PT1868635T - Métodos para tratar distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto com moléculas mutantes solúveis de ctla4 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODOS PARA TRATAR DISTÚRBIOS IMUNES ASSOCIADOS A TRANSPLANTAÇÃO DE ENXERTO COM MOLÉCULAS MUTANTES SOLÚVEIS ΠΤΤ xjai i i-iM*»

PEDIDO RELACIONADO

O presente pedido reivindica o benefício de prioridade sob o Título 35 § 119Çe) do Pedido provisório dos Estados Unidos N° 6Q™668.ÉÉ4, depositado em 6 de Abril de 2005. CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a moléculas mutantes solúveis de CTLA4 para utilização no tratamento de distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Dado o papel central das célula T em rejeição a transplante, um objetivo comum entre as terapêuticas imunosupressoras atuais é bloquear a ativação e função de células T ÇSayegh MH, Turka LA. The role of T-cell costimulatory activation pathways in transplantation rejection. N Engl J Med 1998; 338Ç25) : 1813-21) . As células T requerem um sinal antigénio-específico ÇSinal 1) e co-estimulador ÇSinal 2) para ativação total ÇLenschow DJ, Walunas TL, Bluestone JA. CD2S™BE system of T cell costimulation. Annu Rev Immunol 1996; 14: 233-58). Uma das vias co-estimuladoras melhor caraterizadas envolve a interação de CD2S-CD80™86 ÇBÉ-1™2) ÇLinsley PS, Ledbetter JA. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annu Rev Immunol 1993; 11: 191-212). 0 antigénio 4 de linfócito-T citotóxico ÇCTLA4) se I iga ao CD8G™86 com maior atividade do que a CD28 e é transitoriamente expresso sobre células T após sua ativação, onde ele interrompe a interação entre CD28 e CD80™86 ÇOosterwegel MA, Greenwald RJ, Mandelbrot DA, Lorsbach RB, Sharpe AH. CTLA-4 e T cell activation. Curr

Opin Immunol 199S; 11Ç3): 294-300.). Isto cria um sinal de retroalimentação negativo para a ativação de células T. A intervenção nesta via foi anteriormente buscada com CTLA4Ig. CTLA4Ig tem sido usado com sucesso como uma estratégia para tratar distúrbios autoimunes mediados por células T, tais como artrite reumatoide ÇKremer JM, Westhovens R, Leon M, et al. Treatment of rheumatoid arthritis by selective inhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA4Ig. N Engl J Med 2003; 349Ç20) : 190É-15) e psoríase ÇAbrams JR, Lebwohl MG, Guzzo CA, et al. CTLA4Ig-mediated blockade of T-cell costimulation in patients with psoriasis vulgaris. J Clin Invest 1999; 103Ç9): 1243-52). LEA29Y tem sido estudado em modelos de transplante em primatas não-humanos em separado e em combinação com outros agentes imunossupressores. Christian Larsen, et al. ÇC. Larsen, T. Pearson, A. Adams, P. Tso, N. Shirasugi, E. Strobert, D. Anderson, S. Cowan, K. Price, J. Naemura, J. Emswiler, J. Greene, L.A. Turk, J. Bajorath, R. Townsend, D. Hagerty, P. Linsley e R. Peach; Rational Development of LEA29Y Çbelatacept), a High- Afinnity Variant of CTLA4-Ig with Potent Immunosuppressive Properties; American Journal of Transplantation; Vol. 5, Edição 3, Março de 2005, página 443) mostraram a atividade imunossupressora intensificada do LEA29Y em comparação com CTLA4-Ig num modelo com primata não-humano utilizado para estudar a rejeição a aloenxerto renal. LEA29Y foi administrado intra-operatoriamente Ç10 mg™kg intravenosamente), no dia 4 Ç15 mg™kg) e nos dias 14, 28, 42, 56 e É0 pós-operatórios Ç20 mg™kg intravenosamente). CTLA4Ig Ç16 mg™kg) foi administrado intra-operatoriamente e nos dias 4, 8, 11 e 16 pós-operatórios. O regime de tratamento também incluía MMF Ç15 mg™kg bid s.c. nos dias 0-14, qd nos dias 15-180), metilprednisolona Çinjeção subcutânea de acordo com o seguinte esquema, dia 0: 20 mg, dia 1: 16 mg, dia 3: 8 mg, dia 4: 4 mg, dia 5-14: 3 mg, dia 15-180: 1 mg) e basiliximab Ç0,3 gm™kg intravenoso, nos dias 0 e 4) . A sobrevivência de recetores com aloenxerto renal tratados com LEA29Y era claramente superior àquela de um grupo tratado com CTLA4-Ig, a despeito de concentrações comparáveis no soro. Recetores de controlo tratados com albumina mostraram um tempo de sobrevivência média similar ao grupo tratado com CTLA4-Ig. Contudo, a despeito do tratamento em andamento com LEA29Y, todos os recetores experimentaram um declínio significativo na função renal Çelevação da creatinina no soro).

Andrew Adams, et al. ÇA. Adams, N. Shirasugi, T. Jones, M. Durham, E. Strobed, S. Cowan, P. Rees, R. Hendrix, K. Price, N. Kenyon, D, Hagerty, R, Townsend, D. Hollenbaugh, T. Pearson e C. Larsen; Development of a Chimeric Anti-CD40 Monoclonal Antibody That Synergizes with LEA29Y to Prolong Islet Allograft Survival; The Journal of Immunology; Janeiro de 2005; 1É4; página 542) mostraram que a combinação de LEA29Y e Chi220 Çum mab anti-CD40 humano quimérico) atua sinergisticamente num modelo com primata não-humano de transplantação de ilhota pancreática para prolongar a sobrevivência em aloenxerto. LEA29Y foi administrado intravenosamente intra-operatoriamente Ç20 mg™kg); nos dias 4, É e 14 pós-operatórios; então, a cada 2 semanas até o dia 100. Doses adicionais Ç20 mg™kg) foram administradas mensalmente no decorrer de 6 meses. Quatro protocolos foram testados: 1) LEA29Y em separado, 2) Chi220 Çanti-CD40), 3) LEA29Y combinado com Chi220 e 4) LEA29Y combinado com anti-CD20.

Andrew Adams, et al. ÇA. Adams, N. Shirasugi, M. Durham, E. Strobert, D. Anderson, P. Rees, S. Cowan, H. Xu, Y. Blinder, M. Cheung, D. Hollenbaugh, N. Kenyon, T. Pearson e C. Larsen; Calcineurin Inhibitor-Free CD28 Blockade-Based Protocol Protects Allogeneic Islets in Nonhuman Primates; Diabetes, Vol. 51Ç2), Fevereiro de 2002, página 265) mostraram que a combinação de LEA29Y, rapamicina e mAb anti-IL-2R prolongou significativamente a sobrevivência em aloenxerto de ilhota. Em um modelo com primata não-humano de transplantação de ilhota pancreática, LEA29Y foi administrado intravenosamente intra-operatoriamente Ç10 mg™kg) e no dia 4 pós-operatório Ç15 mg™kg). Doses adicionais de 20 mg™kg foram fornecidas no dia 14 pós-operatório e a cada 2 semanas, até o dia 154 pós-operatório.

Durante 2003, mais de 25.000 órgãos foram transplantados nos EUA. Transplantação de rim representou aproximadamente 60 % dos transplantes de órgão sólido, seguido por transplante de fígado a 21 %, coração a 8 %, pulmão a 4 % e os Ê % restantes representados por outros órgãos, tais como pâncreas e intestino ÇOPTN™SRTR Annual Report 2004 em www.optn.org).

Transplantação renal é o tratamento mais eficaz para doença renal em estágio final. Ele proporciona sobrevivência e qualidade de vida ÇQoL) aperfeiçoadas. Manutenção de um transplante renal em funcionamento requer terapêutica imunossupressora pelo resto da vida para impedir destruição imune do enxerto. Regimes imunossupressores atuais proporcionam taxas de sobrevivência de 1 ano de 89 % para enxertos cadavéricos e de 98 % para aqueles de dadores vivo. Ao longo do tempo, contudo, há perda progressiva de indivíduos e enxertos. Sobrevivência de cinco anos para transplantes renais de dador cadavérico e vivo é de 66 % e É9 %, respetivamente ÇlJnited Network for Organ Sharing Renal Transplantation Registry 2003 em www.unos.org).

As causas mais comuns de perda de indivíduo e enxerto a longo prazo são doença cardiovascular e nefropatia crónica por aloenxerto ÇCAN), respetivamente ÇL.C. Paul, Chronic allograft nephropathy - A model of impaired repair rom injury? Nephrol Dial Transplant 2000; 15: 149-151)

Paradoxalmente, as principais terapêuticas para transplantação renal, os inibidores de calcineurina ÇCNI), CsA e tacrolimus, contribuem diretamente para a perda de aloenxerto e morte do indivíduo a longo prazo, uma vez que elas são inerentemente nefrotóxicas e também causam ou exacerbam os riscos cardiovasculares, incluindo hipertensão, hipercolesterolemia e diabetes mellitus. Todavia, esses agentes formam a pedra fundamental de todos os regimes imunossupressores convencionais para transplantação renal.

No momento, não há agentes aprovados que possam substituir os CNI como terapêutica de manutenção principal numa ampla gama de indivíduos. Um agente, sirolimus Çrapamicina, Rapamune da Wyeth™Ayerst), foi aprovado para utilização num regime sem CNI. CNI, contudo, ainda devem ser usados com sirolimus durante pelo menos 3 meses pós-transplantação. De modo mais importante, o sirolimus foi aprovado como um agente sem CNI nesse ambiente apenas para indivíduos com risco baixo a moderado de perda de enxerto. Assim, para aqueles com maior risco de perda de enxerto, nos quais evitar os efeitos nefrotóxicos dos CNI seria de grande benefício, não hã alternativa aprovada aos CNI.

Portanto, há uma necessidade médica não satisfeita de agentes imunossupressores que possam proporcionar controlo aceitável da resposta aloimune comparável ao padrão de terapêuticas práticas sem toxicidades que contribuem para a morte do indivíduo e perda de enxerto a longo prazo. De uma maneira ideal, o agente seria útil não apenas em indivíduos com baixo risco, mas também em indivíduos com maior risco de perda de enxerto.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma molécula mutante de CTLA4 para utilização no tratamento de distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto como definido nas reivindicações. A molécula mutante de CTLA4 compreende um domínio extracelular de CTLA4 como mostrado na SEQ ID NO: 8 que começa com alanina na posição 2 6 ou metionina na posição 2É e que termina com ácido aspãrtico na posição 150, em que no domínio extracelular uma alanina na posição 55 é substituída com uma tirosina, e uma leucina na posição 130 é substituída com um ácido glutâmico. As moléculas mutantes para a utilização médica da invenção podem incluir também uma segunda sequência de aminoãcidos que aumenta a solubilidade da molécula mutante.

Um exemplo de uma molécula mutante de CTLA4 para a utilização médica da invenção é L104EA29YIg ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4), como descrito no presente documento. Uma outra molécula mutante de CTLA4 descrita no presente documento é L104EIg ÇFigura 8, SEQ ID NOS: 5 e 6) . L104EA2 9YIg e L104EIg ligam-se a CD80 e CD86 mais avidamente que CTLA4Ig. 0 tratamento compreende um regime em fase precoce e um regime em fase de manutenção e em que Çi) o regime em fase precoce varia dos primeiros 3 a 6 meses pós-transplantação e compreende a administração da molécula mutante de CTLA4 a um indivíduo no dia 1, visita na semana 2, visita na semana 4 e então mensalmente até a visita no mês 3 numa dosagem de 10 mg™kg de peso do indivíduo, e Çii) o regime em fase de manutenção começa após o regime em fase precoce terminar e envolve a administração que não é mais frequente que mensalmente de uma dose eficaz da molécula mutante de CTLA4 a um indivíduo de modo a proporcionar uma concentração sérica mínima da molécula mutante de CTLA4 entre cerca de 0,2 p.g™ml e cerca de 3 ug™ml durante o regime em fase de manutenção. Assim, na fase precoce, as doses são

tipicamente mais altas e a frequência de administração é aumentada durante o período de maior risco imunolõgico. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a análise de ligação de equilíbrio de L104EA29YIg, L104EIg e CTLA4Ig do tipo selvagem a CD86Ig.

As Figuras 2A À 2B ilustram dados de ensaios de FACS que mostram a ligação de L1Q4EA2.9YIg, L104EIg e CTLA4Ig a células CEO transfetadas com CD80 ou CD86 humano, conforme descrito no Exemplo 2, infra.

As Figuras 3A À 3B representam a inibição de proliferação de células CHO CD80-positivas e CD86-positivas, conforme descrito no Exemplo 2, infra.

As Figuras 4A Ã 4B mostram que L104EA2 9YIg é mais eficaz do que CTLA4Ig na inibição de proliferação de células T aloestimuladas primárias e secundárias, conforme descrito no Exemplo 2, infra.

As Figuras 5A-C ilustram que L104EA29YIg é mais eficaz do que CTLA4Ig na inibição de produção das citocinas IL-2 ÇFIG. 5A) , IL-4 ÇFIG. 5B) e γ-interferão ÇFIG. 5C) por células T humanas aloestimuladas, conforme descrito no Exemplo 2, infra. A Figura 6 demonstra que L104EA29YIg é mais eficaz do que CTLA4Ig na inibição de proliferação de células T de macaco estimuladas com fitohemaglutinina ÇPHA), conforme descrito no Exemplo 2, infra. A Figura É ÇSEQ ID NOS: 3 e 4) representa uma sequência de nucleõtidos e aminoácidos de uma molécula mutante de CTLA4 Ç"L104EA29YIg") que compreende um péptido sinalizador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 que começa na metionina na posição +1 e que termina no ácido aspártico na posição +124 ou que começa na alanina na posição -1 e que termina no ácido aspártico na posição +124; e uma região de Ig conforme descrito no Exemplo 1, infra. SEQ ID NOS: 3 e 4 representam uma sequência de nucleótidos e aminoácidos, respetivamente, de uma molécula mutante de CTLA4 Ç"L104EA29YIg") que compreende um péptido sinalizador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 que começa na metionina na posição +2É e que termina no ácido aspãrtico na posição Ê150 ou que começa na alanina na posição Ê2 6 e que termina no ácido aspártico na posiçãoÊ150; e uma região de Ig. A Figura 8 ÇSEQ ID NOS: 5 e 6) representa uma sequência de nucleótidos e aminoácidos de uma molécula mutante de CTLA4 Ç"L104EIg") que compreende um péptido sinalizador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 que começa na metionina na posição Ê1 e que termina no ácido aspártico na posição Ê124 ou que começa na alanina na posição -1 e que termina no ácido aspártico na posição Ê124; e uma região de Ig, conforme descrito no Exemplo 1, infra. SEQ ID NOS: 5 e 6 representam uma sequência de nucleótidos e aminoácidos, respetivamente, de uma molécula mutante de CTLA4 Ç"L104EIg") que compreende um péptido sinalizador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 que começa na metionina na posição Ê2É e que termina no ácido aspãrtico na posição Ê150 ou que começa na alanina na posição Ê2 6 e que termina no ácido aspártico na posição Ê150; e uma região de Ig. A Figura 9 ÇSEQ ID NOS: É e 8) representa uma sequência de nucleótidos e aminoácidos de uma CTLA4Ig que tem um péptido sinalizador; uma sequência de aminoácido do tipo selvagem do domínio extracelular de CTLA4 que começa na metionina na posição Ê1 ao ácido aspãrtico na posição Ê124 ou que começa na alanina na posição -1 ao ácido aspártico na posição Ê124; e uma região de Ig. SEQ ID NOS: É e 8 representam uma sequência de nucleótidos e aminoácidos, respetivamente, de uma CTLA4Ig que compreende um péptido sinalizador; uma sequência de aminoácido do tipo selvagem do domínio extracelular de CTLA4 que começa na metionina na posição Ê2É e que termina no ácido aspãrtico na posição Ê150 ou que começa na alanina na posição Ê26 e que termina no ácido aspãrtico na posição Ξ150; e uma região de Ig.

As Figuras 10A-C são um gel de SDS ÇFIG. 10A) para C-TLA4Ig Çpista 1) , L104EIg Çpista 2) e L104EA29YIg Çpista 3A); e cromatografia por exclusão de tamanho de CTLA4Ig ÇFIG. 10B) e L104EA29YIg ÇFIG. 10C).

As Figuras 11A e 11B ilustram um diagrama de fita da dobra semelhante a V da Ig extracelular de CTLA4 gerada a partir da estrutura em solução determinada através de espetroscopia por RMN. A FIG. 11B mostra uma vista expandida da região S25-R33 e da região MYPPPY indicando a localização e orientação de cadeia lateral das mutações que intensificam a avidez, L104 e A2 9 . A Figura 12 representa um diagrama esquemático de um vetor, piLN-L104EA29Y, que tem o inserto L104EA29YIg.

A Figura 13 representa a sequência de nucleótido e de aminoácido do recetor de CTLA4 ÇSEQ ID NOS: 9 e 10). DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

Todos os termos técnicos e científicos usados no presente pedido têm os significados comummente usados na especialidade, a não ser que de outro modo especificado. Conforme usado no presente pedido, as palavras ou frases a seguir têm os significados especificados.

Conforme usado no presente documento, "ligando" refere-se a uma molécula que reconhece especificamente e liga-se à outra molécula, por exemplo, um ligando para CTLA4 é uma molécula BÉ.

Conforme usado no presente documento, "CTLA4 do tipo selvagem" ou "CTLA4 não mutada" tem a sequência de aminoácido da CTLA4 de comprimento total de ocorrência natural, conforme mostrado na Figura 13 ÇSEQ ID NOS: 9 e 10; também conforme descrito nas Patentes U.S. N° 5.434.131, 5.844.095, 5.851.É95) ou qualquer porção ou derivado da mesma, que reconhece e se liga à BÉ ou interfere com a BÉ, de modo que ele bloqueia a ligação ao CD2 8 e™ou CTLA4 Çpor exemplo, CD2 8 e™ou CTLA4 endógeno) . Nas moléculas de CTLA4 do tipo selvagem, o domínio extracelular de CTLA4 do tipo selvagem começa com metionina na posição Ê1 e termina no ácido aspártico na posição Ê124 ou o domínio extracelular de CTLA4 do tipo selvagem começa com alanina na posição -1 e termina no ácido aspártico na posição Ê124, CTLA4 do tipo selvagem é uma proteína da superfície celular, que tem um domínio extracelular N-terminal, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático C- terminal. 0 domínio extracelular liga-se a moléculas alvo, tal como uma molécula BÉ. Numa célula, a proteína CTLA4 de ocorrência natural do tipo selvagem é traduzida como um polipéptido imaturo, o qual inclui um péptido sinalizador na extremidade N-terminal, 0 polipéptido imaturo sofre processamento pós-traducional, o qual inclui clivagem e remoção do péptido sinalizador para gerar um produto da clivagem de CTLA4 que tem uma extremidade N-terminal recentemente gerada que difere da extremidade N- terminal na forma imatura. Aqueles versados na especialidade apreciarão que processamento pós-traducional adicional pode ocorre, o qual remove um ou mais dos aminoácidos da extremidade N-terminal recentemente gerada do produto da clivagem de CTLA4. Alternativamente, o péptido sinalizador pode não ser removido completamente, gerando moléculas que começam antes do aminoácido inicial comum metionina. Assim, a proteína CTLA4 madura pode começar na metionina na posição Ê1 ou alanina na posição - 1. A forma madura da molécula de CTLA4 inclui o domínio extracelular ou qualquer porção do mesmo, o qual se liga à BE . "CTLA4Ig" é uma proteína de fusão solúvel que compreende um domínio extracelular de CTLA4 do tipo selvagem unido a uma cauda de Ig ou uma porção do mesmo que se liga à BÉ. Uma CTLA4Ig pode compreender o domínio extracelular de CTLA4 do tipo selvagem Çconforme mostrado na Figura 9, SEQ ID NOS: É e 8) que começa na metionina na posição Ê1 e que termina no ácido aspártico na posição Ê124; ou que começa na alanina na posição -1 ao ácido aspártico na posição Ê124; um resíduo de aminoácido na junção de glutamina na posição Ê125; e uma imunog1obu1ina porção abrangendo ácido glutâmico na posição Ê126 à lisina na posição Ê35É ou glicina na posição Ê356 ÇADN que codifica CTLA4Ig foi depositado em 31 de Maio de 1991 na Coleção Americana de Culturas Celulares ÇATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 sob as condições do Tratado de Budapeste e foi atribuído o número de acesso de ATCC ATCC 68629; Linsley, P., et al, , 1994 Immunity 1: É93-80. CTLA4Ig-24, uma linha de células de Ovário de Hámster Chinês ÇCHO) que expressa CTLA4Ig, foi depositada em 31 de Maio de 1991 com número de identificação da ATCC CRL-10É62). As moléculas solúveis de CTLA4Ig podem ou não incluir uma sequência de péptido sinalizador Çlíder),

Conforme usado no presente documento, uma "proteína de fusão" é definida como uma ou mais sequências de aminoãcidos unidas juntas usando métodos bem conhecidos na especialidade e conforme descrito na Patente US N° 5.434.131 ou 5.63É.481. As sequências de aminoácidos unidas, desse modo, formam uma proteína de fusão.

Conforme usado no presente documento, "solúvel" refere-se a qualquer molécula ou fragmentos e derivados da mesma, não ligados ou fixados a uma célula, isto é, em circulação. Por exemplo, CTLA4, BÉ ou CD28 pode ser tornada solúvel através de fixação de uma porção de imunog1obulina Çlg) ao domínio extracelular de CTLA4, BÉ ou CD28, respetivamente. Alternativamente, uma molécula, tal como CTLA4, pode ser tornada solúvel através de remoção de seu domínio transmembrana.

Conforme usado no presente documento, "o domínio extracelular de CTLA4" é a porção de CTLA4 que reconhece e se liga a ligandos de CTLA4, tal como moléculas BÉ. Por exemplo, um domínio extracelular de CTLA4 compreende metionina na posição Ê1 ao ácido aspártico na posição Ê124 ÇFigura 13, SEQ ID NOS: 9 e 10) . Alternativamente, um domínio extracelular de CTLA4 compreende alanina na posição -1 ao ácido aspártico na posição Ê124 ÇFigura 13, SEQ ID NOS: 9 e 10). 0 domínio extracelular inclui fragmentos ou derivados de CTLA4 que se ligam a uma molécula BÉ. 0 domínio extracelular de CTLA4, conforme mostrado na Figura 13 ÇSEQ ID NOS: 9 e 10), pode também incluir mutações que alteram a avidez de ligação da molécula de CTLA4 por uma molécula BÉ.

Conforme usado no presente documento, uma "molécula mutante de CTLA4" significa CTLA4 do tipo selvagem conforme mostrado em ÇSEQ ID NOS: 9 e 10) ou qualquer porção ou derivado da mesma, que tem uma mutação ou múltiplas mutações Çde preferência no domínio extracelular de CTLA4 do tipo selvagem) . Uma molécula mutante de CTLA4 tem uma sequência que é similar, mas não idêntica, à sequência da molécula de CTLA4 do tipo selvagem, mas ainda se liga à BÉ.

As mutações podem incluir um ou mais resíduos de aminoácido substituídos por um aminoácido que tem estrutura ou propriedades químicas conservantes Çpor exemplo, substituir uma leucina por uma isoleucina) ou não-conservativa Çpor exemplo, substituir uma glicina por um triptofano), deleções, adições, desvios de rede ou truncamentos de aminoácido. Moléculas mutantes de CTLA4 podem incluir uma molécula de não-CTLA4 na mesma ou presa à mesma. As moléculas mutantes podem ser solúveis Çisto é, em circulação) ou estar ligadas a uma superfície celular. Moléculas mutantes de CTLA4 adicionais incluem aquelas descritas nos Pedidos de Patente US Números de Série 09™865.321, 60™214.Q65 e 60™28É.5É6; nas Patentes U.S. Números 6.090.914, 5.844.095 e 5.ÉÉ3.253; e conforme descrito por Peach, R. J., et al. em J Exp Med 180: 2049- 2058 Ç1994)). Moléculas mutantes de CTLA4 podem ser feitas sintética ou recombinantemente. "L104EA29YIg" é uma proteína de fusão que é uma molécula mutante de CTLA4 solúvel que compreende um domínio extracelular de CTLA4 do tipo selvagem com alterações de aminoãcido A29Y Çum resíduo de aminoácido tirosina substituindo uma alanina na posição 29) e L104E Çum resíduo de aminoãcido ácido glutâmico substituindo uma leucina na posição Ê104) ou uma porção do mesmo que se liga a uma molécula BÉ, unido a uma cauda de Ig Çincluída na Figura É, SEQ ID NOS: 3 e 4; ADN que codifica L104EA29YIg foi depositado em 20 de Junho de 2000 na ATCC sob o número PTA-2104; Pedidos de Patente US co-pendentes Números de Série 09™5É9.9 2 É, 60™28É.5É6 e 60™214,065. As moléculas solúveis de L104EA2 9YIg usadas na utilização médica da invenção podem ou não incluir uma sequência de péptido sinalizador Çlíder). Tipicamente, nos métodos e™ou kits da invenção, as moléculas não incluem uma sequência de péptido sinalizador.

Conforme usado no presente documento, o termo "mutação" significa uma alteração na sequência de nucleótidos ou aminoãcidos de uma molécula do tipo selvagem, por exemplo, uma alteração na sequência de ADN e™ou de aminoãcido do domínio extracelular de CTLA4 do tipo selvagem. Uma mutação em ADN pode alterar um códão, levando a uma alteração na sequência de aminoãcidos. Uma alteração de ADN pode incluir substituições, deleções, inserções, união alternativa ou truncamentos. Uma alteração de aminoácido pode incluir substituições, deleções, inserções, adições, truncamentos ou erros de processamento ou clivagem da proteína. Alternativamente, mutações numa sequência de nucleótido podem resultar numa mutação silenciosa na sequência de aminoãcido, conforme é bem compreendido na especialidade. A esse respeito, determinados codões de nucleótido codificam o mesmo aminoácido. Exemplos incluem os codões de nucleótido CGU, CGG, CGC e CGA que codificam o aminoãcido arginina ÇR); ou codões GAU e GAC que codificam o aminoãcido ácido aspártico ÇD). Assim, uma proteína pode ser codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que diferem quanto à sua sequência de nucleõtidos específica, mas ainda codifica moléculas de proteína que tem sequências idênticas. A sequência de codificação de aminoácidos é como se segue:_

A molécula mutante pode ter uma ou mais mutações.

Conforme usado no presente documento, uma "sequência de proteína de não-CTLA4" ou "molécula de não-CTLA4" significa qualquer molécula de proteína que não se liga à BÉ e não interfere com a ligação de CTLA4 a seu alvo. Um exemplo inclui, mas não se limita a, uma região constante de imunoglobulina Çlg) ou porção da mesma. De preferência, a região constante de Ig é uma região constante de Ig humana ou de macaco, por exemplo, CÇgama)1 humana, incluindo as regiões de dobradiça, CH2 e CH3. A região constante de Ig pode sofrer mutação para reduzir suas funções efetuadoras ÇPatentes US 5.63É.481, 5.844.095 e 5.434.131).

Conforme usado no presente documento, a "fragmento" ou "porção" é qualquer parte ou segmento de uma molécula de CTLA4, de preferência o domínio extracelular de CTLA4 ou uma parte ou segmento do mesmo, que reconhece e se liga a seu alvo, por exemplo, uma molécula BÉ. 0 domínio extracelular de CTLA4 pode incluir mutações que alteram a avidez de ligação da molécula de CTLA4 por uma molécula BÉ.

Conforme usado no presente documento, "BÉ" refere-se à família de moléculas BÉ que inclui, mas não se limita a, BÉ-1 ÇCD80) , BÉ-2 ÇCD86) e BÉ-3 que podem reconhecer e se ligar à CTLA4 e™ou CD28.

Conforme usado no presente documento, "células BÉ-positivas" são quaisquer células com um ou mais tipos de moléculas BÉ expressadas sobre a superfície celular.

Conforme usado no presente documento, um "derivado" é uma molécula que partilha homologia de sequência e atividade de sua molécula precursora. Por exemplo, um derivado de CTLA4 inclui uma molécula solúvel de CTLA4 que tem uma sequência de aminoácido pelo menos ÉO % similar ao domínio extracelular de CTLA4 do tipo selvagem e a qual reconhece e liga-se à BÉ, por exemplo, CTLA4Ig ou a molécula mutante solúvel de CTLA4 L104EA29YIg,

Conforme usado no presente documento, "regular" uma resposta imune é ativar, estimular, regular positivamente, inibir, bloquear, regular negativamente ou modificar a resposta imune. As doenças autoimunes descritas no presente documento podem ser tratadas através de regulação de uma resposta imune, por exemplo, através de regulação de interações células CTLA4- e™ou CD28-posit.ivas funcionais com células BÉ- positivas. Por exemplo, um método para regulação de uma resposta imune compreende colocar em contato as células BÉ-positivas com uma molécula solúvel de CTLA4 como descrito no presente documento de modo a formar complexos solúveis de CTLA4™BÉ, a molécula solúvel de CTLA4 interfere na reação de uma molécula de CTLA4 e™ou CD28 endógena com a dita molécula BÉ.

Conforme usado no presente documento, "bloquear" ou "inibir" um recetor, sinal ou molécula significa interferir na ativação do recetor, sinal ou molécula, conforme detetado através de um teste reconhecido na especialidade. Bloqueio ou inibição pode ser parcial ou total. Por exemplo, o bloqueio de uma resposta imune mediada por célula pode ser detetado através da determinação da funcionalidade do transplante, tal como as concentrações de creatinina no soro após transplantação renal.

Conforme usado no presente documento, "bloqueio de interação com BÉ" significa interferir na ligação de BÉ a seus ligandos, tais como CD28 e™ou CTLA4, desse modo, obstruindo as interações células T- e células BÉ-positivas. Exemplos de agentes que bloqueiam a interação com a BÉ incluem, mas não se limitam a, moléculas, tal como um anticorpo (ou porção ou derivado do mesmo) que reconhece e se liga a qualquer uma das moléculas de CTLA4, CD28 ou BÉ Çpor exemplo, BÉ-l, BÉ-2); uma forma solúvel Çou porção ou derivado da mesma) das moléculas, tal como CTLA4 solúvel; um fragmento peptídico ou outra molécula pequena projetada para interferir no sinal celular através de interação mediada por CTLA4™CD28™BÉ. Numa forma de realização preferida, o agente de bloqueio é uma molécula mutante solúvel de CTLA4, tal como L104EA29YIg ÇATCC PTA-2104).

Conforme usado no presente documento, "tratar" ou "tratamento de" um distúrbio ou doença significa tratar uma doença ou distúrbio através de terapêuticas medicinais ou outras. Tratamento de uma doença ou distúrbio pode suprimir eventos mediados pelo sistema imune associados a uma doença, aliviar os sintomas de uma doença ou distúrbio, reduzir a gravidade de uma doença ou distúrbio, alterar o curso de progressão da doença ou distúrbio e™ou aliviar ou curar o problema básico da doença ou distúrbio. Por exemplo, tratar um distúrbio imune associado a transplantação de enxerto pode ser realizado através de regulação de uma resposta imune, por exemplo, através de regulação de interações funcionais de células CTLA4- e™ou CD28-positivas com células BÉ-positivas. Alternativamente, o tratamento de uma doença ou distúrbio imune pode ser realizado através de prevenção ou inibição de ocorrência ou progressão da doença ou distúrbio através da utilização das composições descritas no presente documento. Por exemplo, tratamento de rejeição a transplante renal inclui inibição de rejeição a transplante renal, conforme medido através da taxa de filtração glomerular ÇGFR). Por exemplo, tratamento de distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto inclui profilaxia de rejeição de órgão através de administração de L104EA29YIg. Ainda, tratamento de distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto pode prolongar a sobrevivência do hospedeiro e do órgão transplantado.

Conforme usado no presente documento, "doença do sistema imune" inclui qualquer doença mediada através de interações de células T com células BÉ-positivas que inclui, mas não se limita a, doenças autoimunes, doenças imunoproliferativas e distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto.

Conforme usado no presente documento, "distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto" significa qualquer doença relacionada a transplante mediada através de interações de células T com células BÉ-positivas que inclui, mas não se limita a, distúrbios imunes associados a rejeição a transplantação de enxerto, distúrbios relacionados a enxerto, doença enxerto versus hospedeiro ÇGVHD) Çpor exemplo, tal como pode resultar de transplante de medula óssea ou na indução de tolerância) , rejeição do enxerto ou transplante, incluindo rejeição aguda ao enxerto ou transplante e rejeição crónica ao enxerto ou transplante. 0 enxerto pode ser aloenxertos ou xenoenxertos de órgãos sólidos, aloenxertos ou xenoenxertos de tecido ou célula ou aloenxertos ou xenoenxertos de anatomia externa que inclui, mas não se limita a, pele, células da ilhota Çtambém conhecidas como ilhotas), músculos, hepatócitos, neurõnios, coração, fígado, rim, pulmão, apêndice, membros, nariz, orelha ou face.

Conforme usado no presente documento, doenças imunoproliferativas incluem, mas não estão limitadas a, linfoma de células T; leucemia linfoblástica aguda de células T; linfoma de células T angiocêntrico testicular; e angiite linfocítica benigna.

Conforme usado no presente documento doenças autoimunes incluem, mas não estão limitadas a, doenças tais como lúpus Çpor exemplo, lúpus eritematoso, nefrite por lúpus), psoríase; tiroidite de Hashimoto, mixedema primário, doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença de Addison, diabetes Çpor exemplo, diabetes mellitus dependente de insulina, diabetes mellitus do tipo I, diabetes mellitus do tipo II), sindrome de Goodpasture, miastenia gravis, pênfigo, doença de Crohn, doença do intestino inflamatório ÇIBD), oftalmia simpatética, uveíte autoimune, esclerose múltipla, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia idiopãtica, cirrose biliar primária, hepatite de ação crónica, colite ulcerativa, síndrome de Sjogren, doenças reumáticas Çpor exemplo, artrite reumatoide, artrite psoriática), polimiosite, escleroderma e doença mista do tecido conetivo.

De forma que a invenção descrita no presente documento possa ser mais totalmente compreendida, a descrição a seguir é apresentada.

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS A presente invenção proporciona uma nova classe de terapêutica imunossupressora para transplantação que se liga a moléculas BÉ sobre a superfície de células que apresentam antigénio ÇAPCs) inibindo a co-estimulação requerida para ativação de células T. As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 para a utilização médica da invenção diferem dos imunossupressores existentes pela distribuição limitada de seu alvo molecular e especificidade de seu efeito. As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 que reconhecem e se ligam ao CD80 e™ou CD86. Em algumas formas de realização, os mutantes de CTLA4 solúvel têm uma maior avidez pelo CD80 e™ou CD86 do que pela CTLA4Ig. Por exemplo, L104EA29YIg liga-se aproximadamente 2 vezes mais avidamente do que a CTLA4Ig do tipo selvagem Çno presente documento depois dita como CTLA4Ig) ao CD80 e aproximadamente 4 vezes mais avidamente ao CD86. Esta ligação mais forte resulta no fato de o L104EA29YIg ser mais eficaz do que a CTLA4Ig no bloqueio de respostas imunes.

Além disso, métodos para tratamento de doenças do sistema imune são descritos no presente documento. Os métodos compreendem a administração de uma composição terapêutica que compreende as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento a um indivíduo numa quantidade eficaz para aliviar pelo menos um dos sintomas associados a doenças do sistema imune. Adicionalmente, as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento podem proporcionar terapêutica a longo prazo para doenças do sistema imune através de bloqueio de interações células T™células BÉ-positivas, desse modo, bloqueando a ativação de células T™estimulação através de sinais co-estimuladores, tal como Ligação de BÉ a CD28, levando à indução de anergia ou tolerância a células T. Doenças do sistema imune incluem, mas não se limitam a, doenças autoimunes, doenças imunoproliferativas e distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto discutidos acima.

Também se descrevem no presente documento métodos para a indução de tolerância num indivíduo que tem distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto através da administração de uma composição terapêutica que compreende as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento.

As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento exibem propriedades inibidoras in vivo. Sob condições onde as interações de células T™células BÉ-positivas, por exemplo, interações de células T™células B, estão a ocorrer como um resultado do contato entre as células T e células BÉ- positivas, a ligação das moléculas mutantes de CTLA4 introduzidas para reagir com células BÉ-positivas, por exemplo células B, pode interferir, isto é, inibir, as interações de células T™células BÉ-positivas resultando na regulação de respostas imunes.

Além disso, métodos para a regulação de respostas imunes são descritos no presente documento. Respostas imunes reguladas negativamente Çreduzidas) pelas moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento podem ser por meio de inibição ou bloqueio de uma resposta imune jã em progresso ou pode envolver a prevenção da indução de uma resposta imune. As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento podem inibir as funções de células T ativadas, tais como proliferação de linfócitos T, secreção de citocina e™ou produção de citocina, através de supressão de respostas de células T ou através de indução de tolerância específica a células T ou ambos. Ainda, as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento que interferem com a via CTLA4™CD28™BÉ podem inibir a proliferação de células T e™ou secreção de citocina e, assim, resultam em destruição tecidual e indução de não responsividade de células T ou anergia reduzidas.

As moléculas mutantes de CTLA4 descritas no presente documento compreendem pelo menos o domínio extracelular de CTLA4 ou porções do mesmo que se ligam ao CD80 e™ou CD86. A porção extracelular de uma molécula mutante de CTLA4 compreende uma sequência de aminoácidos que começa com metionina na posição Ê1 ao ácido aspãrtico na posição Ê124 (Figura É, SEQ ID NOS: 3 e 4; ou Figura 8, SEQ ID NOS: 5 e 6). Alternativamente, a porção extracelular da CTLA4 pode compreender uma sequência de aminoácidos que começa com alanina na posição -1 ao ácido aspártico na posição Ê124 (Figura É, SEQ ID NOS: 3 e 4; ou Figura 8, SEQ ID NOS: 5 e 6) .

As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento podem ser proteínas de fusão que compreendem o domínio extracelular de CTLA4 que tem uma ou mais mutações numa região de uma sequência de aminoácidos que começa com serina em Ê25 e que termina com arginina em Ê33 (S25-R33) . Por exemplo, a alanina na posição Ê29 da CTLA4 do tipo selvagem pode ser substituída por tirosina (codões: UAU, UAC) . Alternativamente, a alanina pode ser substituída por leucina Çcodões: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG) , fenilalanina Çcodões: UUU, UUC), triptofano Çcõdão: UGG) ou treonina Çcodões: ACU, AGO, ACA, ACG) . Conforme os peritos na especialidade compreenderão prontamente, o nucleótido uracilo ÇU) de uma sequência de ARN corresponde ao nucleótido timina ÇT) da sequência de ADN.

Além disso, as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento as quais são proteínas de fusão compreendem o domínio extracelular de CTLA4 que tem uma ou mais mutações em ou próximo de uma região de uma sequência de aminoãcidos que começa com metionina em Ê9É e que termina com glicina em Ê10É ÇM9É-G10É). Por exemplo, a leucina na posição Ê104 da CTLA4 do tipo selvagem pode ser substituída por ácido glutâmico Çcodões: GAA, GAG). Uma molécula mutante de CTLA4 que tem esta substituição é dita no presente documento como L104EIg ÇFigura 8, SEQ ID NOS: 5 e 6) .

Além disso, as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento as quais são proteínas de fusão compreendem o domínio extracelular de CTLA4 que tem uma ou mais mutações nas regiões S25-R33 e M9É-G10É. Por exemplo, uma molécula mutante de CTLA4 pode compreender tirosina na posição Ê29 ao invés de alanina; e ácido glutâmico na posição Ê104 ao invés de leucina. Uma molécula mutante de CTLA4 que tem essas substituições é dita no presente documento como LlQ4EA29YIg ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4). A molécula de ácido nucleico que codifica L104EA29YIg está contida no pD16 L104EA29YIg e foi depositada em 19 de Junho de 2000 na Coleção Americana de Culturas Celulares ÇATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 ÇATCC N° PTA-2104). 0 vetor pD16 LlG4EA29YIg é um derivado do vetor pcDNA3 ÇINVITROGEN).

A molécula mutante solúvel de CTLA4 para a utilização médica da invenção pode compreender um domínio extracelular de um mutante de CTLA4 conforme mostrado na Figura É ÇSEQ ID NOS: 3 e 4) e uma fração que altera a solubilidade, afinidade e™ou valência de uma molécula mutante de CTLA4.

De acordo com uma prática da invenção, a fração pode ser uma região constante de imunoglobulina ou porção da mesma, por exemplo, um ou mais de um domínio CHI, dobradiça, domínio CH2 ou domínio CH3. Para utilização in vivo, é preferido que a região constante de imunoglobulina não estimule uma resposta imune prejudicial no indivíduo. Por exemplo, em protocolos clínicos, pode ser preferido que as moléculas mutantes incluam regiões constantes de imunoglobulinas humanas ou de macaco ou porção das mesmas. Exemplos de domínios de imunoglobulina adequados incluem, mas não se limitam a, IgCyl ÇlgCgamal), IgCy2 ÇIgCgama2), IgCv3 ÇIgCgama3), IgCy4 ÇIgCgama4), IgCp ÇlgCmu), IgCal ÇlgCalfal) , IgCa:2 ÇIgCalfa2), IgCõ ÇlgCdelta) ou IgCe ÇlgCépsilon). Outros isotipos são possíveis. Ainda, outras regiões constantes de imunoglobulina ou porção das mesmas são possíveis Çde preferência, outras regiões constantes de imunoglobulina fracamente ou não-imunogénicas ou porção das mesmas).

Para protocolos clínicos, é preferido que a fração de imunoglobulina não estimule uma resposta imune prejudicial num indivíduo. A porção preferida é a região constante de imunoglobulina ou porção da mesma, incluindo as regiões constantes de imunoglobulina humanas ou de macaco ou porções das mesmas. Um exemplo de uma região de imunoglobulina adequada é Cyl humana, incluindo as regiões de dobradiça, CH2 e CH3, as quais podem mediar funções efetuadoras, tais como ligação a recetores Fc, mediação de citotoxicidade complemento-dependente ÇCDC) ou mediação de citotoxicidade mediada por célula anticorpo-dependente ÇADCC) . A fração de imunoglobulina pode ter uma ou mais mutações na mesma Çpor exemplo, no domínio CH2, para reduzir funções efetuadoras, tais como CDC ou ADCC), onde a mutação modula a capacidade de ligação da imunoglobulina a seu ligando, através de aumento ou diminuição da capacidade de ligação da imunoglobulina a recetores Fc. Por exemplo, mutações na fração de imunoglobulina podem incluir alterações em qualquer ou todos os seus resíduos de cisteína dentro do domínio de dobradiça, por exemplo, as cisternas nas posições Ê130, Ê136 e Ê139 são substituídas por serina ÇFigura 9, SEQ ID NO: 8). A fração de imunoglobulina pode também incluir a prolina na posição Ê148 substituída por uma serina, conforme mostrado na Figura 9 ÇSEQ ID NO: 8) . Ainda, as mutações na fração de imunoglobulina podem incluir ter a leucina na posição Ê144 substituída por fenilalanina, leucina na posição ÊI45 substituída por ácido glutãmico ou glicina na posição Ê14É substituída por alanina. Exemplos de frações de imunoglobulina incluem aquelas descritas nas Publicações de Patente US N° 2002™0114814 AI e 2Q04™0151É25 AI, Patentes US N° 6.444.É92 e 6.É50.334 e documento WO 9É™2826É.

Outras frações incluem marcadores polipeptídicos. Exemplos de marcadores adequadas incluem, mas não se limitam a, a molécula p9É, a molécula env gpl20, a molécula EÉ e a molécula ova ÇDash, B., et al. Ç1994) J. Gen. Virol. É5: 1389-9É; Ikeda, T., et al. Ç1994) Gene 138: 193-6; Falk, K., et al. Ç1993) Cell. Immunol. 150: 44É-52; Fujisaka, K. , et al. Ç1994) Virology 204: É89-93). Outras moléculas para utilização como marcadores são possíveis ÇGerard, C., et al. Ç1994) Neuroscience 62: É21-É39; Byrn, R-, et al. , J. Virol. Ç1989) 63: 43É0-43É5; Smith, D., et al., Ç198É) Science 238; 1É04-1É0É; Lasky, L, Ç1996) Science 233: 203-212).

As proteínas de fusão mutantes solúveis de CTLA4Ig para utilização na utilização médica da invenção são de preferência mais reativas com o antigénio CD80 e™ou CD86 comparado com a CTLA4 do tipo selvagem. Um exemplo é L104EA29YIg, conforme mostrado na Figura É ÇSEQ ID NOS: 3 e 4) .

Noutra forma de realização, a molécula mutante solúvel de CTLA4 inclui um resíduo de aminoácido na junção, o qual está localizado entre a porção de CTLA4 e a porção de imunoglobulina. 0 aminoácido de junção pode ser qualquer aminoácido, incluindo glutamina, 0 aminoácido de junção pode ser introduzido através de métodos de síntese molecular ou química conhecidos 11a especialidade.

Noutra forma de realização, a molécula mutante solúvel de CTLA4 inclui a porção de imunoglobulina Çpor exemplo, domínios de dobradiça, CH2 e CH3), onde qualquer um ou todos os resíduos de cisteína, dentro do domínio de dobradiça da porção de imunoglobulina são substituídos por serina, por exemplo, as cisternas nas posições Ê130, Ê136 ou Ê139 ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4) . A molécula mutante pode também incluir a prolina na posição Ê148 substituída por uma serina, conforme mostrado na Figura É ÇSEQ ID NOS: 3 e 4) . A molécula mutante solúvel de CTLA4 pode incluir uma sequência de péptido sinalizador ligada à extremidade N-terminal do domínio extracelular da porção de CTLA4 da molécula mutante. 0 péptido sinalizador pode ser qualquer sequência que permita a secreção da molécula mutante, incluindo o péptido sinalizador de oncostatina M ÇMalik, et al., Ç1989) Molec. Cell. Biol. 9: 284É-2853) ou CD5 ÇJones, N. H., et al. , Ç1986) Nature 323: 346-349) ou o péptido sinalizador de qualquer proteína extracelular. A molécula mutante pode incluir o péptido sinalizador de oncostatina M ligado na extremidade N-terminal do domínio extracelular de CTLA4 e a molécula de imunoglobulina humana Çpor exemplo, dobradiça, CH2 e CH3) ligada a extremidade C-terminal do domínio extracelular de CTLA4. Esta molécula inclui o péptido sinalizador de oncostatina M que abrange uma sequência de aminoácidos que tem metionina na posição -26 a alanina na posição -1, a porção de CTLA4 que abrange uma sequência de aminoácidos que tem metionina na posição Ξ1 ao ácido aspãrtico na posição Ê124, um resíduo de aminoãcido de junção de glutamina na posição Ê125 e a fração de imunoglobulina que abrange uma sequência de aminoácidos que tem ácido glutâmico na posição Ê126 à lisina na posição Ê35É ou glicina na posição Ê356.

As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 para a utilização médica da invenção podem ser obtidas através de métodos de síntese molecular ou química. Os métodos moleculares podem incluir as seguintes etapas: introdução de uma célula hospedeira adequada com a molécula de ácido nucleico que expressa e codifica a molécula mutante solúvel de CTLA4; cultura da célula hospedeira assim introduzida sob condições que permitem que a célula hospedeira expresse as moléculas mutantes; e isolamento das moléculas mutantes expressas. A porção de péptido sinalizador da molécula mutante permite que as moléculas de proteína sejam expressas sobre a superfície celular e sejam segregadas pela célula hospedeira. As moléculas mutantes traduzidas podem sofrer modificação pós-traducional, envolvendo clivagem do péptido sinalizador para produzir uma proteína madura que tem as porções de CTLA4 e de imunoglobulina. A clivagem pode ocorrer após a alanina na posição -1, resultando numa molécula mutante madura que tem metionina na posição Ê1 como o primeiro aminoácido ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4). Alternativamente, a clivagem pode ocorrer após a metionina na posição -2, resultando numa molécula mutante madura que tem alanina na posição -1 como o primeiro aminoácido. 0 perito na especialidade estará ciente que a expressão de L104EA29YIg em células de mamífero pode resultar na produção de variantes N- e C- terminais, de modo que as proteínas produzidas podem ter a sequência de aminoácidos dos resíduos: Çi) Ê1 a Ê35É, Çii) -1 a Ê35É; Çiii) Ê1 a Ê356 ou Çiv) -1 a 356 ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4) ,

Uma forma de realização preferida é a utilização médica de uma molécula mutante solúvel de CTLA4 que tem o domínio extracelular de CTLA4 humana ligado a toda ou uma porção da molécula de imunoglobulina humana Çpor exemplo, dobradiça, CH2 e CH3) . Esta molécula preferida inclui a porção de CTLA4 da molécula solúvel que abrange uma sequência de aminoácidos que tem metionina na posição Ê1 ao ácido aspãrtico na posição Ê124, um resíduo de aminoácido de junção de glutamina na posição Ê125 e a fração de imunoglobulina que abrange ácido glutâmico na posição Ê126 à lisina na posição Ê35É ou glicina na posição Ê356. A porção que tem o domínio extracelular de CTLA4 sofre mutação, de modo que a alanina na posição Ê29 é substituída por tirosina e a leucina na posição Ê104 é substituída por ácido glutâmico. A porção de imunoglobulina da molécula mutante pode sofrer mutação, de modo que as cisteínas nas posições Ê130, Ê136 e Ê139 são substituídas por serina e a prolina na posição Ê148 é substituída por serina. Esta molécula mutante é designada no presente documento como L104EA29YIg ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4) .

Noutra forma de realização, L104EA29YIg é uma molécula mutante que tem uma sequência de aminoácidos que tem alanina na posição -1 ao ácido aspãrtico na posição Ê124, um resíduo de aminoácido de junção de glutamina na posição Ê125 e a porção de imunoglobulina que abrange ácido glutâmico na posição Ê126 Çpor exemplo, Ê126 à lisina na posição Ê35É ou glicina na posição Ê356). A porção que tem o domínio extracelular de CTLA4 sofre mutação, de modo que a alanina na posição Ê29 é substituída por tirosina; e a leucina na posição Ê104 é substituída por ácido glutâmico. A porção de imunoglobulina da molécula mutante sofre mutação, de modo que as cisteínas nas posições Ê130, Ê136 e Ê139 são substituídas por serina e a prolina na posição Ê148 é substituída por serina. Esta molécula mutante é designada no presente documento como L104EA29YIg ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4). Após a sequência sinalizadora ter sido clivada, L104EA29YIg pode começar com a metionina na posição Ê1 ou começar com alanina na posição -1.

Outra molécula mutante descrita no presente documento é uma molécula mutante solúvel de CTLA4 que tem o domínio extracelular de CTLA4 humana ligada à molécula de imunoglobulina humana Çpor exemplo, dobradiça, CH2 e CH3) . Esta molécula inclui a porção da sequência de aminoácidos que codifica CTLA4 que começa com metionina na posição Ê1 ao ácido aspãrtico na posição Ê124, um resíduo de aminoãcido de junção de glutamina na posição Ê125 e a porção de imunoglobulina que abrange uma sequência de aminoácidos que tem ácido glutâmico na posição Ê126 à lisina na posição Ê35É ou glicina na posição Ê356, A porção que tem o domínio extracelular de CTLA4 sofre mutação, de modo que a leucina na posição Ê104 é substituída por ácido glutâmico. A porção de dobradiça da molécula mutante sofre mutação, de modo que as cisternas nas posições Ê130, Ê136 e Ê139 são substituídas por serina e a prolina na posição Ê148 é Substituída por serina. Esta molécula mutante é designada no presente documento como Li04EIg ÇFigura 8, SEQ ID NOS: 5 e 6).

Alternativamente, uma L104EIg pode ser uma molécula mutante solúvel de CTLA4 que tem um domínio extracelular de CTLA4 humana ligado a uma molécula de imunoglobulina humana Çpor exemplo, dobradiça, CH2 e CH3). Esta molécula inclui a porção de CTLA4 que abrange uma sequência de aminoácidos que começa com alanina na posição -1 ao ácido aspártico na posição Ê124, um resíduo de aminoácido de junção de glutamina na posição Ê125 e a porção de imunoglobulina que abrange ácido glutâmico na posição Ê126 à lisina na posição Ê35É ou glicina na posição Ê356. A porção que tem o domínio extracelular de CTLA4 sofre mutação, de modo que a leucina na posição Ê104 é substituída por ácido glutâmico. A porção de dobradiça da molécula mutante sofre mutação, de modo que as cisternas nas posições Ê130, Ê136 e Ê139 são substituídas por serina e a prolina na posição Ê148 é substituída por serina. Esta molécula mutante é designada no presente documento como L104EIg ÇFigura 8, SEQ ID NOS: 5 e 6) .

Em formas de realização adicionais da invenção, a molécula mutante solúvel de CTLA4 tem: Ça) uma primeira sequência de aminoácidos de uma glicoproteína de membrana, por exemplo, CD28, CD86, CD80, CD40 e gp39, a qual bloqueia a proliferação de células T, fundida a uma segunda sequência de aminoácidos; Çb) a segunda sequência de aminoácidos sendo um fragmento do domínio extracelular da CTLA4 mutante o qual bloqueia a proliferação de células T tal como, por exemplo, uma molécula de aminoãcido que compreende metionina na posição Ê1 ao ácido aspártico na posição Ê124 ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4); e Çc) uma terceira sequência de aminoácidos a qual atua como uma etiqueta de identificação ou intensifica a solubilidade da molécula. Por exemplo, a terceira sequência de aminoácidos pode consistir essencialmente de resíduos de aminoácido das regiões de dobradiça, CH2 e CH3 de uma molécula de imunoglobulina não- imunogénica. Exemplos de moléculas de imunoglobulina adequadas incluem, mas não se limitam a, imunoglobulina humana ou de macaco, por exemplo, IgCYl. Outros isotipos são também possíveis.

Também se descreve no presente documento um método para tratamento de um distúrbio imune associado a transplantação de enxerto através da administração, a um indivíduo, de uma dose eficaz de uma molécula mutante de CTLA4 com um domínio extracelular de CTLA4, conforme mostrado em SEQ ID NO: 8, que começa com alanina na posição 2 6 ou metionina na posição 2É e que termina com ácido aspártico na posição 150 ou uma porção da mesma. Adicionalmente, no domínio extracelular ou porção do mesmo, uma alanina na posição 55 e substiturda por uma tirosina θ uma leucina na posição 130 é substituída por um ácido glutâmico. Ainda, o regime de administração compreende um regime de fase precoce, em que o regime de fase precoce pode variar dos primeiros 3 a 6 meses pós-transplante e envolve a administração que inicialmente é mais frequente do que mensalmente.

Adicionalmente, descreve-se no presente documento um método para tratamento de um distúrbio imune associado a transplantação de enxerto através da administração, a um indivíduo, de uma dose eficaz de uma molécula mutante de CTLA4 com uma sequência de aminoácidos que começa com metionina na posição 2É e que termina com ácido aspártico na posição 15 0 de SEQ ID NO: 4 ou com uma sequência de aminoácidos que começa com alanina na posição 26 e que termina com ácido aspártico na posição 150 de SEQ ID NO: 4. Ainda, um regime de administração de molécula mutante de CTLA4 compreende um regime de fase precoce, em que o regime de fase precoce pode variar dos primeiros 3 a 6 meses põs-transplante e envolve administração que inicialmente é mais frequente do que mensalmente.

Descrevem-se moléculas de ácido nucleico adicionais que compreendem sequências de nucleótidos que codificam as sequências de aminoácidos correspondentes às moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento. A molécula de ácido nucleico pode ser um ADN Çpor exemplo, ADNc) ou um híbrido da mesma. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico podem ser ARN ou um híbrido do mesmo.

As sequências de nucleótidos descritas no presente documento podem estar compreendidas por um vetor. Além disso, um sistema de vetor hospedeiro é descrito no presente documento. 0 sistema de vetor hospedeiro compreende o vetor numa célula hospedeira adequada. Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem, mas não se limitam a, células procariotas e eucariotas.

Além disso, as composições farmacêuticas são descritas no presente documento para utilização no tratamento de distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto que compreende doses farmaceuticamente eficazes de moléculas mutantes solúveis de CTLA4. Os distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto podem ser mediados por interações de células CD28- e™ou CTLA4-positivas com células CD80- e™ou CD86-positivas. As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 são, de preferência, moléculas de CTLA4 que tem uma ou mais mutações no domínio extracelular de CTLA4. A composição farmacêutica pode incluir moléculas mutantes solúveis de proteína de CTLA4 e™ou moléculas de ácido nucleico e™ou vetores que codificam as moléculas. Em formas de realização preferidas, as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 têm a sequência de aminoácidos do domínio extracelular de CTLA4, conforme mostrado na Figura É ÇSEQ ID NOS: 3 e 4), L104EA29Y, conforme descrito no presente documento. As composições podem, adicionalmente, incluir outros agentes terapêuticos que inclui, mas não se limita a, toxinas de fãrmaco, enzimas, anticorpos ou conjugados.

As composições farmacêuticas também incluem, de preferência, veículos e adjuvantes adequados os quais incluem qualquer material o qual, quando combinado com a molécula mutante de CTLA4 para a utilização médica da invenção Çpor exemplo, uma molécula mutante solúvel de CTLA4, tal como, L104EA29Y) retém a atividade da molécula e é não-reativo com o sistema imune do indivíduo. Exemplos de veículos e adjuvantes adequados incluem, mas não se limitam a, albumina de soro humano; permutadores de iões; alumina; lecitina; substâncias tampão, tais como fosfatos; glicina; ácido sórbico; sorbato de potássio,· e sais e eletrólitos, tal como sulfato de protamina. Outros exemplos incluem qualquer um dos veículos farmacêuticos padrões, tais como uma solução salina tamponada com fosfato; água; emulsões, tais como emulsões õleo™ãgua; e vários tipos de agentes de umedecimento. Outros veículos podem também incluir soluções estéreis; tabletes, incluindo tabletes revestidos e cápsulas. Tipicamente, tais veículos contêm excipientes, tais como amido, leite, açúcar, determinados tipos de argila, gelatina, ácido esteárico ou sais do mesmo, estearato de cálcio ou magnésio, talco, gorduras ou óleos vegetais, gomas, glicóis ou outros excipientes conhecidos, tais veículos podem também incluir aditivos de aroma e cor ou outros ingredientes. As composições que compreendem tais veículos são formuladas através de métodos convencionais bem conhecidos. Tais composições também podem ser formuladas dentro de várias composições lipídicas tais como, por exemplo, lipossomas, bem como em várias composições poliméricas, tais como microesferas poliméricas.

As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser administradas usando modos de administração convencionais que incluem, mas não se limitam a, administração intravenosa Çi.v.), administração intraperitoneal Çi.p.), administração intramuscular Çi.m.), administração subcutânea, administração oral, administração como um supositório ou como um contato tópico ou o implante de um dispositivo com liberação lenta, tal como uma bomba miniosmótica, ao indivíduo.

As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem estar numa variedade de formas as quais incluem, mas não se limitam a, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microveículos adesivos, lipossomas e soluções injetáveis ou passíveis de infusão. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

Uma composição farmacêutica para administração intravenosa Çi.v.) é listada a seguir.

Composição de L104EA29YIg liofilizada 100 mg/produto de fármaco no frasco

O produto de fármaco liofilizado pode ser constituído com um veículo aquoso. 0 veículo aquoso de interesse no presente documento é um o qual é farmaceuticamente aceitável Çseguro e não-tóxico para administração a um ser humano) e ê útil para a preparação de uma formulação líquida, após liofilização. Tipicamente, o produto de fármaco liofilizado é constituído para cerca de 25 mg™ml com 10 ml de Água Estéril para Injeção, USP ÇSWFI) ou Cloreto de Sódio a 0,9 % para Injeção, USP. A solução reconstituída ainda é diluída para concentrações de produto de fármaco entre 1 e 10 mg™ml com Cloreto de Sódio para Injeção a 0,9 %, USP. 0 produto de fármaco diluído para injeção é isotõnico e adequado para administração através de infusão intravenosa.

Um tensioativo pode ser adicionado à formulação numa quantidade suficiente para reduzir ou impedir a interação do produto de fármaco constituído com uma seringa siliconizada. 0 modo de administração e regime de dosagem mais eficaz para as composições descritas no presente documento dependem da gravidade e curso da doença, da saúde do paciente e resposta ao tratamento e julgamento do médico que prescreve o tratamento. Consequentemente, as dosagens Çtambém conhecidas como doses) das composições deverão ser tituladas ao paciente individual.

As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 podem ser administradas a um indivíduo numa quantidade, numa frequência durante um período de tempo Çpor exemplo, extensão de tempo e™ou múltiplos períodos de tempo) suficiente para bloquear moléculas BÉ endógenas Çpor exemplo, CD80 e™ou CD86) de ligação a seus respetivos ligandos, no indivíduo. Bloqueio de ligação de BÉ endógena™!igando deste modo, inibe as interações entre células BÉ-positivas Çpor exemplo, células CD80- e™ou CD86-positivas) com células GD28- e™ou CTLA4-positivas. Dosagem de um agente terapêutico é dependente de muitos fatores que inclui, mas não se limita a, o tipo de tecido afetado, o tipo de distúrbio imune associado ao transplantação de enxerto que está a ser tratado, a gravidade da doença, a saúde do indivíduo e a resposta do indivíduo ao tratamento com os agentes.

As doses das moléculas mutantes de CTLA4 ou das composições farmacêuticas descritas no presente documento baseiam-se no peso corporal e os regimes de administração podem ser orientados pelos perfis do alvo no soro. Tipicamente, concentrações alvo no soro das moléculas mutantes de CTLA4 entre cerca de 3 pg™ml e cerca de 30 pg™ml durante os primeiros 3 a 6 meses pós-transplantação serão suficientes para manter a função do aloenxerto, de preferência entre cerca de 5 pg™ml e cerca de 20 pg™ml. A concentração alvo no soro de moléculas mutantes de CTLA4 para a utilização médica da invenção durante a fase de manutenção estão entre cerca de 0,2 pg™ml e cerca de 3 pg™ml, de preferência entre cerca de 0,25 pg™ml e cerca de 2,5 pg™ml.

As moléculas mutantes de CTLA4 descritas no presente documento podem ser administradas numa quantidade entre cerca de 0,1 a cerca de 20,0 mg™kg de peso do paciente, tipicamente entre cerca de 1,0 a cerca de 15,0 mg™kg, Por exemplo, L104EA29Y pode ser administrado a 10 mg™kg de peso do paciente durante a fase precoce, um período de alto risco que segue ao transplante e diminuída para 5 mg™kg de peso do paciente para uma dosagem de manutenção. A administração das moléculas ou composições farmacêuticas descritas no presente documento pode ser realizada durante vários tempos. Tipicamente, regimes de administração incluem uma fase precoce, na qual as doses são maiores e a frequência de administração é aumentada durante o período de maior risco imunológico, seguido de uma fase de manutenção. 0 regime de fase precoce pode variar dos primeiros 3 a 6 meses pós-transplantação e envolve a administração que inicialmente é mais frequente do que mensalmente, de preferência tão frequentemente quanto diariamente, semanalmente ou a cada duas semanas, dependendo do risco imunológico e™ou concentração alvo no soro. A fase de manutenção começa quando a fase precoce termina e envolve administração que não é mais frequente do que mensalmente e dura durante tanto tempo quanto necessário, tipicamente tanto quanto o paciente retém o transplante. Conforme usado no presente documento, dia 1 é definido como o dia do transplante ou o primeiro dia de tratamento com moléculas mutantes de CTLA4 ou composições farmacêuticas descritas no presente documento. A dosagem de moléculas mutantes de CTLA4 na fase precoce é cerca de 8 a cerca de 12 mg™kg de peso do paciente, de preferência cerca de 10 mg™kg. A dosagem de moléculas mutantes de CTLA4 na fase de manutenção é cerca de 3 a cerca de É mg™kg de peso do paciente, de preferência cerca de 5 mg™kg. A fase precoce pode variar dos primeiros 3 a 6 meses pós-transplantação. 0 regime de administração durante a fase precoce pode variar, dependendo do estado do recetor e™ou enxerto. Por exemplo, um regime de fase precoce mais intenso administraria uma maior dose das moléculas mutantes de CTLA4 ou composições farmacêuticas no dia 1, dia 5, visita na semana 2 Çpor exemplo, dia 13-1É), então, a cada duas semanas durante os primeiros 3 meses Çpor exemplo, na visita na semana 4, visita na semana 6, visita na semana 8, visita na semana 10 e visita na semana 12), seguido de administração mensal no decorrer da visita no mês 6 Çpor exemplo, visita no mês 4, visita no mês 5 e visita no mês 6) . Um exemplo de um regime de fase precoce mais intenso típico é administração de 10 mg™kg de peso do paciente de L104EA29YIg nos dias 1, 5, 15, 29, 43, 5É, Él, 85, 113, 141 e 169. Um regime menos intenso, por exemplo, administraria as moléculas mutantes de CTLA4 ou composições farmacêuticas no dia 1, visita na semana 2, visita na semana 4, então, mensalmente no decorrer da visita no mês 3. Um exemplo de um regime de fase precoce menos intenso típico é administração de 10 mg™kg de peso do paciente de L104EA29YIg nos dias 1,15, 29, 5É e 85.

Tipicamente, uma fase precoce é seguida de uma fase de manutenção onde doses menores das moléculas mutantes de CTLA4 ou composições farmacêuticas são administradas em intervalos de um a dois meses durante tanto tempo quanto o paciente retiver o transplante. Um exemplo da fase de manutenção para o regime intensivo descrito acima inclui administração mensal de 5 mg™kg de peso do paciente de L104EA29YIg que começa na visita no mês É. Enquanto que um exemplo da fase de manutenção para o regime menos intensivo acima incluiria administração mensal de 5 mg™kg de peso do paciente de L104EA29YIg que começa na visita no mês 4.

Alternativamente, aqueles com conhecimento na especialidade serão capazes de modificar o regime de administração em resposta ao estado de risco do paciente e™ou resposta à terapêutica pós-transplantação. Por exemplo, a fase precoce do regime menos intensivo descrita acima poderia ser modificada através de adição do dia 5 de administração ao regime, deste modo, aumento da frequência de administração durante o período de maior risco imunológico.

Conforme usado no presente documento, "quatro semanas," "mês", "meses" ou "mensalmente" refere-se a um período de 28 ± 5 dias. Conforme usado no presente documento, "duas semanas" refere-se a um período de 14 + 3 dias.

Flexibilidade nos regimes de administração é requerida para facilitar o esquema de administração nas vidas dos recetores de transplante, ao mesmo tempo em que mantém o alvo através do perfil de moléculas mutantes de CTLA4. Janelas permitidas para administração das doses podem ser como se seaue:

A data alvo é um resultado de adição da duração desejada à data de visita real anterior. A duração desejada para a visita na semana 2 é 10 dias. A duração desejada é 14 dias para uma visita planejada durante duas semanas a partir da visita anterior, por exemplo, uma visita na semana 6 após uma visita na semana 4. A duração desejada é 28 dias para uma visita planejada durante um mês ou quatro semanas a partir da visita anterior, por exemplo, uma visita no mês 4 após uma visita no mês 3. A duração desejada é 56 dias para uma visita planejada durante dois meses a partir da visita anterior, por exemplo, uma visita no mês 8 após uma visita no mês 6. Por exemplo, uma data de visita real no dia 15 mais 14 dias resulta na data alvo na semana 4 do dia 29. Baseado nas janelas de visita acima, a administração pode ocorrer no dia 29 ± 3 dias. A administração deverá ocorrer no dia 26, este dia se tornando a data real de visita utilizada para o cálculo da próxima data alvo.

Recetores com baixo risco de rejeição aguda incluem, tipicamente, aqueles que receberam transplantes de dadores vivos e dadores™recetores bem combinados. Recetores em alto risco de rejeição aguda incluem, tipicamente, aqueles que recebem transplantes de dadores marginais ou retransplantes, têm um elevado quadro de anticorpos reativos ou são Afro-Americanos.

Além de risco imediato de rejeição aguda a transplante, a utilização de fármacos de manutenção, tais como inibidores de calcineurina e esteroide, durante um longo prazo resulta em toxicidades que têm um impacto negativo nos resultados a longo prazo e na qualidade de vida do paciente. Por exemplo, efeitos colaterais de fármacos de manutenção incluem nefrotoxicidade ÇCAN) resultando em declínio da função renal e™ou perda de enxerto e doenças cardiovasculares e metabólicas, tais como hipertensão, hiperlipidemia e diabetes, os quais resultam em doença cardiovascular e morte. Efeitos secundários adicionais incluem hirsutismo, alopecia, hiperplasia gengival, tremor, neurotoxicidade e perda óssea, os quais resultam em não-conformidade e qualidade de vida reduzidas. As moléculas mutantes de CTLA4 ou composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser usadas para evitar essas consequências, para reduzir a incidência, desenvolvimento e™ou progressão dessas consequências quanto de tratamento de distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto ou para tratar distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto em indivíduos em risco dessas consequências. As moléculas mutantes de CTLA4 ou composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser usadas para melhorar a função renal, tal como medido através de GFR. A administração das moléculas mutantes de CTLA4 ou composições farmacêuticas descritas no presente documento pode ser via uma infusão intravenosa de 30 minutos a uma ou mais horas. Alternativamente, uma única ou múltiplas injeções subcutâneas podem distribuir a dosagem requerida. Tipicamente, uma infusão intravenosa de 30 minutos é a via de administração utilizada durante a fase precoce de tratamento enquanto o paciente está no hospital e™ou faz visitas esquematizadas ao profissional de saúde para monitoramento. A injeção subcutânea é o modo de administração típica utilizado durante a fase de manutenção, deste modo, permitindo que o paciente retorne para seu esquema normal através de diminuição das visitas ao profissional de saúde para infusões intravenosas.

Além disso, é descrito no presente documento um método para tratamento de um distúrbio imune associado a transplantação de enxerto em indivíduos que receberam uma terapêutica imunossupressora alternativa põs-transplantação. Os indivíduos sob uma terapêutica imunossupressora alternativa podem alterar ou trocar ou converter uma terapêutica, incluindo as moléculas mutantes de CTLA4 ou composição farmacêutica descritas no presente documento, deste modo, eliminando o fármaco alternativo. Tipicamente, o produto farmacêutico que tem de ser eliminado é interrompido durante um período de tempo apropriado, baseado nas instruções de prescrição deste fármaco específico enquanto que, ao mesmo tempo, as moléculas ou composição farmacêutica da presente invenção é administrada mais frequentemente do que mensalmente. Uma vez que o indivíduo está completamente fora do fármaco alternativo, o indivíduo pode retornar a um regime de manutenção padrão utilizando as moléculas mutantes de CTLA4 ou composição farmacêutica descritas no presente documento. Por exemplo, um indivíduo que está a receber um regime de CsA™MMF ± corticosteroide pode trocar a CsA por L104EA29YIg por um regime com L104EA29YIg™MMF+ corticosteroide. 0 esquema de administração de conversão pode incluir uma interrupção de CsA durante dois e a administração de 5 mg™kg de L104EA29YIg a cada duas semanas durante estes dois meses. Uma vez que a CsA é eliminada, o indivíduo, então, entraria na fase de manutenção e continua a receber 5 mg™kg a cada 4 ou 8 semanas durante o decorrer do tratamento na ausência de CsA.

Dosagens apropriadas para uma molécula mutante solúvel de CTLA4 descrita no presente documento que é eficaz para bloqueio de interação de uma BÉ com seu ligando e™ou tratamento de uma doença do sistema imune podem ser baseadas no peso corporal e os regimes de administração podem ser orientados pelos perfis do alvo no soro. Por exemplo, as concentrações eficazes no soro de moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento para tratar uma doença do sistema imune podem estar entre cerca de 0,2 ug™ml e cerca de 30 pg™ml. Alternativamente, as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento podem ser administradas numa quantidade entre cerca de 0,1 a cerca de 2 0,0 mg™kg de peso do paciente para tratar doenças do sistema imune.

Além disso, são descritos no presente documento métodos para tratamento de distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto. Nestes métodos, os distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto podem ser mediados por interações de células CD28- e™ou CTLA4-positivas com células CD80™CD86-positivas. Além disso, nestes métodos, interações de células T podem ser inibidas. Estes métodos compreendem a administração, a um indivíduo, das moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento para regular interações de células T com as células CD80- e™ou CD86-positivas. Exemplos de distúrbios imunes associados à transplantação de enxerto são discutidos acima.

Além disso, é descrito no presente documento um método para profilaxia de ou inibição de ou prevenção de rejeições a transplante de órgãos sólidos, tecido, célula e™ou anatomia externa por um indivíduo, o indivíduo sendo um recetor de transplante de órgão sólido, tecido, célula e™ou anatomia externa. Tipicamente, em transplantes, rejeição do enxerto é iniciada através de seu reconhecimento como estranho por células T, seguido de uma resposta imune que destrói o enxerto. As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento, através da inibição da proliferação de linfócitos T e™ou secreção de citocina, podem resultar em destruição tecidual e indução de não responsividade de células T antigénio-específica reduzidas, o que pode resultar em aceitação do enxerto a longo prazo. 0 estudo descrito no Exemplo 3 comparou a eficácia e segurança de L104EA29YIg como um imunossupressor de manutenção com ciclosporinaA ÇCsA) durante 12 meses quando usado como parte de um regime combinado isento de CNI consistindo em indução com basiliximabe ÇSimulect®; Novartis), micofenolato de mofetilo ÇMMF; CellCept®; Roche) e corticosteroides em recetores de transplante renal. Objetivos incluíam avaliação da incidência de rejeição aguda Çconfirmada por biópsia ou presumida) em 6 meses e 1 ano; taxa de filtração glomerular medida ÇGFR) via retirada de iohexol a 1, 6 e 12 meses; parâmetros de hipertensão incluindo colesterol e triglicerídeos no soro; e segurança global. Outras análises pré-especifiçadas incluíam morte do paciente ou perda de enxerto a 1 ano,· a gravidade de rejeição aguda; a incidência de diabetes mellitus pós-transplantação [definido como qualquer terapêutica requerida para hiperglicemia durante >4 semanas ou uma hemoglobina A1C ÇHbAlc) >É %, em pacientes que não se sabia ser anteriormente diabético]; GFR calculada, usando a Modificação de Dieta em Doença Renal ÇMDRD, Levey AS, Bosch JP, Lewis JP, Greene T, Rogers N, Roth D. A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann Intern Med 1999; 130: 461-4É0), Jelliffe ÇRW. Creatinine clearance: Bedside estimate. Ann Inter Med. 19É3; É9: 604-605), Cockcroft-Gault ÇCockcroft DW, Gault MH. Prediction of creatinine clearance from serum creatinine. Nephron 19É6; 16: 31-41) e Nankivell ÇNankivell BJ, Gruenewald SM, Allen RD, Chapman JR. Predicting glomerular filtration rate after kidney transplantation. Transplantation. 1995; 59Ç12): 1683-1689) formulas; pharmacokinetics and immunogenicity. Diagnosis and tratment of acute rejection ÇAR) was based on the Banff 9É criteria and grade ÇRacusen LC, Solez K, Colvin RB, et al, The Banff 9É working classification of de renal allograft pathology. Kidney Int 1999; 55Ç2): É13-23.). A análise post hoc foi conduzida a respeito da incidência de nefropatia crónica por aloenxerto ÇCAN).

Este estudo de 12 meses demonstrou que a terapêutica de manutenção baseada em L104EA29YIg conferiu eficácia prevalente na prevenção de AR e sobrevivência do paciente e enxerto comparado com CsA. Além disso, a L104EA29YIg demonstrou aperfeiçoamentos significativos na função renal e reduções na CAN comparado com imunossupressão de manutenção baseada em CsA. A L104EA29YIg era segura e bem tolerada e não foi associada a toxicidades CNI-relacionadas típicas.

Foi mostrado que a função renal aperfeiçoada durante o primeiro ano pós-transplantação correlaciona-se com melhores consequências a longo prazo ÇHariharan S, McBride MA, Cherikh WS, Tolleris CB, Bresnahan BA, Johnson CP. Post transplant renal function in the first year predicts long term kidney transplant survival. Kidney Int 2002; 62Ç1) : 311-8) , uma vez que a utilização de CNI a longo prazo é limitada por sua nefrotoxicidade ÇDanovitch GM. Immunosuppressive medications for renal transplantation: a multiple choice question. Kidney Int 2001; 59Ç1): 388-402), o que leva à redução de função do enxerto e insuficiência renal com todos os seus problemas pertinentes. Assim, talvez, as descobertas mais notáveis observadas com tratamento com L104EA29YIg são as GFRs superiores associadas à histologia renal de 12 meses que mostra reduções no desenvolvimento e™ou progressão de CAN comparado com CsA. Este foi um resultado surpreendente e a primeira vez que uma descoberta deste tipo foi mostrada foi num experimento em Fase II aleatório de uma terapêutica imunossupressora. Uma vez que a preservação da massa de nefros, através de prevenção de eventos imunológicos, cardiovasculares e™ou metabólicos contribui para efeitos benéficos sobre a sobrevivência do paciente e do enxerto, é possível que a L104EA29YIg possa estar associada a melhores resultados a longo prazo.

Essas questões são particularmente importantes com a utilização crescente de órgãos de dadores ou recetores com critérios prolongados, uma vez que estes são particularmente suscetíveis à toxicidade CNI-relacionada. Diminuição da incidência de CV e eventos metabólicos em pacientes que sofreram transplante renal também é central para melhorar as consequências a longo prazo.

As moléculas mutantes de CTLA4 ou composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser usadas para tratar distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto em indivíduos que são recetores com critérios prolongados e™ou que estão a receber enxertos de dadores com critérios prolongados. Estes critérios, os quais são baseados, em parte, em critérios emitidos pelo United Network of Organ Sharing ÇUNOS), podem incluir um ou mais dos seguintes: idade do dador de menos de 10 ou mais de ou igual a 60 anos; dador após morte cardíaca; tempo de isquemia antecipada do órgão doado maior do que ou igual a 24 horas; indivíduos que sofreram um primeiro transplante com uma PRA atual > 50 % ou que sofreram retransplantação com PRA > 30 %; indivíduos com perda anterior de enxerto em virtude de rejeição aguda durante os primeiros 6 meses após transplante; indivíduos com exame de compatibilidade linfocitotóxica de células T positivos usando soro do recetor e linfõcitos do dador; indivíduos com infeção pelo VIH; indivíduos com tuberculose ativa que requer tratamento dentro dos 3 anos anteriores; ou outros critérios emitidos pelo United Network of Organ Sharing ÇUNOS). Um exemplo de possíveis critérios prolongados para um dador e™ou o rim do dador inclui pelo menos 1 dos seguintes critérios prolongados para doação de órgãos a) Idade do dador > 60 anos OU b) Idade do dador de 50 - 59 anos e 1 dos seguintes: Çi) Acidente cerebrovascular ÇCVA) Ê hipertensão Ê SCr > 1,5 mg™dL OU Çii) CVA Ê hipertensão OU Çiii) CVA Ê SCr > 1,5 mg™dL OU Çiv) Hipertensão Ê SCr > 1,5 mg™dL OU c) CIT > 24 horas, idade do dador > 10 anos ou d) Dador com morte cardíaca Çdador sem batimento cardíaco). Métodos para inibição de doença de enxerto versus hospedeiro num indivíduo descritos no presente documento podem compreender a administração, ao indivíduo, de uma molécula mutante solúvel de CTLA4 descrita no presente documento, em separado ou juntamente, concomitante ou sequencialmente, com outros ligandos adicionais reativos com IL-2, IL-2R, IL-4 ou γ-interferão. Por exemplo, a molécula mutante solúvel de CTLA pode ser administrada a um recetor de transplante de medula óssea para inibir a alorreatividade de células T dadoras. Alternativamente, células T dadoras dentro de um enxerto de medula óssea podem ser toleradas por aloantigénios do recetor ex vivo antes de transplante.

As moléculas mutant.es solúveis de CTLA4 para a utilização médica da invenção, por exemplo, L104EA29Y, podem ser administradas como o único ingrediente ativo ou junto, concomitante ou sequencialmente, com um ou mais de outros fármacos em regimes de imunomodulação, agentes imunossupressores e™ou outros agentes anti-inflamatórios, por exemplo, para o tratamento, prevenção ou inibição ou profilaxia de rejeição aguda ou crónica a aloenxerto ou xenoenxerto ou para induzir à tolerância. Por exemplo, elas podem ser usadas em combinação com um inibidor de calcineurina Çpor exemplo, ciclosporina A ou FK506); um macrolídeo imunossupressor Çpor exemplo, tacrolimus, rapamicina, sirolimus) ou um derivado do mesmo Çpor exemplo, 40-O-Ç2- hidroxi)etil-rapamicina, sirolimus, centican); um agente de abrigo de linfócito Çpor exemplo, FTYÉ20) ou um análogo do mesmo ÇFKÉÉ8, Jak-3), corticosteroides ,* ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida ou um análogo do mesmo; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato de mofetilo; 15-deoxiespergualina ou um análogo da mesma; anticorpos monoclonais imunossupressores Çpor exemplo, basiliximabe, daclizumab), ligandos, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo dos mesmos a recetores de leucina Çpor exemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD lla™CD18, CDÉ, CD25, CD 2É, BÉ, CD40, CD45, CD58, CD 13É, ICOS, CD150 ÇSLAM) , 0X40, 4-1 BB ou seus ligandos); ou outros compostos imunomoduladores Çpor exemplo, CTLA4™CD28-Ig) ou outros inibidores de moléculas de adesão Çpor exemplo, mAbs) ou inibidores de baixo peso molecular, incluindo antagonistas de LFA- 1, antagonistas de Selectina e antagonistas de VLA-4. 0 composto é particularmente útil em combinação com um composto o qual interfere com CD4 0 e seu ligando Çpor exemplo, anticorpos a CD40 e anticorpos a CD4Q-L), tal como CN220 ÇPatente US 6.051.228), por exemplo, nas indicações descritas acima, por exemplo, na indução de tolerância.

Onde as moléculas mutant.es solúveis de CTLA4 são administradas concomitante ou sequencialmente em conjunto com outra terapêutica imunossupressora ™ imunomoduladora, por exemplo, conforme no presente documento especificado, dosagens do composto imunossupressor ou imunomodulador coadministrado, naturalmente, variarão, dependendo do tipo de cofármaco utilizado, por exemplo, se ele é um esteroide ou uma ciclosporina, do fãrmaco específico utilizado, da condição que está a ser tratada e assim por diante.

De acordo com o precedente, são descritas no presente documento combinações terapêuticas, por exemplo, um kit, por exemplo, para utilização em qualquer método conforme definido acima, que compreende L104EA29YIg, na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável, a ser usado concomitantemente ou em sequência com pelo menos uma composição farmacêutica que compreende um fãrmaco imunossupressor, imunomodulador ou anti- inflamatório. 0 kit pode compreender instruções para sua administração.

De acordo com o precedente, métodos conforme definido acima podem compreender a coadministração, por exemplo, concomitantemente ou em sequência, de uma dose terapeuticamente eficaz de uma molécula mutante solúvel de CTLA4 descrita no presente documento, com agentes imunossupressores. Agentes imunossupressores incluem gp39 solúvel Çtambém conhecido como ligando de CD40 ÇCD40L), CD154, T-BAM, TRAP), CD29 solúvel, CD40 solúvel, CD80 solúvel Çpor exemplo, ATCC 6862É), CD86 solúvel, CD28 solúvel Çpor exemplo, 68628), CD56 solúvel, Thy-1 solúvel, CD3 solúvel, TCR solúvel, VLA-4 solúvel, VCAM-1 solúvel, LEGAM-1 solúvel, ELAM-1 solúvel, CD44 solúvel, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com gp39 Çpor exemplo, ATCC HB-10 916, ATCC HB-12055 e ATCC HB-12056), ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CD40 Çpor exemplo, ATCC HB-9110), ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com BÉ Çpor exemplo, ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, etc), ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CD28 Çpor exemplo, ATCC HB-11944 ou mAb 9.3, conforme descrito por Martin, et al. ÇJ. Clin. Immun. 4Ç1) : 18-22, 1980), ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com LFA-1 Çpor exemplo, ATCC HB-95É9 e ATCC TIB-213), ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com LFA-2, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com IL-2 ou IL-2R, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com IL-12, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com IFN-gama, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CD2, anticorpos ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CD48, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com qualquer ICAM Çpor exemplo, ICAM-1 ÇATCC CRL-2252) , ICAM-2 e ICAM-3), ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CTLA4 Çpor exemplo, ATCC HB-304), ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com Thy-1, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CD56, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CD3, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CD29, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com TCR, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com VLA-4, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com VCAM-1, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com LECAM-1, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com ELAM-1, ligandos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo reativos com CD44. Em determinadas formas de realização, anticorpos monoclonais são preferidos. Em outras formas de realização, fragmentos de anticorpo são preferidos. Fragmentos de anticorpo incluem, mas não se limitam a, Fab, Fab' , FÇab' ) 2, Fv, scFv e anticorpos de domínio ÇdAbs) que inclui, mas não se limita a, aqueles descritos no documento W02006™030220. Conforme os peritos na especialidade compreenderão prontamente, a combinação pode incluir as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento e um outro agente imunossupressor, as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 com dois outros agentes imunossupressores, as moléculas solúveis de CTLA4 com três outros agentes imunossupressores, etc. A determinação da combinação e dosagens ótimas pode ser determinada e otimizada usando métodos bem conhecidos na especialidade.

Uma combinação particularmente útil é L104EA29YIg ou uma composição farmacêutica do mesmo com um composto que interfere com a IL-2 e seu ligando, especificamente um antagonista objetivado contra IL-2R Çalfa), o qual é seletivamente expresso sobre a superfície de linfócitos T ativados. Um composto que se liga ao IL-2RÇalfa) competitivamente inibe a ativação de linfócitos mediada por IL-2, a qual é uma via crítica na resposta imune celular envolvida em rejeição a aloenxerto.

Algumas combinações específicas incluem as seguintes: L104EA2 9YIg e anticorpos monoclonals a CD80 ÇmAbs) ; L104EA29YIg e mAbs a CD86; L104EA29YIg, mAbs a CD80 e mAbs a CD86; L104EA29YIg e mAbs a gp3 9; L104EA2 9YIg e mAbs a CD40; L104EA29YIg e mAbs a CD28; L104EA29YIg, mAbs a CD80 e CD86 e mAbs a gp39; L104EA29YIg, mAbs a CD80 e CD86 e mAbs a CD40; e L104EA2 9YIg, mAb anti-LFAl e mAb anti-gp39. Um exemplo específico de um mAb a gp39 é MR1. Outras combinações serão prontamente apreciadas e compreendidas pelos peritos na especialidade.

De acordo com o precedente, métodos conforme definido acima podem compreender a coadministração, por exemplo, concomitantemente ou em sequência, de uma dose terapeuticamente eficaz da molécula mutante solúvel de CTLA4 descrita no presente documento, com um agente adjuvante e™ou um corticosteroide. 0 objetivo é substituir os inibidores de calcineurina tóxicos pelas moléculas mutantes de CTLA4. No entanto, as moléculas mutantes de CTLA4 podem também ser coadministradas concomitante ou sequencialmente com CNI, tais como ciclosporina ÇNeoral®, Sandimmune® da Novartis) e tacrolimus ÇFK506, Prograf® da Fuj isawa) .

Exemplos de agentes adjuvantes incluem, mas não se limitam a, inibidores de dehidrogenase de monofosfato de inosina ÇIMPDH), por exemplo, micofenolato de mofetilo ÇMMF, Cellcept® da Roche Laboratories) e ácido micofenõlico ÇMyfortic® da Novartis); rapamicina Çsirolimus, Rapamune® da Wyeth™Ayerst) ; azatioprina ÇAzarsan® da Salix, Imuran®, genérico); um agente de abrigo de linfócitos, por exemplo, FTYÉ20 Çda Novartis); FKÉÉ8 Çda Fujisawa); Jak-3 Çda Pfizer); e Certican® Çeverolimus da Novartis).

Exemplos de corticosteroides incluem, mas não se limitam a, betametasona, budesonida, cortisol, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona e triancinolona.

Combinações de coadministração típicas incluem, mas não se limitam a, L104EA29YIg e pelo menos um agente adjuvante selecionado a partir do grupo listado acima; L104EA29YIg e pelo menos um corticosteroide selecionado a partir do grupo listado acima; L104EA29YIg, MMF ÇCellcept da Roche) e um corticosteroide selecionado a partir do grupo listado acima; L104EA29YIg, rapamicina Çsirolimus, Rapamune® da Wyeth™Ayerst) com ou sem um corticosteroide selecionado a partir do grupo listado acima.

As combinações de coadministração descritas acima podem ser utilizadas com um agente de indução, tal como anticorpos monoclonais imunossupressores, por exemplo, basiliximabe ÇSimulect® da Novartis), muromonab ÇOrthoclone 0KT3® da Ortho Biotech), rituximab ÇRituxan® da Genentech) e daclizumab ÇZenapax® da Roche Labs); ou globulina antitimócito ÇThymoglobulin® da SangStat). Por exemplo, combinações adequadas incluem, mas não se limitam a, basiliximabe ÇSimulect® da Novartis) com L104EA29YIg, MMF ÇCellcept da Roche) e prednisolona; ou daclizumab ÇZenapax® da Roche), L104EA29YIg e rapamicina Çsirolimus, Rapamune® da Wyeth™Ayerst).

Tipicamente, as dosagens padrões e regime de administração dos fármacos coadministrados descritos acima nao sao influenciados pela adiçao de uma molécula mutante de CTLA4 ao regime de tratamento. No entanto, aqueles com conhecimento na especialidade podem prescrever doses menores dos fármacos coadministrados, por exemplo, agentes adjuvantes e™ou corticosteroides, em virtude da incorporação das moléculas mutantes de CTLA4 menos tóxicas descritas no presente documento no regime de tratamento. A informação a respeito da prescrição pode ser baseada na bula para cada fármaco coadministrado. Um corticosteroide pode ser coadministrado com as moléculas mutantes de CTLA4 ou composição farmacêutica descritas no presente documento. Por exemplo, os indivíduos podem ser tratados diariamente com corticosteroides. Uma estratégia de prevenção e manutenção com esteroide pode incluir 500 mg de metilprednisolona i.v., ao chegar na sala de operações ÇOU) 250 mg de metilprednisolona i.v., no Dia 2, seguido de prednisona Çou prednisolona) 100 mg oralmente no Dia 3, seguido de uma prevenção com prednisona Çou prednisolona) para 20 - 30 mg™dia pelo final da semana 2, seguido de uma prevenção com prednisona Çou prednisolona) para não menos do que 2,5 mg™dia no decorrer do mês 6. Os indivíduos podem permanecer sob pelo menos 2,5 mg ™dia no decorrer do curso de seu tratamento.

Fármacos adicionais coadministrados podem incluir micofenolato de mofetilo ÇMMF). Tipicamente, o MMF é administrado em 2 doses divididas num esquema consistente com relação ao período do dia e refeições. Um exemplo de um regime de administração para MMF inclui 2 g diariamente. A primeira dose pode ser administrada pré-operativamente. Doses subsequentes podem ser administradas p.o. tão logo o indivíduo seja capaz de tolerar medicações pela boca. A dose e esquema podem ser ajustados com base em valores laboratoriais Çpor exemplo, WBCs diminuída) e tolerabilidade do indivíduo. A bula na embalagem proporciona informação completa a respeito da prescrição.

Outro fãrmaco coadministrado pode incluir basiliximabe. Basiliximabe reconstituído Ç20 mg em 5 ml) pode ser diluído para um volume de 50 ml com solução salina normal ou dextrose a 5 % e administrado como uma infusão intravenoso, durante 20-30 minutos. A primeira dose de 20 mg pode ser administrada no Dia 1 Ço dia de transplantação). A segunda dose de 20 mg pode ser fornecida no Dia 5. A bula na embalagem proporciona informação completa a respeito da prescrição. São descritas ainda combinações terapêuticas, por exemplo, um kit, por exemplo, para utilização em qualquer método conforme definido acima, que compreende L104EA29YIg, na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável, a ser usado concomitantemente ou em sequência com pelo menos uma composição farmacêutica que compreende um agente adjuvante e corticosteroides. 0 kit pode compreender instruções para sua administração. A bula e™ou as instruções podem indicar que a composição farmacêutica pode ser usada sozinha ou em combinação, concomitante ou sequencialmente com um segundo agente para tratar uma condição de escolha, por exemplo, doenças do sistema imune, doenças autoimunes, doenças imunoproliferativas, distúrbios imunes associados a transplantação de enxerto, conforme descrito acima. A bula pode indicar dosagens apropriadas para as moléculas, conforme descrito no presente documento. Por exemplo, a bula pode indicar dosagens para uma molécula que são eficazes para bloqueio de interação de uma BÉ com seu ligando e™ou tratamento de uma doença do sistema imune pode ser baseado no peso corporal e os regimes de administração podem ser orientados pelos perfis do alvo no soro. Por exemplo, a bula pode indicar que as concentrações do alvo no soro eficazes de moléculas mutantes de CTLA4 descritas no presente documento para tratar uma doença do sistema imune podem estar entre cerca de 0,2 pg™ml e cerca de 30 pg™ml. Alternativamente, a bula pode indicar que as moléculas mutantes de CTLA4 descritas no presente documento podem ser administradas numa quantidade entre cerca de 0,1 a cerca de 2 0,0 mg™kg de peso do paciente para tratar doenças do sistema imune.

MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DAS MOLÉCULAS MUTANTES DE CTLA4 DA INVENÇÃO A expressão de moléculas mutantes de CTLA4 pode ser em células procariotas. Procariotas são, mais frequentemente, representados por várias cepas de bactérias. As bactérias podem ser gram-positivas ou gram-negativas. Tipicamente, bactérias gram-negativas, tal como E. coli, são preferidas. Outras cepas microbianas também podem ser usadas.

Sequências que codificam moléculas mutantes de CTLA4 podem ser inseridas num vetor projetado para expressão de sequências estranhas em células procariotas, tal como E. coli. Estes vetores podem incluir sequências de controlo procariotas comummente usadas as quais são definidas no presente documento como incluindo promotores para início de transcrição, opcionalmente com um operador, junto com sequências de local de ligação ribossómica, incluem promotores comummente usados, tais como os sistemas promotores de beta-lactamase Çpenicilinase) e lactose Çlac) ÇChang, et al., Ç19ÉÉ) Nature 198: 1056), o sistema promotor de triptofano Çtrp) ÇGoeddel, et al., Ç1980) Nucleic Acids Res. 8: 405É) e o promotor PL lambda derivado e local de ligação ribossómica do N-gene ÇShimatake, et al., Ç1981) Nature 292: 128).

Tais vetores de expressão também incluirão origens de replicação e marcadores selecionáveis, tais como o gene de fosfotransferase de beta-lactamase ou neomicina que conferem resistência a antibióticos, de modo que os vetores podem se replicar em bactérias e células trazendo os plasmídeos podem ser selecionadas para quando crescimento na presença de antibióticos, tal como ampicilina ou canamicina. 0 plasmideo de expressão pode ser introduzido em células procariotas via uma variedade de métodos padrões que inclui, mas não se limita a, CaCI2-choque ÇCohen, Ç19É2) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69: 2110 e Sambrook, et al. Çeds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, Ç1989)) e eletroporação. Células eucariotas são também células hospedeiras adequadas. Exemplos de células eucariotas incluem qualquer célula animal, quer primária ou imortalizada, células de levedura Çpor exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris) e de planta. Células de mieloma, COS e CEO são exemplos de células de animal que podem ser usadas como hospedeiros. Células CEO particulares incluem, mas não se limitam a, DG44 ÇChasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 199É Biochemistry 36: 10901-10909), CH0-K1 ÇATCC N° CCL-61) , a linha de células CH0-K1 Tet-On ÇClontech) , CHO designada ECACC 85050302 ÇCAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), clone 13 de GHO ÇGEIMG, Genova, IT), clone B de CHO ÇGEIMG, Genova, IT) , CH0-K1™5F designada ECACC 9306160É ÇCAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) e RR-CH0K1 designada ECACC 92052129 ÇCAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Células de planta exemplificativas incluem células de tabaco Çplantas inteiras, cultura de células ou caule), milho, soja e arroz. Sementes de milho, soja e arroz também são aceitáveis.

Sequências de ácido nucleico que codificam as moléculas mutantes de CTLA4 também podem ser inseridas num vetor projetado para expressão de sequências estranhas num hospedeiro eucariota. Os elementos reguladores do vetor podem variar de acordo com o hospedeiro eucariota particular.

Sequências de controlo eucariotas comummente usadas para utilização em vetores de expressão incluem promotores e sequências de controlo compatíveis com células de mamífero tais como, por exemplo, o promotor de CMV Çvetor CDM8) e vírus sarcoma de ave ÇASV) Çvetor nLN) . Outros promotores comummente usados incluem os promotores tardio e precoce do Vírus Simian 40 ÇSV40) ÇFiers, et al. , Ç19É3) Nature 2É3: 113) ou outros promotores virais, tais como aqueles derivados de polioma, Adenovirus 2 e vírus papiloma bovino. Um promotor induzível, tal como hMTII ÇKarin, et al., Ç1982) Nature 299: É9É-SQ2) também pode ser usado.

Vetores para expressão de moléculas mutantes de CTLA4 em eucariotas também podem trazer sequências denominadas regiões intensificadoras. Essas são importantes em otimização de expressão do gene e são encontradas a montante ou a jusante da região promotora.

Exemplos de vetores de expressão para células hospedeiras eucariotas incluem, mas não se limitam a, vetores para células hospedeiras de mamífero Çpor exemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 ÇManiatis); pIRES ÇClontech); pRc™CMV2, pRc™RSV, pSFVl ÇLife Technologies); vetores pVPakc, vetores pCMV, vetores pSG5 ÇStratagene)), vetores retrovirais Çpor exemplo, vetores pFB ÇStratagene)), pCDNA-3 ÇInvitrogen) ou formas modificadas dos mesmos, vetores adenovirais. Vetores de vírus adeno-associados, vetores de baculovírus, vetores de levedura Çpor exemplo, vetores pESC ÇStratagene)).

Sequências de ácido nucleico que codificam moléculas mutantes de CTLA4 podem se integrar no genoma da célula hospedeira eucariota e se replicar à medida que o genoma do hospedeiro se reproduz. Alternativamente, o vetor que traz moléculas mutantes de CTLA4 pode conter origens de replicação que permitem replicação extracromossómica.

Para expressão das sequências de ácido nucleico em Saccharomyces cerevisiae, a origem de replicação do plasmídeo de levedura endógeno, o círculo 2p pode ser usado. ÇBroach, Ç1983) Meth. Enz. 101: 30É) . Alternativamente, sequências do genoma de levedura capazes de promover replicação autónoma podem ser usadas Çveja-se, por exemplo, Stinchcomb, et al. , Ç19É9) Nature 282: 39); Tschemper, et al. , Ç1980) Gene 10: 15É; e Clarke, et al. , Ç1983) Meth. Enz. 101: 300).

Sequências de controlo transcricionais para vetores de levedura incluem promotores para a síntese de enzimas glicolíticas ÇHess, et al. , Ç1968) J. Adv. Enzyme Reg. É: 14 9; Holland, et al. , Ç19É8) Biochemistry 1É: 4900). Promotores adicionais conhecidos na especialidade incluem o promotor de CMV proporcionado no vetor CDM8 ÇToyama e Okayama, Ç1990) FEES 268: 21É-221) ; o promotor para 3-fosfoglicerato cinase ÇHitzeman, et al. , Ç1980) J. Biol. Chem. 255: 20É3) e aqueles para outras enzimas glicolíticas.

Outros promotores são induzíveis porque eles podem ser regulados por estímulos ambientais ou o meio de crescimento das células. Estes promotores induzíveis incluem aqueles dos genes para proteínas de choque térmico, álcool desidrogenase 2, isocitocroma C, fosfatase ácida, enzimas associadas ao catabolismo de azoto e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose.

Sequências reguladoras podem também ser colocadas na extremidade 3' das sequências de codificação. Essas sequências podem atuar para estabilizar o ARN mensageiro. Tais terminadores são encontrados na região não traduzida 3' após as sequências de codificação em vários genes de mamífero e derivados de levedura.

Vetores exemplificativos para plantas e células de planta incluem, mas não se limitam a, plasmídeos de Agrobacterium T!( vírus mosaico de couve-flor ÇCaMV) e vírus mosaico ouro de tomate ÇTGMV).

Aspetos gerais de transformações de sistema de células hospedeiras de mamífero foram descritos por Axel ÇPatente US N° 4.399.216, emitida em 16 de Agosto de 1983). Células de mamífero podem ser transformadas através de métodos que inclui, mas não se limita a, transfeção na presença de fosfato de cálcio, microinjeção, eletroporação ou via transdução com vetores virais. Métodos para introdução de sequências de ADN estranhas em genomas de planta e levedura incluem ÇT) métodos mecânicos, tal como microinjeção de ADN em células simples ou protoplastos, turbilhonamento das células com glóbulos de vidro na presença de ADN ou disparo de esferas de tungsténio ou ouro revestidas de ADN em células ou protoplastos; Ç2) introdução de ADN que torna as membranas celulares permeáveis às macromoléculas através de tratamento com polietileno glicol ou sujeição a pulsos elétricos de alta tensão Çeletroporação); ou Ç3) a utilização de lipossomas Çcontendo ADNc) os quais se fundem às membranas celulares. A expressão de moléculas mutantes de CTLA4 pode ser detetada através de métodos conhecidos na especialidade. Por exemplo, as moléculas mutantes podem ser detetadas através de géis de SDS-PAGE corados com Coomassie e imunoblotting usando anticorpos que se ligam à CTLA4. Recuperação de proteína pode ser realizada usando meios padrões de purificação de proteína, por exemplo, cromatografia por afinidade ou cromatografia de troca de iões, para proporcionar o produto substancialmente puro ÇR. Scopes em: "Protein Purification, Principles and Practice", Terceira Edição, Springer-Verlag Ç1994)).

As Publicações de Pedido de Patente US Número 2005™0019859, 2005™Q084933 e WO 04™058944 ensinam um processo para a produção de proteínas, especificamente produtos de glicoproteina recombinantes, através de culturas de células de animal ou mamífero.

As moléculas mutantes solúveis de CTLA4 podem ser produzidas como descrito no presente documento.

MUTAGÊNE8E COM BASE EM CÓDÃO DE CTLA4IG A mutagénese direcionada ao local e um novo procedimento de seleção foram usados para identificar várias mutações no domínio extracelular de CTLA4 que melhoram a avidez de ligação por CD86. Neste contexto, mutações foram realizadas em resíduos nas regiões do domínio extracelular de CTLA4 de serina 25 para arginina 33, na fita C' (alanina 49 e treonina 51) , na fita F (lisina 93, ácido glutâmico 95 e leucina 96) e na região de metionina 9É à tirosina 102, tirosina 103 à glicina 10É e na fita G nas posições glutamina 111, tirosina 113 e isoleucina 115. Estes locais foram escolhidos baseado em estudos de proteínas de fusão CD28™CTLA4 quiméricas (Peach, et al. , J. Exp. Med., 1994, 180: 2049-2058) e num modelo que prevê quais cadeias laterais de recetor de aminoácido serão expostas a solvente e uma falta de identidade ou homologia de resíduo de aminoácido em determinadas posições entre CD28 e CTLA4. Também, qualquer resíduo o qual está espacialmente em proximidade íntima (5 a 20 Unidades Angstrom) aos resíduos identificados é considerado parte da presente descrição.

Para sintetizar e selecionar moléculas mutantes solúveis de CTLA4 com afinidades alteradas por CD80 e™ou CD86, uma estratégia em duas etapas foi adotada. Os experimentos requerem primeiro geração de uma biblioteca de mutações num cõdão específico de uma porção extracelular de CTLA4 e, então, seleção das mesmas através de análise pelo BIAcore para identificar mutantes com reatividade alterada ao CD80 ou CD86. 0 sistema de ensaio Biacore (Pharmacia,

Piscataway, N.J.) usa um sistema detetor de ressonância de plasmõnio na superfície que envolve, essencialmente, ligação covalente de CDSOIg ou CD86Ig a uma lasca sensora revestida com dextrano o qual está localizado no detetor. A molécula de teste pode, então, ser injetada na câmara contendo a lasca sensora e a quantidade de proteína complementar que se liga pode ser avaliada baseado em alteração na massa molecular a qual está fisicamente associada ao lado revestido com dextrano da lasca sensora; a alteração na massa molecular pode ser medida pelo sistema detetor. VANTAGENS DAS MOLÉCULAS MUTANTES DE CTLA 4

Em virtude do facto de a ligação de CTLA4 a CD80 e CD86 ser caraterizada por taxas de "ligação" rápidas e taxas de dissociação Ç"desligamento") baixas e em virtude do facto de complexos de CTLA4Ig-CDS6 se dissociarem aproximadamente 5- a 8 vezes mais rapidamente do que complexos de CTLA4Ig-CD80, foi considerado que diminuição da taxa de dissociação de CTLA4Ig de CD80 e™ou CD86 resultaria em moléculas com propriedades imunossupressoras mais potentes. Assim, espera-se que moléculas mutantes solúveis de CTLA4 que tem uma maior avidez por células CD80- ou CD86-positivas comparado com CTLA4 do tipo selvagem ou formas sem mutação de CTLA4Ig, bloqueiem a produção de células ativadas por antigénio específico com maior eficácia do que CTLA4 do tipo selvagem ou formas sem mutação de CTLA4Ig,

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são apresentados para ilustrar a presente invenção e auxiliar os peritos na especialidade no fabrico e utilização da mesma. Os exemplos não se destinam a limitar de qualquer forma o âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Este exemplo proporciona uma descrição dos métodos usados para gerar as sequências de nucleótido que codificam as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no presente documento. Um mutante num único local L104EIg foi gerado e testado com relação à cinética de ligação a CD80 e™ou CD86. A sequência de nucleótidos do L104EIg foi usada como um modelo para gerar a sequência de CTLA4 mutante em dois locais, L104EA29YIg, a qual foi testada com relação à cinética de ligação a CD80 e™ou CD86.

Mutagénese Com Base Em Côdão De CTLA4Ig

Uma estratégia de mutagénese e seleção foi desenvolvida para identificar moléculas de CTLA4Ig mutantes que tinham menores taxas de dissociação Çtaxas de "desligamento") de moléculas CD80 e™ou CD86. Sequências de nucleótidos mutantes num único local foram geradas usando CTLA4Ig ÇPatentes US N°: 5.844.095; 5.851.É95; e 5.885.É96; N° de Acesso de ATCC 68629) como um modelo. Iniciadores de PCR de oligonucleótido mutagénicos foram projetados para mutagénese aleatória de um códão de ADNc específico que permitem qualquer base nas posições 1 e 2 do códão, mas apenas guanina ou timina na posição 3 ÇXXG™T; também conhecida como NNG™T). Dessa maneira, um códão específico que codifica um aminoãcido poderia sofrer mutação aleatória para codificar cada um dos 20 aminoãcidos. A este respeito, mutagénese xxg™T proporciona 32 codões potenciais que codificam cada um dos 20 aminoãcidos. Produtos de PCR que codificam mutações em proximidade íntima a -M9É-G10É de CTLA4Ig Çveja-se Figura É, SEQ ID NOS: 3 e 4; ou Figura 8, SEQ ID NOS: 5 e 6), foram digeridas com Sacl™Xbal e subclonados no vetor de expressão nLN de CTLA4Ig similarmente cortado Çtambém conhecido como piLN). Este método foi usado para gerar a molécula mutante de CTLA4 num único local LlQ4EIg ÇFigura 8, SEQ ID NOS: 5 e 6).

Para mutagénese em proximidade a S25-R33 de CTLA4Ig, um local de restrição Nhel silencioso foi primeiro introduzido 5' a este loop, através de mutagénese direcionada a iniciador de PCR. Os produtos de PCR foram digeridos com Nhel™Xbal e subclonados em vetores de expressão de CTLA4Ig ou L104EIg similarmente cortados. Este método foi usado para gerar a molécula mutante de CTLA4 em dois locais L104EA29YIg ÇFigura É, SEQ ID NOS: 3 e 4) . Em particular, a molécula de ácido nucleico que codifica a molécula mutante num único local de CTLA4, L104EIg, foi usada como um modelo para gerar a molécula mutante em dois locais de CTLA4, L104EA29YIg. 0 vetor piLN que tem a L!04EA29YIg é mostrado na Figura 12. EXEMPLO 2 0 seguinte proporciona uma descrição de métodos de rastreio usados para identificar os polipéptidos de CTLA4 mutantes num único e em locais duplos, expressos a partir das estruturas descritas no Exemplo 1, que exibiam uma maior avidez de ligação pelos antigénios CD80 e CD86, comparado com moléculas de CTLA4Ig não mutada.

Estudos in vitro e in vivo atuais indicam que a CTLA4Ig em si é incapaz de bloquear completamente a produção de células T ativadas por antigénios específicos. Estudos in vitro com CTLA4Ig e anticorpo monoclonal para CD80 ou CD86 que medem a inibição de proliferação de células T indicam que o anticorpo monoclonal anti-CD80 não aumenta a inibição de CTLA4Ig. No entanto, o anticorpo monoclonal anti-CD86 aumenta a inibição, indicando que a CTLA4Ig não era tão eficaz no bloqueio de interações com CD86. Estes dados sustentam as descobertas anteriores de Linsley, et ai. Çlmmunity, Ç1994), 1: É93-801) que mostra que inibição de respostas celulares CD80-mediadas requer concentrações de CTLA4Ig aproximadamente 100 vezes menores do que para respostas CD86-mediadas. Baseado nestes descobertas, foi suposto que moléculas mutantes solúveis de CTLA4 que tem uma maior avidez por CD86 do que a CTLA4 do tipo selvagem seriam mais capazes de bloquear a produção de células T ativadas por antigénios específicos do que a CTLA4Ig.

Para. esta finalidade, as moléculas mutantes solúveis de CTLA4 descritas no Exemplo 1 acima foram rastreadas usando um novo procedimento de rastreio para identificar várias mutações no domínio extracelular de CTLA4 que melhoram a avidez de ligação a CD80 e CD86. Esta estratégia de rastreio proporciona um método eficaz para identificar diretamente mutantes com taxas de "desligamento" evidentemente menores sem a necessidade de proteína ou quantificação de proteína, uma vez que a determinação da taxa de "desligamento" é independente da concentração ÇO'Shannessy, et al., Ç1993) Anal. Biochem., 212: 45É-468), Células COS foram transfetadas com ADN de plasmídeo purificado mini-preparado individual e propagadas durante vários dias. Meio de cultura condicionado durante três dias foi aplicado às lascas biossensoras BIAcore ÇPharmacia Biotech AB, Uppsala, Suécia) revestidas com CD8QIg ou CD86Ig solúvel. A ligação e dissociação específicas de proteínas mutantes foram medidas através de ressonância de plasmão em superfície ÇO'Shannessy, D. J., et al., Ç1993)

Anal. Biochem. 212: 45É-468). Todos os experimentos foram realizados sobre biossensores BIAcore™ ou BIAcore™ 2000 a 25 °C. Ligandos foram imobilizados sobre lascas sensoras NCM5 de grau para pesquisa ÇPharmacia) usando acoplamento padrão com N-hidróxisuccinimida de N-etil-N'-Çdimetilaminopropil) carbodiimida ÇJohnsson, B., et al. Ç1991) Anal. Biochem. 198: 268-2ÉÉ; Khilko, S.N., et al.Ç1993) J. Biol. Chem. 268: 5425-15434). Método de Rastreio Células COS crescidas em placas de cultura tecidual com 24 poços foram transitoriamente transfetadas com ADN que codifica CTLA4Ig mutante. Meio de cultura contendo CTLA4Ig mutante solúvel segregada foi colhido 3 dias depois.

Meio de cultura de células COS condicionado foi deixado fluir sobre lascas biossensoras BIAcore com CD86Ig ou CDSOIg Çconforme descrito em Greene, et ai., 1396 J. Biol. Chem. 2É1: 26É62-26ÉÉ1) e moléculas mutantes foram identificadas com taxas de "desligamento" menores do que aquelas observadas para CTLA4Ig do tipo selvagem. Os ADNc que se correspondem às amostras de meio rastreadas foram sequenciados e o ADN foi preparado para realizar a transfeção transitória de células COS numa escala maior, das quais a proteína de CTLA4Ig mutante foi preparada após purificação por proteína A do meio de cultura.

As condições de análise pelo BIAcore e análise de dados de ligação de equilíbrio foram realizadas conforme descrito em J. Greene, et ai. 1996 J. Biol. Chem. 2É1: 26É62-26ÉÉ1 e conforme descrito no presente documento. Análise de Dados pelo BIAcore

Linhas de base do sensorgrama foram normalizadas para zero unidade de resposta ÇRU) antes da análise. As amostras foram passadas sobre células de fluxo placebo-derivatizadas para determinar os valores de unidade de resposta ÇRU) de base em virtude de diferenças grandes no índice refrativo entre as soluções. As constantes de dissociação em equilíbrio ÇKa) foram calculadas a partir de plotagens de Req versus C, onde Req é a resposta em estado estacionário menos a resposta sobre uma lasca placebo-derivatizada e C é a concentração molar de analito. Curvas de ligação foram analisadas usando um software de adaptação de curva não linear comercial ÇPrism, GraphPAD Software).

Os dados experimentais foram primeiro adaptados a um modelo para uma única ligação a ligando a um único recetor Çmodelo com 1-local, isto é, um sistema de Langmuir simples, A+B«-»AB) e as constantes de associação em equilíbrio ÇKa=[A]®[B]\[AB]) foram calculadas a partir da equação R=Rmax®C/ÇKd+C) . Subsequentemente, os dados foram adaptados ao modelo com dois-locais mais simples de ligação a ligando Çisto é, a um recetor que tem dois locais de ligação de não-interação independentes, conforme descrito pela equação R=Rraaxi®C\ÇKd:LÊC) ÊRmax2*C\ÇKd2ÊC) ) . A melhor das adaptações destes dois modelos foi analisada virtualmente através de comparação com dados experimentais e estatisticamente através de um F teste da soma-dos-quadrados. 0 modelo com um-local mais simples foi escolhido como a melhor adaptação, a não ser que o modelo com dois-locais se adaptasse significativamente melhor Çp<0,1).

Análises de associação e dissociação foram realizadas usando o software BIA evaluation 2.1 ÇPharmacia). As constantes da taxa de associação kiigação foram calculadas de duas formas, admitindo interações em único-local homogéneas e interações em dois-locais paralelas. Para interações num único local, os valores de kiiga?§0 foram calculados de acordo com a equação Rt=ReqÇl-exp"ksv't”tO) , onde Rt é a resposta no tempo fornecido, t; Req é a resposta em estado estacionário; t0 é o tempo no início da injeção,* e ks=dR™dt= kiigação* Ckdesiígamento e onde C é a concentração de analito, calculada em termos de locais de ligação monomérica. Para interações em dois locais, os valores de kiigação foram calculados de acordo com a Rt=ReqiÇl-expKslçt“ to)ÊReq2Çl-exp'<s2ÇL‘Lo> . Para cada modelo usado, os valores de kiigação foram determinados a partir do declínio calculado Çpara cerca de ÉO % da associação máxima) de plotagens de ks versus C.

Os dados de dissociação foram analisados de acordo com os modelos com um local ÇAB=AÊB) ou dois locais ÇAiBj =AiEBj) as constantes de taxa Çkdesiigar£iento) foram calculadas a partir de curvas de melhor adaptação. 0 modelo de local de ligação foi usado, exceto quando os residuais eram maiores do que a base da máquina Ç2-10 RU, de acordo com a máquina) , caso no qual o modelo com dois-locais de ligação foi utilizado. Os meios-tempos de ocupação do recetor foram calculados usando a relação ti'»2 = 0,693™ kde sligamento *

Citometria de Fluxo mAb L30É.4 de murino Çanti-CDSO) foi adquirido da Becton Dickinson ÇSan Jose, Califórnia) e IT2.2 Çanti-BÉ-0 [também conhecido como CD86]), da Pharmingen ÇSan Diego, Califórnia). Para imunocoloração, células CHO CD80-positivas e™ou CD86-positivas foram removidas de seus vasos de cultura através de incubação em solução salina tamponada com fosfato ÇPBS) contendo EDTA a 10 mM. Células CHO Çl-10 x 105) foram primeiro incubadas com mAbs ou proteínas de fusão de imunoglobulina em DMEM contendo soro bovino fetal a 10 % ÇFBS), então, lavadas e incubadas com reagentes para a segunda etapa de imunoglobulina anti-humana ou antiratinho de cabra isotiocianato de fluoresceína-conjugados ÇTago, Burlingame, Califórnia). Às células foi fornecida uma lavagem final e analisadas sobre um FACScan ÇBecton Dickinson). SDS-PAGE e Cromatografia de Exclusão por Tamanho SDS-PAGE foi realizado sobre géis de Tris™glicina acrilamida a 4-20 % ÇNovex, San Diego, CA). Géis analíticos foram corados com Coomassie Blue e imagens dos géis húmidos foram obtidas através de varredura digital. CTLA4Ig Ç25 ug) e L104EA2 9YIg Ç25 pg) foram analisados através de cromatografia por exclusão de tamanho usando uma coluna TSK-GEL G300 SWxl ÇÊ,8 X 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) equilibrada em solução salina tamponada com fosfato contendo NAN3 a 0,02 % numa taxa de fluxo de 1,0 ml™min. CTLA4XCi20s e L104EA2 9YXCi2os CTLA4XCi2os com cadeia simples foi preparado conforme anteriormente descrito ÇLinsley, et ai. , Ç1995) J. Biol.

Chem., 2É0: 1541É- 15424). Resumidamente, um plasmídeo de expressão de CTLA4 de oncostatina M Ç0MCTLA4) foi usado como um modelo, o iniciador direto, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG foi escolhido para combinar sequências no vetor; e o iniciador indireto, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC correspondia aos sete últimos aminoãcidos Çisto é aminoácidos 118-124) no domínio extracelular de CTLA4 e continha um local de enzima de restrição e um códão terminal ÇTGA). 0 iniciador indireto especificava uma mutação C120S Çcisteína para serina na posição 120) . Em particular, a sequência de nucleótidos GCA Çnucleõtidos 34-36) do iniciador indireto mostrado acima é substituída por uma das seguintes sequências de nucleótido: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT ou GCT. Conforme os peritos na especialidade compreenderão, a sequência de nucleótidos GCA é uma sequência complementar reserva do códão TGC para cisteína. Similarmente, as sequências de nucleótido AGA, GGA, TGA, CGA, ACT ou GCT são as sequências complementares reversas dos codões para serina. Os produtos da reação em cadeia de polimerase foram digeridos com HindIII,/XbaI e direcionalmente subclonados no vetor de expressão ttLN ÇBristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ) . L104EA2 9YXCi2os foi preparado de uma maneira idêntica. Cada estrutura foi verificada através de sequenciamento de ADN.

Identificação e Caraterização Bioquímica de Mutantes com Alta Avidez

Vinte e quatro aminoãcidos foram escolhidos para mutagénese e as proteínas mutantes de -2300 resultantes avaliadas com relação à ligação a CD86Ig através de ressonância de plasmão em superfície ÇSPR; conforme descrito, supra). Os efeitos predominantes de mutagénese em cada local são resumidos no Quadro II. A mutagénese aleatória de alguns aminoãcidos em S25-R33 aparentemente não altera a ligação ao ligando. A mutagénese de E31 e R33 e dos resíduos M9É-Y102 aparentemente resultou em ligação ao ligando reduzido. A mutagénese dos resíduos S25, A29 e T30, K93, L96, Y103, L104 e G105 resultou em proteínas com taxas de "ligação" e™ou "desligamento" lentas. Estes resultados confirmam as descobertas anteriores de que os resíduos na região S25-R33 e resíduos em ou próximo de M9É- Y102 influenciam a ligação ao ligando ÇPeach, et al., Ç1994) J. Exp. Med., 180: 2049-2058. A mutagénese dos locais S25, T30, K93, L96, Y103 e G105 resultou na identificação de algumas proteínas mutantes que tinham menores taxas de "desligamento" de CD86Ig. No entanto, nestes casos, a lenta taxa de "desligamento" foi comprometida por uma lenta taxa de "ligação", a qual resultou em proteínas mutantes com uma avidez total por CD86Ig que era aparentemente similar àquela observada com CTLA4Ig do tipo selvagem. Além disso, a mutagénese de K93 resultou em agregação significativa, a qual pode ter sido responsável pelas alterações cinéticas observadas. A mutagénese aleatória de L104 seguida de transfeção e rastreio de células COS através de amostras do meio de cultura SPR sobre CD86Ig imobilizado proporcionaram seis amostras de meio contendo proteínas mutantes com taxas de "desligamento" aproximadamente 2 vezes mais lenta do que a CTLA4Ig do tipo selvagem. Quando o ADNc correspondente destes mutantes foi sequenciado, descobriu-se que cada um codifica uma mutação de leucina para ácido glutâmico ÇL104E). Aparentemente, a substituição de leucina 104 por ácido aspártico ÇL104D) não afeta a ligação a CD86Ig. A mutagénese foi, então, repetida em cada local listado no Quadro II, dessa vez usando L104E como o modelo de PCR ao invés de CTLA4Ig do tipo selvagem, conforme descrito acima. Análise por SPR, novamente usando CD86Ig imobilizado, identificou seis amostras de meio de cultura da mutagénese de alanina 29 com proteínas que tem taxas de "desligamento" aproximadamente 4 vezes mais lenta do que a CTLA4Ig do tipo selvagem. As duas mais lentas eram substituições de tirosina ÇL104EA29Y), duas eram leucina ÇL1Q4EA29L), uma foi triptofano ÇL104EA29W) e uma foi treonina ÇL104EA29T), Aparentemente, nenhum mutante com taxa de "desligamento" lenta foi identificado quando alanina 2 9 sofreu mutação aleatória, apenas, em CTLA4Ig do tipo selvagem. A massa molecular relativa e estado de agregação de L104E e L104EA29YIg purificados foram avaliados através de SDS-PAGE e cromatografia por exclusão de tamanho. L104EA2 9YIg Ç~1 pg; pista 3) e L104EIg Ç~1 pg; pista 2) aparentemente tinham a mesma mobilidade eletroforética que a CTLA4Ig Ç~1 pg; pista 1) sob condições de redução Ç~50 kDa; ΕβΜΕ; mais 2-mercaptoetanol) e não-redução Ç-100 kDa; -EME) ÇFIG. 10A) . Cromatografia por exclusão de tamanho demonstrou que L104EA29YIg ÇFIG. 10C) aparentemente tinha a mesma mobilidade que a CTLA4Ig dimérica ÇFIG. 10B) . Os principais picos representam dímero de proteína, enquanto que o pico menor com eluição mais rápida na FIG. 10B representa agregados de maior peso molecular. Aproximadamente 5,0 % de CTLA4Ig estava presente como agregados de maior peso molecular, mas não havia evidência de agregação de L104EA29YIg ou L104EIg. Portanto, a ligação mais forte a CD86Ig observada com L104EIg e L104EA29YIg não poderia ser atribuída à agregação induzida por mutagénese. Análise de Ligação em Equilíbrio e Cinética A análise de ligação em equilíbrio e cinética foi realizada sobre CTLA4Ig, L104EIg e L104EA29YIg purificados por proteína A usando ressonância de plasmão em superfície ÇSPR). Os resultados são mostrados no Quadro I.

QUADRO I

As constantes de dissociação em equilíbrio observadas ÇKd; quadro I) foram calculadas a partir de curvas de ligação geradas sobre uma faixa de concentrações Ç5,0-200 nM) . L104EA29YIg liga-se mais fortemente a CD86Ig do que L104EIg ou CTLA4Ig. A Kd de L104EA29YIg Ç3,21 nM) menor do que L104EIg Ç6;06 nM) ou CTLA4Ig Ç13;9 nM) indica maior avidez de ligação de L104EA29YIg a CD86Ig. A Kd de L104EA2 9YIg Ç3,66 nM) menor do que L104EIg Ç4,4É nM) ou CTLA4Ig Ç6,51 nM) indica maior avidez de ligação de L104EA29YIg a CDSOIg.

Análise de ligação cinética revelou que as taxas de "ligação" comparativas para ligação de CTLA4Ig, L104EIg e L104EA29YIg a CD80 eram similares, assim como as taxas de "ligação" para CD86Ig ÇQuadro I) . No entanto, as taxas de "desligamento" para essas moléculas não eram equivalentes ÇQuadro I) . Comparado com CTLA4Ig, L104EA29YIg tinha uma taxa de "desligamento" de CDSOIg aproximadamente 2 vezes mais lenta e uma taxa de "desligamento" de CD86Ig aproximadamente 4 vezes mais lenta. L104E tinha taxas de "desligamento" intermediárias entre L104EA29YIg e CTLA4Ig. Uma vez que a introdução dessas mutações não afeta significativamente as taxas de "ligação", o aumento na avidez por CD80Ig e CD86Ig observado com L104EA29YIg foi provavelmente em virtude, primariamente, de uma diminuição nas taxas de "desligamento".

Para determinar se o aumento na avidez de L104EA29YIg por CD86Ig e CDSOIg foi em virtude das mutações que afetam a forma como cada monômero é associado como um dímero ou se houve alterações estruturais que intensificam a avidez introduzidas em cada monômero, estruturas com cadeia simples dos domínios extracelulares de CTLA4 e L104EA29Y foram preparadas após mutagénese da cisteína 120 para serina conforme descrito supra e por Linsley, et al., Ç1995) J. Biol. Chem., 2É0: 1541É- 15424. Foi mostrado que as proteínas CTLA4Xci2os e L104EA29YXci2os purificadas eram monoméricas através de cromatografia por permeação de gel ÇLinsley, et al, , Ç1995), supra), antes que suas propriedades de ligação a ligando fossem analisadas através de SPR. Os resultados mostraram que a afinidade de ligação de ambas as proteínas monoméricas por CD86Ig era aproximadamente 35-80 vezes menor do que aquela observada para seus respetivos dímeros ÇQuadro I) . Isso sustenta os dados anteriormente publicados estabelecendo que a dimerização de CTLA4 era requerida para ligação a ligando com alta avidez ÇGreene, et al., Ç1996) J. Biol. Chem., 2É1 : 26É62-26ÉÉ1) . L104EA2 9YXCi.2os ligou-se com uma afinidade aproximadamente 2 vezes maior do que CTLA4Xcl20s a CD80Ig e CD86Ig. A afinidade aumentada foi em virtude de uma taxa de dissociação aproximadamente 3 vezes mais lenta de ambos os ligandos. Portanto, a ligação a ligando mais forte pelo L104EA29Y foi, mais provavelmente, em virtude de alterações estruturais que alteram a avidez que tinham sido introduzidas em cada cadeia monomérica ao invés de alterações nas quais a molécula dimerizava.

Localização e Análise Estrutural de Mutações que

Intensificam a Avidez A estrutura em solução do domínio extracelular semelhante a IgV da CTLA4 foi recentemente determinada através de espetroscopia por RMN ÇMetzler, et al. , Ç199É)

Nature Struct. Biol., 4: 52É-531. Isso permitiu localização precisa de leucina 104 e alanina 29 na dobra tridimensional ÇFIG. 11A-B). Leucina 104 está localizada próximo da sequência de aminoácidos MYPPPY altamente conservada. Alanina 29 está situada próximo da extremidade C-terminal da região S25-R33, a qual é espacialmente adjacente à região MYPPPY. Embora exista uma interação significativa entre resíduos na base dessas duas regiões, evidentemente não há interação direta entre L104 e A2 9, embora elas possam compreender parte de um núcleo hidrofóbico contínuo na proteína. As consequências estruturais dos dois mutantes que intensificam a avidez foram avaliadas através de modelamento. A mutação A29Y pode ser facilmente acomodada no agrupamento entre a região S25-R33 e a região MYPPPY e pode servir para estabilizar a conformação da região MYPPPY. Em CTLA4 do tipo selvagem, L104 forma interações hidrofóbicas extensivas com L96 e V94 próximo da região MYPPPY. É altamente improvável que o ácido glutâmico mutação adote uma conformação similar àquela da L104 por duas razões. Primeiro, há espaço insuficiente para acomodar a cadeia lateral de ácido glutâmico mais longa na estrutura sem perturbar significativamente a região S25-R33. Segundo, os custos energéticos de retirada da carga negativa da cadeia lateral de ácido glutâmico na região hidrofóbica serão grandes. Antes, estudos de modelamento preveem que a cadeia lateral de ácido glutâmico se move sobre a superfície, onde sua carga pode ser estabilizada através de solvatação. Tal alteração conformacional pode ser facilmente acomodada por G105, com distorção mínima a outros resíduos nas regiões.

Ligação de Mutantes com Alta Avidez às Células CHO que

Expressam CD80 ou CD86

Análise por FACS ÇFig. 2) de ligação de CTLA4Ig e moléculas mutantes CHO CD80+ e CDS6-+· estavelmente transfetadas foi realizada conforme descrito no presente documento. Células CHO CD80-positivas e CD86-positivas foram incubadas com concentrações crescentes de CTLA4Ig, L104EA29YIg ou L104EIg e, então, lavadas. Proteína de fusão de imunoglobulina ligada foi detetada usando imunoglobulina anti-humana de cabra conjugada com isotiocianato de fluoresceína.

Conforme mostrado na Figura 2, as células CHO CD80-positivas ou CD86-positivas Ç1,5 x 10b) foram incubadas com as concentrações indicadas de CTLA4Ig Çquadrados cheios), Li04EA29YIg Çcírculos) ou L104EIg Çtriângulos) durante 2 horas a 23QC, lavadas e incubadas com anticorpo de imunoglobulina anti-humana de cabra conjugado com isotiocianato de fluoresceína. Ligação sobre um total de 5.000 células viáveis foi analisada Çdeterminação única) sobre um FACScan e a intensidade média de fluorescência ÇMFI) foi determinada a partir de histogramas de dados usando PC-LYSYS. Os dados foram corrigidos para a fluorescência de base medida sobre células incubadas com reagente para segunda etapa apenas ÇMFI = É) . mAb L6 de controlo Ç80 pg™ml) proporcionou MFI < 30. Estes resultados são representativos de quatro experimentos independentes. A ligação de L104EA29YIg, L104EIg e CTLA4Ig às células CHO humanas CD80-transfetadas é aproximadamente equivalente ÇFIG. 2A) . LIQ4EA29YIg e L104EIg ligam-se mais fortemente às células CHO estavelmente transfetadas CD86 humano do que a CTLA4Ig ÇFIG. 2B).

Ensaios Funcionais

As células T humanas CD4-positivas foram isoladas através de seleção negativa imunomagnética ÇLinsley, et al, , Ç1992) J. Exp. Med. 1É6: 1595-1604) . Células T CD4-positivas isoladas foram estimuladas com acetato de miristato de forbal ÇPMA) mais células CHO CD80-positivas ou CD86-positivas na presença de concentrações para titulação de inibidor. Células T CD4-positivas Ç8-10 x 104™poço) foram cultivadas na presença de PMA a 1 nM com ou sem estimulantes de células CHO irradiados. As respostas proliferativas foram medidas através da adição de 1 pCi™poço de [3H]timidina durante as É horas finais de uma cultura de É2 horas. Inibição de PMA mais células T estimuladas com CEO CD80-positiva ou CEO CD86-positiva através de L104EA29YIg e CTLA4Ig foi realizada. Os resultados são mostrados na FIG. 3. L104EA29YIg inibe a proliferação de células CEO tratadas com PMA CD80-positivo mais do que CTLA4Ig ÇFIG. 3A) . L104EA29YIg é também mais eficaz do que a CTLA4Ig na inibição de proliferação de células CEO tratadas com PMA CD86-positivo ÇFIG. 3B) . Portanto, L104EA29YIg é um inibidor mais potente de co-estimulação mediada por CD80 e CD86 de células T. A Figura 4 mostra a inibição, por L104EA29YIg e CTLA4Ig, de células T humanas aloestimuladas preparadas acima e ainda aloestimuladas com uma linha de células linfoblastoide B humana ÇLCL) denominada PM que expressa CD80 e CD86 Çcélulas T a 3,0 x 104™poços e PM a 8,0 X 103™poço). Aloestimulação primária ocorreu durante 6 dias, então, as células foram submetidas a pulso com JH-timidina durante É horas, antes que a incorporação de radiomarcador fosse determinada.

Aloestimulação secundária foi realizada como se segue. Células T primárias aloestimuladas sete dias foram colhidas sobre meio de separação de linfócito ÇLSM) ÇICN, Aurora, OH) e deixadas descansar durante 24 horas. As células T foram, então, reestimuladas Çsecundária), na presença de quantidades para titulação de CTLA4Ig ou L104EA29YIg, através de adição de PM na mesma proporção conforme acima. Estimulação ocorreu durante 3 dias, então, as células foram pulsadas com radiomarcador e colhidas conforme acima. 0 efeito de L104EA29YIg sobre células T aloestimuladas primárias é mostrado na FIG. 4A. 0 efeito de L104EA29YIg sobre células T aloestimuladas secundária é mostrado na FIG. 4B. L104EA2 9YIg inibe as respostas proliferativas primárias e secundárias de células T melhor do que a CTLA4Ig.

Para medir a produção de citocina ÇFigura 5), placas de aloestimulaçâo secundária em duplicata foram preparadas. Após 3 dias, meio de cultura foi avaliado usando um kit ELISA ÇBiosource, Camarillo, CA) usando condições recomendadas pelo fabricante. Descobriu-se que L104EA29YIg era mais potente do que CTLA4Ig no bloqueio de produção de citocinas IL-2, IL-4 e y-IFN por células T após um estímulo alogénico secundário ÇFIGS. 5A-C).

Os efeitos de L104EA29YIg e CTLA4Ig sobre a resposta mista de linfócitos de macaco ÇMLR) são mostrados na Figura 6. Células mononucleares de sangue periférico ÇPBMC'S; 3,5 x 104 células™poço de cada macaco) de 2 macacos foram purificadas sobre meio de separação de linfócitos ÇLSM) e misturadas com 2 pg™ml de fitohemaglutinina ÇPHA). As células foram estimuladas 3 dias, então, pulsadas com radiomarcador 16 horas antes de coleta. L104EA29YIg inibiu a proliferação de células T de macaco melhor do que a CTLA4Ig.

OUADRO II

EXEMPLO 3

Este estudo comparou a eficácia e segurança de L104EA29YIg, descrito acima, como um imunossupressor de manutenção com CsA durante 12 meses quando usado como parte de um regime combinado isento de CNI que consiste em indução com basiliximabe ÇSimulect®; Novartis), micofenolato de mofetilo ÇMMF; CellCept®; Roche) e corticosteroides em recetores de transplante renal.

Recetores adultos de um aloenxerto renal não-HLA idêntico de um dador vivo ou morto eram elegíveis. Indivíduos com um transplante renal anterior, um histórico de anticorpos painel-reativos de >20 % ou aqueles considerados pelo investigador como estando em maior risco de rejeição aguda foram restritos a <10 % da população de estudo. Os critérios de exclusão incluíam doença renal subjacente de glomeruloesclerose focal e segmentai, glomerulonefrite membrano-proliferativa do Tipo I ou II ou síndrome urémica hemolítica™púrpura trombocitopénica trombótica; hepatite B ou C ou VIH ativos; e idade do dador >60 ou <6, dadores com morte cardíaca ou dadores com um tempo de isquemia renal de >36 horas.

Este foi um estudo multicentro, de marcador-aberto, aleatório, ativo-controlado, dose-múltipla realizado nos Estados Unidos, Europa e Canadá. Os pacientes elegíveis de qualquer sexo com idade <18 anos que sofreram um transplante renal (dador vivo ou morto, exceto quando o dador e o recetor eram HLA-idênticos) foram aleatoriamente distribuídos a tratamento numa proporção de 1: 1: 1 com um regime de tratamento com L104EA29YIg mais intensivo (Ml), um regime de tratamento com L104EA29YIg menos intensivo (LI) ou Ciclosporina A (CsA); todos em terapêutica combinada com indução com basiliximabe (Simulect®; Novartis), terapêutica de manutenção adjunta com micofenolato de mofetilo (MMF; CellCept®; Roche) e corticosteroides. Ambos os regimes com L104EA29YIg incluíam uma fase precoce, na qual L104EA29YIg foi administrado a 10 mg™kg e uma fase de manutenção, na qual L104EA29YIg foi administrado a 5 mg™kg em intervalos de q4 semanas ou q8 semanas. As doses para cada regime eram baseadas no peso corporal. Essas doses foram orientadas pelos perfis alvo mostrados como sendo eficazes durante estudos com primatas não- humanos. Estes perfis requeriam doses que eram maiores inicialmente, durante o período de maior risco imunológico (Dias 0-90) . A fase precoce durou mais tempo sob o regime MI (6 vs. 3 meses) e incluía dosagem mais frequente. 0 regime de tratamento com L104EA29YIg mais intensivo (Ml) consistia em administração de 10 mg™kg nos dias 1,5, 15, 29, 43, 5É, Él,85, 113, 141 e 169, seguido de 5 mg™kg a cada 4 ou 8 semanas. 0 regime de tratamento com L104EA29YIg menos intensivo ÇLI) consistia em 10 mg™kg nos dias 1,15, 29, 5É e 85, seguido de 5 mg™kg a cada 4 ou 8 semanas. L104EA29YIg foi administrado numa infusão intravenosa de 30 minutos. Os pacientes aleatoriamente distribuídos à CsA receberam doses duas vezes ao dia ÇÊ ± 3 mg™kg) para obter a faixa pré-especifiçada de concentrações alvo no soro de 150-400 ng™ml durante o primeiro mês e 150-300 ng™ml durante os meses 2-12, o qual é consistente com a prática médica atual. Todos os pacientes receberam 2 g de MMF diariamente e 20 mg de basiliximabe a cada 4 dias. Um regime de redução com corticosteroide foi também fornecido, consistindo num bolo iv de 500 mg de metilprednisolona no Dia 1 e 250 mg no Dia 2, seguido de 100 mg de prednisona oral no Dia 3, 50 mg no Dia 4, 25 mg nos dias 5-30, 22,5 mg nos dias 31-44, 20 mg nos dias 45-58, 1É,5 mg nos dias 59-É2, 15 mg no Dia É3-86, 12,5 mg nos dias 8É-100 e 10 mg nos dias 101-114. Após o Dia 114, a dose de prednisona pôde ser diminuída para 2,5 mg mês sim, mês não para menos do que 5 mg por dia. 0 objetivo primário era demonstrar que L104EA29YIg não era inferior à CsA na prevenção de rejeição aguda a 6 meses. Objetivos secundários incluíam avaliação da incidência de rejeição aguda Çbiópsia-confirmada ou presumida) a 6 meses e 1 ano; taxa de filtração glomerular ÇGFR) por meio da retirada de iohexol a 1, 6 e 12 meses; parâmetros de hipertensão; colesterol e triglicerídeos no soro; e segurança global. Outras análises pré-especifiçadas incluíam morte do paciente ou perda do enxerto a 1 ano; a gravidade de rejeição aguda; a incidência de diabetes mellitus pós-transplante [definido como qualquer terapêutica requerida para hiperglicemia durante >4 semanas ou uma hemoglobina A1C ÇHbAlc) >É %, em pacientes que não se tinha conhecimento de serem diabéticos anteriormente]; GFR calculada, usando as fórmulas de Modificação da Dieta na Doença Renal ÇMDRD, Levey AS, Bosch JP, Lewis JP, Greene T, Rogers N, Roth D. A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann Intern Med 1999; 130: 461-4ÉQ), Jelliffe ÇRW. Creatinine clearance: Bedside estimate. Ann Inter Med. 19É3; É9: 604-605), Cockcroft-Gault ÇCockcroft DW, Gault MH. Prediction of creatinine clearance from serum creatinine. Nephron 19É6; 16: 31-41) e Nankivell ÇNankivell BJ, Gruenewald SM, Allen RD, Chapman JR. Predicting glomerular filtration rate after kidney transplantation. Transplantation. 1995; 59Ç12): 1683-1689); farmacocinética e imunogenicidade. Diagnóstico e tratamento de rejeição aguda ÇAR) eram baseados nos critérios e graus de Banff 9É ÇRacusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 9É working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999; 55Ç2): É13-23.). Uma análise post-hoc foi conduzida a respeito da incidência de nefropatia crónica pelo aloenxerto ÇCAN).

Diagnóstico e tratamento de rejeição aguda ÇAR) eram baseados nos critérios e grais de Banff 9É ÇRacusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 9É working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999; 55Ç2): É13-23.). Biópsias do aloenxerto renal intraoperatórias foram realizadas para avaliar a histologia de linha de base. 0 tecido submetido à biópsia foi corado e graduado de acordo com a classificação de trabalho Banff 9É de patologia de transplante renal. As biópsias foram avaliadas por um patologista independente não ciente do tratamento para confirmar todos os episódios de AR clinicamente suspeito antes de tratamento para AR.

Pontos finais adicionais incluíam: rejeição aguda clinicamente suspeita e comprovada por biópsia ÇCSBPAR) a 12 meses; morte ou perda do enxerto a 1 ano; gravidade dos episódios de AR Çmedida usando a escala Banff 9É); falha do tratamento Çdefinido como a opinião do investigador; ^rejeição de grau UB; rejeição recorrente ou resistente a esteroide); função renal a 1, 6 e 12 meses Çtaxas de filtração glomerular [GFRs] avaliadas através de retirada de lohexol) e evidência de nefropatia crónica pelo aloenxerto ÇCAN) Çfibrose intersticial e atrofia tubular); parâmetros de hipertensão Çpressão sanguínea diastólica [BP] >90 mm de Hg e™ou BP sistólica >140 mm de Hg) ; lipídios no soro; segurança, tolerabilidade e eventos adversos ÇAEs) em pacientes tratados com L104EA29YIg comparado com pacientes tratados com CsA.

Para avaliações de segurança e tolerabilidade, AEs, medições laboratoriais Çhematologia, bioquímica e análise de urina) e sinais vitais foram registrados durante visitas esquematizadas regulares na clínica.

Resultados

Um total de 218 pacientes sofreu transplante renal e foram aleatoriamente distribuídos ao grupo MI ÇN = É4), grupo LI ÇN = Él) ou CsA ÇN = É3) . As populações e caraterísticas clínicas de linha de base eram similares entre os três grupos de tratamento. Um total de 164 pacientes completou 1 ano de tratamento. Dos pacientes que descontinuaram antes de 1 ano ÇN = 16 vs 16 vs 20; regime MI versus regime LI versus CsA), as razões mais comuns foram AEs ÇN = 5 versus 8 vs 9) e falha de tratamento ÇN = É versus 5 versus 3). A incidência de CSBPAR ocorreu menos frequentemente em todos os grupos de tratamento e não havia diferença significativa na incidência de CSBPAR ou rejeição aguda comprovada por biópsia ÇBPAR) entre os grupos de tratamento. A 6 e 12 meses, a incidência de CSBPAR foi de 6,8 %, 5,6 % e 8,2 % para tratamento MI, LI e CsA, respetivamente. A incidência de BPAR também foi similar entre os grupos a 6 e 12 meses, embora BPAR fosse ligeiramente maior no grupo LI do que nos outros dois grupos Ç18,9 %, 29,6 % e 1É,S % para o tratamento MI, LI e CsA, respetivamente). Rejeição aguda comprovada por biópsia foi mais frequente do que CSBPAR em todos os grupos de tratamento e era mais comum no grupo LI. No entanto, verificou-se que muitos destes eventos ocorriam em pacientes com L104EA29YIg abaixo das concentrações desejadas no soro.

Nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os grupos de tratamento foi observada quanto à gravidade de AR; no entanto, os números eram pequenos e não resultaram em perda do enxerto.

Este estudo foi a cegas quanto à medicação do estudo de forma a permitir padronização de assistência com relação à CsA, o que provavelmente contribuiu para o número aumentado de biópsias tomadas de grupos com L104EA29YIg ÇN = 34 5) comparado com o grupo com CsA ÇN = 144) . Embora não seja esperado para um estudo planejado dessa forma, poderia haver uma incidência aumentada da taxa de diagnóstico de anormalidades histológicas renais nos grupos de tratamento com L104EA29YIg.

Morte e™ou perda do enxerto não foi frequente em todos os grupos de tratamento, com 1 morte reportada no grupo MI, 4 no grupo com CsA e nenhuma no grupo LI. A maioria das perdas de enxerto não foi causada por eventos imunológicos e apenas 3 enxertos foram perdidos nos grupos MI com CsA versus 1 no grupo LI.

Aperfeiçoamentos significativos na função renal foram observados com tratamento baseado em L104EA29YIg comparado com imunossupressão baseada em CsA. Retirada de lohexol foi maior com tratamento com L104EA29YIg em todos os pontos de tempo, com um aperfeiçoamento médio de 11 ml™min™!,É3m2 Ç~2Q %) comparado com CsA a 12 meses. A 12 meses, nefropatia crónica pelo aloenxerto ÇCAN) era entre 3 0 e 5 0 % menos comum, em termos relativos, nos pacientes tratados com LlG4EA29YIg do que naqueles tratados com CsA. As taxas de nova ou piora de CAN a 12 meses foram de 29 %, 19 % e 44 % para os grupos MI, LI e com CsA, respetivamente. A 1 ano, a pressão sanguínea sistólica média era 3-4 mmHg maior em pacientes tratados com CsA Ç133 mmHg) versus pacientes em nos grupos de tratamento MI Ç13 0 mmHg) e LI Ç129 mmHg) . Isso foi a despeito de menor utilização de medicação anti-hipertensiva nos grupos com L104EA29YIg ÇMI: 8É,5 %; LI 84,1 %: CsA 92,2 %) . 0 colesterol total no soro era ligeiramente menor com os pacientes tratados com L104EA29YIg ÇMI: 198 mg™dL; LI: 201 mg™dL) versus aqueles tratados com CsA Ç212 mg™dL), embora a utilização de medicação para diminuição de lipídios também fosse menor com L104EA29YIg ÇMI: 36,1 %; LI: 31,9 %; CsA : 53,1 %) .

Quatro Ç5,5 %) pacientes morreram no grupo com CsA comparado com 1 nos grupos de tratamento com L104EA29YIg. As taxas de eventos adversos ÇAEs) eram comparáveis entre os grupos de tratamento; no entanto, AEs relacionados eram significativamente menores após tratamento com L104EA29YIg do que tratamento com CsA. Administração intravenosa de L104EA29YIg foi bem tolerada sem nenhuma reação à infusão. Pacientes tratados com L104EA29YIg não exibiram eventos adversos CsA-relacionados típicos, tais como anemia, leucopenia, hirsutismo, tremor e hiperplasia gengival. Terapêutica baseada em L104EA29YIg não foi associada a qualquer risco aumentado de infeções ou malignidades comparado com a terapêutica baseada em CsA.

Conclusão

Este estudo de 12 meses demonstra que a terapêutica de manutenção baseada em LlG4EA29YIg confere eficácia equivalente na prevenção de AR e sobrevivência similar do paciente e enxerto comparado com CsA. Além disso, L104EA2 9YIg demonstrou aperfeiçoamentos significativos na função renal e reduções em CAN comparado com imunossupressão de manutenção baseada em CsA. L104EA29YIg era seguro e bem tolerado e não foi associado a toxicidades relacionadas com CNI típicas.

As taxas de CSBPAR e BPAR foram similares entre os três grupos de tratamento, demonstrando que as baixas taxas de AR observadas com terapêutica baseada em CsA são também obtidas com L104EA29YIg. A maioria dos BPARs foi classificada com subclínicos, sugerindo que a função renal não foi prejudicada. A taxa numericamente menor de AR no grupo Ml, comparado com o grupo LI, sugere uma possível resposta dose-dependente com L104EA29YIg. Biópsias mais frequentes com os grupos com L104EA29YIg poderiam ter levado potencialmente ao sobrediagnóstico de rejeição aguda e crónica nestes grupos, sugerindo que os benefícios de terapêutica com L104EA29YIg podem estar subestimados neste estudo. A maioria dos eventos de BPAR ocorreu dentro dos primeiros três meses pós-transplantação, o que não é esperado, uma vez que outros mostraram que doses maiores de imunossupressores são requeridas durante o período imediatamente pós-transplantação ÇWiecek A, Nowicki M, Kokot F, Ritz E. Acute failure of transplanted kidney-pathophysiology, diagnosis and prevention. Ann Transplante 1996 ; 1Ç4) : 5-9 e Bennett WM. Posttransplant acute renal failure. Ren Fail 199É; 19Ç2) : 225-6) . Uma vez que a maioria destes eventos ocorreu abaixo dos valores desejados, consideração deve ser dada à alteração do regime no primeiro mês de tratamento, antes de atingir um estado estacionário. A maioria dos BPARs observados durante a fase de manutenção ocorreu em níveis muito baixos ou indetetãveis de L104EA29YIg, sugerindo que a incidência de AR durante estes períodos estava relacionada com a imunossupressão insuficiente, o que pode ser evitado por alterações no regime de dose.

Este estudo demonstra que L104EA29YIg está associado a taxas globais de AE similares comparado com CsA, com menos AEs relacionados ao fármaco de estudo. Nenhuma diferença real no número de AEs relacionados com vírus era idêntica entre os três grupos de tratamento.

Na presença de baixas taxas de AR, o novo objetivo de imunossupressão de manutenção é redução das complicações para a saúde a longo prazo, incluindo hipertensão, hiperlipidemia, toxicidade pelo fármaco e a prevenção de formação de cicatrizes. Conforme em doenças autoimunes, uma nova geração de agentes imunossupressores de manutenção imunosseletiva está a emergir. Inibição de co-estimulação de células T por meio de bloqueio de co-estimulação imunosseletiva com L104EA29YIg representa um novo paradigma, oferecendo a promessa de imunossupressão de manutenção mais seletiva, toxicidades reduzidas e resultados a longo prazo aperfeiçoados em transplante renal. EXEMPLO 4

Existe uma necessidade médica substancial não satisfeita de novas terapêuticas em transplantação renal que proporcionem sobrevivência a curto prazo do indivíduo e enxerto comparável com os CNI sem seus efeitos nefrotóxicos, cardiovasculares e metabólicos a longo prazo. A necessidade é particularmente grande entre recetores de ECD que define aloenxertos renais, cujas taxas de sobrevivência a longo prazo do indivíduo e do enxerto estão distintamente abaixo daquelas de recetores de aloenxertos de dadores que vão de encontro aos critérios padrões de elegibilidade. L104EA29YIg, um agente imunossupressor com um novo mecanismo de ação, é um candidato não nefrotõxico promissor para utilização em recetores de transplante renal de aloenxertos ECD. Em virtude do facto de o L104EA29YIg poder ser administrado no momento de enxerto ao invés de um modo retardado, conforme é frequentemente necessário com CNI - especialmente naqueles aloenxertos com função renal inicial prejudicada - ele proporciona imunossupressão de uma maneira sincronizada e sem a necessidade de preparados policlonais antilinfócito. Isso pode se traduzir em taxas de rejeição aguda comparáveis com um perfil de segurança favorável. Uma vez que o L104EA29YIg não é previsto como sendo nefrotóxicos, benefícios adicionais seriam observados com relação à estrutura Çisto é, CAN) e função Çisto é, GFR) do aloenxerto. Finalmente, diferente dos CNI, o mecanismo objetivado de ação do L104EA29YIg proporcionaria imunossupressão sem afetar adversamente o perfil cardiovascular™metabólico. Uma avaliação de benefício-risco global para utilização do L104EA29YIg nesta população é proporcionada a seguir.

Dois regimes de dose Çconforme descrito no Exemplo 3, com uma modificação mínima no regime LI e usando o esquema de infusão de manutenção a cada 4 semanas) serão estudados.

Oh"i pfivoc? Pr iMârHrscs 1) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a sobrevivência composta do indivíduo e enxerto a 12 meses. 2) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à

CsA, sobre o composto de GFR < 60 ml™min™i,É3 m2 medida no Mês 12 ou uma diminuição na GFR > 10 ml™min™l,É3 m2 medida do Mês 3 ao Mês 12.

Obj etivos Secundários 1) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR medida a 12 meses. 2) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a CAN biópsia-comprovada em 12 meses. 3) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR medida a 3 meses e alteração da linha de base Ç3 meses) a 12 meses. 4) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com uma GFR < 30 ml™min™l,É3 m2 medida a 12 meses. 5) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR calculada a 3, 12, 24 e 36 meses e alteração da linha de base Ç3 meses) a 12, 24 e 36 meses. 6) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre PTDM a 12, 24 e 36 meses. É) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre medidas de hipertensão a 12, 24 e 36 meses, incluindo SBP e DBP, incidência e prevalência de hipertensão e hipertensão controlada e intensidade do regime de tratamento. 8) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre as medidas de dislipidemia, a 12, 24 e 36 meses, incluindo soro total, não- HDL, lipoproteína de baixa densidade ÇLDL) e HDL colesterol e TGs, incidência e prevalência de dislipidemia e dislipidemia controlada e intensidade do regime de tratamento. 9) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a sobrevivência do indivíduo e enxerto a 24 e 36 meses. 10) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre as medidas de rejeição aguda a 6 meses, incluindo a incidência e gravidade de rejeição aguda, a utilização de preparados policlonais antilinfòcito para função renal prejudicada e DGF prevista, a utilização inicial de terapêutica para redução de linfócitos para tratamento de rejeição aguda, a incidência de rejeição aguda resistente a esteroide, a incidência de recuperação completa ÇSCr retornado para a linha de base) após rejeição aguda, a incidência de rejeição subclínica e a incidência de todos os episódios de rejeição aguda tratados a despeito dos achados histológicos. 11) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à

CsA, sobre QoL 12) Avaliar a segurança global do L104EA29YIg, com relação à CsA. ΠΗ ίΆ τι es Τοτ*ρ i a v* ί ag 1) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o declínio e interrupção da GFR calculada a partir da linha de base Ç3 meses) a 12, 24 e 36 meses. 2) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com uma GFR medida < 45 ml™min™l,É3 m2 a 12 meses. 3) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com GFR calculada < É5 ml™min™l,É3 m2 no Mês 12 e indivíduos com uma diminuição na GFR calculada do Mês 3 ao Mês 12 de pelo menos 15 ml™min™l,É3 m2. 4) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a incidência de DGF. 5) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à

CsA, sobre medidas de rejeição aguda a 12, 24 e 36 meses, incluindo a incidência e gravidade de rejeição aguda, a utilização de preparados policlonais antilinfócitos para função renal prejudicada e DGF prevista, a utilização inicial de terapêutica para redução de linfócitos para tratamento de rejeição aguda e a incidência de rejeição aguda resistente a esteroide, a incidência de recuperação completa ÇSCr retornando para a linha de base) após rejeição aguda, a incidência de rejeição subclínica e a incidência de todos os episódios de rejeição aguda tratados, a despeito dos achados histológicos. 6) Avaliar os efeitos do LlG4EA29YIg, com relação à CsA, sobre um ponto final composto de doença cardiovascular Çmorte cardiovascular comprovada, enfarte do miocãrdio, derrame isquémico, hospitalização não-eletiva por causas cardiovasculares e intervenção coronária percutânea) a 12, 24 e 36 meses. É) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre um ponto final composto de doença cardiorrenal Çmorte, perda do enxerto, enfarte do miocárdio não-fatal e derrame) a 12, 24 e 36 meses. 8) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o Escore de Risco de Framingham a 12, 24 e 36 meses. 9) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a incidência de descontinuação do fármaco de estudo. 10) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre anticorpos ao antigénio de leucócitos antidador humano ÇHLA). 11) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a positividade de C4d em espécimes de biópsia.

Projeto do Estudo A duração do estudo é de 3 anos com um subsequente período de acompanhamento de 8 semanas para avaliações de segurança. No final do período de tratamento de 3 anos, os indivíduos podem ser elegíveis para um estudo de extensão a longo prazo.

Este é um estudo com grupos paralelos, aleatoriamente distribuído, parcialmente cego, ativo-controlado. Todos os indivíduos receberão um rim de um dador com critérios entendidos, conforme definido abaixo. Estes critérios são baseados, em parte, naqueles emitidos pela United Network of Organ Sharing ÇUNOS); eles também incluem outras caraterísticas amplamente usadas para identificar órgãos potencialmente comprometidos, tais como aqueles de dadores com morte cardíaca ÇDCD, sem batimento cardíaco) ou tempo de isquemia prolongado ÇCIT).

Aproximadamente 540 indivíduos serão aleatoriamente distribuídos, numa proporção de 1: 1: 1, a tratamento com L104EA2 9YIg Çregime MI), L104EA29YIg Çregime LI) ou CsA. Todos os indivíduos também receberão indução com basiliximabe e um regime imunossupressor de manutenção de base de MMF e corticosteroides. Indivíduos aleatoriamente distribuídos ao regime MI receberão L104EA29YIg intravenoso. Ç10 mg™kg) nos dias 1 e 5, então, a cada 2 semanas no decorrer do mês 3 ÇSemanas 2, 4, 6, 8, 10 e 12) e, então, a cada 4 semanas durante 6 meses ÇSemanas 16, 20 e 24) . Após 6 meses, indivíduos no grupo de tratamento Ml receberão a dose de manutenção de 5 mg™kg de L104EA29YIg administrada a cada 4 semanas, até término do experimento a 36 meses. Indivíduos aleatoriamente distribuídos ao regime LI receberão L104EA29YIg intravenoso. Ç10 mg™kg) nos dias 1 e 5 e, então, a cada 2 semanas no decorrer do mês 1 ÇSemanas 2 e 4) e a cada 4 semanas no decorrer do mês 3 ÇSemanas 8 e 12) . Após 3 meses, indivíduos no grupo de tratamento LI receberão a dose de manutenção de 5 mg™kg de L104EA2 9YIg administrada a cada 4 semanas até término do experimento a 36 meses. 0 desconhecimento entre os grupos LI e MI será preservado com a utilização de infusões de placebo no grupo com tratamento LI nas Semanas 6 e 10. Indivíduos aleatoriamente distribuídos à CsA receberão doses duas vezes ao dia, as quais são projetadas para obter uma faixa de concentração especificada no soro consistente com a prática médica atual. A utilização de preparados policlonais antilinfócitos ÇTimoglobulina ou ATGAM) é permitida - mas não requerida -para indivíduos aleatoriamente distribuídos à CsA que experimentam função renal prejudicada pelo aloenxerto e DGF prevista. Estes agentes são amplamente utilizados por sua capacidade de proporcionar imunossupressão ate que a função do enxerto se recupere para administração de CsA. A decisão de usar uma dose de preparado policlonal antilinfócito neste ambiente clínico está a critério do investigador dentro das diretrizes de protocolo. A segurança e eficácia do L104EA29YIg serão avaliadas a 1,2 e 3 anos.

Medidas de Consequências Primárias

Cada regime baseado em L104EA29YIg será comparado com o regime baseado em CsA sobre as seguintes medidas de consequências de eficácia primárias: Çl) o composto de sobrevivência do indivíduo e enxerto a 12 meses; Ç2) o composto de GFR medida < 60 ml™min™l,É3 m2 no Mês 12 ou uma diminuição na GFR medida > 10 ml™min™l,É3 m2 do Mês 3 ao Mês 12. A intenção é demonstrar a não-inferioridade com relação à morte e perda do enxerto e superioridade com relação à função renal. 0 ponto final de sobrevivência do indivíduo e enxerto foi selecionado uma vez que essas medidas são as consequências clínicas mais importantes para recetores de aloenxerto. Embora a perda do aloenxerto possa ser impedida através de terapêutica imunossupressora eficaz, a mesma terapêutica pode aumentar o risco de morte por infeção, PTLD, malignidade, nefrotoxicidade ou doença cardiovascular. Assim, é apropriado examinar o ponto final composto de sobrevivência do indivíduo e do enxerto como uma medida do benefício líquido de terapêutica imunossupressora em recetores de aloenxerto. Este ponto final composto tem ainda a vantagem de ser passível de avaliação em todos os indivíduos sem tendências em virtude de dados que faltam ou classificação errónea do indivíduo. A função renal como um ponto final foi selecionada uma vez que a relação entre função renal pós-transplantação e consequências renais a longo prazo foi repetidamente demonstrada em vários ambientes. A associação está presente quer a função renal seja medida uns poucos dias após transplante, no momento de alta do hospital ou a 6 e 12 meses após o transplante. Ela foi observada em recetores de rins de dadores vivos e cadavéricos, em recetores de rins de dadores cadavéricos e mais velhos e mais novos, em recetores sob um segundo transplante e em recetores adultos e pediátricos.

Resultados de estudos multicentro confirmam a importância de SCr para prever a sobrevivência do enxerto a longo prazo. A relação entre função renal e prognóstico a longo prazo é forte e reproduzível, mas nâo rigorosamente linear. Numa análise de recetores de transplante renal adultos, exame da reação entre a SCr a 1 ano e semivida média projetada do enxerto revelou um ponto de inflexão pronunciado a SCr > 1,5 mg™dL. Similarmente, exame da relação entre a alteração na SCr de 6 meses a 1 ano (Δ SCr) e semivida média projetada do enxerto revelou um ponto de inflexão pronunciado a Δ SCr > 0,3 mg™dL. Assim, o nível absoluto de função renal a 1 ano e a alteração na função renal de 6 meses (ou um ponto de tempo pós-transplantação precoce estável similar) a 1 ano é adequado para utilização como medidas de consequências. A presença de não-linearidade na relação de função renal para consequências a longo prazo sugere que medidas categóricas de função renal deverão ser de maior relevância clínica do que aquelas dimensionais. Valores limítrofes de > 1,5 mg™dL a 1 ano para função renal e alteração na SCr de > 0,3 mg™dL do Mês 6 ao Ano 1 parecem apropriados.

Nos estudos mencionados acima, a importância prognóstica de função renal foi demonstrada usando a SCr como um marcador. Estes estudos, em geral, são muito grandes para usar medidas diretas de filtração glomerular. As limitações da SCr como um marcador de função renal são bem conhecidas. Os níveis de SCr refletem o equilíbrio entre a excreção renal de creatinina e a geração endógena de creatinina. 0 último pode ser significativamente afetado por variações na massa muscular, infeção, inflamação e utilização de esteroides, os quais são todos comuns na população de transplantados. Além disso, a excreção renal de creatinina pode ocorrer através de 2 vias - filtração glomerular é secreção tubular. 0 impacto de perda de filtração glomerular sobre a Scr é comummente mascarado pelos aumentos compensatórios na secreção tubular e a utilidade aumentada da SCr como um marcador de dano renal é, deste modo, reduzida. Estima-se que 40 % dos indivíduos com GFR reduzida tenham SCr normal ou baixa. Numerosas fórmulas foram desenvolvidas para buscar melhorar a correlação entre a SCr e a GFR levando-se em conta o efeito de fatores demográficos e biométricos. 0 nível de concordância entre GRF estimada de várias fórmulas e a GFR verdadeira medida através de retirada de inulina foi estudado em 294 recetores de transplante com função renal estável. A proporção de valores de GFR prevista diferindo da retirada medida de inulina em pelo menos a 10 ml™min™l,É3 m2 oscilava de 34 % para a fórmula de Jelliffe a 53 % para a fórmula de Nankivell. A fórmula proposta por Levey, et al. será usada para calcular a GFR neste estudo. Foi mostrado que esta fórmula prevê a GFR mais precisamente na população com transplante, que tem a melhor correlação entre o valor previsto e medido do que outras fórmulas, tal como aquela de Nankivell. Dada a diferença substancial entre a GFR verdadeira e a GFR calculada, retirada de um marcador de filtração glomerular verdadeiro será usada para avaliar o ponto final primário de função renal ÇApêndice 1) . Uma GFR de 60 ml™min™l,É3 m2 ou alteração na GFR de pelo menos 10 ml™min™l,É3 m2, será usada, uma vez que isso é aproximadamente igual aos valores limítrofes de SCr de 1,5 mg™dL ou alteração na SCr de pelo menos 0,3 mg™dL estabelecida em grandes estudos epidemiológicos. 0 componente alteração do ponto final composto será avaliado dos Meses 3 a 12, uma vez que a função renal pós-transplantação é grandemente estável no Mês 3.

Outras Medidas de Consequências

Os objetivos-chave secundários são avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR medida a 12 meses e sobre a CAN biópsia-comprovada a 12 meses. Estes pontos finais são segregados dos outros pontos finais secundários para enfatizar sua importância na avaliação de L104EA2 9YIg. Conforme discutido acima, é provável que a massa de nefrónio funcional e reserva renal em rins ECD sejam reduzidas no momento de transplante em virtude das caraterísticas do dador Çpor exemplo, idade mais velha, co-morbidades cardiovasculares, procedimentos de procuração e CIT) com taxas de sobrevivência do indivíduo e do enxerto resultantes que estão bem abaixo daquelas observadas com órgãos de dadores de critérios padrões. Uma vez que a função renal é potencialmente diminuída no momento de um enxerto, é possível que uma proporção substancial de indivíduos que vão de encontro aos critérios para o ponto final de função renal coprimária no momento de entrada no estudo ou determinação da função renal do aloenxerto de linha de base. Consequentemente, um objetivo-chave secundário do protocolo é avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, na diferença na GFR medida a 12 meses. Este ponto final-chave secundário permite discernimento dos efeitos do L104EA29YIg, em comparação com a CsA, a despeito de variabilidade de dador preexistente nesta população de ECD. Ele também contribui para a avaliação de função renal em geral e ainda reforça a conclusão de que o L104EA29YIg proporciona um benefício médico significativo em recetores de transplante renal. 0 objetivo-chave secundário restante é a CAN biópsia-comprovada em 12 meses. CAN é secundária apenas à morte com um enxerto funcionando como a causa que leva à perda tardia do aloenxerto renal. Paradoxalmente, acredita-se que CNI contribuem para a CAN através de vias diretas Çisto é, efeitos nefrotóxicos diretos) e indiretas Çisto é, efeitos cardiovasculares e metabólicos adversos). Em virtude de seu mecanismo de ação específico, é improvável que o L104EA2 9YIg seja diretamente nefrotóxico ou altere adversamente os parâmetros cardiovasculares e metabólicos.

No Exemplo acima, efeitos favoráveis foram observados na incidência reduzida de CAN entre indivíduos tratados com L104EA2 9YIg. No presente estudo, estabelecimento de uma diminuição na incidência de CAN, em conjunto com uma melhora na função renal, fortaleceria a conclusão de que o L104EA29YIg proporciona um benefício médico significativo em recetores de transplante renal. A eficácia do L104EA29YIg na prevenção de rejeição aguda será avaliada através de uma variedade de medidas de resultados. Essas incluem sua incidência, gravidade, responsividade à terapêutica e consequências. A interpretação destas medidas, no entanto, é complicada pelas diferenças intrínsecas no L104EA29YIg e CsA. L104EA29YIg é administrado no momento de transplante, enquanto que a CsA é iniciada onde há evidência de função renal incipiente. É previsto que alguns indivíduos aleatoriamente distribuídos à CsA neste estudo receberam um preparado policlonal antilinfócitos para proporcionar cobertura imunossupressora se a função renal inicial está prejudicada e DGF é previsto. Esta ação terapêutica pode prevenir ou mascar o desenvolvimento de rejeição aguda em indivíduos CsA-tratados e tornar o indivíduo não passível de avaliação quanto às consequências de rejeição aguda. Em virtude do facto de ser desnecessário tomar ação similar em indivíduos aleatoriamente distribuídos a L104EA29YIg - que são tratados a partir do momento de transplante - a avaliação comparativa de rejeição aguda é desigual. De forma a avaliar mais precisamente a eficácia do L104EA29YIg na prevenção de rejeição aguda, a utilização de preparados policlonais antilinfócitos também será reportado em conjunto com outras medidas de rejeição aguda.

População de Estudo A população de estudo inclui recetores de aloenxertos renais que são potencialmente subótimos em virtude de caraterísticas do dador, procedimento de procuração, CIT ou outros fatores. Os critérios de elegibilidade específicos são baseados nos "critérios expandidos" para doação de órgãos emitidos pela UNOS. Recetores de rim de dadores com CIT prolongada ou DCDs também serão elegíveis. Em geral, critérios imunológicos nâo exercerão um grande papel na seleção do indivíduo. Indivíduos em níveis variados de risco imunológico são elegíveis. 0 estudo, no entanto, excluirá indivíduos de maior risco imunológico Çcruzamento positivo, anticorpos reativos a painel [PRA] de > 30 % ou aqueles que sofreram um transplante anteriormente). Estes indivíduos podem requerer terapêutica para reduzir sua carga de anticorpo, tal como plasmaferese, a qual está além do âmbito do presente protocolo. Indivíduos são selecionados em aproximadamente 90 locais globalmente. Medidas de Resultados de Eficácia Primários 1) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o composto de sobrevivência do indivíduo e enxerto a 12 meses. 2) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o composto de GFR medida < 60 ml™min™l,É3 m2 no Mês 12 ou uma diminuição na GFR medida > 10 ml™min™l,É3 m2 do Mês 3 ao Mês 12.

Medidas de Resultados de Eficácia Secundários 1) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR medida a 12 meses. 2) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre CAN biópsia-comprovada a 12 meses. 3) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR medida a 3 meses e alteração da linha de base Ç3 meses) a 12 meses. 4) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com uma GFR medida < 30 ml™min™l,É3 m2 a 12 meses. 5) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à

CsA, sobre a GFR calculada a 3, 12, 24 e 36 meses e alteração da linha de base Ç3 meses) a 12, 24 e 36 meses . 6) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre PTDM a 12, 24 e 36 meses. É) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre medidas de hipertensão a 12, 24 e 36 meses, incluindo SEP e DBP, incidência e prevalência de hipertensão e hipertensão controlada e intensidade do regime de tratamento. 8) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à

CsA, sobre medidas de dislipidemia, a 12, 24 e 36 meses, incluindo soro total, não-HDL, LDL e HDL colesterol e TGs, incidência e prevalência de dislipidemia e dislipidemia controlada e intensidade do regime de tratamento. 9) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a sobrevivência do indivíduo e enxerto a 24 e 36 meses. 10) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre medidas de rejeição aguda a 6 meses, incluindo a incidência e gravidade de rejeição aguda, a utilização de preparados policlonais antilinfócitos para função renal prejudicada e DGF prevista, a utilização inicial de terapêutica para redução de linfócitos para tratamento de rejeição aguda e a incidência de rejeição aguda resistente a esteroide, a incidência de recuperação completa ÇSCr retornando para a linha de base) após rejeição aguda, a incidência de rejeição subclínica e a incidência de todos os episódios de rejeição aguda tratados a despeito dos achados histológicos. 11) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre QoL. 12) Avaliar a segurança global do L104EA29YIg, com relação à CsA.

Medidas de Resultados Terciários 1) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o declínio e interrupção de GFR calculada da linha de base Ç3 meses) a 12, 24 e 36 meses. 2) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com uma GFR medida < 45 ml™min™l,É3 m a 12 meses. 3) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com GFR calculada < É5 ml™min™l,É3 m2 no Mês 12 e indivíduos com uma diminuição na GFR calculada do Mês 3 ao Mês 12 de pelo menos 15 ml™min™l,É3 m2. 4) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a incidência de DGF. 5) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre as medidas de rejeição aguda a 12, 24 e 36 meses, incluindo a incidência e gravidade de rejeição aguda, a utilização de preparados policlonais antilinfócitos para função renal prejudicada e DGF prevista, a utilização inicial de terapêutica para redução de linfócitos para tratamento de rejeição aguda e a incidência de rejeição aguda resistente a esteroide, a incidência de recuperação completa ÇSCr retornando para a linha de base) após rejeição aguda, a incidência de rejeição subclínica e a incidência de todos os episódios de rejeição aguda tratados a despeito dos achados histológicos. 6) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à

CsA, sobre um ponto final composto de doença cardiovascular Çmorte cardiovascular confirmada, enfarte do miocárdio, derrame isquémico, hospitalização não-eletiva para causa cardiovascular e intervenção coronariana percutânea) a 12, 24 e 36 meses. É) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre um ponto final composto de doença cardiorrenal Çmorte, perda do enxerto, enfarte do miocãrdio não-fatal e derrame) a 12, 24 e 36 meses. 8) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o Escore de Risco de Framingham a 12, 24 e 36 meses. 9) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a incidência de descontinuação do fãrmaco de estudo. 10) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre anticorpos HLA antidador. 11) Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a positividade a C4d em espécimes de biópsia.

Definição de Perda do enxerto

Perda do enxerto é definida como perda funcional ou perda física. Perda funcional será definida como um nível sustentado de SCr > 6,0 mg™dL Ç530 mol™L) conforme determinado pelo laboratório central durante > 4 semanas ou > 56 dias consecutivos de diálise ou prejuízo da função renal até um grau tal que o indivíduo recebeu um segundo transplante. Todas as causas de perda do enxerto serão julgadas por um EAC independente.

Definição de Função Retardada do Enxerto ÇDGF) DGF é definida como tratamento com diálise no Dia 8 de estudo ÇDia É pós-operatório).

Definição de Nefropatia Crónica pelo Aloenxerto ÇCAN) CAN comprovada por biópsia será determinada por um histopatologista central a cegas usando a classificação de trabalho Banff 9É de patologia de transplante renal. A incidência de CAN será determinada através de comparação de todas as biópsias pós-Dia 1 com as biópsias de linha de base obtidas no momento de transplante. Esta comparação estabelece a presença e gravidade de qualquer histopatologia pré-existente que pode ser depois interpretada como CAN.

Definição de Diabetes Mellitus Põs-transplante PTDM será definido de acordo com a definição apresentada pelas diretrizes de um consenso internacional recente. Estes critérios são resumidos como: a) Sintomas de diabetes mais concentração de glicose no plasma casual ÇPG) > 200 mg™dL Çll,l mmol™L) ou b) glicose no plasma em jejum ÇFPG) > 26 mg™dL ÇÉ,0 mmol™L) OU c) PG a 2-horas > 200 mg™dL Çll,l mmol™L) durante um teste de tolerância à glicose oral e d) um teste laboratorial confirmatório sobre medições da PG venosa deve ser feito no dia seguinte na ausência de hiperglicemia inequívoca acompanhada de descompensação metabólica aguda. 0 estudo utilizará FPG para avaliação de PTDM, no entanto, se os indivíduos são avaliados usando estes outros métodos e verifica-se que vão de encontro aos critérios acima, eles serão considerados como que tem PTDM.

Definição de Medidas de Hipertensão

Hipertensão será conforme definido neste estudo de acordo com o Seventh Report of the Joint National Committee on the Prevention, Detetion, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure para indivíduos com doença renal crónica. Esta definição é baseada em SBP > 130 mm de Hg ou DBP > 80 mm de Hg. Além disso, todos os indivíduos que têm uma SBP < 130 mm de Hg e uma DBP < 80 mm de Hg que estão a receber uma medicação anti-hipertensiva para a indicação de hipertensão ou com um histórico médica de hipertensão estão incluídos nesta definição. A incidência de hipertensão é definida como a proporção de indivíduos que desenvolvem hipertensão após distribuição aleatória e transplante. A prevalência de hipertensão é definida como a proporção de indivíduos em qualquer dado momento que vão de encontro à definição estabelecida acima de hipertensão. Hipertensão controlada é definida como uma SBP < 130 mm de Hg e uma DBP

< 80 mm de Hg, enquanto recebe uma medicação anti-hipertensiva para a indicação de hipertensão ou recebendo uma medicação anti- hipertensiva para outra indicação com um histórico médica de hipertensão. Indivíduos com uma SBP < 130 mm de Hg e uma DBP < 80 mm de Hg que são prescritos com medicações anti-hipertensivas para uma outra indicação que não hipertensão Çpor exemplo, beta bloqueadores para profilaxia de enxaqueca) sem história médica de hipertensão não serão considerados como que tem hipertensão ou hipertensão controlada. A intensidade do regime de tratamento é definida como o número total de medicações anti-hipertensivas usadas para controlar hipertensão. Todas as medicações anti-hipertensivas serão consideradas para a indicação de hipertensão em indivíduos com hipertensão ou hipertensão controlada, uma vez que os efeitos anti-hipertensivos estão presentes, a despeito da indicação. Definição de Medidas de Dislipidemia

Dislipidemia é definida de acordo com as diretrizes recentes do National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative ÇNKF-K™DOQI). A dislipidemia é definida como hipertrigliceridemia ÇTGs ε 500 mg™dL [5,65 mmol™L]), hipercolesterolemia ÇLDL ε 100 mg™dL [2,59 mmol™L]) ou não-HDL elevado Çnão-HDL ε 130 mg™dL [3,36 mmol™L] ) na presença de altas TGs ÇTGs ε 200 mg™dL [2,26 mmol™L]. A dislipidemia controlada é definida neste estudo como indivíduos que estão a receber tratamento farmacológico para uma das dislipidemias estabelecidas acima que são tratados com sucesso e seus valores de lipídio caem abaixo dos limiares descritos no parágrafo anterior. Alguns destes agentes têm precauções específicas e™ou preocupações com relação à dose inicial ou dose máxima recomendada com utilização concomitante de CsA, dosagem com insuficiência renal ou pode causar alterações na PK de CsA. Refira-se à bula na embalagem apropriada para recomendações específicas. Qualquer outro agente Çisto é, terapêutica com não-estatina) usado como um anti-hiperlipidémico será considerado intensidade de tratamento Nível I. Utilização concomitante de uma estatina e um agente de outra classe Çpor exemplo, ezetimiba) elevará o nível de intensidade da terapêutica com estatina para o nível 1; portanto, mais de 5 níveis de intensidade são possíveis.

Rejeição aguda será definida como um evento clínico-patólogico que requer evidência clínica e confirmação por biópsia. Biópsias do aloenxerto serão avaliadas com relação à presença e gravidade de rejeição aguda por um patologista independente central a cegas usando a classificação de trabalho Banff 9É de patologia de transplante renal. Nas análises de rejeição aguda, a interpretação de biópsia e graduação pelo patologista central substituirão a interpretação local. Biópsias realizadas para rejeição aguda suspeita que não preenchem totalmente os critérios, mas são interpretadas pelo patologista central como rejeição aguda e resulta em tratamento para rejeição aguda, deverá ser considerada como rejeição aguda. Rejeição subclínica é definida como achados histológicos pelo patologista central consistente com rejeição aguda, mas carecendo de correlação clínica. Rejeição aguda resistente a esteroide é definida como falta de melhora na SCr e™ou achados histológicos que requerem a utilização de terapêutica para redução de linfócitos após tratamento com corticosteroides. Escore de Risco de Framingham este escore de risco utilizado dados do Estudo cardíaco de Framingham para estimar o risco em 10 anos de doença cardíaca coronariana "grave" Çenfarte do miocárdio e morte coronariana). Os fatores de risco incluídos neste cálculo são idade, sexo, colesterol total, HDL colesterol, SBP, diabetes, tratamento para hipertensão e qualquer utilização de cigarros no mês anterior.

Determinação de Tamanho da Amostra 0 objetivo primário é estimar o efeito de L104EA29YIg sobre as taxas de sobrevivência do indivíduo e enxerto e função renal a 12 meses em comparação com CsA. Os 2 pontos finais coprimãrios são: Çl) a proporção de indivíduos com uma sobrevivência do enxerto a 12 meses pós- transplante e Ç2) a proporção de indivíduos cuja GFR medida a 12 meses é < 6 0 ml™min™l,É3 m2, e™ou cuja GFR medida diminuiu > 10 ml™min™l,É3 m2 do Mês 3 ao Mês 12. Um tamanho de amostra de 180 indivíduos por grupo de tratamento proporcionará 83 % de escolha para determinar a ligação máxima de CIs equivalentes de 9É,3 % para a diferença absoluta Çentre cada regime de L104EA2 9YIg e o regime de CsA) no primeiro ponto final coprimãrio Çsobrevivência do indivíduo e enxerto) não excederá a 10 %, se a taxa verdadeira de sobrevivência do indivíduo e enxerto a 12 meses é de 80 % para o regime de CsA e de 83 % para cada um dos 2 regimes de L1Q4EA2 9YIg. Para o ponto final de função renal, o tamanho de amostra de 180 indivíduos por grupo é escolhido para detetar uma diminuição de 25 % na proporção de indivíduos que vão de encontro ao ponto final de GFR medida para cada regime de Li 04EA29YIg em comparação com o regime de CsA, admitindo que É5 % dos indivíduos com CsA vão de encontro ao ponto final de função renal e 25 % falhas por grupo de tratamento. Em geral, 180 indivíduos por grupo de tratamento proporcionarão pelo menos 80 % de escolha para detetar 1 regime de L104EA29YIg que vai de encontro aos pontos finais coprimários com erro do Tipo I controlado num nível de significância de 0,05 Çajuste de Dunnett). Critérios de Inclusão

População alvo: 1) 0 indivíduo é um recetor pela primeira vez de um transplante de rim de um dador morto. 2) 0 dador e™ou rim do dador deverá ir de encontro a pelo menos 1 dos seguintes critérios prolongados para doação de órgãos: a) Idade do dador > 60 anos OU b) Idade do dador 50 - 59 anos e 1 dos seguintes: Çi) Acidente cerebrovascular ÇCVA) Ê hipertensão Ê SCr > 1,5 mg™dL OU Çii) CVA Ê hipertensão OU Çiii) CVA Ê SCr > 1,5 mg™dL OU Çiv) Hipertensão Ê SCr >1,5 mg™dL OU c) CIT > 24 horas, dador com idade > 10 anos OU d) Dador com morte cardíaca Çdador com coração sem batimento). 3) Homens e mulheres, idades de 18 e mais velhos, inclusive. 4) WOCBP devem estar usando um método adequado de contraceção para evitar gravidez no decorrer do estudo e durante até 8 semanas após o estudo, de maneira que o risco de gravidez seja minimizado. WOCBP inclui qualquer mulher que experimenta menarca e que não sofreu esterilização cirúrgica com sucesso Çhisterectomia, ligação tubal bilateral ou ooforectomia bilateral) ou não está na pós-menopausa Çdefinido como amenorreia > 12 meses consecutivos; ou mulheres com terapêutica de reposição hormonal [HRT] com um nível documentado de hormona de estimulação folicular [FSH] no soro > 35 mIU™ml) . Mesmo mulheres que estão usando hormonas orais ou injetáveis ou dispositivos mecânicos implantados contracetivos ou produtos mecânicos, tal como um dispositivo intrauterina ou métodos de barreira Çdiafragma, condões, espermicidas) para prevenir gravidez ou praticam abstinência ou onde o parceiro é estéril Çpor exemplo, vasectomia), serão consideradas como passíveis de engravidar em potencial. WOCBP devem ter um teste de gravidez negativo no soro Çsensibilidade mínima de 25 IU™L ou unidades equivalentes de gonadotropina coriónica humana [HCG]) dentro de É2 horas antes de começar a medicação de estudo. 5) Homens devem usar um método adequado de contraceção no decorrer do estudo e durante até 8 semanas após a última infusão, de modo que o risco de engravidar para suas parceiras seja minimizado.

Critérios de Exclusão 1) WOCBP que não concordam ou são incapazes de usar um método aceitável para evitar gravidez durante todo o estudo e durante até 8 semanas após a última infusão. 2) Mulheres que estão grávidas ou a amamentar. 3) Mulheres com um teste de gravidez positivo quando de seleção ou antes de administração do fármaco de estudo. 4) Homens que não concordam ou incapazes de usar um método adequado de contraceção durante todo o período de estudo e durante até 8 semanas após a última infusão de medicação de estudo. 5) Idade do dador < 10 anos. 6) Indivíduos com doença renal subjacente: a) Glomeruloesclerose focal segmentai Çcomprovada por biópsia) b) glomerulonefrite membrano-proliferativa do Tipo I ou II c) Síndrome urémica hemolítica™ síndrome de púrpura trombocitopénica trombótica. É) Indivíduos com PRA atual > 30 %. 8) Indivíduos com um cruzamento linfocitotóxico de células T positivo. 9) Indivíduos com transplante de órgão sólido anterior Çincluindo rim) . 10) Indivíduos que receberam um transplante de órgão sólido concorrente Çcoração, fígado, pâncreas) ou célula Çilhota, medula óssea, células estaminais. 11) Indivíduos que estão a receber rins aos pares Çtransplante duplo de rim duplo). 12) Indivíduos que são anticorpos-positivos para hepatite C ou reação em cadeia de polimerase ÇPCR)-positivos para hepatite C. 13) Indivíduos que são antigénios na superfície-positivos para hepatite B ou PCR-positivos para hepatite B. 14) Indivíduos com infeção conhecida pelo vírus da imunodeficiência humana ÇVIH). 15) Indivíduos com tuberculose ativa ÇTB) ÇTB) requerendo tratamento dentro dos 3 anos anteriores ou qualquer indivíduo que requereu anteriormente terapêutica combinada tripla Çou mais) para TB. Indivíduos com um derivado de proteína purificado conhecido ÇPPD) não serão elegíveis para o estudo, a não ser que eles terminem o tratamento para TB latente e tenham um raio X do tórax negativo no momento de seleção. Testagem de PPD feita dentro dos últimos 12 meses é aceitável, na medida em que haja documentação dos resultados. Indivíduos sem um PDD nos últimos 12 meses que têm um resultado anterior negativo podem ser selecionados, se eles também têm um raio X do tórax negativo quando de seleção, sem sintomas indicativos de TB, nenhum contato com TB, não está atualmente residindo, viajou recentemente ou imigrou anteriormente de uma área endémica para TB. Uma resposta de PPD que é ^ 10 mm ou um escore de Heaf > 1 em indivíduos não-imunizados contra o Bacilo de Calmette-Guérin Çnão-BCG) ou > 2 em indivíduos imunizados com BCG serão considerados um teste positivo. Critérios mais conservatives podem ser aplicados de acordo com diretrizes publicadas e™ou normas locais endossadas pela sociedade médica. 16) Indivíduos com qualquer infeção ativa ou outra contraindicação que normalmente excluiria a transplantação. 1É) Indivíduos cuja expectativa de vida é gravemente limitada pelo estado doentio ou outra condição médica subjacente. 18) Indivíduos com um histórico de cancro Çoutro que não melanoma, cancros de células da pele curados através de ressecção local) dentro dos últimos 5 anos. 19) Indivíduos com um histórico de abuso de substâncias Çdroga ou álcool) dentro dos últimos 5 anos ou distúrbios psicóticos que não são compatíveis com acompanhamento adequado no estudo. 20) Indivíduos com doença de úlcera péptica ativa, diarreia crónica ou má absorção gastrointestinal. 21) Indivíduos com valores laboratoriais locais que são Critérios Comuns de

Toxicidade ÇCTC) de Grau II ou maior não podem participar do estudo. No entanto, determinados parâmetros laboratoriais especificados que são exceções ao CTC de Grau II serão permitidos. As seguintes concessões são permitidas: Hematologia: Hemoglobina pode estar abaixo de CTC de Grau II Çmas não abaixo de 8 g™dL) Plaquetas pode estar abaixo de CTC de Grau II, mas não abaixo de 80.000™mm3 Ç80 x 109™L) Contatem total de células sanguíneas brancas ÇWBC) pode estar abaixo de CTC de Grau II, mas não abaixo de 3000™mm3 Ç3 x 109™L) Contagens de granulõcitos e linfócitos pode ser qualquer valor. Química: Valores de SCr e azoto de ureia no sangue ÇBUN) podem ser qualquer valor. Glicose no sangue pode ser de qualquer valor. Urinálise: Resultados da urinálise podem ser qualquer valor. 22) Todas as mulheres de 40 anos ou mais velhas e mulheres de qualquer idade que têm parentes em primeiro grau com um histórico de carcinoma de mama ou que têm outros fatores de risco, devem ter um mamograma de seleção ou fornecer resultados de um mamograma de seleção realizado dentro de 6 meses de seleção. Indivíduos com um mamograma que é suspeito de malignidade e nos quais a possibilidade de malignidade não pode ser razoavelmente excluída, avaliações clínicas, de laboratório ou outros diagnósticos adicionais deverão ser excluídos. Se o mamograma de seleção não foi realizado dentro de 6 meses de seleção, mas o indivíduo é considerado um candidato adequado para transplante pelos critérios locais, o mamograma de linha de base pode ser obtido dentro de 4 semanas após transplante. 23) Indivíduos que têm dificuldade de acesso intravenoso, ou outras razões que provavelmente excluiriam o ponto final coprimário de GFR medida ou indivíduos que são improváveis Çpor exemplo, em virtude de problemas de coagulação pré-existentes) ou que não concordam em sofrer o protocolo especificado na biópsia do aloenxerto do mês 12. 24) Indivíduos com um histórico de alergia verdadeira de alergia a agentes de contraste de raio x iodados intravenosos. 25) Indivíduos que usaram qualquer fãrmaco investigacional dentro de 30 dias antes da visita do dia 1. 26) Indivíduos previamente tratados com L104EA29YIg. 2É) Prisioneiros ou indivíduos que estão compulsorlamente detidos Çinvoluntariamente encarcerados) para tratamento de uma enfermidade psiquiátrica ou física Çpor exemplo, doença infeciosa), não devem ser selecionados para este estudo.

Administração de L104EA29YIg

Dia 1 é definido como o dia de transplantação ÇDia 0 pós-transplante). Infusão da dose do dia 1 deverá começar após o cirurgião ter feito uma avaliação inicial íntraoperatóría e ter concluído que o indivíduo permanece um candidato a transplante e o transplante se processará e antes de começar as anastomoses vasculares para o transplante. Doses de infusão serão baseadas no peso corporal real do indivíduo no Dia 1 de estudo e não serão modificados durante o curso do estudo, a não ser que haja uma alteração de peso corporal ± 10 %. 0 fármaco de estudo deverá ser administrado ao indivíduo numa taxa relativamente constante durante 30 minutos. As doses do dia 1 e Dia 5 ÇDia 4 pós-transplante) deverão ser administradas em intervalos de aproximadamente 96 horas DZ 6 horas) . A visita subsequente e janelas de infusão são proporcionadas a seguir. Para indivíduos sob diálise, infusão de L104EA2 9YIg e determinação do peso do indivíduo deverão ocorrer após tratamento de diálise.

Regime MI com L104EA29YIg: Indivíduos aleatoriamente distribuídos ao regime MI receberão L104EA29YIg intravenoso. Ç10 mg™kg) nos dias 1 e 5 e, então, semana sim, semana não durante 2 meses ÇSemanas 2, 4, 6, 8, 10 e 12) e, então, a cada 4 semanas até 6 meses ÇSemanas 16, 20 e 24). Após 6 meses, indivíduos no grupo com tratamento Ml receberão L104EA29YIg na dose de manutenção de 5 mg™kg a cada 4 semanas até término do experimento a 36 meses.

Regime LI com L104EA29YIg: Indivíduos aleatoriamente distribuídos ao regime LI receberão L104EA29YIg intravenoso. Ç10 mg™kg) nos dias 1 e 5 e, então, semana sim, semana não durante 2 semanas ÇSemanas 2 e 4) e, então, a cada 4 semanas durante 2 meses ÇSemanas 8 e 12) . Após 3 meses, indivíduos no grupo de tratamento LI receberão L104EA2 9YIg na dose de manutenção de 5 mg™kg a cada 4 semanas até término do experimento a 36 meses. Desconhecimento entre os grupos LI e MI será preservado com a utilização de 2 infusões de placebo no grupo com tratamento LI. Portanto, a indivíduos aleatoriamente distribuídos ao regime LI serão administradas infusões de placebo Çdextrose a 5 % em água para injeção [D5W] ) nas Semanas 6 e 10,

Administração de Ciclosporina (CsA) A dose diária de CsA deverá ser administrada em 2 doses divididas num esquema consistente com relação ao período do dia e refeições. Nos dias de visita do estudo, o indivíduo deve manter a dose da manhã de CsA até após o nível de CsA no sangue cair. Nos dias de visita do estudo, quando o indivíduo tem de ter avaliações padronizadas de monitoramento de BP e™ou GFR medida, essas medidas têm de ser terminadas antes de dosagem de CsA. A dose diária inicial deverá ser É + 3 mg™kg Çisto é, 4 - 10 mg™kg) . Doses subsequentes deverão ser ajustadas para manter uma faixa predefinida de concentrações no soro: Io mês: nível alvo de 150- 300 ng™ml. Após Io mês: nível alvo de 100-250 ng™ml. Monitoramento dos níveis de CsA usando a concentração no plasma 2 horas pós-dose ÇC2) não deve ser usada neste estudo. Embora um enunciado do consenso internacional recente sobre administração de Neoral através de monitoramento de C2 favoreça a utilização de monitoramento de C2, também é claramente estabelecido que a falta de dados com relação aos efeitos a longo prazo sobre a função renal, incidência de CAN e perfil de segurança geral associado a monitoramento de C2. Além disso, nem todos os indivíduos são adequados para monitoramento de C2, incluindo indivíduos com diabetes, esvaziamento gástrico lento de indivíduos usando medicação concomitante que altera a retirada de CsA. Além disso, baixos níveis de C2 podem resultar de verdadeira absorção baixa Çna qual a dose de CsA deverá ser aumentada) ou de absorção lenta Çna qual há uma concentração máxima no plasma e um aumento na dose pode produzir toxicidade). Finalmente, esta prática não é universal e validação prospetiva dessa prática está além do âmbito do presente protocolo. Para informação adicional a respeito de prescrição, veja-se a bula na embalagem. CsA deverá ser iniciada em todos os indivíduos no Dia É. Para indivíduos nos quais o investigador acredita que não está no melhor interesse do indivíduo iniciar CsA de modo algum Çpor exemplo, em virtude de função renal prejudicada) e elege usar uma medicação não-estudo Çpor exemplo, sirolimus), esta ação será considerada uma descontinuação da medicação de estudo.

Para Indivíduos com função imediata ao Aloenxerto:

Para indivíduos aleatoriamente distribuídos a tratamento com CsA, a primeira dose de CsA deverá ser administrada tão logo, mas não até que, haja evidência de função adequada do aloenxerto. Função adequada do aloenxerto é definida como uma diminuição na SCr de pelo menos 1 mg™dL comparado com o valor inicial pós-transplante ou produção de urina á 250 ml num período de 12 horas Çou menos) pós-transplante.

Para Indivíduos com Função renal prejudicada pelo aloenxerto e DGF prevista: Indivíduos com função renal prejudicada pelo aloenxerto põs- operatória e DGF prevista são elegíveis - mas não requerido - para receber um preparado policlonal antilinfócitos. Quer um indivíduo receba um preparado policlonal antilinfõcitos ou não, CsA deverá ser iniciada quando há evidência de recuperação de função do aloenxerto Çconforme definido acima) ou no Dia É.

Cortiçosteroides

Todos os indivíduos neste estudo serão tratados com corticosteroides diariamente. MANUTENÇÃO-REDUÇÃO COM ESTEROIDES. Dia de transplantação ÇDia 1) : metilprednisolona Çcomo sucinato de sódio) 500 mg intravenoso, ao chegar na sala de operações ÇOR)

Dia 2: metilprednisolona Çcomo sucinato de sódio) 250 mg intravenoso.

Dia 3: prednisona Çou prednisolona) 100 mg oralmente Çp.o.) Dia 4 ao Dia 14 Çisto é, final da Semana 2) : prednisona para prevenção Çou prednisolona) a 20 - 30 mg p.o. diariamente

Dia 15 no decorrer do mês 6: prednisona para prevenção Çou prednisolona) não mais do que 2,5 mg p.o. diariamente. Indivíduos devem permanecer sob pelo menos 2,5 mg p.o. diariamente até o Ano 3.

As 2 primeiras doses ÇDia 1 do estudo, dia de transplantação e Dia 2 do estudo, Dia 1 pós-operatório) têm de ser administradas intravenoso. As doses restantes deverão ser administradas p.o. No entanto, a dosagem intravenosa de uma dose equivalente de metilprednisolona é permitida em momentos quando dosagem oral não é possível. As razões para dosagem intravenosa, ao invés de p.o. são enfermidade intercorrente, íleo pós-operatório ou outras causas a critério do investigador. Se metilprednisolona não estiver disponível, a utilização de outro equivalente de dose de agente corticosteroide intravenoso, à metilprednisolona é permitido.

Dosagem de Micofenolato de mofetilo

Todos os indivíduos neste estudo serão tratados com MMF. Diariamente, MMF deverá ser administrado em 2 doses divididas num esquema consistente com relação ao período do dia e refeições. A dose deverá ser de 2 g diariamente; no entanto, em Af ro-Americanos, 3 g ao dia podem ser administrados a critério do investigador. MMF deverá ser administrado p.o. A dosagem intravenosa é permitida, se for necessário, em virtude de enfermidade intercorrente, íleo põs-operatório ou outras causas a critério do investigador. A primeira dose deverá ser administrada pré-operativamente. Doses subsequentes serão administradas p.o. tão logo o indivíduo seja capaz de tolerar medicações pela boca. A dose e o esquema podem ser ajustados, determinados com base em valores laboratoriais Çpor exemplo, WBCs diminuídos) e tolerabilidade do indivíduo Çveja-se a seguir). Para informação completa a respeito da prescrição, veja-se a bula na embalagem.

Para indivíduos que desenvolvem náusea, diarreia ou outros efeitos adversos gastrointestinais MMF-relacionados Çpor exemplo, sintomas totalmente avaliados e considerados como que tem uma outra etiologia que não intolerância ao MMF) , a dose de MMF pode ser diminuída para a dose maximamente tolerada. Para indivíduos que desenvolvem neutropenia Çcontagem de neutrófilos absoluta < 1,3 x 103™L), a dosagem com MMF deverá ser interrompida ou a dose reduzida, conforme a bula na embalagem.

Dosagem de Basiliximabe

Todos os indivíduos neste estudo serão tratados com o regime de dosagem recomendado de basiliximabe. Basiliximabe deverá ser administrado através de uma veia periférica ou central apenas. Basiliximabe reconstituído Ç20 mg em 5 ml) deverá ser diluído para um volume de 50 ml com solução salina normal ou dextrose a 5 % e administrado como uma infusão intravenoso, durante 20-30 minutos. A primeira dose de 2 0 mg deverá ser administrada no Dia 1 Ço dia de transplantação; Dia 0 põs-operatório). Para indivíduos aleatoriamente distribuídos a L104EA29YIg, esta primeira infusão de basiliximabe deverá ocorrer tão logo possível após término da infusão de L104EA29YIg. A segunda dose de 20 mg deverá ser fornecida no Dia 5 ÇDia 4 põs-operatório). A segunda dose de basiliximabe não deverá ser administrada aos indivíduos se eles receberam ou espera-se que recebam um tratamento de redução de linfócitos. Para informação adicional veja-se a bula na embalagem.

Preparados Policlonais Antilinfócitos para Função Renal Prejudicada pelo Aloenxerto e DGF Prevista A utilização de preparados policlonais antilinfõcitos ÇTimoglobulina ou ATGAM) é permitida - mas não requerida -para indivíduos aleatoriamente distribuídos à CsA que experimenta função renal prejudicada pelo aloenxerto DGF prevista após transplante. A utilização de outros preparados policlonais antilinfõcitos ou globulinas antitimõcito policlonais é permitida em regiões onde exista autorização para comercialização e se eles forem indicados para o tratamento de rejeição aguda em transplante renal. De nota, 0KT3 não deve ser usado para esta finalidade, mas pode ser usado para tratamento de rejeição aguda com Banff 9É Grau Ilb ou maior ou rejeição aguda resistente a esteroide. A utilização de Campath 1-H® Çalemtuzumab) não é permitida neste protocolo, uma vez que ele não é indicado para utilização em transplante de rim. Estes agentes são amplamente utilizados por sua capacidade de proporcionar imunossupressão até que função do enxerto permita a administração de CsA. Portanto, preparados policlonais antilinfócito podem ser usados neste ambiente clínico, a critério do investigador, em indivíduos que vão de encontro a 2: 1 dos seguintes critérios que são observados na presença de uma artéria e veia em transplante patente e sem evidência de hidronefrose através de sonograma: a) produção de urina < 250 cc™12 horas b) Sem melhora significativa Ç< 1 mg™dL) na SCr do valor de linha de base durante as primeiras 24 - É2 horas pós-transplantação c) tratamento de diãlise. A utilização destes agentes para função renal prejudicada pelo aloenxerto e DGF prevista não é permitido em indivíduos tratados com L104EA29YIg.

Dosagem de Sulfametoxasol/Trimetoprim

Todos os indivíduos que participam deste estudo que não têm contraindicações deverão receber profilaxia com sulfametoxazol™trimetoprim para prevenir infeções do trato urinário e por Pneumocystis carinii. A dosagem e administração têm de ser determinadas pelo nível de função renal consistente com a bula na embalagem. Indivíduos com uma contraindicação ou intolerância a fármacos de sulfa ou trimetoprim podem receber terapêutica profilática com pentamidina inalada a critério do investigador. Para informação completa a respeito da prescrição, veja-se as bulas nas embalagens.

Dosagem de Valganciclovir / Ganciclovir, Aciclovir / Valaciclovir

Todos os recetores que não têm contraindicações ao valganciclovir, ganciclovir, aciclovir e valaciclovir deverão ser profilaticamente tratados com estes fármacos para prevenir infeções em virtude de CMV e Herpes simplex. 0 seguinte são diretrizes para dosagem e duração de tratamento profilático:

Profilaxia para os 10 Primeiros Dias Pós-transplantação ou Durante Terapêutica de Redução de Células T: Todos os indivíduos com transplante receberão valganciclovir ou ganciclovir por protocolo durante 10 dias após cirurgia. Se forem tratados com terapêutica de redução de células T para terapêutica de indução ou tratamento de rejeição aguda, o indivíduo receberá valganciclovir ou ganciclovir durante o decorrer da terapêutica de redução de células T. Se o indivíduo tem alta antes de 10 dias, valganciclovir, ganciclovir, valaciclovir ou aciclovir oral começará baseado no estado imune ao CMV, conforme descrito a seguir.

Valganciclovir para Profilaxia: Depuração de creatinina >60 ml™min, dose de 900 mg diariamente; Depuração de creatinina 40 - 59 ml™min, dose de 450 mg diariamente; Depuração de creatinina < 40 ml™min, dose de 450 mg dia sim, dia não.

Ganciclovir para Profilaxia: Se o indivíduo é incapaz de tolerar medicações orais ou valganciclovir não está disponível para utilização, suspensão ou cápsulas de ganciclovir podem ser usados como substitutos. Depuração de creatinina > É0 ml™min, dose de 1 g 3 vezes ao dia; Depuração de creatinina 50 - 69 ml™min, dose de 500 mg 3 vezes ao dia; Depuração de creatinina 25 - 49 ml™min, dose de 500 mg duas vezes ao dia; Depuração de creatinina 10 -24 ml™min, dose de 500 mg diariamente; Depuração de creatinina < 10 ml™min, dose de 500 mg; após hemodiálise 3 vezes™semana. Se ganciclovir intravenoso for necessário, veja-se bula na embalagem para dosagem.

Profilaxia Após 10 Dias Pós- transplantação a pelo menos 3 Meses: Dador Soro-positivo para Anticorpo ao CMV para Recetor Soro-negativo para Anticorpo ao ÇMV: Continuar protocolo de valganciclovir ou ganciclovir listado acima durante > 3 meses.

Dador Soro-positivo ou Soro-negativo para Anticorpo ao CMV para um Recetor Soro-positivo para Anticorpo ao CMV: Aciclovir oral durante > 3 meses pós-transplantação: Creatinina no soro >50 ml™min, dose de 800 mg oralmente 4 vezes ao dia; Creatinina no soro 25 - 49 ml™min, dose de 800 mg oralmente 3 vezes ao dia; Creatinina no soro 11-24 ml™min, dose de 800 mg oralmente duas vezes ao dia; Creatinina no soro < 10 ml™min, dose de 800 mg oralmente ao dia Sob hemodiálise, dose de 800 mg diariamente após hemodiálise.

Valaciclovir pode ser substituído por aciclovir no momento de alta para conveniência do indivíduo. Creatinina no soro >50 ml™min, dose de 500 mg oralmente 2 vezes ao dia; Creatinina no Soro 25 - 49 ml™min, dose de 500 mg oralmente ao dia; Creatinina no soro 11-24 ml™min, dose de 500 mg oralmente ao dia; Creatinina no soro < 10 ml™min, dose de 2 50 mg oralmente ao dia; Sob hemodiálise, dose de 250 mg diariamente após hemodiálise.

Dador Soro-Negativo para Anticorpo ao CMV Para um Recetor Negativo para Anticorpo ao CMV: Protocolo de Aciclovir oral necessário para profilaxia de herpes apenas: continuar durante > 3 meses pós-transplantação. 400 mg de Aciclovir mg p.o. duas vezes ao dia ou valaciclovir podem ser substituídos no momento de alta para conveniência do indivíduo. Para informação completa sobre prescrição, refira-se à bula da embalagem.

Procedimentos de Visita para Infusão Apenas a) Para indivíduos aleatoriamente distribuídos ao tratamento com L104EA29YIg: um teste de gravidez negativo ê requerido antes de administração de L104EA29YIg. A dose tem de ser baseada no peso do indivíduo na visita de estudo anterior mais recente. Os indivíduos deverão ser monitorados com relação aos sinais vitais Çpré- e pós-infusão) e AEs deverão ser avaliados. Amostras PK podem ser requeridas em algumas visitas. b) Para indivíduos aleatoriamente distribuídos ao tratamento com CsA: Indivíduos deverão ser contatados para avaliar AEs apenas. Esta visita pode ser um contato telefónico e deverá ocorrer dentro da janela de visita prescrita para a visita especificada.

Janelas de Visita a) Para indivíduos aleatoriamente distribuídos a tratamento com L104EA29YIg: as doses dos dias 1 e 5 serão administradas num intervalo de aproximadamente 96 horas Ç+ 6 horas). Para facilitar a esquematização de visitas para infusão apenas, as seguintes janelas são permitidas para as doses subsequentes: Visita na Semana 2, data alvo para Janela de Visita ± 2 dias; Visita na Semana 4 - Mês 6 data alvo para Janela de Visita ± 3 dias, Visita no Mês É - Mês 36, data alvo para Janela de Visita ± 5 dias ; Visita de acompanhamento de 8 semanas, data alvo para

Janela de Visita ± 5 dias. b) Para indivíduos aleatoriamente distribuídos a tratamento com CsA: Após Dia 5, é requerido que os indivíduos visitem a clínica apenas nas Semanas 2, 4, 8 e 12; então, a cada visita com intervalo de 3 meses. Mas visitas com intervalo de não-3 meses Çisto é, Semanas 6, 10, 16, 20, 28, 32, etc.), um contato telefónico será conduzido para coletar informação sobre AE. As visitas na clínica e contato deverão ocorrer dentro das mesmas janelas de visita, conforme especificado acima para indivíduos aleatoriamente distribuídos a L104EA29YIg. As datas alvo para as avaliações de GFR de 3- e 12-meses são a Semana 12 + 14 dias e a Semana 52 + 14 dias. Sob determinadas circunstâncias e com a aprovação prévia do monitor médico, as avaliações de GFR medidas no Mês 3 e Mês 12 podem ser conduzidas no decorrer do mês 6 e Mês 15, respetivamente. As razões que podem assegurar extensão de uma avaliação de GFR medida incluem a presença de um episódio concorrente de rejeição aguda ou a necessidade de repetir uma avaliação por razões técnicas. A data alvo para biópsia de aloenxerto no mês 12 é a Semana 52 + 14 dias. Similarmente, sob determinadas circunstâncias e com aprovação prévia do monitor médico, a biópsia do aloenxerto pode ser obtida no decorrer do mês 15. As razões que podem assegurar extensão de uma biópsia de aloenxerto incluem necessidade temporária de anticoagulação. EXEMPLO 5

Aqueles com conhecimento na especialidade poderiam utilizar o esquema de administração descrito no Exemplo 4 acima para planejar um estudo que compreende uma população de estudo, critérios do dador e™ou objetivos diferentes. Por exemplo, este estudo de transplante avaliaria indivíduos que receberam um transplante de rim de um dador vivo ou um dador morto com um tempo de isquemia previsto < 24 horas. Indivíduos em níveis variados de risco imunológico serão elegíveis. No entanto, o estudo excluirá indivíduos de maior risco imunológico. Indivíduos serão aleatoriamente distribuídos aos ramos MI, LI ou CsA, conforme descrito acima no Exemplo 4.

Objetivos Primários

Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o composto de sobrevivência do indivíduo e enxerto em 12 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o composto de GFR medida < 60 ml™min™l,É3 nh no Mês 12 ou uma diminuição da GFR medida > 10 ml™min™l,É3 m2 do Mês 3 ao Mês 12. Avaliar os efeitos do LlQ4EA29YIg, com relação à CsA, sobre a incidência de rejeição aguda em 12 meses.

Obj etivos Secundários

Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR medida a 12 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre CAN biópsia-comprovada a 12 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre componentes individuais do ponto final composto primário de GFR medida < 60 ml™min™l,É3 m2 no Mês 12 ou uma diminuição na GFR medida > 10 ml™min™l,É3 m2 do Mês 3 ao Mês 12. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o ponto final composto triplo de morte, perda do enxerto e rejeição aguda em 12, 24 e 3 6 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com uma GFR medida < 60 ml™min™l,É3 m2 a 24 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR medida a 3 e 24 meses e alteração da linha de base Ç3 meses) a 12 meses e a 24 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com uma GFR medida < 30 ml™min™l,É3 m2 a 12 e 24 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a GFR calculada a 6, 12, 24 e 36 meses e alteração de 6 meses a 12, 24 e 36 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre PTDM a 12, 24 e 36 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre as medidas de hipertensão a 12, 24 e 36 meses, incluindo SBP e DBP, incidência e prevalência de hipertensão e hipertensão controlada e intensidade de regime de tratamento. A.valiar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre medidas de dislipidemia, a 12, 24 e 36 meses, incluindo lipoproteína de baixa densidade ÇLDL), não-HDL e HDL colesterol e TGs totais no soro, incidência e prevalência de dislipidemia e dislipidemia controlada e intensidade de regime de tratamento. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a sobrevivência do indivíduo e enxerto em 24 e 36 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com uma GFR calculada < 60 ml™min™l,É3 rrt a 24 e 36 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre medidas de rejeição aguda em 6, 12, 24 e 36 meses, incluindo a incidência e gravidade de rejeição aguda, a utilização de preparados policlonais antilinfocito para função renal prejudicada e função retardada prevista do enxerto ÇDGF), a utilização inicial de terapêutica para redução de linfócitos para tratamento de rejeição aguda, a incidência de rejeição aguda resistente a esteroide, a incidência de recuperação completa ÇSCr que retorna à linha de base) após rejeição aguda, a incidência de rejeição subclínica, a incidência de todos os episódios de rejeição aguda tratados, a despeito dos achados histológicos e o momento de início de rejeição aguda. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre QoL. Avaliar a segurança global do L104EA29YIg, com relação à CsA. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o declínio e interrupção da GFR calculada de 3 meses a 12, 24 e 36 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com GFR calculada < 60 ml™min™l,É3 m2 no Mês 12 ou indivíduos com uma diminuição na GFR calculada do Mês 3 ao Mês 12 de pelo menos 10 ml™min™l,É3 m2. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a incidência de DGF. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com doença renal crónica no Estágio

I ao Estágio 5 a 12 e 24 meses, conforme avaliado pela GFR medida. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a proporção de indivíduos com doença renal crónica no Estágio 1 ao Estágio 5 a 36 meses, conforme avaliado pela GFR calculada. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre um ponto final composto de doença cardiovascular Çprocedimentos de morte cardiovascular decretada, enfarte do miocãrdio, derrame isquémico e revascularização [cirúrgica ou percutânea]) em 12, 24 e 36 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre um ponto final composto de doença cardiorrenal Çmorte, perda do enxerto, enfarte do miocárdio não-fatal e derrame) em 12, 24 e 36 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre o Escore de Risco de Framingham a 12, 24 e 36 meses. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a incidência de descontinuação do fármaco de estudo. Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre anticorpos ao antigénio de leucócitos humanos antidador ÇHLA) . Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre anticorpos ao recetor do tipo 1 de angiotensina II ÇAT1). Avaliar os efeitos do L104EA29YIg, com relação à CsA, sobre a positividade para C4d em espécimes de biópsia. p£i m> «ur J inS w* *tr Vi? £&amp; fa? V** UiwVr A duração do estudo é de 3 anos com um subsequente período de acompanhamento de 8 semanas para avaliações de segurança. Este é um estudo aleatoriamente distribuído, parcialmente-cego, ativo-controlado, grupo-paralelo. Todos os indivíduos receberão um transplante de rim de um dador vivo ou um dador morto com um CIT previsto < 24 horas.

Aproximadamente 660 indivíduos serão aleatoriamente distribuídos, numa proporção de 1: 1: 1, ao tratamento com L104EA29YIg Çregime MI), L104EA2 9YIg Çregime LI) ou CsA. Todos os indivíduos também receberão indução com basiliximabe e um regime imunossupressor de manutenção de base de MMF e corticosteroides. Indivíduos aleatoriamente distribuídos ao regime MI receberão L104EA29YIg intravenoso. Ç10 mg™kg) nos dias 1 e 5, então, a cada 2 semanas no decorrer do mês 3 ÇSemanas 2, 4, 6, 8, 10 e 12)

e, então, a cada 4 semanas a 6 meses ÇSemanas 16, 20 e 24). Após 6 meses, indivíduos no grupo de tratamento MI receberão a dose de manutenção de 5 mg™kg de L104EA29YIg administrada a cada 4 semanas até término do experimento a 36 meses. Indivíduos aleatoriamente distribuídos ao regime LI receberão L104EA29YIg intravenoso. Ç10 mg™kg) nos dias 1 e 5 e, então, a cada 2 semanas no decorrer do mês 1 ÇSemanas 2 e 4) e a cada 4 semanas no decorrer do mês 3 ÇSemanas 8 e 12) . Após 3 meses, indivíduos no grupo de tratamento LI receberão a dose de manutenção de 5 mg™kg de L104EA2 9YIg administrada a cada 4 semanas até término do experimento a 36 meses. Desconhecimento entre os grupos LI e MI será preservado com a utilização de infusões de placebo no grupo com tratamento LI nas Semanas 6 e 10. Indivíduos aleatoriamente distribuídos à CsA receberão doses duas vezes ao dia, as quais são projetadas para obter uma faixa de concentração especificada no soro consistente com a prática médica atual. A segurança e eficácia do L1Q4EA2 9YIg serão avaliadas a 1, 2 e 3 anos. Um DSMB independente revisará os dados do estudo numa base em andamento e fará recomendações para alterar a conduta do experimento, se for necessário.

População de Estudo A população de estudo inclui recetores de aloenxertos renais de dadores vivos ou dadores mortos com um CIT previsto < 24 horas. Em geral, critérios imunológicos não exercerão um grande papel na seleção do indivíduo. Indivíduos em níveis variados de risco imunológico são elegíveis. 0 estudo, no entanto, excluirá indivíduos de maior risco imunológico Çcruzamento positivo, painel atual de anticorpos reativos [PRA] de > 50 % ou aqueles anteriormente transplantados com um PRA atual > 30 %). Estes indivíduos podem requerer terapêutica para reduzir sua carga de anticorpo, tal como plasmaferese, a qual está além do âmbito deste protocolo. Os indivíduos serão selecionados em aproximadamente 100 locais globalmente.

Pr"i farina Hp ΤτίρΊ nciãn

População Alvo: 1) 0 indivíduo é um recetor de um transplante de rim de um dador vivo ou um dador morto com um CTI previsto < 24 horas. 2) Homens e mulheres, idades de 18 e mais velhos, inclusive. 3) WOCBP devem estar usando um método adequado de contraceção para evitar gravidez no decorrer do estudo e durante até 8 semanas após o estudo, de maneira que o risco de gravidez seja minimizado. WOCBP inclui qualquer mulher que experimenta menarca e que não sofreu esterilização cirúrgica com sucesso Çhisterectomia, ligação tubal bilateral ou ooforectomia bilateral) ou não está na pós-menopausa Çdefinido como amenorreia durante 12 meses consecutivos; ou mulheres com terapêutica de reposição hormonal [HRT] com um nível documentado de hormona de estimulação folicular [FSH] no soro > 35 mlC/ml). Mesmo mulheres que estão usando hormonas orais ou injetáveis ou dispositivos mecânicos implantados contracetivos ou produtos mecânicos, tal como um dispositivo intrauterina ou métodos de barreira Çdiafragma, condões, espermicidas) para prevenir gravidez ou praticam abstinência ou onde o parceiro é estéril Çpor exemplo, vasectomia), serão consideradas como passíveis de engravidar em potencial. WOCBP devem ter um teste de gravidez negativo no soro Çsensibilidade mínima de 25 IU™L ou unidades equivalentes de gonadotrofina coriónica humana [HCG]) dentro de É2 horas antes de começar a medicação de estudo.

Critérios de Exclusão 1) WOCBP que nâo concordam ou são incapazes de usar um método aceitável para evitar gravidez durante todo o estudo e durante até 8 semanas após a última infusão. 2) Mulheres que estão grávidas ou amamentando. 3) Mulheres com um teste de gravidez positivo quando de seleção ou antes de administração do fármaco de estudo. 4) Pares de dador™recetor geneticamente idênticos Çisto é, gêmeos idênticos). 5) Idade do dador < 10 anos. 6) Indivíduos que receberam e prolongaram os critérios de órgão dador conforme definido por: a) Idade do dador > 60 anos OU b) Idade do dador 50 - 59 anos e 1 dos seguintes: Çi) Acidente cerebrovascular ÇCVA) Ê hipertensão Ê SCr > 1,5 mg™dL OU Çii) CVA Ê hipertensão OU Çiii) CVA Ê SCr > 1,5 mg™dL OU Çiv) Hipertensão Ê SCr > 1,5 mg™dL OU c) CIT previsto > 24 horas OU d) Dador com morte cardíaca Çdador com coração sem batimento). É) Indivíduos com doença renal subjacente de: a) Glomeruloesclerose primária focal segmental, b) glomerulonefrite membrano-prolif erativa do Tipo I ou II, c) Síndrome urémica hemolítica ÇHUS) ™ síndrome de púrpura trombocitopénica trombõtica. Se um indivíduo tem ESRD de etiologia desconhecida e™ou não tem diagnóstico histologicamente confirmado, o indivíduo pode ser selecionado para o estudo na medida em que não existam sinais ou sintomas clínicos consistentes com o diagnóstico clínico de glomeruloesclerose primária focal segmentai, glomerulonefrite membrano-prolif erativa do Tipo I ou II ou HUS, conforme considerado pelo investigador. 8) Indivíduos que sofreram transplante primário Çprimeira vez) com um PRA atual > 50 % ou indivíduos que sofreram retransplantação com um PRA ε 30 %. 9) Indivíduos com perda anterior do enxerto em virtude de rejeição aguda. 10) Indivíduos com um cruzamento linfocitotõxico de células T positivo. 11) Indivíduos com transplante de órgão sólido não-renal anterior Çindivíduos que sofreram retransplantação de rim são elegíveis dependendo se os outros critérios de estudo estão a ser reunidos) ou indivíduos que sofreram transplantes de múltiplos órgãos Çpor exemplo, rim-pâncreas) ou indivíduos considerados prováveis de ter um segundo transplante de células ou órgão sólido Çpor exemplo, transplante de pâncreas ou ilhota) nos próximos 3 anos pelo investigador. 12) Indivíduos que receberam um transplante de órgão sólido concorrente Çcoração, fígado, pâncreas) ou célula Çilhota, medula óssea, células tronco). 13) Indivíduos que estão a receber rins aos pares Çtransplante duplo de rim ou en bloc) . 14) Indivíduos que se sabe que são anticorpo-positivos para hepatite C ou reação em cadeia de polimerase ÇPCR)-positivos para hepatite C. 15) Indivíduos que se sabe que são antigénio na superfície-positivos para hepatite B ou PCR-positivos para hepatite B. 16) Indivíduos com infeção conhecida pelo vírus da imunodeficiência humana ÇVIH). 1É) Indivíduos com tuberculose ativa ÇTB) que requerem tratamento dentro dos 3 anos anteriores ou qualquer indivíduo que requereu anteriormente terapêutica combinada tripla Çou mais) para TB. Indivíduos com um derivado de proteína purificado conhecido ÇPPD) não serão elegíveis para o estudo, a não ser que eles terminem o tratamento para TB latente e tenham um raio X do tórax negativo no momento de seleção. Testagem de PPD feita dentro dos últimos 12 meses é aceitável, na

medida em que haja documentação dos resultados. Indivíduos sem um PDD nos últimos 12 meses que têm um resultado anterior negativo podem ser selecionados, se eles também têm um raio X do tórax negativo quando de seleção, sem sintomas indicativos de TB, nenhum contato com TB, não está atualmente residindo, viajou recentemente ou imigrou anteriormente de uma área endémica para TB. Uma resposta de PPD que é ^ 10 mm ou um escore de Heaf > 1 em indivíduos não-imunizados contra o Bacilo de Calmette-Guérin Çnão-BCG) ou > 2 em indivíduos imunizados com BCG serão considerados um teste positivo. Critérios mais conservantes podem ser aplicados de acordo com diretrizes publicadas e™ou normas locais endossadas pela sociedade médica. 18) Indivíduos com qualquer infeção ativa ou outra contraindicação que normalmente excluiria a transplantação. 19) Indivíduos cuja expectativa de vida é gravemente limitada pelo estado doentio ou outra condição médica subjacente. 20) Indivíduos com um histórico de cancro Çoutro que não melanoma, cancros de células da pele curdos através de ressecção local) dentro dos últimos 5 anos. 21) Indivíduos com um histórico de abuso de substâncias Çdroga ou álcool) dentro dos últimos 5 anos ou distúrbios psicóticos que não são compatíveis com acompanhamento adequado do estudo. 22) Indivíduos com úlcera péptica ativa, diarreia crónica ou má absorção gastrointestinal. Administração e janelas de visita para os regimes L104EA2 9YIg MI e LI e CsA, incluindo listas conforme requerido, serão conforme descrito acima e no Exemplo 4. LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Bristol-Myers Squibb Company Hagerty, David Rusnak,

James <12Ο> MÉTODOS PARA TRATAR DISTÚRBIOS IMUNES ASSOCIADOS A TRANSPLANTAS ÃO DE ENXERTO COM MOLÉCULAS MUTANTES SOÚVEIS DE CTLA4

<130> 10522 PSP <160> 10 <10 0> PatentIn versão 3.2

<210> 1 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador direto da oncostatina M CTLA4 ÇOMCTLA4) < 4 0 0 > 1 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 < 210 > 2

< 211> 4 2 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador indireto da Oncostatina M CTLA4 ÇOMCTLA4) <400> 2 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42

<210> 3 <211> 1152 <212> ADN <213> Sequencia artificial < 2 2 Ο > <223> L104EA29YIg <400> 3 atggçtgtac tgetcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctcoaggca aatatactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgeggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt' tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacetca etatccaagg actgagggcc atggacacgg gaçtotacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggasccca gatttatgta 420 attgatceag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcao 480 acatccccac cgtccccage aectgaactc ctggggggat cgtcagtctt cotcttcccc 540 ccaaaaccca aggaeaccct catgatetec eggacccetg aggtoacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaocc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa aocatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcecccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgoc tggtcaaagg cttctatecc agcgacatcg ccgtggagtg gçagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg ccteccgtge tçgactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tçctccgtga tgcatçaggc tctgcacaac caotacacgo agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152

<210> 4 <211> 383 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> L104EA29YIg <4QG> 4

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1*5 10 -15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly He Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45

Tyr Ala Ssr Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Ara 50 55 60

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 85 SO 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125

Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 14 5 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175

Phe Lèu Phe Pro Pro Lys -Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr 180 185 ISO

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 ' 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys '245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie 260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 ” ’ 310 315 320

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 - 345 350

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 350 365

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380

< 210 > 5 <211> 1152 <212> ADN <213> Sequencia artificial <220> <223> L104EIg <400> 5 atgggtgtec tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat goacgtggoc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaao ctacatgatg 240

gggaatgagt tgaccttoct agatgattcc atctgcaegg gcacetccag tggaaatcaa 30Q gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacaogg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatoosg aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatcoccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttccac 540 ccaaaaccca aggacaccct cstgatctcc cggscccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagco acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag'cagtacaaba gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcotcaccg tectgcaeea ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccocga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatoc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttetatccc agogacatcg ccgtggagtg ggagagcaat S60 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgo tggactccga cggctccttc 1020 ttcctetaca gcsagctcac cgtggacaag agoaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccotgtot 1140 ccgggtaaat ga 1152

<210> 6 <211> 383 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> L104EIg <400> 6

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cvs Glu 35 '3 0 4 5

Tvr Ala Ser Pro Gly Lvs Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met ' 65 70 75 · 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Cl 1 y Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Fro Pro Pro Tyr 115 120 125

Tyr Glu Gly He Gly Asn Gly Thr Gin He Tyr Val lie Asp Pro Glu 130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 ' 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr 180 ” 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 " 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 " 240

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 " 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie 260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 275 ' 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr .Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 . 315 320

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365

His Asn His Tvr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 " 375 ' 380 < 210 > É <211> 1152

< 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> CTLA4Ig <400> É atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggeaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtecgggtg 180 acagtgcttc ggcaggatga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca efcatecaagg actgagggcc atggacacgg gactctacafc ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 aoatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcscgtaGcg ggtggtcagc ' 720 gtcctcaccg icctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctce 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatec cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 etgacctgcc tggtcaaagg ottctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg- agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttccfcota.oa gcaagcfccac ccftoga^ascí agoaggtgcjo dgcsggggsa cejucttctC5 10S0 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagaqcct ctccctgtct 1140 ccgggtaast ga . 1152

<210> 8 <211> 383 <212> PRT <213> SscjuGnc i ct icl.3.1 <220> <223> CTLA4Ig <400> 8

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Àla Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125

Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 180 185 190 IJro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Eis Glu Asp Pro Glu 195 200 205

Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai Eis Asn Ala Lys 210 " 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser 225 230 235 240

Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 255

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr IIe 260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 275 280 285

Pro Ser Arg .Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu 290 " 295 300

Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 315 320

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser 325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg 340 345 350

Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu 355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380

< 210 > 9 <211> 636 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220>

<221> CDS <222> Ç1) . .Ç636) <220> <221> mat paptids <222> ÇÉ9) . . Ç) <400> 9 atg ggt gta ctg etc aca cag agg aeg ctg etc agt ctg gtc ett gca 48

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 etc ctg ttt cca age atg geg age atg gca atg cac gtg gee cag cct 96

Leu Leu Phe Puo Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro -10 -5 “11 5 get gtg gta ctg gee age age ega ggc ate gee age ttt gtg tgt gag 144

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 tat gca tet cca ggc aaa gee act gag etc egg gtg aca gtg ett egg 192

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 ” 35 cag get gac age cag gtg act gaa gtc tgt geg gca ace tac atg atg 240

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 ggg eat gag ttg see the eta gat gat tee ate tgc aeg ggc acc tee 288

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 " 70 agt gga aat caa gtg aac etc act ate caa gga ctg agg gee atg gac 336

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 SO 85 aeg gga etc tac ate tgc aag gtg gag etc atg tac cca ccg cca tac 384

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr SO 95 100 tac ctg ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432

Tyr Leu Gly He Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val He Asp Pro Glu 105 110 115 ccg tgc cca gat tet gac ttc etc etc tgg ate ett gca gca gtt agt 480

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp He Leu Ãla Ala Val'Ser 120 125 130 teg ggg ttg ttt ttt tat age ttt etc etc aca get gtt tet ttg age 528

Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu' Ser 135 140 145 150 aaa atg eta aag aaa aga age cct ett aca aca ggg gtc tat gtg aaa 576

Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lvs 155 160 165 atg ccc cca aca gag cca gaa tgt gaa aag caa ttt cag cct tat ttt 624

Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 170 175 180 att ccc ate aat 636 lie Pro lie Asn 185

<210> 10 <211> 212 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 10

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala “25 -20 -15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro -10 -5 -1 1 5

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly He Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 ’ 15 20

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Tie Gin Gly Leu Arg Alá Met Asp 75 - 80 85

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100

Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin He Tyr Val lie Asp Pro Glu 105 110 115

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp He Leu Ala Ala Val Ser 120 125 130

Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser 135 140 145 150

Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys 155 " 160 165

Met Pro Pro Thr Glu. Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 170 175 180 lie Pro He Asn 185

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não ê parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 60668ÉÉ4 B [0001] • US 5434131 A [0019] [0021] [0027] • US 5844095 A [0019] [0024] [0027] [0145] • US 5851É95 A [0019] [0145] • US 563É481 A [0021] [0027] • US 865321 A [0024] • US 60214065 B [0024] [0025] • US 6028É5É6 B [0024] [0025] • US 6090914 A [0024] • US 5ÉÉ3253 A [0024] • US 5É992É A [0025] • US 20020114814 AI [0052] • US 20040151É25 AI [0052] • US 6444É92 B [0052] • US 6É50334 B [0052] • WO 9É2826É A [0052] • US 6051228 A [0102] • WO 2006030220 A [0105] • US 4399216 A, Axel [0135] • US 20050019859 A [0138] • US 20050084933 A [0138] • WO 04058944 A [0138] • US 5885É96 A [0145]

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Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma molécula mutante de CTLA4 que compreende um domínio extracelular de CTLA4 como mostrado na SEQ ID NO: 8 que começa com alanina na posição 2 6 ou metionina na posição 2É e que termina com ácido aspãrtico na posição 150, em que no domínio extracelular uma alanina na posição 55 é substituída com uma tirosina, e uma leucina na posição 130 é substituída com um ácido glutâmico, para utilização no tratamento de um distúrbio imune associado a transplantação de enxerto, em que o tratamento compreende um regime em fase precoce e um regime em fase de manutenção e em que Çi) o regime em fase precoce varia dos primeiros 3 a 6 meses pós-transplantação e compreende a administração da molécula mutante de CTLA4 a um indivíduo no dia 1, visita na semana 2, visita na semana 4 e então mensalmente até a visita no mês 3 numa dosagem de 10 mg™kg de peso do indivíduo, e Çii) o regime em fase de manutenção começa após o regime em fase precoce terminar e envolve a administração que não é mais frequente que mensalmente de uma dose eficaz da molécula mutante de CTLA4 a um indivíduo de modo a proporcionar uma concentração sérica mínima da molécula mutante de CTLA4 entre cerca de 0,2 pg™ml e cerca de 3 pg™ml durante o regime em fase de manutenção,
2. 2. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o regime em fase precoce compreende a administração da molécula mutante de CTLA4 no dia 1, visita na semana 2, visita na semana 4, visita na semana 8 e semana 12 visita.
3. 3. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o regime em fase precoce compreende ainda a administração da molécula mutante de CTLA4 no dia 5.
4. 4. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 3 em que o regime em fase precoce compreende a administração da molécula mutante de CTLA4 no dia 1, dia 5, visita na semana 2, então a cada duas semanas para os primeiros 3 meses, seguido de administração mensal até a visita no mês 6.
5. 5. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 3 em que o regime em fase precoce compreende a administração da molécula mutante de CTLA4 no dia 1, dia 5, visita na semana 2, visita na semana 4, visita na semana 6, visita na semana 10, visita no mês 4, visita no mês 5 e visita no mês 6.
6. 6. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que a dose eficaz da molécula mutante de CTLA4 durante o regime em fase de manutenção é de 5 mg™kg de peso do indivíduo. É. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o tratamento compreende a administração da molécula mutante de CTLA4 numa dosagem de 10 mg™kg de peso do indivíduo nos dias 1, 15, 29, 5É, 85 e numa dosagem de 5 mg™kg de peso do indivíduo mensalmente depois disso.
7. 8. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o tratamento compreende a administração da molécula mutante de CTLA4 numa dosagem de 10 mg™kg de peso do indivíduo nos dias 1, 5, 15, 29, 5É, 85, e numa dosagem de 5 mg™kg de peso do indivíduo mensalmente depois disso.
8. 9. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o tratamento compreende a administração da molécula mutante de CTLA4 numa dosagem de 10 mg™kg de peso do indivíduo nos dias 1,5, 15, 29, 43, 5É, É1,S5, 113, 141, 169, e numa dosagem de 5 mg™kg de peso do indivíduo mensalmente depois disso.
9. 10. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em que o distúrbio imune associado a transplantação de enxerto compreende rejeição a transplante de órgão sólido, de tecido e™ou de célula.
10. 11. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 10 em que o distúrbio imune associado a transplantação de enxerto compreende rejeição a transplante de rim.
11. 12. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o indivíduo é um recetor de critérios expandidos e™ou quem recebeu o enxerto de um dador de critérios expandidos.
12. 13. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 12, em que os critérios expandidos incluem um ou mais dos seguintes: enxerto de idade do doador de menos de 10 ou mais de ou igual a 60 anos; enxerto de dador após morte cardíaca; enxerto com tempo de isquemia fria antecipada de órgão de dador mais de ou igual a 24 horas; indivíduos que passam por transplante pela primeira vez com um PRA atual > 50 %, ou que passam por retransplantação com PRA > 30 %; indivíduos com perda anterior de enxerto devido a rejeição aguda durante os primeiros 6 meses após transplante; indivíduos com prova cruzada linfocitotóxica de célula T positiva usando linfõcitos do dador e soro do recetor; indivíduos com infeção por VIH; indivíduos com tuberculose ativa que requerem tratamento dentro dos 3 anos anteriores; ou outros critérios publicados pela United Network of Organ Sharing ÇUNOS).
13. 14. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 12, em que os critérios expandidos para urn rim de dador incluem pelo menos 1 dos seguintes critérios expandidos para a donação de órgão a) idade do dador >60 anos; ou b) idade do dador 50 - 59 anos e 1 dos seguintes: Çi) acidente cerebrovascular ÇCVA) Ê hipertensão Ê SCr > 1.5 mg™dL ou Çii) CVA Ê hipertensão ou Çiii) CVA Ê SCr > 1.5 mg™dL ou Çiv) hipertensão Ê SCr >1,5 mg™dL; ou c) CIT >24 horas e idade do dador > 10 anos; ou d) dador com morte cardíaca Çdador sem batimento cardíaco).
14. 15. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a molécula mutante de CTLA4 compreende: Ça) uma sequência de aminoãcidos que começa com metionina na posição 2É e que termina com ácido aspãrtico na posição 150 de SEQ ID NO:4, ou Çb) uma sequência de aminoãcidos que começa com alanina na posição 26 e que termina com ácido aspãrtico na posição 150 de SEQ ID NO:4.
15. 16. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 em que a molécula mutante de CTLA4 compreende ainda uma sequência de aminoãcidos que altera a solubilidade, afinidade e™ou valência da molécula mutante solúvel de CTLA4. 1É. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a sequência de aminoãcidos que altera a solubilidade, afinidade e™ou valência compreende uma fração de imunoglobulina.
16. 18. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 1Ξ, em que a fração de imunoglobulina é uma região ou porção constante da imunoglobulina da mesma.
17. 19. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 18, em que a região ou porção constante da imunoglobulina da mesma é mutada para reduzir a função efetora.
18. 20. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 18 ou 19 em que a região ou porção constante da imunoglobulina da mesma compreende uma dobradiça, regiões CH2 e CH3 de uma molécula de imunoglobulina humana ou de macaco.
19. 21. A molécula para a utilização de acordo com a reivindicação 1É, em que a imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que começa com ácido glutâmico na posição Ê152 e termina com lisina na posição Ê383, como mostrado na SEQ ID NO:4.
20. 22. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 que compreende ainda um resíduo de aminoácido de junção e uma imunoglobulina, onde o resíduo de aminoácido de junção está localizado entre a sequência de aminoácidos que termina com ácido aspãrtico na posição Ê150 e a imunoglobulina.
21. 23. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a molécula mutante de CTLA4 compreende: Ça) uma sequência de aminoácidos que começa com metionina na posição Ê1 e que termina com lisina na posição Ê35É ou glicina na posição Ê356 da Figura É, ou Çb) uma sequência de aminoácidos que começa com alanina na posição -1 e que termina com lisina na posição Ê35É ou glicina na posição Ê356 da Figura É.
22. 24. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 em que a dita molécula mutante de CTLA4 é para ser coadministrada com pelo menos um dos agentes selecionados a partir do grupo que consiste em basiliximab, daclizumab, globulina antitimócito, inibidores de calcineurina, ciclosporina, tacrolimus, micofenolato de mofetilo, rapamicina de ácido micofenólico, azatioprina, muromonab, rituximab, sirolimus, everolimus, FTYÉ20, FKÉÉ8, Jak-3, centican, corticosteroides, betametasona, budesonida, cortisol, cortisona, dexametasona, hidrocritisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona e triancinolona.
23. 25. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 em que a molécula mutante de CTLA4 é para ser coadministrada concomitantemente ou sequencialmente com agentes que compreendem basiliximab e MMF.
24. 26. A molécula para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 em que a molécula mutante de CTLA4 é para ser coadministrada concomitantemente ou sequencialmente com agentes que compreendem daclizumab e sirolimus.