⅳ. NK 細胞與融合蛋白二聚體的抗癌活性之測定：試管內 範例1 ，NK 細胞和/ 或融合蛋白二聚體對各種癌的癌細胞生長抑制作用之測定
參照用於96孔盤的盤設計，分別地將50μl的0.01%聚-L-鳥胺酸溶液(Cat#. P4957)(Sigma Aldrich, US)分配於孔中並進行包被。然後，置於室溫下1小時。1小時後，移除該分配的0.01%聚-L-鳥胺酸溶液，並於室溫下完全乾燥1小時。將2μl的CELLTRACKERTM Deep Red Dye (Cat# C34565)(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)加至以4×105 細胞/mL製備的癌細胞(標靶細胞)中，並容許在37℃及5% CO2 下反應60分鐘。
反應後，在300×g下對反應產物離心5分鐘。去除上清液，然後溶於RPMI1640 + 5% hABS培養溶液中至4×105 細胞/mL。分別將50μl製得的癌細胞分配於包被的96孔盤之孔中。然後，將製得的盤置於INCUCYTE® Live-Cell分析系統(Satorius, Germany)儀器中，之後容許穩定10分鐘。參考以下表8，將含測試材料之培養溶液配製於RPMI1640 + 5% hABS中。 [表8]
測試基質 對照 GI-101 CD80-Fc+Fc-IL2v2
濃度 0 nM 100 nM CD80-Fc：100 nM, Fc-IL2v2: 100 nM
通過懸浮於RPMI1640 + 5% hABS培養溶液中至4×105 細胞/mL製備自然殺手細胞(效應細胞)。參考以下表9，將於製備範例1及2中製得的自然殺手細胞加至具有分配癌細胞之各孔中，然後加入100μl用INCUCYTE® CytoTox (250 nM)處理的培養溶液。 [表9]
E/T 比 0/1 1/3 1/1 3/1 10/1
NK 細胞之數目 - 6.7×103 2×104 6×104 2×105
癌細胞之數目 2×104 2×104 2×104 2×104 2×104
之後，將其放入INCUCYTE® Live-Cell分析系統中以30分鐘之間隔分析3天。範例1.1 ，在有標靶癌細胞無NK 細胞之情況下，單獨融合蛋白二聚體之效率的測定
如以上範例1所述，當在僅有標靶癌細胞無NK細胞之存在下培養各種癌症類型之細胞株(K562、MDA-MB-231、HCT-116及A549細胞株)時，觀察到各別的測試材料GI-101及CD80-Fc+Fc-IL2v2沒有顯著地影響癌細胞之生存力(見表9，E/T比=0/1) (圖8至11)。範例1.2 ，NK 細胞及融合蛋白二聚體對K562 細胞( 淋巴母細胞) 之癌細胞增殖抑制作用
確認自然殺手細胞在K562細胞株，一種白血症癌細胞株，上的癌細胞殺傷能力。具體地，分別地確認當共培養作為標靶細胞(T)之K562細胞株與作為效應細胞(E)之自然殺手細胞，E/T比= 1/3、1/1、3/1及10/1時，以測試材料GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2作為組合材料處理的癌細胞生存力。
結果顯示，當自然殺手細胞殺傷癌細胞以對抗K562細胞株時，GI-101組合材料(其是IL2- Fc -CD80融合蛋白之形式)之處理，抑制癌細胞之生存力勝過CD80-Fc+Fc-IL2v2處理(圖12至15)。範例1.3 ，NK 細胞與融合蛋白二聚體對MDA-MB231 細胞之癌細胞增殖抑制作用。
確認自然殺手細胞在MDA-MB231細胞株，一種乳癌細胞株，中之癌細胞殺傷能力。具體地，分別地確認當共培養作為標靶細胞(T)之MDA-MB231細胞株與作為效應細胞(E)之自然殺手細胞，E/T比=1/3、1/1、3/1及10/1時，以測試材料GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理的癌細胞生存力。
結果顯示當自然殺手細胞殺傷癌細胞以對抗MDA-MB231細胞株時，GI-101組合材料(其是IL2-Fc-CD80融合蛋白之形式)之處理，抑制癌細胞之生存力勝過CD80-Fc+Fc-IL2v2處理(圖16至19)。範例1.4 ，NK 細胞與融合蛋白二聚體對HCT-116 細胞之癌細胞增殖抑制作用
確認自然殺手細胞在HCT-116細胞株，一種結腸癌細胞株，中之癌細胞殺傷能力。具體地，分別地確認當共培養作為標靶細胞(T)之HCT-116細胞株與作為效應細胞(E)之自然殺手細胞，E/T比=1/3、1/1、3/1及10/1時，以測試材料GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力。
結果顯示當自然殺手細胞殺傷癌細胞以對抗HCT-116細胞株時，GI-101組合材料(其是IL2-Fc-CD80融合蛋白形式)之處理，抑制癌細胞之生存力勝過CD80-Fc+Fc-IL2v2處理(圖20至23)。範例1.5 ，NK 細胞與融合蛋白二聚體對A549 細胞之癌細胞增殖抑制作用
確認自然殺手細胞在A549細胞株，一種結腸癌細胞株，中之癌細胞殺傷能力。具體地，分別地確認當共培養作為標靶細胞(T)之A549細胞株與作為效應細胞(E)之自然殺手細胞，E/T比=1/3、1/1、3/1及10/1時，以測試材料GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力。
結果顯示當自然殺手細胞殺傷癌細胞以對抗A549細胞株時，GI-101組合材料(其是IL2-Fc-CD80融合蛋白形式)之處理，抑制癌細胞之生存力勝過CD80-Fc+Fc-IL2v2處理(圖24至27)。Ⅴ. NK 細胞與融合蛋白二聚體在癌小鼠模型中之癌細胞殺傷能力的測定：活體內 範例2 ，mGI-101 及NK 細胞之投與
通過腹膜內途徑對癌小鼠模型投與製備範例4中獲得的mGI-101，通過靜脈途徑投與製備範例3中製得的小鼠來源NK細胞。在投與當天(腫瘤移植後第6天、第10天及第13天)使用拋棄式針筒(31G，1mL)進行一次投與，共3次。針對腫瘤生長抑制模型，如以下表10所示，待投與之細胞及投與劑量四組均不同(圖28)。 [表10]
組 投與細胞 hIgG4或mGI-101之劑量 (mg/kg) NK細胞之數量
G1 (對照) hIgG4 4 0
G2 hIgG4 + NK細胞 4 1×106
G3 單獨mGI101 0.6 0
G4 mGI101 + NK細胞 0.6 1×106
範例3 ，癌小鼠模型之腫瘤體積的測量
使用數位卡尺(mitutoyo, Japan)測量腫瘤之最大長度(L)及垂直寬度(W)一周二次，套用以下方程式1以計算腫瘤體積(TV)。 [方程式1] TV (mm3 ) = W × W × L × 0.5
使用以下方程式2計算腫瘤生長抑制百分比： [方程式2] 腫瘤生長抑制(%) = (1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100 Ti = 測試組於投與前之腫瘤體積 T0 = 測試組於投與後之腫瘤體積 Vi = 對照組於投與前之腫瘤體積 V0 = 對照組於投與後之腫瘤體積
投與前各個體的腫瘤體積設定為分組時測量的值。範例4 ，CT26 移植癌小鼠模型中腫瘤生長抑制作用之測定 範例4.1 ，腫瘤體積之測量
配製準備給健康Balb/c小鼠之CT26結直腸癌細胞懸浮液(5×105 細胞/0.1mL)，將製得的溶液裝在拋棄式針筒中，皮下投與至小鼠的右背(0.1mL/隻)進行移植。在腫瘤移植後，分別投與表10中所示的藥物。之後，在第10天、第13天及第17天測量腫瘤尺寸。與對照組(載具)相比，單獨用自然殺手(NK細胞)或mGI-101治療之組中，細胞腫瘤生長受到抑制。與對照組(載具)相比，用自然殺手(NK細胞)與mGI-101組合治療之組中，細胞腫瘤生長受到抑制。與單獨用自然殺手細胞或mGI-101相比，用自然殺手與mGI-101組合治療之組中，細胞腫瘤生長受到抑制(圖29)。範例4.2 ，腫瘤生長抑制分析
在實驗結束(腫瘤移植後，第17天)時，計算相較於藥物治療第1天(腫瘤移植後，第10天)之腫瘤生長抑制率。對照組(載具)有3隻小鼠具有腫瘤生長抑制30%以上，3隻具有腫瘤生長抑制率50%以上及2隻具有腫瘤生長抑制率80%。自然殺手細胞治療組有6隻具有腫瘤生長抑制率30%以上，5隻具有腫瘤生長抑制率50%以上及2隻具有腫瘤生長抑制率80%。mGI-101治療組有5隻具有腫瘤生長抑制率30%以上，5隻具有腫瘤生長抑制率50%以上及1隻小鼠具有腫瘤生長抑制率80%。自然殺手細胞與mGI-101組合治療組有7隻小鼠具有腫瘤生長抑制率30%以上，6隻具有腫瘤生長抑制率50%以上及3隻具有腫瘤生長抑制率80% (圖30)。在圖30中，黑長條表示腫瘤生長抑制率30%以上，淺灰色長條表示腫瘤生長抑制率50%以上及深灰色長條表示腫瘤生長抑制率80%以上。範例4.3 ，個別實驗動物之腫瘤體積的測量
測定各治療組中個別實驗動物之腫瘤生長。具體地，測定對照組(載具)、自然殺手細胞(NK細胞)、mGI-101及自然殺手細胞+mGI-101治療組中個別實驗動物之腫瘤生長，並示於圖31中。在圖31中，虛線表示腫瘤尺寸為500 mm3 ，實線表示腫瘤尺寸為250 mm3 。
更具體地，測定對照組中個別實驗動物之腫瘤生長程度並示於圖32中，及測定自然殺手細胞治療組中個別實驗動物之腫瘤生長程度並示於圖33中。此外，測定mGI-101治療組中個別實驗動物之腫瘤生長程度並示於圖34中及測定自然殺手細胞與mGI-101組合治療組中個別實驗動物之腫瘤生長程度並示於圖35中。
(無)
圖1是本發明中所使用的融合蛋白二聚體之實施例的示意圖。
圖2顯示確認所獲得的融合蛋白二聚體(GI-101)之SDS-PAGE影像。
圖3顯示所獲得的融合蛋白二聚體(GI-101)之粒徑篩析層析法(SEC)的分析。
圖4顯示確認所獲得的Fc-IL2v2融合蛋白之SDS-PAGE影像。
圖5顯示所獲得的Fc-IL2v2融合蛋白之粒徑篩析層析法(SEC)的分析。
圖6顯示確認所獲得的hCD80-Fc融合蛋白之SDS-PAGE影像。
圖7顯示所獲得的hCD80-Fc融合蛋白之粒徑篩析層析法(SEC)的分析。
圖8顯示在無自然殺手細胞之情況下單獨培養K562細胞株(E/T比= 0/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2處理之癌細胞生存力結果。在此情況下，E表示作為效應細胞之NK細胞，T表示作為標靶細胞之K562癌細胞株。
圖9顯示在無自然殺手細胞之情況下單獨培養MDA-MB-231細胞株(E/T比=0/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2處理之癌細胞生存力結果。在此情況下中，E表示作為效應細胞之NK細胞，T表示作為標靶細胞之MDA-MB-231癌細胞株。
圖10顯示在無自然殺手細胞之情況下單獨培養HCT-116細胞株(E/T比=0/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2處理之癌細胞生存力結果。在此情況下，E表示作為效應細胞之NK細胞，T表示作為標靶細胞之HCT-116癌細胞株。
圖11顯示在無自然殺手細胞之情況下單獨培養A549細胞株(E/T比=0/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2處理之癌細胞生存力結果。在此情況下，E表示作為效應細胞之NK細胞，T表示作為標靶細胞之A549癌細胞株。
圖12顯示在共培養K562細胞株(標靶細胞)與自然殺手細胞(效應細胞)，E/T比=1/3時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
在此，Y軸=0表示在起始接種時癌細胞之生存力訊號(紅色訊號)範圍設為0。Y軸＞0是接種後發現癌細胞生存力訊號範圍增加之情況，表示細胞增殖率快於細胞死亡率(細胞增殖率＞細胞死亡率)。即，可視為癌細胞數增加。然而，一般認為增加的值越低，則越能抑制癌細胞的增殖。同時，假如測得的存活癌細胞面積小於起始接種時測得的存活癌細胞面積，則表示為負值，其表示細胞增殖率低於細胞死亡率(細胞增殖率＜細胞死亡率)。即，與在起始接種時測得的面積相比，面積減少表示為負值。因此，提示負值越大可能不僅與癌細胞增殖的抑制有關，而且與癌細胞死亡有關。
圖13顯示在共培養K562細胞株與自然殺手細胞(E/T比=1/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖14顯示在共培養K562細胞株與自然殺手細胞(E/T比=3/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖15顯示在共培養K562細胞株與自然殺手細胞(E/T比=10/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖16顯示在共培養MDA-MB231細胞株與自然殺手細胞(E/T比=1/3)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖17顯示在共培養MDA-MB231細胞株與自然殺手細胞(E/T比=1/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖18顯示在共培養MDA-MB231細胞株與自然殺手細胞(E/T比=3/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖19顯示在共培養MDA-MB231細胞株與自然殺手細胞(E/T比=10/1)時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖20顯示在共培養HCT-116細胞株(標靶細胞)與自然殺手細胞(效應細胞) ，E/T比=1/3時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖21顯示在共培養HCT-116細胞株與自然殺手細胞，E/T比=1/1時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖22顯示在共培養HCT-116細胞株與自然殺手細胞，E/T比=3/1時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖23顯示在共培養HCT-116細胞株與自然殺手細胞，E/T比=10/1時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖24顯示在共培養A549細胞株(標靶細胞)與自然殺手細胞(效應細胞) ，E/T比=1/3時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖25顯示在共培養A549細胞株與自然殺手細胞，E/T比=1/1時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖26顯示在共培養A549細胞株與自然殺手細胞，E/T比=3/1時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖27顯示在共培養A549細胞株與自然殺手細胞，E/T比=10/1時，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2之組合材料處理之癌細胞生存力結果。
圖28是顯示對CT26移植癌小鼠模型進行mGI-101和/或NK細胞組合療法之投與時間表的示意圖。
圖29顯示對CT26移植癌小鼠模型共投與自然殺手細胞與mGI-101之腫瘤生長抑制作用的結果。
圖30顯示對CT26移植癌小鼠模型共投與自然殺手細胞與mGI-101之腫瘤生長抑制百分比。
圖31顯示在CT26移植癌小鼠模型中，各治療組(載具、NK細胞、mGI-101、NK細胞 + mGI-101)之個別實驗動物之腫瘤生長測量值。
圖32顯示在CT26移植癌小鼠模型中，載具組之個別實驗動物的腫瘤生長測量值。
圖33顯示在CT26移植癌小鼠模型中，NK細胞治療組之個別實驗動物的腫瘤生長測量值。
圖34顯示在CT26移植癌小鼠模型中，mGI-101治療組之個別實驗動物的腫瘤生長測量值。
圖35顯示在CT26移植癌小鼠模型中，自然殺手細胞與mGI-101共投與組之個別實驗動物的腫瘤生長測量值。
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(無)

Claims (20)

  1. 一種含有IL-2變異體及CD80蛋白或CD80片段之融合蛋白在製備藥學組成物之用途，該藥學組成物用於與自然殺手(NK)細胞組合以治療癌症，其中該IL-2變異體包含序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個胺基酸之取代，其中該CD80片段包含CD80蛋白之胞外結構域。
  2. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該IL-2變異體及該CD80蛋白透過一連接子附接。
  3. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該IL-2變異體包含序列辨識編號：10之胺基酸序列中R38A與F42A之取代。
  4. 如請求項3之融合蛋白的用途，其中該IL-2變異體進一步包含至少一個選自於由下列所構成之群組之取代：序列辨識編號：10之胺基酸序列中的Y45A、E61R及L72G。
  5. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該IL-2變異體含有任一個選自於下列序列辨識編號：10之胺基酸序列中的取代組合(a)至(d)：(a)R38A/F42A(b)R38A/F42A/Y45A(c)R38A/F42A/E61R(d)R38A/F42A/L72G。
  6. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該IL-2變異體具有序列辨識編號：6、22、23或24之胺基酸序列。
  7. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該CD80蛋白具有序列辨識編號：11之胺基酸序列。
  8. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該CD80片段由序列辨識編號：11中第35個至第242個胺基酸構成。
  9. 如請求項2之融合蛋白的用途，其中該連接子是白蛋白或免疫球蛋白之Fc結構域。
  10. 如請求項9之融合蛋白的用途，其中該Fc結構域是野生型Fc結構域或Fc結構域變異體。
  11. 如請求項9之融合蛋白的用途，其中該Fc結構域具有序列辨識編號：4之胺基酸序列。
  12. 如請求項10之融合蛋白的用途，其中該Fc結構域變異體具有序列辨識編號：12之胺基酸序列。
  13. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該融合蛋白由下列結構式(I)或(II)構成：N'-X-[連接子(1)]n-Fc結構域-[連接子(2)]m-Y-C' (I) N'-Y-[連接子(1)]n-Fc結構域-[連接子(2)]m-X-C' (II)其中，在該結構式(I)及(II)中，N'是該融合蛋白之N端，C'是該融合蛋白之C端，X是CD80蛋白，Y是IL-2變異體，該連接子(1)及(2)是胜肽連接子，及n及m各獨立地為0或1。
  14. 如請求項13之融合蛋白的用途，其中該連接子(1)是由序列辨識編號：3之胺基酸序列構成的胜肽連接子。
  15. 如請求項13之融合蛋白的用途，其中該連接子(2)是由序列辨 識編號：5之胺基酸序列構成的胜肽連接子。
  16. 如請求項13之融合蛋白的用途，其中該融合蛋白由該結構式(I)構成。
  17. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該融合蛋白與序列辨識編號：9、26、28或30之胺基酸序列具有85%以上的序列一致性。
  18. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該融合蛋白是二聚體。
  19. 如請求項1之融合蛋白的用途，其中該癌症是選自於由下列所構成之群組中之任一者：胃癌、肝癌、肺癌、結直腸癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、急性淋巴母細胞白血病、腦瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
  20. 一種用於治療癌症的藥學組成物，其包含作為活性成份之含有IL-2變異體及CD80蛋白或CD80片段之一融合蛋白以及一自然殺手(NK)細胞，其中該IL-2變異體包含序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個胺基酸之取代，其中該CD80片段包含CD80蛋白之胞外結構域。
TW109141895A 2019-11-27 2020-11-27 包含含有il-2蛋白及cd80蛋白之融合蛋白與自然殺手細胞的用於治療癌症的藥學組成物 TWI785426B (zh)

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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3175457A1 (en) * 2020-03-18 2021-09-23 Gi Innovation, Inc. Pharmaceutical composition for treating cancer, comprising fusion protein comprising il-2 protein and cd80 protein and anticancer drug

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229109A (en) * 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
EP2079833A1 (en) * 2006-11-14 2009-07-22 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts Compositions and methods for immunotherapy
EP3202415B1 (en) * 2010-06-30 2021-12-08 Compugen Ltd. Fusion protein comprising a c1orf32 polypeptide and one or more domains of an immunoglobulin heavy chain constant region for treatment of multiple sclerosis, rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders.
EP3075745B1 (en) 2011-02-10 2018-09-05 Roche Glycart AG Mutant interleukin-2 polypeptides
US8956619B2 (en) * 2011-10-25 2015-02-17 University Of Maryland, Baltimore County Soluble CD80 as a therapeutic to reverse immune supression in cancer patients
AU2016350701B2 (en) * 2015-11-02 2021-08-19 Five Prime Therapeutics, Inc. CD80 extracellular domain polypeptides and their use in cancer treatment
KR102379464B1 (ko) * 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
BR112019017329A2 (pt) * 2017-04-03 2020-04-14 Hoffmann La Roche imunoconjugados, um ou mais polinucleotídeos e vetores, métodos para a produção de um imunoconjugado, tratamento de uma doença e para a estimulação do sistema imunológico, composição, uso do imunoconjugado, invenção e usos da composição
WO2019109980A1 (zh) * 2017-12-06 2019-06-13 科济生物医药（上海）有限公司 嵌合蛋白、表达嵌合蛋白的免疫效应细胞及其应用
EP3715367B1 (en) * 2018-09-17 2024-06-12 GI Innovation, Inc. Fusion protein comprising il-2 protein and cd80 protein, and use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
期刊 Gäken J.A., et al., "Irradiated NC Adenocarcinoma Cells Transduced with Both B7.1 and Interleukin-2 Induce CD4+-Mediated Rejection of Established Tumors", Human Gene Therapy, Vol. 8, 2008, page: 477-488. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP7488337B2 (ja) 2024-05-21
KR20210065874A (ko) 2021-06-04
JP2023504414A (ja) 2023-02-03
EP4067481A1 (en) 2022-10-05
CA3157575A1 (en) 2021-06-03
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